Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Система микотоксикологического контроля объектов ветеринарно-санитарного и экологического надзора

На правах рукописи

КОНОНЕНКО Галина Пантелеевна

СИСТЕМА МИКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ОБЪЕКТОВ ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОГО И ЭКОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусоло!ия, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Авторефрат

диссертации на соискание ученой степени ( доктора биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в лаборатории микотоксикологии Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» РАСХН (ГНУ ВНИИВСГЭ)

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор Лспнтпп Марк Михайлович (ГНУ ВИЗР, г Санкт-Петербург)

Доктор биологических наук Козловский Анатолий Григорьевич (ИБФМ им. Г.К Скрябина, г. Пущино)

' Доктор биологических наук Мялнк Нина Ивановна (ФГУ ВГНКИ, г. Москва)

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» (ГНУ ВНИТИП, г. Сергиев Посад).

Защита состоится 30 июня 2005 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д.220.011.01 при Федеральном Государственном Учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Адрес: Россия, 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ФГУ ВГНКИ. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ВГНКИ.

Автореферат разослан « » мая 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук, доцент,

заслуженный ветеринарный врач РФ Козырев Ю А.

3

Л У^з/з^

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В группе природных соединений, обладающих токсическим действием, особое место принадлежит метаболитам несовершенных микроскопических грибов - микотоксинам. Способность токсигешгых грибов поражать посевы всех видов сельскохозяйственных растений и активно развиваться на агропродукции после уборки и в период хранения, возможность трансмиссии микотоксинов в органы и ткани продуктивных животных, а также высокие уровни их токсичности, придают этой проблеме чрезвычайную значимость. Микотоксикология в прошлом столетии совершила стремительный взлет от первых описаний клинических признаков отравлений, вызванных плеснеобразующими грибами, до разносторонних фундаментальных исследований токсиногенеза грибов, химического строения, механизмов биосинтеза и физиологического действия микотоксинов. Наиболее важным достижением этого периода стало выяснение причин возникновения таких острых и хронических интоксикаций человека и животных как эрготизм, акабаби-токсикоз, болезнь «желтого риса», алиментарная токсическая алейкия, балканская эндемическая нефропатия и многие другие.

Последние десятилетия- прошедшего века были отмечены общим ухудшением микотоксикологической ситуации в мире. Грибные заболевания зерновых культур стали все чаще приобретать характер обширных и затяжных эпифитотий (Канада, США, 1980-82 гг.; СССР, 1985-89 гг.), произошли массовые отравления людей фузариозным зерном (Индия, 1987 г., Китай, 1989-93 гг.), были описаны новые формы микотоксикозов животных. Прогнозы распространения микогенных заболеваний растений оставались неблагоприятными. в связи с возрастающим уровнем антропогенных воздействий на состояние биоценозов и смещением экологического

равновесия. В этих условиях возникла необходимость кардинального изменения прежней тенденции развития микотоксикологии и переориентации ее от исследований post factum па поиск приемов упреждающего контроля агропродукции. Это новое направление требовало развития масштабных национальных проектов, призванных определить показатели и методы оценки кормов и продовольствия в рамках сложившейся структуры arpo- и кормопроизводства.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы стало создание системы микотоксикологического контроля зернопродукции и кормов в Российской Федерации на основе научно-обоснованного выбора приоритетных критериев их безопасности и разработки эффективных аналитических приемов обнаружения, идентификации и количественного определения.

В соответствии с поставленной целью нами решались следующие задачи:

- изучение токсинообразующего потенциала основных возбудителей фузариоза зерновых культур;

исследование распространенности микотоксинов в зерне по территориям его возделывания;

- обследование санитарного состояния кормов в промышленном животноводстве;

- разработка методологии микотоксикологического анализа для наиболее значимых объектов ветеринарно-санитарного и экологического надзора.

Научная новизна работы. Создано новое направление микотоксикологических исследований по оценке последствий'фузариозного поражения зерновых культур, основанное на изучении особенностей токсиногенеза отдельных изолятов и популяций возбудителей. В ходе масштабного изучения микотоксикологической ситуации впервые в стране

осуществлен научно-обоснованный выбор основных критериев контроля агропродукции и кормов. Разработаны новые методы идентификации и количественного определения микотоксинов с применением спектрального, хроматографического и иммуноферментного анализа. Получены новые сведения относительно биогенеза и состава токсичных метаболитов грибов рода Fusarium, установлено строение группы ранее неизвестных природных соединений.

Практическая значимость. Работа относится к фундаментальным исследованиям в области микотоксикологии и имеет социальное и народнохозяйственное значение. Полученные результаты нашли отражение в 12 методических рекомендациях и наставлениях по организации и обеспечению микотоксикологического контроля фузариозного зерна, продуктов его переработки, других объектов ветеринарно-санитарного и экологического надзора, утвержденных Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ, ГУП ГАП СССР, Отделением ветеринарной медицины РАСХН и Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ. Материалы диссертации использованы на лекциях и семинарах в системе повышения квалификации специалистов государственной ветеринарной службы и животноводческих предприятий.

Апробация результатов исследований. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Международном симпозиуме по азот-содержащим микотоксинам (Пущино, 1991 г.), годичном общем собрании Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 1995 г.), Международной научной конференции «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» (Москва, 1999 г), научной сессии Россельхозакадемии (Москва, 2002 г.), Первом съезде микологов России (Москва, 2002 г.), Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (Москва, 2003, 2004 гг.), на заседаниях Ученого Совета ВНИИВСГЭ в 1985-2004 гг.

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 75 статей и тезисов докладов в отечественных и зарубежных изданиях, 5 методических указаний и рекомендаций.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Особенности юксинообразования видов Fusarium graminearum, F. роае, F.sporoti ichioides и F.avenaceum на зерновых субстратах.

2. Токсигеинын потенциал географических популяций доминирующих возбудителей фузариоза колоса и прогнозирование состояния контаминации зерна по террн юриям возделывания.

3. Характер распространенности фузариотоксииов и охратоксина А в зерне колосовых культур.

4. Приоритетные критерии микотоксикологического контроля основных видов кормового сырья и кормов.

5. Методы количественного определения 8-оксотрихотеценов на основе тонкослойной хроматофафии - флуориметрии, газовой и обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

6. Унифицированный прием экспрессного иммуноанализа микотоксинов в зернопродукции и кормах.

7. Хроматографические и спектральные методы анализа и идентификации фузариотоксииов в мицелиально-зерновой биомассе грибов.

Объем н структура работы. Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка сокращений и библиографического списка, включающего 468 источников, из которых 54 опубликованы в отечественных и 414 - в зарубежных изданиях. Работа иллюстрирована 55 таблицами и 18 рисунками.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы:

- изоляты грибов рода Fusarium Link., представляющие виды F.graminearum Schw., F. роае (Peck) Wr., F.sporotrichioides Sherb., F.avenaceum (Corda ex Fr.) Sacc., F.acuminatum Ellis et Everhart, F.culmorum (W.G.Smith) Sacc., F. equiseti Corda (Sacc.) и подвид F.moniliforme var.subglulinans Wr. et Reink., выделение и видовая идентификация которых проведены сотрудниками ВНИИВСГЭ Малиновской Л.С. и Пирязевой Е.А.;

- изолят F.graminearum Schw. № 579, полученный в 1986 г. из Всесоюзного научно-исследовательского института зерна и продуктов его переработки (г. Москва);

- изоляты F.moniliforme Sheld. и F.moniliforme var. lactis (Pir. et Rib.) Bilai comb, nova, полученные в 1989 г. из Института микробиологии и вирусологии (УССР) и Всесоюзного селекционно-генетического института (УССР);

- образцы от парши заготавливаемого зерна в Юго-Западном, Центральном, Центральночерноземном (ЦЧР), Волго-Вятском, Поволжском, Уральском, Западно-Сибирском, Восточно-Сибирском и Дальневосточном регионах Российской Федерации;

- средние образцы от товарных партий кормового сырья и комбикормов, отобранные в соответствии с действующими ГОСТ на птицеводческих предприятиях Центральной России и Поволжья;

- коммерческие препараты микотоксинов - зеараленон (ЗЕН) («Serva», США), 4 -дезоксипиваленол (ДОН), монилиформин (МОН), ниваленол (НИВ), охратоксин A (OA), роридин А (РОА), стеригматоцистин (СТЕ), Т-2 токсин (Т-2) («Sigma», США);

бутснолпд 5-ацетамидо-2(5Н)-фуранон (5-АЛФ), предоставленный сотрудниками Краснодарского политехнического института Поскониным В.В. п Бадовской Л А ;

- афлаюксин В| (АВО, выделенный из биомассы Aspergillus flavus NRRL 2999 (27-28°С, 10 сут) и идентифицированный по совокупности спектральных и хроматографических данных.

Для выделения метаболитов грибов в индивидуальном виде использовали очистку экстрактов биомассы в несмешивающихся жидкостях, прием фильтрования через сорбенты (окись алюминия, активированный уголь, целиты), колоночную жидкостную хроматографию (ЖХ) на силикагеле и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) на обращеннофазовых и привитых сорбентах.

Установление строения полученных соединений проводили по данным ИК- (КВг), УФ- (метанол, этанол), 'Н-ЯМР- (CDC13, 400 MHz), |ЭС-ЯМР- (D5-пиридин, 50,3 MHz) и масс-спектрометрии (МС) в режимах электронного удара (ЭУ, 70 эВ), химической ионизации (ХИ, 0,7 мм рт.ст, 70-100 В), бомбардировки ускоренными атомами (БУА, 6-8 КэВ) и лазерной десорбции (ИДИ). Токсичность веществ определяли на Tetrahimena periformis (ИК50), куриных эмбрионах (ЛД50), мышах (ЛД50, перорально), крысах и кроликах (кожная биопроба).

Изучение гоксиногенеза грибов Fusarium проводили в лабораторных экспериментах по схеме, включающей посев гомогенной взвеси клеток 1риба в 0,01%-ном водном растворе твина 80 с концентрацией около 20 гыс диаспор/мл на стерильный зерновой субстрат (рис, дробленая кукуруза, ячмень, пшеница) с влажностью 30% и стационарное кулыивирование в темноте продолжительностью 4 недели при 28°С, 25"С, 22°С, с понижением температуры от 25°С до 8°С во второй половине инкубации, а гакже в течение 16 недель при 8°С. По окончании выращивания образцы

мицелиалыю-зерновой биомассы анализировали на содержание фузариотоксинов. Общее число исследованных изолятов составило 1143.

В качестве объектов для разработки методов аналитического контроля использовали зерно пшеницы, ячменя, овса, ржи, кукурузы, зерноотходы, подсолнечный и соевый жмыхи и шроты, кормовые концентраты, премиксы, комбикорма, солому пшеницы, ячменя и овса до и после выращивания культур F.graminearurri № 579, Myrothecium roridum F-882 и Dendrodochium toxicum F-827.

Мониторинговые исследования были выполнены в 1985-2003 гг. на 2499 образцах зерна, отобранных специалистами ветеринарных служб республик, краев и областей в хозяйствах 47 административных территорий в начальный послеуборочный период. Для обследования санитарного состояния кормов использовали 1318 образцов зерна кукурузы, соевого шрота, подсолнечного жмыха и шрота и комбикормов, предоставленных специалисшми зоотехнических служб птицеводческих предприятий в период 1997-2004 гг.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Токсинообразующий потенциал грибов рода Fusarium Link.

3.1.1 Компонентный состав токсичных метаболитов

Для отдельных, изолятов F.graminearum, F.avenaceum, F.sporotrichioides и F.poae была установлена способность к образованию токсичных ме1аболитов различной химической природы - сесквитерпеноидов (12,13-эпокситрихотецены Т-2, ДОН, НИВ), азотсодержащих соединений (бутенолид 5-ААФ, фузарины (ФУЗ), энниатины), а также ЗЕН и МОН. Как следует из данных, представленных в табл. 1, для видов F graminearum, F.sporotrichioides и F.poae были характерны общие черты токсиногенеза, тогда как F.avenaceum имел качественно иной состав метаболитов.

Таблица 1

Токсинообразование типовых изолятов отдельных видов Fusarium

Per. № Географическое происхождение Источник выделения, год Метаболиты

F.graminearum

15/2 579 а Краснодарский край то же зерно пшеницы, 1985 то же НИВ ДОН, 3EII

44/2 то же зерно пшеницы, 1986 ДОН, 5-ААФ, ЗЕН

82/3 то же зерно пшеницы,1987 НИВ

253 ю же зерно пшеницы,1988 ДОН, ФУЗ, ЗЕН, 5-ААФ

F.avenaceum

65 Кемеровская область зерно пшеницы, 1986 энниатины, МОН

95/3 Краснодарский край зерно пшеницы, 1987 энниатины, МОН

468/2 Московская область зерно ржи, 1989 энниатины, МОН

487 то же зерно пшеницы, 1989 МОП

491 то же то же МОН

F.sporotrichioides

216/1 Ивановская область зерно пшеницы, 1987 Т-2, ЗЕН

221 Кировская область зерно ржи, 1987 Т-2, ЗЕН, ФУЗ

606/1 Белгородская область зерно пшеницы, 1991 Т-2

815/2 997/1 Нижегородская область Челябинская область зерно ржи, 1991 сено, 1992 Т-2, ЗЕН Т-2

F.poae

80/3 574/3 Краснодарский край Курская область зерно пшеницы, 1987 зерно пшеницы, 1991 Т-2, ФУЗ НИВ

850/2 Нижегородская область зерно ячменя, 1991 НИВ

1277/2 Ульяновская область зерно овса, 1992 Т-2, ЗЕН

970/2 Челябинская область сено, 1992 Т-2, ЗЕН

Продолжение исследований показало, что образуемые изолятами сесквитерпеноиды, энниатины и ФУЗ имеют многокомпонентный состав. В результате хроматографического разделения экстракта биомассы Р.§гаттеагит № 579, продуцирующего ДОН, были выделены и идентифицированы его ближайшие структурные аналоги - 3-ацетил-ДОН (3-Ац-ДОН), 15-ацетил-ДОН (15-Ац-ДОН) и 7-дезокси-ДОН, а также новый

метаболит 3,7,8,15-тетраокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен, которому было присвоено название 7,8-диоксикалонектрин тетраол (рис. 1).

Рис. 1. Строение 12,13-эпокситрихотеценов, выделенных из биомассы изолята Р^гаттеагит № 579.

Такая группа метаболитов для вида Р^гагшпеагит была установлена впервые и их строение соответствовало современным представлениям о механизмах избирательного дезацетилирования и формирования 7-окси-8-оксо-фрагмента в ряду 12,13-эпокситрихотец-9-енов. При биотестировании у всех соединений было выявлено наличие ингибирующего или токсического действия.

К, = СОСН3, К2 = II 3-ацетил-ДОН (3-Ац-ДОН) И, = Н , 1*2= СОСН3, 15-ацетил-ДОИ (15-Ац-ДОН)

7-дезокси-ДОН

7,8- диоксикалонектрин тетраол

В образце биомассы того же изолята было обнаружено вещество, принадлежащее по элементному составу С15Н22О7 к сесквитерпеноидам, для которого по результатам физико-химического анализа была установлена структура 2,3,7,15-тетраокси-7,13-дегидроапотрихотец-8-она. Это повое природное соединение, названное нами грамилауроном, не обладало токсическим действием при пероральном введении мышам в дозе 100 мг/кг и при нанесении 100 мкг на депилнрованнуга кожу кролика. Данные, полученные при сравнении особенностей химическою строения грамилаурона и ДОН позволили предположить возможность их биосинтеза из общего предшественника и, следовательно, существование у токсигенных изолятов Fgгaminearum особых метаболических путей, приводящих к образованию нетоксичных соединений.

После очистки и хроматографического разделения экстрактов биомассы изолятов Р^таттеагшп № 15/2 и 82/3, продуцирующих НИВ, методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) в виде триметилсилильных (ТМС) производных были идентифицированы 4-ацегил-ПИВ (4-Лц-НИВ) и новый метаболит 7-дезокси-НИВ Факт обнаружения 7-дезоксианалогов 8-оксотрнхотеценов (ДОН и НИВ) у разных хемотипов Р^таттеашт установлен впервые. 4-Ац-НИВ, наряду с НИВ, тем же способом был выявлен у двух типовых изолятов Р.роае.

По данным ИК-, УФ-, 'Н-ЯМР и масс-спектрометрии в режиме БУА фракции циклических депсипептидов энниатинов у всех изолятов Р.ауепасеит были идентичны по составу и представлены тремя аналогами -энниатипами В, А! и В|. ЖХ фракций, содержащих ФУЗ, на силикагеле в градиентной подвижной фазе (ПФ), состоящей из хлороформа с последовательными добавками изопропанола от 0,5% до 4,0%, позволила осуществить выделение и последующую идентификацию пяти структурно-близких полисное и в их числе фузарина С (ФУЗ С) по данным ИК-, УФ-, масс-спектров и хроматографическим характеристикам.

Для подтверждения идентификации других представителей группы фузариотоксинов были разработаны методы, представленные в табл. 2.

Таблица 2

Физико-химические методы, использованные для идентификации фузариотоксинов

Вещество Метод Условия выполнения

Т-2 ЖХ-МС(ЛДИ) ТМС, ГХ-МС(ЭУ) ЖХ: колонка силикагель, ПФ бензол-ацетон, 5%-ный градиент ГХ: колонка OV-17 (30 м х 0,32 мм) при 120°-180°С 30°/мин, 180°-280°С 5°/мин

ЗЕН ЖХ-МС(ЛДИ) ЖХ: колонка силикагель, ПФ бензол-ацетон, 5%-ный градиент

5-ДЛФ ГХ-МС(ЭУ) ГХ: колонка SE-54 при 50°С (3 мин), 50°-140°С 157мин, 140°-250°С 25°/мин, 250°С (3 мин)

МОИ ВЭЖХ-МС(ЭУ, ХИ) ВЭЖХ: колонка MicroPAK МСН-5 (4 х 300 мм), ПФ ацетонитрил-вода (18:82) с добавлением водных растворов тетрабутиламмоний гидроксида и КН2РО4, 0,7 мл/мин, 229 нм МС (ХИ): газ-реагент - метан

3.1.2 Характеристика географически локализованных популяций

Для проведения экспериментов по изучению токсинообразующей способности популяций основных возбудителей фузариоза колосовых культур были необходимы методы анализа мицелиально-зерновой биомассы изолятов на содержание основных токсичных метаболитов. Разработанные приемы количественного определения фузариотоксинов с использованием капиллярной ГХ с пламенно-ионизационным детектором (ПИД), инструментальной тонкослойной хроматографии (ТСХ), обращеннофазовой и исш-парной ВЭЖХ представлены в габл. 3.

Таблица 3

Методы хроматографического анализа, использованные для количественного определения фузариотоксинов

Вещество Метод Условия выполнения

Т-2 ТМС-ГХ(ПИД) ГХ: колонка OV-17 ( х 30 м) при 120°-180°С 30°/мин, 180°-280°С 5°/мин, 1ем-ра выхода 278°С

ДОН 1 СХ-обработка-флуориметрня (315 им) ВЭЖХ-УФ (224 им) ТСХ: силуфол, ПФ хлороформ-метанол (7:1), Rr 0,24 Обрабо1ка: 10%-ный этанольный раствор хлористого алюминия, 92°С/10 мин ВЭЖХ: колонка Zorbax ODS, 5 мкм, (4,$ х 250 мм), ПФ вода-ТГФ (95:5), 1,0 мл/мин, t уЯ 10,25 мин

З-Ац-ДОП, 15-Ац-ДОН ТСХ-обработка-флуориметрия (315 им) ТСХ: силуфол, ПФ этилацетат-гексан-метанол (6:4:1), Rf 0,49, 0,42 Обработка: 10%-ный этанольный раствор хлористого алюминия, 92°С/10 мин

7-дезокси-ДОН ВЭЖХ-УФ (224 нм) ВЭЖХ: колонка Zorbax ODS, 5 мкм, (4,6 х 250 мм), ПФ вода-ТГФ (95:5), 1,0 мл/мин, t Уд 8,75 мин

НИВ, 4-Ац-ПИВ ТСХ-обработка-флуориметрия (315 нм) ТСХ: силуфол, ПФ хлороформ-метанол (6:1), Rf 0,20; 0,40 Обработка: 10%-ный этанольный раствор хлористого алюминия, 92°С/10 мин

ЗЕН ТСХ-флуориметрия (314 нм) ТСХ: силуфол, ПФ толуол-этилацетат-муравьиная кислота (5:4:1), Rr 0,54

МОН ВЭЖХ-УФ (229 нм) ВЭЖХ: колонка MicroPAK МСН-5 (4 х 300 мм), ПФ 18% ацетонитрила в воде с ион-парным реагентом (тетрабутил-аммоний гидроксид) и 1,1М водным раствором КН2Р04, 0,7 мл/мин, t уд 7,8 мин

5-ААФ ВЭЖХ-УФ (210 нм) ВЭЖХ: колонка MicroPAK CN-5 (4 х 300 мм), ПФ гексан-изопропанол, 13:7, 0,9 мл/мин, tVÄ. 12-15 мин

В популяции Р §гагшпеагит, представленной на зерне пшеницы Краснодарского края урожая 1985-86 гг., абсолютное большинство изолятов оказались продуцентами ДОН и только незначительная их часть (8,2%) обнаружила способность к биосинтезу НИВ. Степень ее токсигенности в существенной степени зависела от температуры развития Культивирование при 28°С показало, что 84,9% изолятов продуцируют ДОН, при этом более половины изолятов образуют ДОН и ЗЕН с высокими уровнями накопления. Все изученные продуценты ДОН обладали способностью образования 7-дезокси-ДОН в относительных количествах 6,0 - 42,4% на типовом субстрате (зерно риса) и воспроизводили эту способность на пшенице (2,1-18,3%), ячмене (4,5 - 23,3%) и кукурузе (6,4 - 18,2%). В составе метаболитов у 80,8% продуцентов был выявлен 15-Ац-ДОН, но уровни его содержания были ниже (0,1 - 4,7%). Возможность одновременного биосинтеза ДОН, 7-дезокси-ДОН и 15-Ац-ДОН для группы изолятов этого вида обнаружена впервые. Случай образования ДОН, 7-дезокси-ДОН и двух моноацетатов (3-Ац-ДОН и 15-Ац-ДОН), найденный ранее при изучении типового изолята № 579, в составе данной популяции был единственным.

При пониженной температуре (22°С) большинство изолятов (87,1 и 90,3%) также продуцировали 8-оксотрихотецены группы ДОН и ЗЕН, но интенсивность биосинтеза была гораздо слабее - уровни содержания не превышали 10,0 мг/кг субстрата. Более половины изолятов (38 из общего числа 62) в этих условиях образовывали 5-ААФ, но в незначительных количествах - от 0,002 до 1,2 мг/кг. Для абсолютного большинства продуцентов (82 % от общего их числа) были характерны варианты токсипогенеза ДОН+ЗЕН+5-ААФ и ДОН+ЗЕН.

В группе Р.§гагшпеагит из зерна колосовых культур в ЦЧР продуценты ДОН составляли 91,7%, средний уровень накопления - 97,1 мг/кг субстрата по диапазону 0,8 - 199 мг/кг. Способность к образованию ЗЕН в количествах 1,2 - 469 мг/кг (в среднем 62,7 мг/кг) имели 83,3% изолятов, продуценты

НИВ среди них не были выявлены, бутенолид 5-ААФ был обнаружен у 52,0% изолятов в количествах от 0,1 до 60,0 мг/кг.

У F giamineaium, представленного на зерне колосовых культур в Приморском крае в 2001 г , на долю продуцентов ДОН приходилось 64,4% от общего числа изолятов с широким диапазоном образуемых количеств 0,11545 мг/кг Продуценты ЗЕН были представлены примерно с той же частотой (66,7%) и близкими уровнями накопления 1,1 - 1160 мг/кг. Большинство продуцентов (73,5%) обладали способностью одновременного образования ДОН и ЗЕН, случаи раздельного биосинтеза ДОН или ЗЕН среди изолятов были редкими.

Данные, полученные для различных географических популяций F.graminearum, позволяли прогнозировать возможность контаминации зерна 8-оксотрихотеценами группы ДОН и ЗЕН в регионах распространения F.graminearum и существенную зависимость степени ее выраженности от условий развития этого вида.

Для F. роае, представленного в составе микобиоты фузариозного зерна практически во всех регионах зерносеяния, 50,5% изолятов показали способность продуцировать Т-2 с низкими уровнями накопления в диапазоне 0,004 - 5,3 мг/кг. Токсигенность менее всего была выражена у популяций из Центрального (16,7%) и Поволжского (20%) регионов, в Волго-Вягском, Уральском и Восточно-Сибирском имела показатели - 39,5, 43,6 и 51,3%, в ЦЧР и Западно-Сибирском регионе - 67,2 и 62,0%, соответственно.

Способность к образованию НИВ и 4-Ац-НИВ у популяций этого вида по регионам была неоднородной. Если на европейской территории страны продуценты составляли от 41,8 до 65,1% от числа изолятов, то в Красноярском крае (Восточно-Сибирский регион) - всего 3,9%, а в Уральском и Западно-Сибирском регионах не были обнаружены. В Уральском регионе число продуцентов ЗЕН (60,2%) было выше, чем в дру! их

(18,4-23,1%), однако максимальные уровни накопления токсина не превышали 1,0 мг/кг. Случаи выявления ФУЗ у изолятов были крайне редкими. Таким образом, общим свойством всех изученных географических популяций Р.роае, практически повсеместно входящего в состав комплекса возбудителей фузариоза колосовых культур, было устойчивое Т-2 токсинообразование слабой степени, которое обнаруживало варьирование по почвепно-климатическим зонам. » Сравнительная оценка изолятов Р. зропЛпсЬЫсЗез из зерна колосовых

культур в ЦЧР, Центральном, Волго-Вятском, Уральском, ЗападноСибирском и Восточно-Сибирском регионах показала, что все они являются продуцентами Т-2 с чрезвычайно широким диапазоном токсинообразования от 0,01 до 10000 мг/кг и более. По регионам на долю продуцентов с уровнями накопления более 100 мг/кг приходилось от 17,6 до 67,8%. Изоляты, продуцирующие ЗЕН, составляли 41,7% от общего их числа в ЦЧР и от 75,0 до 85,7% в Уральском, Западно-Сибирском и Восточно-Сибирском регионах, однако были способны только к крайне низким уровням его образования. Случаи обнаружения ФУЗ С у изолятов были крайне редкими. Таким образом, для вида Р.БрогойсИЫскз, входящего в состав комплекса возбудителей фузариоза колоса во многих регионах страны, была характерна не только максимальная способность, но и высокая степень образования Т-2.

Таким образом, виды Р.роае и Р.зропЯпсЫоёез во всех регионах их ' распространения могли обеспечивать контаминацию зерна Т-2, частота и

уровни которой определялись долями их участия в составе комплекса , возбудителей и токсигенностью популяций.

Исследование изолятов Р. ауепасеиш, полученных из зерновых кульгур в Европейской части страны (Краснодарский край, Московская область), показало, что большинство из них способны образовывать МОН в количествах от 0,9 до 1095 мг/кг. Однако для популяций, представленных на зерне в Уральском (21 изолят, Республика Башкортостан, Курганская,

Челябинская области), Восточно-Сибирском (75 изолятов, Республика Бурятия, Красноярский край, Иркутская и Читинская области) и Дальневосточном (78 изолятов, Приморский край) регионах, способность к образованию МОП не была подтверждена. Продуцирование изолятами энниатинов, а 1акже 5-ААФ и ФУЗ С, было редким.

Среди возбудителей фузариоза, имеющих ограниченные ареалы распространения, особую значимость имел вид F culmorum. Его токсигенные свойства, как и F gramitiearum, были обеспечены 8-оксотрихотеценами группы ДОН, но с выраженной способностью к накоплению значительных количеств 3-Ац-ДОН. Так, для изолятов из зерна пшеницы Московской области среднее по выборке содержание 3-Ац-ДОН составляло 250 мг/кг (50,0 - 550 мг/кг) при уровне содержания ДОН 24,5 мг/кг. Способность к биосинтезу 3EII была выражена гораздо слабее, а степень продуцирования ФУЗ (11 из 26 изолятов), хотя и была самой высокой, но на долю ФУЗ С в суммарной фракции этих полиенов приходилось всего 0,8%.

Возможность образования нескольких токсичных 8-оксотрихотеценов ДОН, 7-дезокси-ДОН, 3-Ац-ДОН и 15-Ац-ДОН, установленная в ходе экспериментов на отдельных территориальных популяциях видов F.graminearum и F.culmorum, могла быть причиной сочетанной контаминации зерна структурно-близкими аналогами, для обнаружения которых было необходимо провести разработку специальных аналитических методов.

Вид F. acuminatum, наиболее характерный для микобиоты фузариозного зерна колосовых культур в Восточно-Сибирском регионе, показал слабо выраженную способность к биосинтезу Т-2 и ЗЕН. Так, менее половины изолятов, выделенных из зерна в Иркутской области и Красноярском крае, образовывали Т-2 в следовых количествах 0,001-0,1 мг/кг, в Читинской области и Республике Бурятия, а также в Приморском крае Дальневосточного региона продуценты Т-2 и ЗЕН не были выявлены.

Токсигенный потенциал вида Р. ецшзеН, изученный по выборке изолятов из зерна с 13 различных территорий страны в отношении ЗЕН и специфичного для него токсина - фузарохроманона (ФХ), оказался слабым. Доля продуцентов ЗЕН с низкими уровнями накопления составляла 28,6%, продуцентами ФХ были 18,7% изолятов только из зерна в Европейской части страны.

По результатам экспериментов, выполненных на отдельных изолятах и географических популяциях доминантных возбудителей фузариоза колоса при моделировании основных режимов температур, сопровождающих их естественное развитие, была установлена токсигенность видов Р^гапипеагшп, Р.си1тогит, Р.5рого1псЫо1с1е5, Рроае и прогнозирована возможность контаминации зерна Т-2, 8-оксотрихотеценами группы ДОН и ЗЕН в регионах их распространения.

3.2 Микотоксины в объектах ветеринарно-санитарного и экологического надзора

3.2.1 Зерно по территориям возделывания 3.2.1.1 Фузариотоксины

В ходе мониторинговых исследований была подтверждена контаминация зерна 8-оксотрихотеценами группы ДОН и ЗЕН на территориях, где в составе возбудителей фузариоза присутствовали виды Р^гагшпеагит и Р.си1шогит, - в Юго-Западном и Дальневосточном регионах, а также в Центральной России и Поволжье (ЦЧР, Центральный и Волго-Вятский регионы).

В Краснодарском и Ставропольском краях в период эпифитотии фузариоза 1985-91 гг. загрязненность зерна колосовых культур 8-оксотрихотеценами группы ДОН была близка к предельно возможной как по частоте, так и по степени выраженности - уровни накопления токсина

превышали 1000 мкг/кг, в зерне 2 сорта и зерноотходах - 10000 мкг/кь Во всех 15-ти случайно выбранных образцах зерна пшеницы урожая 1985-88 гг., наряду с ДОН, присутствовал 7-дезокси-ДОН в относительных количествах 1,7 - 7,9% Хромато-масс-спектрометрическим анализом был подтвержден факт одновременной естественной контаминации зерна пшеницы ДОН, 7-дезокси-ДОН, 3-Ац-ДОН и 15-Ац-ДОН, который соответствовал свойствам популяции Р^гагшпейгит. В 2002-03 гг. распространенность и уровни содержания токсинов группы ДОН в зерне на этих территориях были гораздо ниже, а случаи обнаружения ЗЕН - крайне редкими.

В Центральной России и Поволжье слабая контаминация зерна 8-оксотрихотеценами группы ДОН в 2002-04 гг. (3,4% образцов пшеницы и 4,3% образцов ячменя) и ЗЕН в 1997-2004 гг. (0,3 и 0,7%) была связана с особенностями состава комплекса возбудителей, в котором виды Р^гагшпеагшп и Р.си1тогит значительно уступали Р.роае и Р.ярогоитсЬгаскБ.

В Приморском крае в 2001-02 гг. 8-оксотрихотецены группы ДОН были обнаружены в 52,9 и 88,9% образцов зерна, ЗЕН - в 30,8 и 72,2%, соответственно. Преобладающим был диапазон уровней содержания ДОН от 100 до 1000 мкг/кг, но сверхпороговые уровни отмечались также достаточно часто. По средним данным за два года 8-оксотрихотецены группы ДОН и ЗЕН чаще встречались в зерне пшеницы (80,0 и 71,7%), чем овса и ячменя В зерне колосовых культур из Хабаровского края распространенность ДОН и ЗЕН составила 17,0 и 4,0%, в Еврейской АО -21,1 и 11,1%, соответствйнно.

В Уральском, Западно-Сибирском и Восточно-Сибирском регионах, где домнпашными в составе возбудителей фузариоза были виды Рроае и Р.5рого1пс1по1с1е5, показатели частоты контаминации Т-2, вычисленные по результатам оценки гоксигенности региональных популяций (30,0%, 31,0% и 16,1%), были близки полученным в ходе мониторинговых исследований (табл. 4).

Таблица 4

Частота обнаружения Т-2 токсина в зерне колосовых культур по регионам возделывания

Регион и годы возделывания Количество образцов, положительные/исследованные

Всего в том числе по видам зерна

Пшеница Овес Ячмень Рожь Зерносмесь

Уральский 1995, 96 гг. 157/431 (36,4%) 22/148 (14.9%) 77/110 (70,0%) 29/93 (31,2%) 29/80 (36,6%) 0

Западно-Сибирский 1995, 97 гг. 162/430 (37,7%) 47/177 (26,6%) 72/123 (58,5%) 24/82 (29,3%) 16/39 (41,0%) 3/9

Восточно-С ибирский 2000-02 гг. 51/480 (10,6%) 12/275 (4,4%) 28/114 (24,6%) 10/56 (17,9%) 1/23 (4,3%) 0/21

Дальневосточный 2001-02 гг. 98/321 (30,5%) 18/97 (18,6%) 60/120 (50,0%) 18/89 (20,2%) 0/7 2/8

По уровням контаминации зерна Т-2 все эти регионы имели сходство, которое было обусловлено преимущественным распространением вида Р.роае, и в меньшей степени - И чрого1пс1ио!с1ез Преобладающим был диапазон от 10 до 100 мкг/кг, а количества, превышающие 100 мкг/кг, были редкими - в 2-3 % проб Во всех регионах случаи контаминации Т-2 зерна овса были более частыми, чем пшеницы, ячменя и ржи (табл. 4).

Результатами могшюринговых исследований в 1997-2004 гг для зерна пшеницы и ячменя в ЦЧР, Центральном, Волго-Вятском и Поволжском регионах была также подтверждена контаминация Т-2 с частотой, соответствующей показателям распространенности и степени токсинообразования региональных популяций Р.роае и И зрогоЫсЬЫскя, только в одном из 97 исследованных образцов было установлено наличие ЗЕН. В отдельные годы частота обнаружения Т-2 в зерне пшеницы изменялась от 3,4 до 21,7% и уровни контаминации соответствовали диапазону от 7,0 до 124 мкг/кг. Для зерна ячменя при частоте обнаружения токсина от 9,1 до 45,5%, загрязненность были несколько выше и нередко отмечались случаи обнаружения количеств, превышающих 100 мкг/кг.

В Дальневосточном регионе для Т-2 был установлен однородный характер распространения по отдельным территориям, частота контаминации составила в Еврейской АО 55,6%, в Хабаровском крае -32,0%, в Хабаровском и Приморском краях - 32,0 и 25,3%, в Амурской области - 20,3%. Общий показатель загрязненности зерна был близок найденным в Уральском и Западно-Сибирском регионах и преимущес1 венной также была контаминация овса (табл. 4). В зерне из Дальневосточного региона преобладали уровни содержания Т-2 от 10 до 100 мкг/кг, хотя случаи более высокого накопления встречались гораздо чаще, чем в Уральском, Западно-Сибирском и Восточно-Сибирском регионах и, в основном, в зерне овса

Для зерна пшеницы и ячменя в 2002-03 гг. в Краснодарском крае

контаминация Т-2 оказалась весьма значительной (58,0% образцов). В большей степени она была выражена у ячменя (77,6% образцов), чем у пшеницы (42,1%), но диапазоны содержания этого токсина были близкими -4,0 - 970,0 мкг/кг и 4,0 - 785,0 мкг/кг, соответственно. Преобладающими были предпоррговые концентрации 10 - 100 мкг/кг, доля образцов с содержанием токсина более 100 мкг/кг составляла 6,7% у пшеницы и 2,6% у ячменя.

Резкие колебания микотоксикологической ситуации, выявленные в Краснодарском и Приморском краях, объясняю 1ся изменчивостью видового состава возбудителей фузариоза и степени токсигенности участвующих в нем видов. Так, в Краснодарском крае в 2002 г. зерно колосовых культур было в основном контаминировано Т-2 (83,4%), гораздо реже - 8-оксотрихотеценами группы ДОН (8,3%) и сочетанием ДОН+Т-2 (7,5%) и крайне редко отдельно ЗЕН (0,8%). При исследовании зерна урожая 2003 г. случаи контаминации зерна пшеницы и ячменя Т-2 и ЗЕН встречались одинаково редко. В Приморском крае в 2001 г в зерне были равномерно представлены три типа - контаминации - отдельно 8-оксотрихотеценами группы ДОН (30%), совместно с ЗЕН (30%) и Т-2 (22%), а в 2002 г. преобладающим был вариант ДОН+ЗЕН.

Мониторинговые исследования подтвердили важное значение фузариотоксинов для оценки безопасности зерна колосовых культур, полное соответствие выбранных критериев реальной микотоксикологической ситуации, а также показали необходимость дифференцированного подхода к организации контроля по видам зерна и территориям его возделывания.

3.2.1.2 Охратоксин А

При выборочном исследовании зерна колосовых культур (пшеницы, ячменя, овса) урожая 1995-96 гг. и продуктов его переработки в Курской области было установлено, что ОА содержат почти 34,7% образцов, при

этом уровни их загрязненности часто превышают 100 мкг/кг и составляют в среднем 115 мкг/кг.

В зерне пшеницы и ячменя из Центральной России и Поволжья в период 1997-2004 гг. степень контаминации ОА существенно не различалась и составляла 6,9 и 8,0%, соответственно, при этом для отдельных образцов ячменя из Курской и Орловской областей уровни содержания токсина были чрезвычайно высокими - 400, 800 и 3250 мкг/кг.

В ходе исследований, проведенных в Уральском и Западно-Сибирском регионах на 808 образцах зерна колосовых культур (пшеницы, ячменя, овса, ржи и их смесей) урожая 1995-97 гг., случаи загрязненности токсином были выявлены только на 4 территориях из 13 - в Республике Башкортостан, Челябинской, Кемеровской и Новосибирской областях, где частота его распространенности варьировала от 1,7 до 7,0% и была наибольшей в Челябинской области (11,7%). Контаминированное зерно было представлено преимущественно овсом и ячменем. Диапазоны обнаруживаемых количеств ОА были различными - в Уральском регионе от 50 до 62 мкг/кг, в ЗападноСибирском - от 29 до 292 мкг/кг. В отдельных пробах овса из Кемеровской и Новосибирской областей загрязненность превышала уровень 100 мкг/кг.

В 2000-02 гг. мониторинговые исследования были проведены на 623 образцах зерна колосовых культур из Восточно-Сибирского и Дальневосточного регионов. Выборки по отдельным территориям имели объемы от 48 до 227 образцов и представляли урожай за два года в Красноярском и Приморском краях. На двух территориях ВосточноСибирского региона (в Республике Бурятия и Иркутской области) а также в Хабаровском крае Дальневосточного региона, ОА в зерне не был обнаружен. На остальных территориях случаи его распространения составляли 2,4% и варьировали от 0,6% до 5,2%. Территорий с частотой загрязненности выше 10% среди них не оказалось. Контаминированное ОА зерно было представлено преимущественно пшеницей, реже другими видами - овес,

рожь и ячмень, и количество ОА находилось в пределах 4 - 200 мкг/кг.

При анализе 370 образцов зерна из Юго-Западного региона (Краснодарский край) в 2002-03 гг. было найдено 5 положительных образцов зерна пшеницы (8,0 и 31,0 мкг/кг) и кукурузы (6,0,29,0 и 177 мкг/кг).

Таким образом, случаи обнаружения ОА в зерне были выявлены на 12 из 24 обследованных территорий, и очаги его наибольшей распросфаненпосги находились в Курской, Орловской и Челябинской ' областях. По остальным загрязненным территориям частота обнаружения

(3,7%) и диапазон содержания (от 4 до 292 мкг/кг) существенно не I отличались от средне статистических мировых данных.

Возможность контаминации зерна ОА, установленная в ходе мониторинговых исследований на значительной части территорий его возделывания, а также существование нескольких очаюв его высокой распросфаненности, указывали па важное значение этою токсина в системе контроля безопасности зерна.

3.2.2 Корма для промышленного животноводства

Оценка состояния контаминации товарных партий фуражного кукурузного зерна по выборке из 171 образца показала ее устойчивый, разнообразный и весьма выраженный характер - ежегодные показатели загрязненности микотоксинами варьировали в диапазоне от 63,2 до 100%. В составе контаминантов были обнаружены фузариотоксины Т-2, ДОН, ЗЕН, фумонизины (ФУМ), а также ОА и АВЬ при этом для каждого из них были выявлены случаи сверхнормативного содержания. Результаты показали, что наиболее распространенными являются ФУМ (61,4%) и Т-2 (53,8%), несколько реже встречаются ДОН (38,0%) и ЗЕН (13,5%). По частоте обнаружения ФУМ и Т-2 и уровням их содержания ситуация ежегодно

сохраняла высокие показатели, тогда как для 8-оксотрихотеценов группы ДОМ и ЗЕН наблюдалась значительная изменчивость.

Для зерна кукурузы, возделанного на территории Краснодарского края в 2002 и 2003 гг., контаминация ФУМ также имела устойчивый характер и высокую степень частоты - 91,8% и 86,7% Уровни загрязненности были весьма значительными - около 30% проб содержали эти токсины в количествах более 10000 мкг/кг Частота обнаружения Т-2 в эти же годы составила всего 18,4% (4,0 - 64,4 мкг/кг) и 10,0% (39,3 - 123 мкг/кг). Загрязненность зерна ДОН и ЗЕН в 2002 г не была установлена, а в 2003 г. выявлена для 6,7% образцов Таким образом, контаминация была обеспечена, главным образом, ФУМ - для урожая 2002 г. доля проб, содержащих эти токсины, составляла 80,0%, в 2003 г. - 84,6%. Возможность обширной распространенности ФУМ в зерне кукурузы была подтверждена результатами оценки токсигенности изолятов F.moniliforme и его подвидов F.moniIi forme var.subglutinans и F moniliforme var. lactis.

Частота обнаружения OA в кукурузном зергге составила всего 6,4%, за весь период исследований АВ: был найден только в 1,2 % образцов и гге было ни одного случая выявления СТЕ.

Результаты обследования 227 товарных партий соевого шрота свидетельствовали о варьировании показателя его загрязненности по годам от 17,6% до 45,2% и указывали на присутствие среди контаминантов фузариотоксинов Т-2, ДОН, ЗЕН, а также ОА. Было установлено, чго наибольшее распространение в образцах имеет ЗЕН (27,8%) с диапазоном содержаний от 10,0 до 3800 мкг/кг, остальные представители этой группы встречаются реже - Т-2 (5,7%) и ДОН (6,0%). Частота контаминации ОА составляла всего 2,2% и массовые концентрации находились в области малых значений - от 4,0 до 11,2 мкг/кг.

Аналитические исследования 154 партий подсолнечного жмыха и шрота показали, что частота контаминации микотоксинами составляет от

35,7% до 76,0% Для большинства образцов была характерна контаминация ОА в количествах от 4,0 до 200 мкг/кг, из чего следовало, что этот вид сырья служит основным источником поступления ОА в рационы животных. Т-2 встречался гораздо реже - в 17,5% образцов в количествах 7,5 - 93,1 мкг/кг, а ЗЕН был выявлен только в одном образце с содержанием 77,5 мкг/кг. 8-оксотрихотецены группы ДОН, а также АВ1 и СТЕ, в образцах подсолнечного жмыха и шрота не были обнаружены Таким образом, для ^ кормового сырья, составляющего основу рационов сельскохозяйственных животных и птицы (зерно кукурузы, соевый шрот, подсолнечный жмых и ^ шрот), частота контаминации микотоксинами имела изменчивость в диапазоне от 17,6 до 100% и группа основных санитарно-значимых показателей была представлена фузариотоксинами (Т-2, ДОН, ЗЕН, ФУМ) и ОА.

В ходе оценки санитарного состояния 766 товарных партий комбикормов, используемых в промышленном птицеводстве, в составе контамииантов были выявлены представители фузариотоксинов (Т-2, ДОН, ЗЕН и ФУМ), а также ОА и АВ[. Общий показатель загрязненности микотоксинами варьировал от 34,6 до 79,5%. Среди фузариотоксинов наиболее распространенным был Т-2 (38,5% образцов), по ежегодным выборкам средние уровни его содержания составляли 30,0 - 58,6 мкг/кг, но в отдельных образцах достигали 550 мкг/кг. С меньшей частотой встречались 8-оксотрихотецены группы ДОН (13,7%), ЗЕН (10,3%) и ФУМ (9,9%). ' Случаи обнаружения ОА в комбикормах с уровнями содержания от 10,4 до ^ 32,5 мкг/кг составляли 15,2 - 42,2%, АВ1 встречался редко (1,6%), СТЕ не был обнаружен.

Микотоксикологическое обследование основных видов кормового сырья и комбикормов стало завершающим этапом работ по выбору приоритетных критериев контроля их безопасности.

3.3 Методы микотоксикологического анализа 3.3.1 Хромятографическое определение 8-оксотрихотеценов

В качесизе подготовительного этапа для выполнения ТСХ и ВЭЖХ была выбрана схема, состоящая в извлечении 8-оксотрихотеценов из образцов смесыо ацетонитрила и воды в объемном соотношении 6:1 и последующей адсорбционной очистке экстрактов на окиси алюминия и активировапнном угле.

В серии лабораторных экспериментов было установлено, что при объемно-весовом соотношении экстракционной смеси и образца (5:1) в условиях стационарной экстракции в течение 14 ч очистка на колонке, заполненной в нижнем слое 1,2 г смеси мелкодисперсной (менее 0,08 мм) фракции активированного угля марки АГ-3 и диатомита Порохром-1М (0,250-0,315 мм) в объемном соотношении 1:1 ив верхнем слое - 4,0 г нейтральной окиси алюминия, является наиболее эффективной. После фильтрования 20 мл экстрактов зерна, жмыхов, шротов и комбикормов при разряжении 90 тыс. Па и затем 20 мл смеси для экстракции, которое продолжалось о г 14 до 16 мин, сухие остатки очищенных экстрактов могли быть использованы для хроматографического анализа. Для экстрактов соломы и половы растворы сухих остатков экстрактов в 2 мл воды необходимо было фильтровать через мини-колонку БЕР-РАК С18 и проводить элюирование 2 мл смеси метанол-вода в объемном соотношении (3:7). В этих условиях степень извлечения ДОН и 7-дезокси-ДОН составляла 98±4%, 3-Ац-ДОН и 15-Ац-ДОН - 97+4%.

Для суммарного определения 8-оксотрихотеценов методами ТСХ-флуориметрии и ВЭЖХ-спектрометрии в виде эквивалентов ДОН был разработан прием обработки сухих остатков очищенных экстрактов 0,05 н. раствором КОН в смеси метанол-вода (9:1) в течение 10 мин, обеспечивающий исчерпывающий гидролиз 3-Ац-ДОН и 15-Ац-ДОН.

Для флуориметрических измерений на сканирующем денситометре «CAMAG TLC II» была выбрана длина волны возбуждающего УФ 315 им, поскольку максимум флуоресценции комплексного соединения ДОН с хлористым алюминием соответствовал диапазону длин волн возбуждения от 306 до 322 им и в интервале 311 - 318 нм интенсивность флуоресценции была постоянной.

В качестве ПФ для выполнения ТСХ на силуфоле было проведено сравнение смесей толуола, бензола, хлороформа и этилацетата с ацетоном, метанолом, этанолом и изопропанолом в соотношениях, обеспечивающих для ДОН значения Rr от 0,28 до 0,35 Для оптимизации условий подготовки пластинок к измерениям по завершении хроматографической стадии их опрыскивали этанольными растворами хлористого алюминия с концентрациями 2 - 20% до полного смачивания слоя и выдерживали в термостате в условиях постоянного контактного нагрева при 92,0±0,1°С и экспозиции от 5 до 25 мин.

В ПФ этилацетат-метанол (20:1), а 1акже в смесях толуола, бензола, хлороформа или этилацетата с ацетоном или изопропанолом, наблюдался нежелательный эффект размывания вещества в слое силикаюля. Компактные и предельно сжатые по вертикали зоны были получены в смесях толуола, бензола или хлороформа с метанолом в соотношениях 6Т, 3:1 или 7:1. Наилучший эффект достигался при обработке пластинок 10%-ным раствором реагента и 15 мин экспозиции. Уровень индуцированной флуоресценции при искусственном освещении оставался неизменным в течение 8 мин, чго было вполне достаточным для считывания результата Флуориметрпчсский анализ обеспечивал измерение ДОН в количествах от 5 до 200 нг. Зависимость количества вещества в пятне от интенсивности аналитического сигнала (высоты пика) была линейной и выражалась уравнением Y = (0,84±0,19)Х. Количественное определение ДОН в интервале

100-2500 мкг/кг обеспечивало удовлетворительную сходимость и правильность получаемых результатов.

Условиям раздельного ТСХ определения 3-Ац-ДОН и 15-Ац-ДОН наилучшим образом удовлетворяла ПФ этилацетат-гексан-метанол (6:4:1) -значения Rr были равны 0,49 и 0,42, соответственно, и интервалы определяемых количеств составляли от 50 до 250 нг.

Для индивидуального определения 8-оксотрихотеценов (ДОН, З-Ац-ДОН, 15-Ац-ДОН, 7-дезокси-ДОН и НИВ) в условиях ВЭЖХ было использовано детектирование при длине волны 224 нм, выбранной в связи с единообразием УФ-спектров в ацетонитриле, метаноле, этаноле, ТГФ и в их смесях с водой. Максимумы поглощения средней интенсивности (е = 5500) располагались в ближней УФ области при длинах волн от 210 до 230 нм.

Оптимизацию условий разделения проводили на хроматографе «Милихром», снабженном микронабивной колонкой (62 мм х 2 мм) Nucleosil С18 (5 мкм), с использованием этанола, ацетонитрила и ТГФ в качестве органических модификаторов водных ПФ. В водном этаноле коэффициенты емкости для всех анализируемых веществ находились в приемлемом интервале значений - от 1,14 до 15,2, но разделение моноацетатов было неудовлетворшельным (а = 1,05) и отделения 7-дезокси-ДОН от ДОН достичь не удавалось. В ПФ, содержащих ацетонитрил, интервал коэффициентов емкости был вполне приемлемым - от 1,06 до 17,0, но разделение анализируемых компонентов происходило с низкой селективностью, которая для ДОН и 7-дезокси-ДОН оставалась практически неизменной при разном содержании ацетонитрила. Для моноацетатов ДОН наибольшая селективность а = 1,11 достигалась только в ПФ вода-ацетонитрил (67:33), когда удерживание этих соединений, а следовательно, размывание пиков и время анализа были слишком велики - значения коэффициента емкости для 15-Ац-ДОН и З-Ац-ДОП составляли 17,0 и 15,3, соответственно.

Наиболее эффективное разделение всех анализируемых компонентов обеспечивали ПФ на основе ТГФ - слабополярного модификатора, способного образовывать водородные связи Последовательность выхода ДОН и 7-дезокси-ДОН изменилась на обратную в сравнении с предыдущими вариантами и этот порядок элюирования веществ оставался неизменным на всем промежутке использованных концентраций ВЭЖХ анализ в ПФ вода-ТГФ при объемном соотношении 76'24 обеспечивал эффекгивное разделение всех компонентов Линейность зависимости аналитическою сигнала для ДОН сохранялась в интервале от 5 до 400 нг Воспроизводимость ввода рабочего раствора была равна 3%, время выполнения хроматографического разделения - 14 мин Нижняя граница измеряемых содержаний соответствовала массовой концентрации 250 мкг/кг, сходимость получаемых результатов не превышала 10%.

Выбор условий капиллярной ГХ для определения ДОН проводили на приборе «Vista Varian-6500», снабженном ПИД и колонкой с 3% OV-17 (30 м х 0,32 мм). При скорости потока газа-носителя 0,4 мл/мин и режиме нагревания от 120°С до 180°С со скоростью 30°/мин, от 180° до 270° со скоростью 5°/мин и далее при 270°С/5 мин время выхода ТМС-эфира ДОН было равно 13,4 мин (238°С). Анализ образцов зерна после соответствующей процедуры очистки экстракта показал, что предел измерения содержания ДОН составляет 500 мкг/кг и сходимость результатов в диапазоне от 500 до 12900 мкг/кг не превышает 10%.

ГХ-МС выполняли на приборе «Finnigan МАТ 4615» с системой обработки данных INCOS-2ÜOO. Разделение ТМС-эфиров 8-оксотрихотеценов (ДОН, 3-Ац-ДОН, 15-Ац-ДОН, 7-дезокси-ДОН, НИВ) было достаточно эффективным на колонках с SPB-1 (30 м х 0,32 мм) при программировании температуры от 60°С до 290°С со скоростью 10°С/мин и OV-351 (45 м х 0,32 мм) в изотермическом режиме при 220°С. Масс-спектрометрическое детектирование ТМС-эфиров в режиме ХИ аммиаком с

одновременной регистрацией спектров ПИ и ОИ показало, что оба типа спектров являются малолинейчатыми и содержат информацию не только о молекулярной массе веществ, но также о характере замещения в молекулах. Для спектров ПИ всех анализируемых соединений были характерны пики ионов (М+Н)+ и (М+1ЧН4)+, интенсивность которых определялась расположением заместителей при С4, С7 и С[5. В спектрах ОИ ТМС-эфиров всех соединений присутствовали пики анион-радикала М , но высокая интенсивность была свойственна только 7-дезокси-ДОН и 3-Ац-ДОН. Для ТМС-эфиров 7-дезокси-ДОП, 15-Ац-ДОН, ДОН и НИВ был характерным однотипный распад молекул на два анион-радикала вследствие разрыва связей Сц-0 и Сз-С6, и пики ионов, образуемых из левой части молекул, были максимальными по интенсивности. Фрагментация ТМС-эфира З-Ац-ДОН происходила с последовательным элиминированием заместителей от С7, С15 и С3, что приводило к образованию в спектре двух пиков при т/т. 290 (16%) и 230 (55%).

Разработанные хроматографические методы позволяли проводить суммарное и индивидуальное количественное определение 8-оксотрихотецепов в объектах и обеспечивали их надежную масс-спектрометрическую идентификацию в условиях хромато-масс-спектрометрии.

3.3.2 Методы на основе иммуноферментного анализа

Для разработки альтернативных приемов определения микотоксинов в объектах контроля в качестве стадии детектирования был использован вариант непрямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Свойства иммунореагентов (антител и твердофазных антигенов) к фузариотоксинам (Т-2, ЗЕН, ФВ,), ОА, АВ], СТЕ и РОА -позволяли рассчитывать на измерения в водных растворах до концентраций 0,01, 0,02, 0,1 или 1,0 нг/мл и на различную специфичность в отношении

ближайших структурных аналогов - высокую (с перекрестной реактивностью не более 5%) для Т-2, ЗЕН, ОА, СТЕ, РОА, групповую - для ЗЕН, АВ,, ФВ, и суммарную для Т-2, ЗЕН и АВ).

Для сохранения основных преимуществ ИФА, таких как простота выполнения и экспресспость, была изучена возможность прямою использования в анализе смеси для извлечения микотоксинов из образцов, состоящей из ацетонитрила и воды (6:1) Эксперименты со всеми типами иммунореагентов показали, что ее добавка к 0,05 М фосфатному буферному раствору, рН 7,0+0,5, содержащему 0,05% твина 20 и 1,0% БСА (ФСБ-т) не может превышать 10%. В этих условиях отрицательный эффект влияния органического растворителя имел место, чувствительность анализа снижалось в среднем в 4 раза, но при этом аналитический диапазон и линейность зависимости относительной оптической плотности от концентрации токсинов оставались неизменными.

Стационарная экстракция по продолжительности (14 ч) совпадала с подготовительной процедурой нанесения твердофазного ангигсиа на поверхность ячеек, могла быть выполнена параллельно и поэтому практически не влияла на длительность аналитической стадии (3,5 - 4 ч). Использование экстрактов после 10-кратного разбавления ФСБ-т не оказывало фоновых эффектов в анализе - для всех видов объектов были выявлены образцы, для которых процент связывания антител превышал 90%. Дополнительное подтверждение было получено в экспериментах по внесению микотоксинов в экстракты «нулевых» образцов, приготовленных на основе 4 видов зернового материала (пшеницы, ячменя, ржи, овса) Диапазоны линейности, углы наклона и расположение калибровочных графиков для всех анализируемых микотоксинов практически не отличались от полученных в ФСБ-т с добавлением 10 об.% смеси ацетонитрила и воды.

Аналитическая схема, включающая экстракцию материала образца смесью ацетонитрила и воды, 10-кратное разбавление экстракта буферным

)• ос. и,ьцминлльна * ,

БИБЛИОТЕКА I

С. Петербург I

О» Ж иг (

раствором и ИФА, обеспечивала возможность количественного определения микотоксинов во всех видах объектов. Нижние пределы измерения, рассчшаниые от уровня 90% связывания за вычетом двух стандартных отклонений, соответствовали массовым концентрациям 2,0, 4,0, 20,0 и 200 мкг/кг. Этот методический прием для всех типов иммунореагентов обеспечивал вполне удовлетворительные метрологические характеристики. Правильность определения составляла 99 - 111 %, показатели сходимости и воспроизводимости результатов не превышали 20%. Нижние пределы измерения содержаний, рассчитанные от уровня 90% связывания за вычетом двух стандартных отклонений, соответствовали концентрациям 0,04, 0,08, 0,4 и 4,0 нг/мл в экстрактах и массовым содержаниям 2,0, 4,0, 20,0 и 200 мкг/кг. Эти пороги чувствительности были вполне приемлемыми для решения задач контроля зернопродукции и кормов при уровнях регламентации микотокснов от 10,0 до 5000 мкг/кг.

Для контроля ОА в комбикормах для восприимчивых видов и возрастных групп сельскохозяйственных животных было необходимо располагать методами, обеспечивающими возможность определения уровней содержания до 1 мкг/кг. Два способа модификации подготовительной процедуры путем экстракции образцов хлороформом с последующим извлечением токсина водными растворами бикарбоната натрия, а также прямое извлечение токсина из образцов водными растворами бикарбоната натрия, содержащими 10% водно-ацетонитрилыюй смеси, позволили успешно решить эту задачу.

Унифицированный прием иммуноферментного определения группы санитарно-значимых микотоксинов (Т-2, ЗЕН, ФУМ, ОА), а также редко встречающихся и потенциальных возможных контаминантов (АВЬ СТЕ и РОА), основанный на методической схеме «экстракция-ИФА», позволял обеспечивать массовый и быстрый контроль санитарного состояния агропродукции и кормов.

4 ВЫВОДЫ

1. Система микотоксикологического контроля объектов вегеринарно-санитарного и экологического надзора, созданная на основе научно-обоснованных критериев и эффективных аналитических методов, способна обеспечивать надежную оценку санитарного состояния агропродукции и кормов в Российской Федерации и гарантировать их безопасность.

2. Изучением географических популяций токсигенных видов Fusarium graminearum, F.sporotrichioides, F.poae и F.culmorum установлена определяющая роль Т-2 токсина, 8-оксотрихотеценов группы 4-дезоксиниваленола и зеараленона в контаминации зерна колосовых культур и показана необходимость дифференцированного подхода к организации его контроля по территориям возделывания.

3. Прогнозирование контаминации зерна по результатам оценки токсиногенеза доминирующих возбудителей фузариоза является перспективным направлением развития микотоксикологических исследований. Разработка методов обнаружения и анализа 12,13-эпокситрихотеценов, монилиформина, бутенолида 5-ацетамидо-2(5Н)-фуранона, фузарина С, фузарохроманона и энниатинов в мицелиально-зерновой биомассе грибов обеспечивает возможность для его дальнейшего совершенствования.

4. В ходе выполнения данной работы получены новые сведения в области биогенеза соединений сесквитерпенового ряда. Особенности химического строения трихотеценов, выделенных из биомассы Fusarium graminearum, позволили подтвердить механизм формирования 7-окси-8-оксо-фрагмента молекул 12,13-эпокситрихотец-9-енов и показать возможность альтернативного пути циклизации промежуточного триходиена до апотрихотеценов.

5. Установлено важное значение охратоксина А для оценки санитарного качества кормов в связи с его значительной распространенностью в зерне колосовых культур на отдельных территориях, а также обширной контаминацией жмыхов и шротв из подсолнечника и комбинированных кормов.

6. Показано, что фузариотоксины являются приоритетными критериями оценки основных видов импортируемого кормового сырья -кукурузного зерна и соевого шрота Устойчивый характер контаминации, значительная частот обнаружения и высокие уровни содержания токсинов, главным образом, фумонизинов и зеараленона, определяют необходимость проведения их регулярного микотоксикологического контроля.

7. Аналитические методы избирательного и совместного определения 8-оксотрихотеценов группы 4-дезоксиниваленола, основанные на применении тонкослойной хроматографии - флуориметрии, обращепнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии -спектрофотометрии и газовой хроматографии - масс-спектрометрии,

I

способны обсспсчива1ь успешное решение задач выборочного и массового контроля зерна и продуктов переработки зерновых культур.

8. Новый унифицированный прием экспрессного иммуноанализа микотоксинов позволяет осуществлять масштабные обследования объектов ветеринарпо-санитарного и экологического надзора по наиболее значимым (Т-2 токсин, зеараленон, фумонизины, охратоксин А), редко встречающимся (афлатоксин В[) и потенциальным (стеригматоцистин, роридин А) контаминантам. Высокая чувствительность анализа обеспечивает возможность эффективного контроля кормов для наиболее восприимчивых видов и групп сельскохозяйственных животных.

9. Для комбикормов, используемых в промышленном птицеводстве страны, подтверждены особая значимость микотоксиколохического контроля и обоснованность выбора критериев оценки безопасности. Установлен

высокий уровень и устойчивый характер их загрязненности микоюксинами (57,2% с диапазоном изменчивости в разные годы о г 34,6 до 79,5%), обусловленный преимущественно фузариотоксинами - Т-2 токсином (38,5%), 4-дезоксиниваленолом (13,7%), зеараленоном (10,3%) и фумонизинами (9,9%), а также охратоксином А (16,8%)

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Мйкоюксикологический контроль безопасности объектов ветеринарно-санитарного и экологического надзора целесообразно проводить на основе установленных критериев с применением следующих приемов и методов количественного анализа:

1. «Методические рекомендации по количественному анализу дезоксиниваленола (вомитоксина) в фуражном зерне с применением капиллярной газожидкостной хроматографии», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.;

2. «Методические рекомендации по количественному определению афлатоксинов С|, 02, Вь В2 в кормах методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии под давлением», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.;

3. «Методические рекомендации по препаративному получению афлатоксинов с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии под давлением», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.;

4. «Методические указания по организации микотоксикологическою контроля фузариозного зерна и продуктов его переработки фуражного назначения», утв. ГУВ ГАП СССР 10.10.88 г.;

5. «Методические рекомендации по количественному определению дезоксиниваленола в зерне с применением обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии», утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1995 г.

6. <<Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения Т-2 токсина «Т-2 токсин - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0514;

7. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения зеараленона «Зеараленон - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0515;

8.«Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения охратоксина А «Охратоксин А - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г, № 13-5-02/0516;

9.«Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения фумонизипа В| «Фумонизин В, - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0519;

10.«Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения афлатоксина В| «Афлатоксин В| - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0520;

11.«Временное наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения роридина А «Роридин А - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0517;

12.«Временное наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения стеригматоцистина «Стеригматоцистин -ИФА», утв. Депаргаменюм ветеринарии МСХ РФ 11 07.2002 г., № 13-502/0518.

6 СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Леонов А Н , Кононенко Г.П., Соболева H.A., Шевцов В К. Ниваленол в культуре изолята Fusarium graminearum 15/2 ВНИИВС // Химия природных соединений. - 1987 - № 6. - С. 923.

2. Леонов А И., Кононенко Г.П., Соболева Н А Идентификация 3-ацегил- и 15-ацетилзамещенных дезоксиниваленола в культуре Fusarium graminearum // Химия природных соединений. - 1988. - № 1. - С. 142-143.

3. Леонов А.Н , Кононенко Г.П., Шевцов В.К., Соболева Н А. Хромато-масс-спектрометрическая идентификация четырех 12,13-эпокситрихогец-9-ен-8-онов в образце фузариозного зерна // Химия природных соединений. -1988.-№ 2.-С. 313-314.

4. Кононенко Г.П., Соболева H.A., Леонов А.Н. Идентификация энниатинов, образуемых Fusarium gibbosum на зерне // Химия природных соединений. - 1988. - № 4. - С. 617-619.

5. Леонов А.Н., Кононенко Г.П., Соболева H.A. Содержание трихотеценов в колосьях и соломе пшеницы сорта Обрий, пораженной фузариозом, в момент уборки // Микология и фитопатология. - 1989. - Т. 23. -№2.-С. 147-151.

6. Леонов А.Н., Соболева H.A., Кононенко Г.П. Флуориметрическое определение дезоксиниваленола в контаминированном зерне // Доклады ВАСХНИИЛ. - 1989. - вып. 7. - № 4. - С. 12-15.

7. Ланин С.Н, Петренко ВВ., Леонов А.Н., Кононенко Г,Г1., Соболева H.A. Селективная бинарная подвижная фаза для высокоэффективной жидкостной хроматографии 12,13-эпокситрихотец-9-ен-8-онов // Химия природных соединений. - 1989. - № 6. - С. 861-863.

8. Леонов А.Н., Соболева Н.А , Малиновская Л.С. Дезоксиниваленол: количественный анализ в изолятах грибов рода, выращенных на твердых

субстратах // Проблемы ветеринарной санитарии. Труды ВНИИВС. - М. -1989. - С. 21-27.

9. Кононенко Г.П., Соболева H.A., Леонов А.Н. 3, 7, 8, 15 - тетраокси-12, 13-эпокситрихотец-9-ен в культуре Fusarium graminearum // Химия природных соединений. - 1990. - № 3. - С. 267-269.

Ю.Леонов А.П., Зотова Е.В., Соболева H.A., Кононенко Г.П. Дерматотоксическое действие сгруктурно-близких трихотеценов грибов Fusarium// Доклады ВАСХНИЛ. - 1990. - № 2. - С. 52-55.

11. Леонов А.Н., Малиновская Л.С., Соболева H.A., Кононенко Г.П., Зелкова II.Г. Совершенствование ветеринарно-санитарных мер по профилактике фузариотоксикозов у' сельскохозяйственных животных // Вестник сельскохозяйственной науки. - 1990 - № 10. - С.73-78.

12. Леонов А.Н., Малиновская Л.С., Соболева H.A., Кононенко Г.П. Токсигенность изолятов Fusarium graminearum Schw. из зерна фузариозной пшеницы в Краснодарском крае//Доклады ВАСХНИИЛ. - 199Ö. - № 11. - С. 21-26.

13. Leonov A.N., Kononenko G.P., Soboleva N.A. Production of DON-related trichothecenes by Fusarium graminearum Schw. from Krasnodarski krai of the USSR // Mycotoxin Research. - 1990. - V. 6. - № 2.- P. 54-60.

14. Леонов A H., Кононенко Г.П., Соболева H.A. Особенности биосинтеза трихотеценов у изолятов Fusarium graminearum Schwabe (579А ВНИИЗ) на зерне // Микология и фитопатология. - 1990. - Т. 4. - № 6. - С. 551-557.

15. Посконин В.В., Бадовская Л.А., Леонов А.Н., Кононенко Г.П. Синтез и свойства 5-ацетамидо-2(5Н)-фуранона - синтетического аналога природного микотоксина // Тезисы Международного симпозиума по азотсодержащим микотоксинам. Пущиио, 4-7 июня 1991 г., С. 15.

16. Кононенко Г.П., Соболева H.A., Леонов А.Н. Методика определения суммарного содержания дезоксиниваленола и его моноацетатов в контаминировапном зерне // Доклады ВАСХНИЛ. - 1991. - № 2. - С. 27-30.

17. Кононенко ГП, Соболева H.A., Леонов А.П., Шевцов В К. Фузаренон X и 7-дезоксиниваленол в культурах изолятов Fusarium graminearum // Химия природных соединений. - 1991. - № 2 - С 267-272.

18. Kononenko G.P., Bekker A.R, Leonov A.N., Soboleva N.A. Gramilaurone, a novel natural sesquiterpenoid from Fusarium graminearum Schw. //Tetrahedron Letters. - 1991. - V. 32. -№ 16. - P. 1893-1896.

19. Леонов АН, Кононенко Г.П., Соболева H.A. Характеристика токсигенности изолятов Fusarium moniliforme var. lactis // Доклады ВАСХНИЛ. - 1991. - № 7. - С. 25-27.

20. Посконин В В., Бадовская Л.А , Леонов А.Н., Кононенко Г П Синтез и свойства 5-ацетамидо-2(5Н)-фуранона - синтетического аналога природного микотоксина // Тезисы Международного симпозиума по азотсодержащим микотоксинам (4-7 июня 1991;Пущино), ИБФМ АН СССР -1991.-С. 15.

21. Зелкова Н.Г., Леонов А.H, Соболева H.A., Кононенко Г.П. Использование пиросульфита натрия для детоксикации дезоксиниваленола в зернофураже // Вестник сельскохозяйственной науки. - 1991. - № 11 - С. 140147.

22. Кононенко Г.П , Шевцов В.К., Зиявидинова З.С., Леонов А H , Соболева H.A. Использование аммиака в качестве газа-реагента при хромато-масс-спектрометрическом контроле контаминации фузариозного зерна трихотеценами // Доклады ВАСХНИЛ. - 1992. - № 1. - С. 22-26 '

23. Леонов А Н., Малиновская Л.С., Кононенко Г П., Соболева Н.А , Путина Т.Г Образование фузарина С грибами, вызывающими фузариоз зерновых культур // Прикладная биохимия и микробиология. - 1993. - Т. 29 -вып. 1. - С. 39-43.

24. Кононенко Г.П., Соболева H.A., Леонов A.H , Малиновская Л С Поиск эффективных продуцентов энниатинов среди изолятов грибов

Fusarium // Прикладная биохимия и микробиология. - 1993. - Т. 29. - вып. 1. -С. 33-38.

25. Зотова Е.В., Соболева H.A., Кононенко Г.П., Леонов А.Н. Токсическое действие ниваленола, 4-дезоксиниваленола и их моноацетатов в локальной биопробе на коже крыс // Лабораторные животные. - 1993. - Т. 3. -№4.-С. 211-216.

26. Леонов А.Н., Кононенко Г.П., Соболева H.A., Малиновская Л.С. Изучение токсиногенеза Fusarium graminearum Schwabe при пониженной температуре культивирования // Микология и фитопатология. - 1994. - Т. 28. -вып. 1. - С. 60-63.

27. Зелкова Н.Г., Кононенкй Г.П., Соболева H.A., Леонов А.Н. Показатели роста и потребления корма у крыс на рационах с высоким уровнем бутенолида 5-ацетамидо-2(5Н)-фуранона // Лабораторные животные. - 1994 - Т. 4. - № 1. - С. 17-21.

28. Кононенко Г.П., Соболева H.A., Леонов А.Н. Бутенолид 5-ацетамидо-2(5Н)-фуранон в составе токсинов, образуемых Fusarium graminearum Schw. на зерне // Прикладная биохимия и микробиология. -1994. - Т. 30. - вып. 4-5. - С. 597-602.

29. Зотова Е.В., Леонов А.Н., Кононенко Г.П., Соболева H.A. Пороговый уровень токсического действия бутенолида 5-ацетамидо-2(5Н)-фуранона при аппликации на кожу кролика // Лабораторные животные. -1994. -Т. 4,- №3. - С. 154-157.

30. Зотова Е.В., Соболева H.A., Кононенко Г.П.. Леонов А.Н. Оценка токсического действия ниваленола, дезоксиниваленола и их моноацетатов в локальной биопробе на коже крыс // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сборник научных трудов. - 1995. - Т. 96. - С. 3-10.

31. Кононенко Г.П. Успехи и перспективы развития исследований по микотокенкологии и химии микотоксинов // Проблемы ветеринарной

санитарии и экологии. Сборник научных трудов. - 1995. - Т. 98. - часть II. - С. 17-20.

32. Кононенко Г.П., Соболева Н А., Зотова Е.В. Способность к биосинтезу фузарохроманона у трех изолятов Fusarium equiseti // Прикладная биохимия и микробиология. - 1996.- Т. 32. - № 6. - С. 639-642.

33. Кононенко Г.П., Соболева H.A., Леонов А.Н. Интенсивность биосинтеза монилиформина у изолятов Fusarium avenaceum и Fusarium moniliforme // Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - Т. 32. - № 3. -С. 335-339.

34. Зелкова Н.Г., Плотникова A.B., Кононенко Г.П., Соболева H.A., Леонов А Н. Снижение содержания дезоксиниваленола в соломе пшеницы при ощелачивании и обработке пиросульфитом натрия // Прикладная биохимия и микробиология. - 1997. - Т. 33. - № 2. - С. 209-212.

35. Кононенко Г.П., Буркин А.А, Соболева H.A., Зотова Е.В. Методика количественною определения Т-2 токсина в кормах с применением ИФА // Ветеринария. - 1997. - № 5. - С. 43-45.

36. Кононенко Г.П., Малиновская Л.С., Пирязева Е.А., Соболева H.A. Видовой состав и токсигенность возбудителей фузариоза всходов пшеницы в Московской области // Микология и фитопатология - 1998. - Т. 32. - вып. 4. -С. 37-41.

37. Кононенко Г.П., Малиновская Л.С., Соболева H.A., Пирязева Е.А., Зотова Е.В., Шалыганова О.Н. Распространенность и токсинообразующие свойства грибов рода Fusarium, поражающих зерно хлебных злаков в Московской области // Микология и фитоиатология. - 1999. -Т. 33.-вып. 2.-С. 118-124.

38. Кононенко Г.П., Буркин A.A., Зотова Е.В., Соболева H.A. Применение твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа для определения фумонизинов группы В // Прикладная биохимия и микробиология. - 1999. - Т. 35. - № 2. - С. 206-211.

39. Кононенко Г.П., Буркин A.A., Соболева Н А., Зотова Е.В. Иммупоферментный метод определения Т-2 токсина в контаминированном зерне // Прикладная биохимия и микробиология. - 1999. - Т. 35. - № 4. - С 457-462.

40. Смирнов A.M., Таланов Г.А., Кононенко Г.П. Животноводству -безопасные корма // Ветеринария. - 1999. - № 1. - С. 3-6.

41. Таланов Г.А., Кононенко Г.П., Рубченков П.Н. Пути получения экологически безопасных продуктов животноводства и кормов // Тезисы докладов Международной научной конференции «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» (16-17 сент. 1999; Москва) / ВНИИВСГЭ РАСХН. - М. - 1999. - С. 24-26.

42. Кононенко Г.П., Буркин A.A. Перспективы использования методической схемы «Экстракция-ИФА» для определения микотоксинов в кормах // Тезисы докладов Международной научной конференции «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» (16-17 сент. 1999; Москва) / ВНИИВСГЭ РАСХН. - М. - 1999. - С. 144-146.

43. Кононенко Г.П., Малиновская Л.С., Соболева H.A., Пирязева Е.А. Распространенность гриба Fusarium equiseti на зерновых культурах и его способность к биосинтезу фузарохроманона // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сборник научных трудов. - 2000. - Т. 108. - С. 72-80.

44. Буркин A.A., Кононенко Г.П., Соболева H.A., Зотова Е.В. Иммуноферментная тест-система определения афлатоксина Bj // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36. - № 1. - С. 93-97.

45. Кононенко Г.П., Буркин A.A., Зотова Е.В., Соболева H.A. Охратоксин А: исследование контаминации зерна // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36. - № 2. - С. 209-213.

46. Буркин A.A., Кононенко Г.П., Соболева H.A., Зотова Е.В. Получение коныогированных антигенов на основе карбоксиметилоксима

зеараленона и их применение в иммуноферментном анализе II Прикладная биохимия и микробиология. - 2000 - Т. 36. - № 3. - С 328-335.

47. Буркин А.А., Кононенко Г.П., Зорян В.Г., Соболева Н.А., Зотова Е.В. Получение антител к роридину А и их применение // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36 - № 4. - С. 428-432

48. Буркин М.А., Яковлева И В., Свиридов В В , Буркин А.А , Кононенко r.fl., Соболева Н.А. Сравнительная иммунохимическая характеристика поликлональных и моноклональных антител к афлатоксину В| // Прикладная биохимия и микробиология - 2000 - Т 36. - № 5 - С 575581.

49. Burkin A. A., Zorjan V G , Soboleva N А , Kononenko G Р Т-2 toxin and roridin A in blood, tissues and excreta of rats after oral administration // Baltic Journal of Laboratory Animal Science. - 2000. - V. 10. - № 1. - C. 26-32.

50. Eroshkin A.A., Kononenko G.P., Burkin A A Ochratoxin A transmission in kidneys and urine of rats under subtoxic dose intake // Baltic Journal of Laboratory Animal Science. - 2000. - V 10. - № 2. - C. 79-85.

51. Пирязева E.A., Малиновская Л.С., Буркин А А , Кононенко Г.П., Соболева Н.А. Микотоксикологические исследования в оценке санитарного качества кукурузного зерна П Проблемы ветеринарной санитарии и экологии Сборник научных трудов. - 2000,- Т. 109. - С.122-133.

52. Ерошкин А.А., Соболева Н.А., Буркин А.А., Кононенко Г.П. Грибы-продуценты охратоксина А в зерновых кормах // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии Сборник научных трудов - 2000 - Т. 109. - С. 134-144.

53. Burkin A.A., Kononenko G.P., Soboleva N A Ochratoxin A' enzyme immunoassay for residues in hens // Baltic Journal of Laboratory Animal Science. -2001.-V. 11. - № 4. - C. 160-167.

54. Буркин А.А., Кононенко Г.П., Соболева Н.А. Получение антител с групповой специфичностью к зеараленону, его метаболитам и

синтетическим аналогам // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. -Т. 38. - № 2. - С. 194-202.

55. Буркин A.A., Кононенко Г.П., Соболева H.A. Получение и аналитические свойства антител с высокой специфичностью к зеараленону // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38. - № 3. - С. 305-311.

56. Буркин A.A., Кононенко Г.П., Соболева H.A. Сравнительная характеристика иммунореагентов на основе гемиацегалей афлатоксина В| и стеригматоцпстина // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38.

- № 5. - С. 571-577.

57. Кононенко Г.П., Буркин A.A. Развитие и современное состояние аналитических исследований микотоксинов // Лабораторный журнал. - 2002.

- Т. 1. - № 1.-С. 50-55.

58. Кононенко Г.П., Буркин A.A. Фузариотоксины в зерновых кормах // Ветеринарная патология. - 2002. - № 2. - С. 128-132.

59. Буркин А.А , Соболева H.A., Кононенко Г.П. Изучение контаминации кукурузного зерна микотоксинами // Тезисы докладов Первого съезда микологов России «Современная микология в России». - М.: Национальная Академия Микологии, 2002. - С.262-263.

60. Буркин А А., Кононенко Г.П. Микотоксины в кормовом сырье растительного происхождения // Тезисы докладов Первого съезда микологов России «Современная микология в России». - М.: Национальная Академия Микологии, 2002. - С.263.

61. Кононенко Г.П., Буркин A.A. Достижения и перспективы использования иммуноферментного анализа в микотоксикологии // Тезисы докладов Первого съезда микологов России «Современная микология в России». - М.: Национальная Академия Микологии, 2002. - С. 266.

62. Кононенко Г.П., Буркин A.A., Соболева H.A., Особенности взаимодействия гемиацеталей афлатоксинов и стеригматоцистина с

альбумином II Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т. 39. - № 1. -С. 116-121.

63. Буркин A.A., Кононенко Г.П., Соболева H.A. Иммунохимические свойства спонтанных конъюгатов афлатоксинов с бычьим сывороточным альбумином // Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т. 39. - № 2. -С. 228-236.

64. Буркин A.A., Кононенко Г П., Кислякова О.С. Актуальность изучения проблемы охратоксикоза в России // Успехи медицинской микологии. - Т. 1. - М.: Национальная Академия Микологии, 2003. - С. 122124.

65. Буркин A.A., Кононенко Г.П. Микотоксины как источник получения аналитических иммунореагентов // Успехи медицинской микологии. - Т. 1. - М.: Национальная Академия Микологии, 2003. - С. 124127.

66. Кононенко Г.П., Буркин A.A. Фузариотоксины в зерне колосовых культур; региональные особенности // Успехи медицинской микологии. - Т. 1. - М.: Национальная Академия Микологии, 2003. - С. 141-144.

67. Кононенко Г.П., Буркин A.A. Достижения и перспективы аналитических исследований в микотоксикологии // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сборник научных трудов. - 2003. - Т. 115. - С. 157-172.

68. Кононенко Г.П., Буркин A.A., Соболева H.A. Иммунохимическая оценка белковых коныогатов 15-гемисукцината З-ацетил-4-дезоксиниваленола // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сборник научных трудов. - 2003. - Т. 115. - С. 173-183.

69. Буркин A.A., Кононенко Г.П. Иммунохимические аспекты микотоксикологии // Материалы VII Всероссийского конгресса Государственная концепция «Политика здорового питания в России» (12-14 ноября 2003; Москва). - М. - С. 87-88.

70. Кононенко Г.П., Буркин A.A. Микотоксикологический мониторинг и безопасность зерновой продукции // Материалы VII Всероссийскою конгресса Государственная концепция «Политика здорового питания в России» (12-14 ноября 2003; Москва). - М. - С. 253-254.

71. Копопенко ГП, Буркин А А. Экологические аспекты проблемы контаминации кормов микотоксинами // Сборник материалов научной сессии Россельхозакадемии «Проблемы техногенного воздействия на агропромышленный комплекс и реабилитации загрязненных территорий» (27-29 июня 2002; Москва) / РАСХН. - М.: Россельхозакадемия, 2003. - С. 428-437.

72. Кононенко Г.П., Соболева H.A. Совершенствование методов определения охратоксина А в кормах на основе иммуноферментного анализа // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2004. - № 3. -С. 38-41.

73. Кононенко Г.П., Буркин A.A. Современные тенденции развития ветеринарной микотоксикологии в России // Успехи медицинской микологии. - Т. 3 - М : Национальная Академия Микологии, 2004. - С 263266.

74. Кононенко Г.П., Буркин A.A., Соболева H.A. Потенциал токсинообразовання основных возбудителей фузариоза колоса // Успехи медицинской микологии. - Т. 3. - М.: Национальная Академия Микологии, 2004. - С. 266-269.

75. Буркин А.А , Кононенко Г.П., Соболева H.A. Контаминация зерновых кормов охратоксином А // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2005 - № 2. - С. 47-49.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

5-ААФ - 5-ацетамидо-2(5Н)-фуранон

АВ, - афлатоксин В1

БУА - бомбардировка ускоренными атомами

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГХ - газовая хроматография

ДОН - 4-дезоксиниваленол

ЖХ - жидкостная хроматография

ЗЕН - зеараленон

ЛДИ - ионизация лазерной десорбцией

МОН - монилиформин

МС - масс-спектрометрия

НИВ - ниваленол

ОА - охратоксин А

ОИ - отицательные ионы

ПИ -' положительные ионы

ПФ - подвижная фаза

РОА - роридин А

СТЕ - стеригматоцистин

Т-2 - Т-2 токсин

ТГФ - тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФУЗ - фузарины

ФУЗ С - фузарин С

ФУМ - фумонизины

ФХ - фузарохроманон

ХИ - химическая ионизация

ЦЧР - Центральночерноземный регион

ВНИИВСГЭ, 2005 г

123022 г. Москва, Звенигородское шоссе, 5 заказ № 99/1, тираж 100 экз.

í

!

I

!

î j

í

I t

*

i

i I

f

€.9 9 9 1

РНБ Русский фонд

2006-4 6529

4

Диссертация является итогом научно-исследовательской работы, выполненной в период с 1985 по 2004 гг. в лаборатории микотоксикологии Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии сельскохозяйственных наук в соответствии с государственными планами фундаментальных НИР (№№ гос. per. 01.86.0 112582, 01.9.60 012296, 01.9.80 002037,01.2.00 103315).

Актуальность темы. В группе природных соединений, обладающих токсическим действием на организм человека и животных, особое место принадлежит метаболитам несовершенных микроскопических грибов - микотоксинам. Способность токсигенных грибов поражать посевы всех видов сельскохозяйственных растений и активно развиваться на агропродукции после уборки и в период хранения, возможность трансмиссии микотоксинов в органы и ткани продуктивных животных, а также высокие уровни их токсичности, опасные и разнообразные формы ее проявления, придают этой проблеме чрезвычайную значимость.

Микотоксикология в прошлом столетии совершила стремительный взлет от первых описаний клинических признаков отравлений, вызванных плеснеобразующими грибами, до разносторонних фундаментальных исследований токсиногенеза грибов, химического строения, механизмов биосинтеза и физиологического действия микотоксинов. Наиболее важным достижением этого периода стало выяснение причин возникновения таких острых и хронических интоксикаций человека и животных как эрготизм, акабаби-токсикоз, болезнь «желтого риса», алиментарная токсическая алейкия, балканская эндемическая нефропатия и многие другие.

Последние десятилетия прошедшего века были отмечены общим ухудшением микотоксикологической ситуации в мире. Вредоносные грибные заболевания зерновых культур стали все чаще приобретать характер обширных и затяжных эпифитотий (Канада, США, 1980-82 гг.; СССР, 1985-89 гг.). Произошли массовые отравления людей фузариозным зерном (Индия, 1987 г., Китай, 1989, 1991 и 1993 гг.), в странах Африки и Юго-Восточной Азии были выявлены новые очаги распространения онкологических заболеваний микогенной этиологии, во многих странах наблюдалось возрастание числа регистрируемых случаев микотоксикозов животных, были описаны новые формы фузариотоксикозов (лейкоэнцефаломалация лошадей, отек легких у свиней).

Прогнозы распространения микогенных заболеваний растений были также неблагоприятными в связи с возрастающим уровнем антропогенных воздействий на состояние биоценозов и смещением экологического равновесия. В этих условиях стала очевидной необходимость кардинального изменения прежней тенденции развития микотоксикологической науки и ее переориентации от исследований post factum на поиск приемов упреждающего контроля агропродукции и кормов. Новое направление нуждалось в проведении масштабных национальных проектов, призванных определить приоритетные критерии обеспечения безопасности кормов и продовольствия в рамках сложившейся структуры arpo- и кормопроизводства.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы стало создание системы микотоксикологического контроля зернопродукции и кормов в Российской Федерации на основе научно-обоснованного выбора приоритетных критериев их безопасности и разработки эффективных аналитических приемов обнаружения, идентификации и количественного определения.

В соответствии с поставленной целью нами решались следующие задачи:

- изучение токсинообразующего потенциала основных возбудителей фузариоза зерновых культур;

- исследование распространенности микотоксинов в зерне по территориям его возделывания;

- обследование санитарного состояния кормов в промышленном животноводстве;

- разработка методологии микотоксикологического анализа для наиболее значимых объектов ветеринарно-санитарного и экологического надзора.

Научная новизна работы. Создано новое направление микотоксикологических исследований по оценке последствий фузариозного поражения зерновых культур, основанное на изучении особенностей токсиногенеза отдельных изолятов и популяций возбудителей. В ходе масштабного изучения микотоксикологической ситуации впервые в стране осуществлен научно-обоснованный выбор основных критериев контроля агропродукции и кормов. Разработаны новые методы идентификации и количественного определения микотоксинов с применением спектрального, хроматографического и иммуноферментного анализа. Получены новые сведения относительно биогенеза и состава токсичных метаболитов грибов рода Fusarium, установлено строение группы ранее неизвестных природных соединений.

Практическая значимость. Работа относится к фундаментальным исследованиям в области микотоксикологии и имеет социальное и народнохозяйственное значение. Полученные результаты нашли отражение в 12 методических рекомендациях и наставлениях по организации и обеспечению микотоксикологического контроля, утвержденных Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ, ГУП ГАП СССР, отделением ветеринарной медицины РАСХН и Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ:

1. «Методические рекомендации по количественному анализу дезоксиниваленола (вомитоксина) в фуражном зерне с применением капиллярной газожидкостной хроматографии», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.

2. «Методические рекомендации по количественному определению афлатоксинов Сь С2, Вь В2 в кормах методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии под давлением», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.

3. «Методические рекомендации по препаративному получению афлатоксинов с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии под давлением», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.

4. «Методические указания по организации микотоксикологического контроля фузариозного зерна и продуктов его переработки фуражного назначения», утв. ГУВ ГАП СССР 10.10.88 г.

5. «Методические рекомендации по количественному определению дезоксиниваленола в зерне с применением обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии», утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1995 г.

6. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения Т-2 токсина «Т-2 токсин - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0514;

7. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения зеараленона «Зеараленон - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0515;

8. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения охратоксина А «Охратоксин А - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0516;

9. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения фумонизина В! «Фумонизин В1 - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0519;

10. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения афлатоксина В! «Афлатоксин В! - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0520;

11. «Временное наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения роридина А «Роридин А - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0517;

12. «Временное наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения стеригматоцистина «Стеригматоцистин - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-502/0518.

Материалы диссертации использованы на лекциях и семинарах в системе повышения квалификации специалистов государственной ветеринарной службы и животноводческих предприятий.

Апробация результатов исследований. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Международном симпозиуме по азот-содержащим микотоксинам (Пущино, 1991 г.), годичном общем собрании отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 1995 г.), Международной научной конференции «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» (Москва, 1999 г.), научной сессии Россельхозакадемии (Москва, 2002 г.), Первом съезде микологов России (Москва, 2002 г.), Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (Москва, 2003, 2004 гг.), на заседаниях Ученого Совета ВНИИВСГЭ в 1985-2004 гг.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 75 статей и тезисов докладов в отечественных и зарубежных изданиях, 5 методических указаний и рекомендаций.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Особенности токсинообразования видов Fusarium graminearum, F. роае, F.sporotrichioides и F.avenaceum на зерновых субстратах.

2. Токсигенный потенциал географических популяций доминирующих возбудителей фузариоза колоса и прогнозирование состояния контаминации зерна по территориям возделывания.

3. Характер распространенности фузариотоксинов и охратоксина А в зерне колосовых культур.

4. Приоритетные критерии микотоксикологического контроля основных видов кормового сырья и кормов.

5. Методы количественного определения 8-оксотрихотеценов на основе тонкослойной хроматографии - флуориметрии, газовой и обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

6. Унифицированный прием экспрессного иммуноанализа микотоксинов в зернопродукции и кормах.

7. Хроматографические и спектральные методы анализа и идентификации фузариотоксинов в мицелиально-зерновой биомассе грибов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка сокращений и библиографического списка, включающего 468 источников, из которых 54 опубликованы в отечественных и 414 - в зарубежных изданиях. Работа иллюстрирована 55 таблицами и 18 рисунками.

4 ВЫВОДЫ

1. Система микотоксикологического контроля объектов ветеринарно-санитарного и экологического надзора, созданная на основе научно-обоснованных критериев и эффективных аналитических методов, способна обеспечивать надежную оценку санитарного состояния агропродукции и кормов в Российской Федерации и гарантировать их безопасность.

2. Изучением географических популяций токсигенных видов Fusarium graminearum, F.sporotrichioides, F.poae и F.culmorum установлена определяющая роль Т-2 токсина, 8-оксотрихотеценов группы 4-дезоксиниваленола и зеараленона в контаминации зерна колосовых культур и показана необходимость дифференцированного подхода к организации его контроля по территориям возделывания.

3. Прогнозирование контаминации зерна по результатам оценки токсиногенеза доминирующих возбудителей фузариоза является перспективным направлением развития микотоксикологических исследований. Разработка методов обнаружения и анализа 12,13-эпокситрихотеценов, монилиформина, бутенолида 5-ацетамидо-2(5Н)-фуранона, фузарина С, фузарохроманона и энниатинов в мицелиально-зерновой биомассе грибов обеспечивает возможность для его дальнейшего совершенствования.

4. В ходе выполнения данной работы получены новые сведения в области биогенеза соединений сесквитерпенового ряда. Особенности химического строения трихотеценов, выделенных из биомассы Fusarium graminearum, позволили подтвердить механизм формирования 7-окси-8-оксо-фрагмента молекул 12,13-эпокситрихотец-9-енов и показать возможность альтернативного пути циклизации промежуточного триходиена до апотрихотеценов.

5. Установлено важное значение охратоксина А для оценки санитарного качества кормов в связи с его значительной распространенностью в зерне колосовых культур на отдельных территориях, а также обширной контаминацией жмыхов и шротов из подсолнечника и комбинированных кормов.

6. Показано, что фузариотоксины являются приоритетными критериями оценки основных видов импортируемого кормового сырья -кукурузного зерна и соевого шрота. Устойчивый характер контаминации, значительная частота обнаружения и высокие уровни содержания токсинов, главным образом, фумонизинов и зеараленона, определяют необходимость проведения их регулярного микотоксикологического контроля.

7. Аналитические методы избирательного и совместного определения 8-оксотрихотеценов группы 4-дезоксиниваленола, основанные на применении тонкослойной хроматографии флуориметрии, обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии - спектрофотометрии и газовой хроматографии - масс-спектрометрии, способны обеспечивать успешное решение задач выборочного и массового контроля зерна и продуктов переработки зерновых культур.

8. Новый унифицированный прием экспрессного иммуноанализа микотоксинов позволяет осуществлять масштабные обследования объектов ветеринарно-санитарного и экологического надзора по наиболее значимым (Т-2 токсин, зеараленон, фумонизины, охратоксин А), редко встречающимся (афлатоксин ВО и потенциальным (стеригматоцистин, роридин А) контаминантам. Высокая чувствительность анализа обеспечивает возможность эффективного контроля кормов для наиболее восприимчивых видов и групп сельскохозяйственных животных.

9. Для комбикормов, используемых в промышленном птицеводстве страны, подтверждены особая значимость микотоксикологического контроля и обоснованность выбора критериев оценки безопасности. Установлен высокий уровень и устойчивый характер их загрязненности микотоксинами (57,2% с диапазоном изменчивости в разные годы от 34,6 до 79,5%), обусловленный преимущественно фузариотоксинами - Т-2 токсином (38,5%), 4-дезоксиниваленолом (13,7%), зеараленоном (10,3%) и фумонизинами (9,9%), а также охратоксином А (16,8%).

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Микотоксикологический контроль безопасности объектов ветеринарно-санитарного надзора и экологического надзора целесообразно проводить на основе установленных критериев с применением следующих приемов и методов количественного анализа:

1. «Методические рекомендации по количественному анализу дезоксиниваленола (вомитоксина) в фуражном зерне с применением капиллярной газожидкостной хроматографии», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.;

2. «Методические рекомендации по количественному определению афлатоксинов в], С2, Вь В2 в кормах методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии под давлением», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.;

3. «Методические рекомендации по препаративному получению афлатоксинов с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии под давлением», утв. Отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 21.11.86 г.;

4. «Методические указания по организации микотоксикологического контроля фузариозного зерна и продуктов его переработки фуражного назначения», утв. ГУВ ГАП СССР 10.10.88 г.;

5. «Методические рекомендации по количественному определению дезоксиниваленола в зерне с применением обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии», утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1995 г.

6. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения Т-2 токсина «Т-2 токсин - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0514;

7. «Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения зеараленона «Зеараленон - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0515;

8.«Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения охратоксина А «Охратоксин А - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0516;

9.«Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения фумонизина В! «Фумонизин В! - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0519;

10.«Наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения афлатоксина В1 «Афлатоксин В1 - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0520;

11.«Временное наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения роридина А «Роридин А - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-5-02/0517;

12.«Временное наставление по применению тест-системы для иммуноферментного определения стеригматоцистина «Стеригматоцистин - ИФА», утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г., № 13-502/0518.