Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение болеутоляющего действия кальцийрегулирующих гормонов и антагонистов кальциевых каналов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫИЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Санкт-Петербургский медицинский институт шеш академика И.П.Павлова

На правах рукописи БУТАКОВА СВЕТЛАНА СТЕПАНОВНА

ИЗУЧЕНИЕ БОЛЕУТОЛЯЩЕГО ДЕЙСТВИЯ КАЛЩйЙРШЛИРУЩНХ ГОРМОНОВ И АНТАГОНИСТОВ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ '

14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена на кафедре фармакологии Санкт-Петербургского медицинского. института имею: академика И.П.Павлова и на кафедре анатомии и физиологии человека Российского государственного педагогического институте им.А.И.Герцэна

Научные руководители. - член-корреспондент РАМН,

. ЗДН РФ, доктор медицинских наук, профессор Ю.Д.Игнатов доктор биологических наук, профессор Ю.А.Даринский

Оффвдиальные оппоненты - ЗДН РФ,

доктор медицинских наук, профессор П.П.Денисенко

доктор медицинских наук, профессор А.Н.Петров

Ведущее учреждение - Институт экспериментальной

медицины РАМН

Защита состоится "_"_1994 г. в_

на заседании специализированного совета К 074.37.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Санкт-Петербургском"медицинском институте им.акад. И.П.Павлова по адресу: 197089, Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, д.в/8, в зале заседаний Ученого совета - главное-здание, 3 этаж.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотека института

Автореферат разослан "__" _1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор медицинских наук,

профессор Э.Э.Звартау

- I -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По современным представлениям кальции имеет важное значение в регуляции ионной проницаемости мембран клеток, генерации возбуждения и в процесса освобождения нейротрансмиттеров (Костюк П.Г., 1986 ; '.ГзТеп R., 1988; Millor R., 1988; Smith 5.. Auguatin G.. 1908). Существенную роль играет кальция в болевой чувствительности и в болеутоляющем действии

о,

опиатов, обусловленном снижением входа Ca в клетки или его связыванием с синаптическими мембранами (Roiner А., 1984; Benedek G., 1988; XuxH., 1988; Цуега П., 1988; Dioraafsn Ii., 1990). В последнее время значительное внимание уделяется изучению влияния на болевую чувствительность средств, регулирующих кальциевый обмен - кальщггошша и блокаторов кальциевых каналов (Сюбаев Р.Д. и соавт., 1988; Шварц Г.Я. и соавт., 1089; Pabbri А., 1981; Prato А., 1907; Contreras В., 1988; Bustamanta D., 1989). Однако в литературе недостаточно изучен механизм болеутоляющего действия кальцитонина, его взаимодействие с антагонистами кальциевых каналов и их влияние на болевую чувствительность. Особую значимость представляет знание о влиянии регуляторов кальциевого обмена на электрогенез нейрональной мембраны, но исследования подобного плана немногочисленны и противоречивы. Отсутствуют данные и об изменении болевой чувствительности под влиянием паратгормона.

В настоящее время общеизвестно,что существенное значение в регуляции боли имеет ГАМК-ергическэя система (Игнатов Ю.Д., Андреев Б.В.. 1983; Дмитриев A.B.. 1990; Андреев Б.В., 1993; Sawynok J., 1987; Suchandra В., 1991). В последние ГОДЫ проводятся исследования, , посвященные анализу болеутоляющей активности ГАМК-производных, но роль кальция в механизмах действия этих соединений до настоящего времени не изучалась.

Настоящая работа выполнена в соответствии с государственной научно-технической программой "Борьба с наиболее распространенными болезнями", направление "Фундаментальные и прикладные проблемы создания лекарственных средств".

Цель иследования. Изучить болеутоляющее действие и ионнда механизмы кальцийрегулирующих гормонов, антагонистов кальциевых каналов и структурных аналогов ГАМК.

Задачи исследования.

1. Исследовать влияние кальцийрегулирующих • гормонов и антагонистов кальциевых каналов на болевую чуствигельность крыс.

2. Исследовать влияние антагонистов кальциевых каналов на аналгетическое действие кальштрина.

3. Изучить влияние кальцитрина и антагонистов кальциевых каналов на болеутоляющее действие ГАМК-производных.

4. Исследовать влияние кальцитрина , антагонистов кальциевых каналов, ГАМК-производных и их комбинация на ионные процессы в мембране нейрона.

Научная новизна. Впервые показана болеутоляющая активность отечественного кальциярегулирующего гормона - кальцитрина. Выявлена высокая степень корреляции между изменениями болевой чувствительности и содежанием общего кальция в плазме крови под влиянием кальцитрина. Продемонстрировано болеутоляющее действие кальцитрина при центральном введении, причем интратекальное введение вызывало наибольший аналитический эффект. Впервые получены данные об ингибирующем действии антагонистов кальциевых каналов - изогггина и нифедипина на аналгетический эффект кальцитрина. Показано, что паратгормон обладает болеутоляющей активностью только при интратекальном введении. Установлено влияние кальцитрина на мембраны нейронов, сопрововдающееся усилением входящего кальциевого тока при низких концентрациях и его снижением - при высоких. Впервые продемонстрировано дозозависимое тормозное действие изопгина на входящий кальциевый ток при действии кальцитрина. Получены новые данные о двухфазном действии изоптина. Впервые показано снижение болеутоляющей активности ГАМК-производных - ЛГПИ-62 и ЛГПИ-П5 под влиянием блокаторов кальциевых каналов и кальцитрина и установлено дозозависимое угнетающее влияние изогггина на входящий кальциевый ток при действии аналогов ГАМК.

Научно-практическое значение работы. Данные об угнетении антагонистами кальциевых, каналов болеутоляющего действия ГАМК-производных и кальцитрина расширяют существующие представления о значении кальция в регуляции болевой чувствительности. Научное значение заключается в том, что показаны мембранно-ионныэ механизмы болеутоляющего действия кальциггрина и ГАМК-производных, а также угнетающее дозозависимое действие блокатора кальциевых каналов изогггина на входящий кальциевый ток при действии кальцитрина и аналогов ГАМК. Подученные данные позволяют разработать новый подход к изучению механизмов действия аналгетиков с позиций их влияния на ионные каналы мембраны нейрона. Данные нейрохимического анализа и болеутоляющего действия регуляторов кальциевого обмена и аналогов ГАМК являются обоснованием для их дальнейшего целенаправленного иследования.

- 3 -

Положения, выносимые на защиту.

1. Кальциарегулирующии гормон - калыцггрии обладает болеутоляющим действием, которое существенно уменьшается антагонистами кальциевых каналов.

2. Антагонисты кальциевых каналов обладают разнонаправленным по характеру и динамике аналитическим эффектом, что связано с дифференцированностью их влияния на отдельные типы кальциовых каналов.

3. Кальцитрин и блокзторы кальциевых каналов уменьшакгг аналитический эффект ГАМК-ергичоских пронаратов.

4. Кальцитрин оказывает двухфазное влияние на трансмомйранный входящий кальциевый ток, усиливая ого при низких концентрациях, и, снижая - при высоких. ГАМК-производныз снижают амплитуду входящего кальциевого тока.

Взлизация результатов исследования. Результаты изучения аналитических свойств ГАМК^производных и регуляторов кальциевого обмена внедрены в НИР и учебный гфоцесс кафедры фармакологии Санкт-Петербургского медицинского института им.акад.И.П.Павлова и кафедры анатомии и физиологии человека и животных Российского государственного годагогичского университета им.А.И.Герцена. Данные об ионных механизмах болеутоляющей активности ГАМК-производаых использованы в исследованиях отдела фармакологии НИЦ СПМИ им.акад.И.П.Павлова. Данные об изменении болевой чувствительности под влиянием антагонистов кальциевых каналов внедрены в НИР лаборатории биофизики клетки НИИ физиологии им.А.А.Ухтомского (Санкт-Петербург).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на Всесоюзной конференции с международным участием "Синтез, фармакология и клинические аспекты новых обезболивающих средств" (Новгород, 1991), Всероссийской конференции "Патофизиология и фармакология боли" (Экспериментальные и клинические аспекты, Москва, 1993), на совместных заседаниях проблемной комиссии "Фармакологическая регуляция гомеостаза" и кафедры фармакологии СПбМИ им.акад.И.П.Павлова (1990,1991,1992), кафедры' анатомии и физиологии человека и животных РГПУ им.Л.И.Герцена (1990,1992,1993), на Санкт-Петербургском обществе фармакологов (1994).

Обьем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на страницах, содержит 18 . таблиц и 19 рисунков.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав,

• заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 208 источников,51 - на русском и 157 - на иностранных языках.

СОДЕРШЛНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на 630 крысах и 120 нейронах моллюска. В работе использован набор лекарственных препаратов и средств отечественного и зарубежного производства (табл.1).

Болеутоляющие свойства веществ оценивали по методике 'ЧаП-Шск". Определяли латентный период в секундах реакции отдергивания хвоста в отчет на локальное термическое воздействие сфокусированным пучком свота на коронь хвоста до введения вещества и после его введения. Оценивалось также изменение эмоционального компонента боловой реакции (А.В.Дмитриев, 1977; А.С.Морозова, 1980) с помощью элоктростимуляции корня хвоста через сьемныо кольцевые электроды. Определялась величина тока, вызывающая вокализацию.

Эффект изоптина (1,5,10 мг/кг, внутрибрюшинно), введенного за 15 мин до кальцитрина, исследовался на 60 минуте.Изоптин, введенный через 30 минут после кальцитрина, исследовали на 45-й минуте. При одновременном введении изоптина и ГАМК-производных тестирование проводили на 40 минуте, а действие изоптина, введенного через 15 минут после аналога ГАМК, исследовали на 30 минуте. Нифедипин вводили внутрибрюшинно в дозах 1,5,10 мг/кг одновременно с - кальцитрином и ГАМК-производными. Парахлорамфетамин вводили внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг за 24 часа до начала опытов. Кроме того, препараты вводили животным под оболочки спинного моз^а (интратекально) между Ь^-Ь^ в субарахноидалыюе пространство микрошприцем в обьеме 5 мкл по методике 3).Уакз11 (1982) и в правый боковой желудочек мозга (Н=4 мм, Ь=Ю мм) микрошприцем в обьеме 5 мкл. Болеутоляющее действие кальцитрина изучали также на фоне повышенного содержания кальция, создаваемого введением лактата кальция (5мг/кг). В ряде опытов на крысах использовалась методика иммобилизционного стресса (О.Н.Забродин, 1978), модифицированная Б.В.Андреевым (1982) и электроболевого воздействия. Электроболевое воздействие осуществлялось прямоугольными импульсами с параметрами 0,8-1,4 мА, 0,05 с, 50 стим/с в течение I мин. Кальцитрин вводили в этих случаях за 45 мин до начала опыта.

Содержание общего кальция в плазме крыс определяли фотоэлектроколориметрическим методом (ЛчИ.Селочник с соавт.,

1978), который заключается в комплэксономэтрическом титровании ЭДТА кальция в присутствии металлоиндикатора мурексида. Для изучения механизмов действия кальцитрина, ГЛМК-производаых и антагонистов кальция использовали методику внутрислоточного

Таблица I

Фармакологические средства, использованные в работе

Название препа- Фирма, Парентерально Мизсроиньокции

рата, или его страна (мг/кг; сд/100г) (мкг; ед; мг)

лабораторный

шифр

Кальцитрин Иаратиреоидин ЛГПИ-62 "Гам-мальгин" ЛГПИ-115 "Омега"

Верапамил (изо-птин)

Нифедилин

Флунаризин

Дилтиазем Парахлор-амфетамин Лактат кальция

Лигза . 1,3,5 ед/100 г 0,015 ед

Россия 1,3,5 ед/100 г 0,1 ед

Россия 100-200 мг/кг 0,5-1 мг

Россия 100-200 мг/кг 0,5-1 мг/кг

"Лек", 1,5,10 мг/кг 0,0125 мг

Югославия

Germed, 1,5,10 МГ/КГ Германия

Yarisen, - 60 MKT

Бельгия

Sigma,США - 60 mkt

Sigma,США 5 МГ/КГ Россия 5 МГ/КГ

диализа в режиме фиксации потенциала на мембране изолированного нейрона моллюска (П.Г.Костюк, О.А.Крышталь, 1981). Опыты проводились совместно со ст.н.с. А.И.ВисЛобановым в лаборатории структурно-функциональных адаптация НИИ ■ физиологии им.А.А.Ухтомского (зав.лаб. - д.б.н. В.П.Галанцев) и ст.н.с. В.В.Манцевым в лаборатории фармакологии наркотиков НИЦ Санкт-Петербургского медицинского института им.акад.И.П.Павлова.

Данные опытов обрабатывались методами параметрической статистики с определением достоверности по Критерию Стьюдента. Определялась корреляционная зависимость Между исследуемыми показателями и вычислялся коэффициент Корреляции.

- б -

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Болеутоляющее действие кальциярегулирующих гормонов и антагонистов кальциевых каналов

"Установлено^ что кальцитрин оказывал аналгетическое действие уже в дозе I ед/100 г массы тела (рис.1). Через 15 мин после введения отмечалось достоверное повышение латентного периода отдергивания хвоста, которое продолжалось в течение 60 минут. Увеличение дозы кальцитрина до 3 и 5 ед/100 г сопровождалось более выраженным дозозависимым аналитическим действием. Введение лактата кальция не изменяло болевую чувствительность крыс и сочетание его с кальцитрином в дозе 3 ед/100 г не сопровождалось усилением аналитического эффекта гормона. При комбинированном введении кальцитрина в дозе 5 ед/100 г с лактатом кальция отмечалось достоверное повышение латентного периода отдергивания хвоста, однако порог вокализации понижался. Нами выявлена высокая степень корреляции (г=-0,в79) между влиянием кальцитрина на болевую чувствительность крыс и развивающимися параллельно изменениями уровня общего кальция в плазме крови. Отмечено совпадении динамики аналгезии кальцитрина и вызываемым им снижением уровня кальция в крови.

При внутрижелудочковом введении кальцитрина (0,015 ед) латентный период отдергивания хвоста повышался на 151Ж через 15 минут и достигал максимума (178%) через 45 минут. Достоверно увеличивался и порог вокализации (рис.1). Интратекальное введение кальцитрина вдвое увеличивало латентный период отдергивания хвоста уже через 15 минут после иньекций, в 3,7 раз - через 30 минут и в 4,7 раз через 45 минут. Длительность аналгезии составляла 90 м^нут. Достоверно повышался и порог вокализации..

Аналгезия, вызванная электроболевым воздействием, проявлялась резким повышением на 438% латентного периода отдергивания хвоста сразу после стимуляции, которое оставалось достоверно высоким в течение 15 минут. Электроболевое воздействие на фоне .кальцитрина приводило к повышению латентного периода лишь на 341Ж и аналгезия продолжалась до 4 минут. Иммобилизационный стресс вызывал повышение латентного периода отдергивания хвоста на 367%. Кальцитрин увеличивал латентный период до 131%. Иммобилизационный стресс на фоне кальцитрина вызывал значительное увеличение латентного периода отдергивания .хвоста (685-Х) л длительности аналгезии.

Парахлорэуфотамии. введенный за ?,4 часа до начала

170 150 130 110 .90 •70 50

Рис.1. Изменение латентного периода отдергивания хвоста (I) и порога вокализации (П) у крыс под влиянием кальцитрина

По оси абсцисс: время в минутах. По оси ординат: изменение латентного периода и порога вокализации в процентах к исходному уровню, принятому за 100%. А. Светлые и темные кружки - дозы кальцитрина I и 3 ед/100 г, соответсвенно; светлые квадраты -5 ед/100 г при внутрийрюшшшом введении. Б. Светлые и темные кружки - внутрижелудочковое (0,015 од) и шггратекалыгае (0,01í> о/О введшие препарата. * - изменения достоверны (Р'0,05).

эксперимента, умеренно снижал выраженность и длительность аналгетичоского эффекта кальцитрина в тесте отдергивания хвоста и не изменял его в тесте вокализации. Так, максимум болеутоляющего дэаствия кальцитрина на фоне парахлорамфетамина отмечался уже через 15 минут и составлял 166% по сравнению с максимумом аналгетического эффекта кальцитрина на 45 минуте (179%).

Паратгормон в дозах 1,3,5 ед/100 г массы тела не оказывал болеутоляющего действия как в тесте отдергивания хвоста, так и в тесте вокализации. Внутрижелудочковое введение паратгормона вызывало достоверную гипоралгезию с 15 по 75 мин после введения. При интратекальном ввода шэд паратгормона латентный период отдергивания хвоста и порог вокализации достоверно повышались.

Нами обнаружено разнонаправленное влияние изоптина и нифедипина на болевую чувствительность крыс (табл.2). Так, изоптин в дозе I мг/кг в течение 75 минут не вызывал ее достоверных изменения, а на 90 минуте отмечалось даже снижение латентного периода отдергивания хвоста. Увеличение дозы до 5 мг/кг приводило к отчетливой аналгезии в тесте отдергивания хвоста, а через 45ч мин развивалась гипералгезия. Сходные изменения выявлены и в тесте вокализации.Изоптин э дозе 10 мг/кг достоверно увеличивал латентный период отдергивания хвоста и порога вокализации (табл.2). Внутрижелудочковое введение изоптина увеличивало латентный период отдергивания хвоста и порога вокализации особенно через 60 минут после введения. Интратекально введенный изоптин повышал латентный период отдергивания хвоста в 2 раза уже через 15 минут и длительность аналгезии составляла 60 щнут. Порог -вокализации достоверно повышался на 30-45 минуте (рис.2).

Совершенно иными были изменения болевой чувствительности при введении нифедипина (табл.2). Так, в дозе I мг/кг он_вызывал гипералгезию как в тесте отдергивания хвоста, так и в тесте вокализации. Увеличение дозы до 5 и 10 мг/кг также приводило к снижению латентного периода отдергивания хвоста и порога вокализации. Аналогичные изменения показателей болевой чувствительности выявлены и при дароральном введении нифедипина в тех же дозах.

, Как видно из рис.2, при внутрижелудочковом введении флунаризина (60 мкг) не изменялся латентный период отдергивания хвоста в течение 75 минут после введения, в то время как порог вокализации достоверно увеличивался. Интратекальное введение

Таблица 2.

Изменение латентного периода отдергивания хвоста и порога вокализации у крыс под влиянием изогггинз и нифодипина '

Препарат и дозы Время после введения препарата (мин) Латентный период отдергивания хвоста (сек) Порог вокализации при электростимуляции корня хвоста(мА)

Мзоптин

I мг/кг Контроль 5.9 ± 0.4 0,8 - 0.1

15 6.0 ± 0,6 0,86 ± 0,1

30 8.9 ± 0,8 0,78 ± 0,1

60 6,6 ± 0,7 0,68 ± 0,07

90 4,8 - 0,2* 0,72 ¿ 0,08

Б мг/кг Контроль 4,85 ± 0,6 0,88 ¿ 0,07

15 8,0 ± 1,2* 1,2 ± 0.2

30 4,7 ± 0,8 I.I ± 0.2

80 4.2 ± 0.8 0,9 í 0.07 '

' 90 3,8 ± 0,3 0,84 - 0,1

10 мг/кг Контроль 3,8 - 0,2 0,64. - 0,06

15 6,1 i 0.5* 0,78 ± 0,05

30 5,8 - 0,4* 0,82 ± 0,04*

60 3,9 ± 0,4 0,78 ± 0,02

90 3,6 - 0,5 0,72 - 0,04

Нифедипин

I мг/кг Контроль 4,55 ¿ 0,2 0,68 ± 0,08

15 4,1 ± 0,3 0,68 - 0,05

30 £.35 - 0,2* 0,53 ± 0,05

60 3,4 ± 0,1* 0,44 - 0,08*

120 3,97 - 0,3 0,44 - 0,04*

5 мг/кг Контроль 4,02 ±0,09 0,35 ± 0,02

15 3,55 ± 0,1* 0,33 - 0,08

30 3.55 - 0.2* 0,24 - 0,02*

80 3;43 ± 0,2* 0,23 ± 0,01*

120 3.57 ± 0,2* 0,24 i 0,02*

10 мг/кг Контроль 4,15 ± 0,2 0,28 ± 0,01

15 3,68 - О.Г* 0,26 ± 0,01

30 3,5 ± 0,1* 0,23 ±0.01*

60 3,47 ± 0,2* .0,28 ± 0,01

120 3,6 - 0,08* 0,28 - 0,01

Примечание: * - изменения достоверны по сравнению с контролем (Р<0.05); данные получены в 40 опытах.

I

А

П

160

О 30 60 90 Рис.2. Влияние внутрижелудочкового (А) и интратекального (Б)

введения аетагонистов кальция на болевую чувствительность крыс.

Светлые кружки - дилгаазем (60 ыкг); темные кружки - изоптин (0,0125 мг); квадраты - флунаризин (80 мкг). * - изменения достоверны (Р<0,05). Остальные обозначения как на рисЛ.

флунаризина (60 мкг) достоверно повышало как латентный период отдергивания хвоста, так и порог вокализации. Дилггиазам (60 мкг) при внутрижелудочковом и интратекальном введении вызывал уменьшение латентного периода отдергивания хвоста, порог «в вокализации достоверно повышался.

Парахлорамфетамин, введонный за 24 часа до изоптина, увеличивал выраженность и длительность аналгетического эффекта последнего. На фоне парахлорамфетамина гипоралгезия не развивалась, достоверно повышался порог вокализации. Изогггин во всех дозах (1,5,10 мг/кг) угнетал болеутоляющий эффект кальцитрина во всех тестах и даже возникала гишралгезия, особенно в тесте вокализации при введении препарата через 30 минут после кальцитрина и за 15 мин до ного. Нифедшжн (1,5,10 мг/кг) полностью устранял болеутоляющее действие кальцитрина во всех тестах, особенно в тесте вокализации.

Таким образом, аналгетический эффект кальцитрина и изоптина проявляется при различных путях введения, нифздипин вызывает гапералгезию, аналгетический эффект кальцитрина подавляется под влиянием антагонистов кальциевых каналов - изоптина и нифедипина.

2. Влияние антагонистов кальциевых каналов и кальцитрина на болеутоляющее действие производных ГАМК"

ЖТШ-62 (100-200 мг/кг) дозозависимо повышал латентный период отдергивания хвоста и порога вокализации в течение. 60 минут. При внутрижелудочковом и интратекальном введении ЛГПИ-82 (0,5-1 мПаналгетический дозозависимый зффект отмечался через 15 .минут и продолжался'до 90 минут.

Аналогичные дозозавис^мые изменения выявлены и при введении ЛГПИ-Н5 (100-200 мг/кг). При его внутрижелудочковом введении (0,5-1 мг ) достоверно увеличивался латентный период отдергивания хвоста в течение 75 мин с максимумом через 45 минут. Порог вокализации максимально повышался через 30 мин и оставался достоверно высоким до 60 минуты. Интратекальное введение ЛГПИ-П5 (0,5 мг) увеличивало через 15 мин латентныа период отдергивания хвоста в 2 раза и он был достоверно выше в течение 75 мин, повышался и порог вокализации. Увеличение дозы до I мг удлиняло продолжительность аналгезии во всех тестах.

Введение изоптина (5 мг/кг) через 15 мин после ЛГПИ-62 полностью устраняло аналгетический эффект последнего в дозах 100 и 200 мг/кг в тесте отдергивания хвоста. Однако в тесте вокализации изменения были недостоверны (табл.3). Аналогичным

Таблица 3

Изменение латентного периода отдергивания хвоста и порога вокализации у крыс под влиянием ЛГШ-62 и ЛГПИ-П5 на фоне введения изопгина.

Лоза препара' (мг/кг)

та

Время после введения препарата (мин)

Латентный период отдергивания хвоста (сек)

Порог вокализации при электростимуляции корня хвоста (МА)

ЛГПИ-62 (100)+ Контроль 5,7 ± 0,4 0,7 ± 0,05

изогггин (5) 30 4,1 ± 0,3* 0,57 - 0,06 через 15 мин

ЛГПИ-62 (100)+ Контроль 5,5 - 0,4 0,7 ± 0,05

изоптин (5) 40 4,4 ± 0,4* 0,74 - 0,08

ЛГШ-62 (200)+ Контроль 4,85 - 0.4 0,6 ± 0,1

изоптин (5) 30 3,8 ± 0,1* 0,86 - 0,2

через 15 мин

ЛГШ-62 (200)+ Контроль 6,7 + 1,2 0,52 + 0,07

изоптин (5) 40 4,9 + 0.7 0,62 + 0,07

ЛГГШ-П5 (100)+ Контроль 7,0 + 0,5 0,66 + 0,08

изоптин (5) 30 5,0 + 0.4* 0,61 + 0,09

через 15 мин '•г

ЛГШ-115 (100)+ Контроль 4,0 + 0,1 0,81 + 0,06

изоптин (5) 40 3,6 + 0,3 0,48 + 0,06*

ЛГШ-115 (200)+ Контроль 6,0 + 0,4 0,73 + 0,07

изоптин (5) 30 8,1 + 0,9* 0,84 + 0,14

через 15 мин

ЛГШ-115 (200)+ Контроль 4,9 + 0,3 0,69 + 0,05

изоптин (5) 40 4,4 + 0,3 0,53 + 0,08

Примечание: * - изменения достоверны по сравнению с контролем (Р<0,05). Каждая доза препарата изучена в 7 опытах. .

образом, изоптин влиял на аналитический эффект ЛГЩ-82 и при одновременном введении препаратов. Нифедипин подавлял 'рчалгети-ческий эффект ЛГШ-62/Г00 и 200 мг/кг/,наблюдалась дозозависи-мая гипералгезия по всем тестам. 'ЛГПИ-П5 (100 мг/кг')' за 15 мин до введения изоптина снижал латентный период отдергивания хвоста и порог вокализации. Введение ЛГПИ-П5 с нифэдипином вызывало изменения аналитического действия производного ГАМК аналогично изменениям аналгетического эффекта ЛГПИ-82. Таким образом, болеутоляющее действие ГАМК-производных ЛГПИ-62 и ЛГПИ-Н5 уменьшается антагонистами кальциевых каналов изоптином и нифедигашом.

Кзльцитрин существенно уменьшал аналитический эффект ЛГПЙ-82 и ЛЛШ~П5 в дозах 100 и 200 мг/кг в двух тестах. Так, введение аналогов ГАМК с кальцитрином приводило к повышению латентного периода отдергивания хвоста, однако это повышение было существенно меньше, чем при введении одного ГАМК-производдого (рис.3).

3. Влияние кальцитрина, антагонистов кальция и ГАМК-производных на ионные процессы в мембране Дилтиазем в концентрациях Ю^^-Ю^М не влиял на кальциевый входящий ионный ток. При увеличении его концентрации до 10 -10 М амплитуда тока уменьшалась соответственно на 16%, 31Ж, 46% и 85Ж по сравнению с контролем. Уменьшение величины 1Са отмечалось уже в концентрациях флунаризина с Ю-9 до КГ3М.

' Достоверное снижение 1Са наблюдалось в концентрации Аппликация изоптши в концентрациях 10-6-10~4М дозозависимо уменьшала амплитуду кальциевого токэ. При увеличении концентрации до 10~4М снижение кальциевого тока на 38% было достоверным (рис.4). Дилтиазем, флунаризин и изоптин не вызывали сдвига вольт-амперной характеристики мембраны для 1Сд. Таким образом, общим в действии исследованных блокаторов кальциевых каналов являлось угнетение входящего кальциевого тока и стабилизация потенциала поверхностного заряда мембраны.

Действие кальцитрина на амплитуду кальциевых токов зависело

_<з _7

от ого концентрации. В концентрации 10 -10 М кзльцитрин недостоверно увеличивал величину 1С в среднем на 22Ж, в концентрации Ю_6М . достоверно снижал амплитуду кальциевого тока. В концентрации 10~9М кальцитрин сдвигал вольт-амперную характеристику вправо на 10 мв, т.е. изменял потенциал поверхностного заряда мембраны.

ЛГПИ-115 в концентрациях 10~®-10-4М достоверно не изменял э в концентрации Ю'^М его снижал. ЛГПИ-62 в концонтр^цга

I

II

340-i 310-

* iso-.

250220190160130-

280-

10070-

Д—Д

0 30 60

90

О 30 60 90

Рис.3. Изменение латентного периода отдергивания хвоста (I) и

порога вокализации (П) у крыс под влиянием ЛГПИ-П5 на фоне введения кальцитрина. Темные кружки - ЛГПИ-115-IOO мг/кг; светлые кружки - 200 мг/кг. Темные треугольники - комбинированное введение ЛГПИ-П5 (100 мг/кг) и кальцитрина (3 ©д / 100 г; светлые треугольники -комбинированное введение ЛГПи-ПБ (200 мг/кг) и кальцитрина (3 ед/ЮО г). « - изменения достоверны (Р<0,05). Остальные обознаения как на рис.1. .

I0~e-I0~^M не оказывал влияния на кальциевый входящий ионный ток. хотя тенденции к уменьшению величины 1Са наблюдалась уже в концентрации препарата КГрм. При увеличении его концентрации до Ю-4 и 10~3М амплитуда тока достоверно уменьшалась.

Комбинированная аппликация кальцитрина в концентрациях I0~9- ТО"7 М и изоптина в концентрациях 10~6-10-4снижала 1Са на 14®, 16% и 28%, соответственно. Отмечалось угнетающее дозозависимое влияние изоптина на амплитуду входящего 1Са при сочетанной аппликации ЛГПИ-ПБ (10~6~10~4). Так, под влиянием изоптина величина кальциевого тока уменьшалась соответственно на 18/, 26% и 42%. Аналогичный эффект : наблюдался и при комбинированной аппликации ЛГПИ-62 и изоптина в тех же концентрациях : амплитуда 1Са уменьшалась на 23%, 26% и 36%, соответственно. Следовательно, изоптин оказывал одинаковое-дозозависимое угнетающее действие на входящие кальциевые каналы в эффектах кальцит)«nía и ГАМКчфоизйоишх.

А

Б

В

- Ц /И/1/

Рис.4. Изменение амплитуда входящего кальциевого тока под влиянием антагонистов кальциевых каналов (А), калыдарша (Б) и ГАМК-производных (В). По оси ординат - изменение 1Са по сравнению с контрлем, принятом

за 100%. По оси абсцисс - концентрации веществ в молях. А. I -флунаризин; 2 - дилтиазем; 3 - изоптин. Б. I- кальцитрин; 2 -

- изоптин; 3 - сочетанное влияние кальцитрина и изоптина. В. I

- ЛГПИ-Н5; 2 - ЛТ1И-62; 3 - сочетанное влияние ЛПШ-62 и изоптина; 4 - сочетанное влияние ЯТШ-П5 и изоптина. * -изменения достоверны (Р<0,05).

'к * *

Болеутоляющее действие кальцитрина проявлялось как при системном, так и при введении в желудочки мозга и под оболочки спинного мозга. Причем, при интратекальном введении он оказывал наибольший эффект, что согласуется с результатами других исследований (Pabbri А., 1981; Prato к., 1987; Welch S., 1988; Gridland R., 1988; Cuidobono P., 1990; Candelettl S., 1990). Анзлгетическия эффект кальцитрина при интратекальном введении, по-видимому, связан с его влиянием на мембранные процессы нейронов. Однако имеются противоположные данные при интратекальном введении пептида генетически родственного каяьпитошту (Welch s., ¡9В9). Выявленная нами высокая степень корреляции н«кду болеутоляющи действием кальцитрия» и его

влиянием на содержание кальция в плазме крови, не является доказательством причинно-следственных отношений между этими эффектами. Учитывая независимость болеутоляющего действия кальцитрина от повышения содержания кальция (при введении лактата кальция), эти два процесса рассматриваются нами в качестве двух независимых, но параллельно развивающихся, что соответствует ранее сформулированным представлениям (Uartin и, 1978). В то же время существует точка зрения, что болеутоляющий эффект кальцитрина связан с возможным повышением уровня эндогинных ошоидов (Mítsuma 3)., 1988).

Способность изоптина уменьшать, а нифедипина полностью устранять аналгетическии эффект кальцитрина свидетельствует об участии медленных потенциал-зависимых и хемочувствительных кальциевых каналов в реализации болеутоляющего дяствия данного гормона. Нами показано, что. кальцитрин дфухфазно влиял на трансмембранныа входящий кальциевый ток и, что изоптин оказывал дозозависимое угнетающее влияние на входящий кальциевый ток при действии кальцитрина.

Можно полагать наличие двух компонентов механизма аналгетического действия - синаптическом (медиаторном) и внесинаптическоы (модуляторном). Синаптическое действие кальцитрина проявляется при его низких концентрациях усилением входящего кальциевого тока, вследствие чего повышается внутриклеточная концентрация ионизированного кальция, способного в качестве вторичного посредника высвобождению медиаторов из нервных терминалей, в частности серотонина (imperato а., 1989). Подтверждением этому может служить снижение кльцитониновой аналгезии после введения, парахлорамфетамина. Внесинаптическое действие кальцитрина проявляется при его высоких концентрациях угнетением входящего кальциевого тока и торможением проведения возбуждения. Существенная роль кальциевых процессов в болеутоляющем действии кальцитрина подтверждается и в опытах с аппликацией кальцитрина на фоне изоггшна, результатом чего явилось угнетение синаптического действия кальцитрина. Резкое снижение кальцигрином постстимульной аналгезии, вызванной электроболевым воздействием, может быть связано с активацией кальциевых каналов и усилением входа Са2+ в клетки поскольку одним из механизмов опиатной аналгезии является снижение

?4-

транспорта Са через мембраны нейронов (Benedek G., 1984; oimishi I., 1 gsa), а активация кальциевых каналов тормозит болеутоляющий аДОокт опиатов (Шегячеп М., 199Ó). Повышение же

аналгезии иммобилизационного стресса связано с резким увеличением эндогенного кальцитонина в ответ на стресс (Мишина

H.Ф., 1981). Наши данные о болеутоляющем действии изоптина согласуется с результатми других иследоватэлей (Сюбаев Р.Д. и др. , 1988; Панов А.В., 1989; Власкавска M.» 1989; Contreras В.,

1988). Нифедипин вызывал гипералгезш в наших опытах,в то же время как другие исследователи отмечали его аналитический эффект (Сюбаев Р.Д. И др., I988;0hnishi 5?.. 1988; Bustamanta D.,

1989). Эти результаты могут объясняться тем, что нами использовался другой вид модели и генеза боли.

Нами установлена важная роль ионов кальция, кальциевых каналов в проявлении болеутоляющего действия ГАМК-производных. Общим в их влиянии на мембранно-ионные процессы явилось угнетающее действие на входящий кальциевый ток, что приводит к уменьшению амплитуда и длительности потенциала действия (Завадская Л.Н., 1984). Антагонисты кальциевых каналов и кальцитрин также подавляли болеутоляющий зффект аналогов ГАМК, что свидетельствует о возможном кальциевом механизме болеутоляющего действия ГАМК-прозводгных (Дмитриев, А.В., 1990).

Несомненно, что нейрофизиологические и ионные механизмы болеутоляющего действия аналогов ГАМК и кальцитрина требуют дальнейшего изучения.^Однако уже полученные нами данные на зтом этапе свидетеьствуют о вовлечении Са2+-мехавизмов. Можно предположить наличие единого механизма внесинаптического действия кальцитрина и аналогов ГАМК. Исключительно важной основой неопиатной аналгезии данными соединениями является сочетанное влияние на синаптическиэ (медиаторные) ' и вяесинаптические (модуляторные) процессы в нервных клетках с вовлечением наряду с неяромедиаторными системами и кальциевых процессов.

ВЫВОДЫ

I. Установлено, что кальцитрин в дозах 1,3,5 ед/100 г массы тела оказывает болеутоляющее действие в тестах отдергивания хвоста и порога вокализации, не зависящее от его гипокальциэмического эффекта. Аналгетический эффект кальцитрина выявлен при внутрижелудочковом (0,015 ед) и интратекзльном (0,015 ед) введении.

2. Пзратгормон не обладает болеутоляющим действием в дозах 1,3,5 ед/100 г при внутрибрюшинном и в дозе 0,1 ед при внутрижсдудочковом введении. При интратекальном введении в дозе

0.1.ед оказывает аналгетическое действие в тестах отдергивания хвоста и порога вокализации.

3. Антагонисты кальциевых каналов - изоптин при внутрибрюшинном введении в дозах 1,5,10 мг/кг, интратекальном и внутрижелудочковом введении в дозе 0,0125 мг, флунаризин (80 мкг) при интратекальном и внутрижелудочковом введении оказывают умеренный аналгетический эффект, нифедапин в дозах 1,5,10 мг/кг при внутрибрюшинном и пероральном введении вызывает гипералгезию, далтиазем • (60 мкг) при интратекальном и внутрижелудочковом введении не обладает болеутоляющим действием в тестах отдергивания хвоста и порога вокализации.

4. Изоптин и нифедапин в дозах 1,5,10 мг/кг устраняют болеутоляющий эффект кальцитрина (3 ед/100) в тестах отдергивания хвоста и порога вокализации.

5. Болеутоляющее действие ЛГПИ-62 и ЛПМ-П5 проявляется в тестах отдергивания хвоста- и порога вокализации при внутрибрюшинном введении в дозах 100 и 200 мг/кг, интратекальном и внутрижелудочковом введении в дозах 0,5-1 мг. Аналгетический эффект аналогов ГАШ снижается под влиянием кальцитрина (3 ед/100 г) и полностью устраняется изоптином и нифедипином (5 мг/кг).

6. Кальцигрин оказывает ' двухфазное действие на входящий кэльциввиа ток на мембране нейрона моллюска, усиливая его при низких концентрациях (10~э-10~"м) и, уменьшая - при высоких (10~8М). ЛПШ-62 И ЛГПИ-П5 в концентрации Ю_3И снижают входящий кальциевый ток.

7. Изоптин в концентрациях Ю"6-10"4М подавляет действие кальцитрина <10~8-10~7М), и ГАМК-производаых (Ю~8-10~4) на входящий кальциевый ток.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Данные о болеутоляющей активности кальцитрина и исследованных производных ГАМК могут быть использованы для дальнейшего целенаправленного изучения этих соединений.

2. Учитывая перспективу клинического применения ЛГПИ-62 и кальцитрина в качестве болеутоляющих средств, рекомендуется завершение в полном обьеме доклинических исследований по данным веществам.

3. Целесообразно продолжить изучение эффектов кальцитрина и ГАМК-производаых в комбинации с антагонистами кальциевых каналов с целью детального изучения механизма их действия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние кальцийрегулирующих гормонов и антагонистов кальция на болевую чувствительность // Фармакодинамика болеутоляющих средств в эксперименте и клинике.-Л., 1991. - С.200-207 (совм. с Дмотриевым A.B., Даринским Ю.А.).

2. Аналгетический эффект и ионные механизмы действия кальцийрегулирующих гормонов и антагонистов кальция // Тез.Всес.конф. с международным участием "Синтез, фармакология и клинические аспекты новых обезболивающих средств". - Новгород, 1991. - С.45-47. (совм. с Вислобоковым А.И., Дмитриевым A.B., Даринским Ю.А.).

3. Болеутоляющее действие кальцийрегулирующих гормонов и антагонистов кальция // Тез.Всерос.конф."Патофизиология и фармакология боли". - Москва, 1993. - С.155 (совм. с Игнатовым Ю.Д.).

РТП РГПУ 3.62 т. 100 8.04.04,