Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение биологически активных веществ отходов спиртового производства

На правах рукописи

КАЙШЕВ АЛЕКСАНДР ШАЛИКОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ОТХОДОВ СПИРТОВОГО ПРОИЗВОДСТВА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

1 7 ОЕЗ 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

4854046

На правах рукописи

КАЙШЕВ АЛЕКСАНДР ШАЛИКОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ОТХОДОВ СПИРТОВОГО ПРОИЗВОДСТВА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Челомбитько Вячеслав Александрович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Компанцев Владислав Алексеевич доктор фармацевтических наук, профессор Бубенчикова Валентина Николаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита диссертации состоится «16» марта 2011 г. в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.069.01 при ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава».

Автореферат разослан «•/<?» января 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время основным источником природных биологически активных веществ (БАВ) является растительное лекарственное сырье. Однако его ресурсы ограничены по ряду причин, главными из которых являются снижение площадей их культивирования и уменьшение объема заготовок дикорастущих растений.

В то же время практически неограниченным источником природных БАВ являются отходы пищевой промышленности. К таким источникам следует отнести послеспиртовую зерновую барду. Это видно из того, что в России ежегодно, по данным статистики, образуется около 10 млн. м3 послеспиртовой барды. Только 10% указанного количества барды используется в качестве кормовой добавки для скота. Несмотря на скудные литературные сведения о химическом составе послеспиртовой барды, следует сказать о возможно богатом составе БАВ барды. Такая предпосылка базируется на том, что барда получается из растительных источников, а именно цельных зерновок злаковых растений. Кроме того, возможно образование новых БАВ в результате ферментативных процессов брожения.

Таким образом, послеспиртовая зерновая барда может быть ценным источником природных биологических веществ.

Однако в таком аспекте послеспиртовая барда до настоящего времени не рассматривалась. Возможной причиной этого является то, что химический состав барды мало изучен, особенно с точки зрения состава БАВ. Проводя аналогию между содержанием БАВ исходного зернового сырья и учитывая возможности его изменения в ходе ферментативного спиртового брожения, следует считать, что в результате глубокого химического исследования можно обосновать использование послеспиртовой зерновой барды в качестве нового источника БАВ и получения лекарственных средств (ЛС) на их основе.

Решение указанного вопроса позволит получить не только новый источник БАВ, но и хотя бы частично решить вопрос утилизации отходов спиртовой технологии.

Поэтому изучение химического состава послеспиртовой зерновой барды, разработка методов получения суммы БАВ из нее и создание лекарственных препаратов на их основе является актуальной проблемой для фармацевтической науки.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось химическое и фармакологическое изучение послеспиртовой зерновой барды, обоснование возможности комплексного использования сырья для получения лекарственных средств антиоксидантного и гастропротекторного действия и разработка нормативной документации на лекарственные средства.

В задачи исследований входило:

^ сравнительный анатомо-диагностический анализ зерновок злаков и остатков зерновок твердой фазы барды;

> исследование физико-химических характеристик и химического состава жидкой и твердой фаз барды, обоснование норм ее качества;

> оптимизация выделения суммы БАВ: Биобардина БМ («белково-минерального») - из жидкой фазы барды, Биобардина УЛ («углеводно-липидного») - из твердой фазы барды;

> определение химического состава Биобардина БМ и Биобардина УЛ;

> сравнительное исследование токсичности, гастропротекторной и анти-оксидантной активности Биобардина БМ и Биобардина УЛ;

> обоснование норм качества субстанций и таблеток Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

Научная новизна работы. Изучен химический состав пшеничной, кукурузной, ячменной, просяной барды и доказана возможность выделения суммы БАВ из жидкой и твердой фаз барды.

Установлена взаимосвязь между составом БАВ в зерне и в послеспиртовой зерновой барде.

В результате сравнительного анатомо-диагностического изучения зерновок злаков и остатков зерновок твердой фазы барды установлено, что диагно-

стическим признаком зерновок пшеничной, кукурузной, ячменной, просяной барды являются крахмальные зерна.

Методами хроматографии (гель-хроматография, ВЭЖХ, ГЖХ, ТСХ), спектрофотометрии, поляриметрии, титриметрии, гравиметрии доказан химический состав жидкой и твердой фаз пшеничной, кукурузной, ячменной, просяной барды. Показано, что в составе жидкой фазы барды содержатся: белки (главным образом среднемолекулярные и нерастворимые в растворах солей), 14 аминокислот (с преобладанием глутаминовой кислоты), из которых 8 являются незаменимыми, биогенные элементы, восстанавливающие сахара, аскорбиновая кислота, а в твердой фазе барды - олигогапактурониды, жирное масло (с накоплением незаменимых жирных кислот), флавоноиды, токоферолы.

Установлена возможность получения суммы БАВ (белков, аминокислот, биогенных элементов, восстанавливающих Сахаров, аскорбиновой кислоты) под названием «Биобардин БМ» из жидкой фазы барды путем ее мембранной фильтрации и обработки охлажденным ацетоном в соотношении 1:3. Показана возможность выделения суммы БАВ (олигогалактуронидов, жирного масла, флавоноидов, токоферолов), названной «Биобардин УЛ», из твердой фазы барды путем экстракции 1% раствором оксалата аммония и обработки извлечения охлажденным спиртом 96% в соотношении 1:2. Выведены уравнения регрессии, адекватно отражающие выход Биобардинов в зависимости от технологических условий.

При изучении химического состава суммы БАВ, выделенных из жидкой и твердой фаз барды, показано преобладание в составе Биобардина БМ белков (среднемолекулярных и нерастворимых в растворах солей); наличие 15 аминокислот (с накоплением глутаминовой кислоты), из которых 9 являются незаменимыми; элементов; аскорбиновой кислоты; восстанавливающих Сахаров. Установлено преимущественное содержание в Биобардине УЛ олигогалактуронидов; жирного масла с накоплением ненасыщенных высших жирных кислот, в т.ч. незаменимых; флавоноидов, токоферолов, каротиноидов.

В опытах на мышах установлено, что Биобардин БМ и Биобардин УЛ носятся к практически нетоксичным веществам.

Доказана выраженная антиоксидантная активность Биобардина УЛ, п вышающая активность веществ сравнения: силибора на 8,3%, свекловично пектина на 30,1%; установлен антирадикальный механизм действия Биобарди УЛ и отсутствие под его влиянием жировой дистрофии печени крыс с модел ным токсическим гепатитом.

Установлено выраженное гастропротекторное действие Биобардина Б проявившееся в уменьшении числа язвенно-геморрагических поражений слиз стой оболочки, стимуляции секреторной и протеолитической функций желуд крыс.

Результаты изучения химического состава и биологических свойств в деленных БАВ явились основанием для разработки ЛС антиоксидантного (Би бардин УЛ таблетки) и гастропротекторного (Биобардин БМ таблетки) дейс вия. Обоснованы методы, показатели и нормы качества субстанций и таблет Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

Новизна исследований подтверждена 4 патентами РФ на изобретения.

Практическая значимость результатов исследования. Пересмотрен ТУ «Барда зерновая», регламентирующее качество барды как сырья для пол чения ЛС.

Предложен способ комплексной переработки жидкой и твердой фаз бард для получения суммы БАВ: соответственно Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

На основании выявленной способности Биобардина БМ уменьшать ст пень язвенно-геморрагических поражений слизистой оболочки желудка, стиму лировать секреторную и протеолитическую функции желудка, разработано Л гастропротекторного действия «Биобардин БМ таблетки».

В результате установленной способности Биобардина УЛ ингибироват процессы свободнорадикапьного пероксидного окисления липидов (ПОЛ) раз работано ЛС антиоксидантного действия «Биобардин УЛ таблетки».

Материалы внедрения

1. Проект ТУ «Барда зерновая послеспиртовая», пояснительная записка к нему. Справка о передаче проекта ТУ и акт о внедрении методик для стандартизации барды получены от ООО «Казачье» (Минераловодский район Ставропольского края).

2. Проекты ФСП «Биобардин БМ» и «Биобардин БМ таблетки», пояснительные записки к ним. Акты об апробации методик показателей качества субстанции и таблеток Биобардина БМ получены от ООО Научно-производственной фирмы «Пекто» (г. Нальчик).

3. Проекты ФСП «Биобардин УЛ» и «Биобардин УЛ таблетки», пояснительные записки к ним. Акты об апробации методик показателей качества субстанции и таблеток Биобардина УЛ получены от ООО Научно-производственной фирмы «Пекто» (г. Нальчик).

Положения, выдвигаемые на защиту:

- теоретическое и экспериментальное обоснование использования по-слеспиртовой зерновой барды (пшеничной, кукурузной, ячменной, просяной) для выделения суммы БАВ с целью разработки на их основе ЛС;

- результаты изучения анатомо-диагностических признаков, физико-химических свойств и химического состава барды, обоснование норм качества;

- данные по исследованию физико-химических характеристик и химического состава выделенных из барды БАВ - субстанций Биобардина БМ и Биобардина УЛ;

- результаты изучения безопасности, антиоксидантной и гастропротек-торной активности Биобардина БМ и Биобардина УЛ;

- обоснование норм качества субстанций и таблеток Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

Апробацпя работы. Фрагменты работы доложены и обсуждены на международных научных конференциях (Краснодар, 2005; Тверь, 2007); Всероссийской конференции (Москва, 2008); научно-практической конференции молодых ученых (Анапа, 2006) и 3 региональных научных конференциях по проблемам фармации, фармакологии и подготовки кадров (Пятигорск, 2008-2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, том числе 4 патента РФ на изобретения и 4 статьи в журналах, рекомендова ных ВАК.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических нау

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научн исследовательских работ ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевт ческая академия Росздрава» (номер государственной регистрации 01200108441).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена н 187 страницах, состоит из введения, пяти глав, общих выводов, списка литер туры. Работа иллюстрирована 29 рисунками и 58 таблицами. Библиографи включает 159 наименований, из которых 26 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Из различных отходов спиртового производства (барда, лютерная вода, газ брожения, сивушные масла, концентрат головных примесей) барда составляет 80 85 объем. %, поэтому она является основным отходом спиртового производства.

Объекты и методы исследования Объектами исследования явились жидкая и твердая фазы пшеничной, ку курузной, ячменной, просяной барды (ТУ 9296-248-00008064-98) производств спиртовых заводов: «Казачье» Минераловодского района и «Суворовский) Предгорного района Ставропольского края. Выбор растительных источнико обусловлен распространенностью их применения в спиртовом производстве, выбор заводов - использованием традиционной спиртовой технологии, осно ванной на обработке зерна ферментными препаратами а-амилазы и глюкоами лазы при повышенном давлении, и характерным для большинства заводов объ емом производства барды (270-400 м3 в сутки). Барда представляет собой по лидисперсную систему, в которой вещества находятся в растворенном и взве шенном состоянии (просматриваются измельченные зерновки), желто коричневого цвета со специфическим запахом, свойственным дрожжам.

Объектами исследования также явились цельные зерновки пшеницы обыкновенной (Triticum aestivum Lam.), кукурузы обыкновенной (Zea mays L.), ячменя обыкновенного (Hordeum vulgare L.), проса посевного (Panicum

miliaceum L.). Пробы для исследования хранили в лаборатории в соответствии с требованиями ГОСТ 17768-90.

Для установления морфолого-анатомических признаков сырья использовали общепринятые методики, описанные в ГФ XI и ГФ XII изданий.

Для получения извлечений, содержащих различные группы БАВ, использовали воду очищенную (ФС 42-2619-97), спирт этиловый различной концентрации (ГОСТ 18300-82), хлороформ (ГОСТ 20015-88), ацетон (ТУ 6-09-351382). Для обнаружения, разделения, идентификации, выделения и количественного определения БАВ в барде и Биобардинах использовали качественные реакции, спектральные, хроматографические, потенциометрические, поляриметрические, титриметрические, гравиметрические и др. методы анализа.

Состав белков по молекулярной массе и растворимости в воде и растворах солей определяли методом гель-хроматографии в лаборатории хроматогра-фических методов анализа ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии (г. Москва).

Анализ аминокислот методом ВЭЖХ проводили на аминокислотном анализаторе «Amino Acid Analyzer Т 339 М» в лаборатории патологии обмена веществ ГНИУ животноводства и кормопроизводства (г. Ставрополь).

Содержание углерода, азота, водорода в органических веществах барды определяли на элементном анализаторе (НИИФОХ РГУ, г. Ростов-на-Дону). Элементный состав барды и Биобардинов изучали методом эмиссионного спектрографического анализа (метод испарения из кратера угольного электрода) (филиал ФГУ «Пятигорский центр стандартизации, метрологии и сертификации», г. Ессентуки).

Испытание микробиологической чистоты барды и Биобардинов проводили в соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота» ГФ XII издания.

Оценку фармакологической активности Биобардинов, выделенных из пшеничной барды, проводили согласно методическим указаниям Фармакологического Комитета МЗ РФ на кафедрах биохимии и микробиологии, фармакологии, физиологии Пятигорской государственной фармацевтической академии. Острую токсичность определяли по методу Кербера в опытах на мышах, гепа-тотоксичность - на модели «пентабарбитапового сна» в опытах на крысах.

Влияние Биобардинов на состояние слизистой оболочки, секреторной и протеолитической функций желудка у крыс изучали на модели «острой язвы», вызванной введением преднизолона.

Антиоксидантное действие Биобардинов изучали на моделях: «ПОЛ олеиновой кислоты, входящей в состав твина-80», «ПОЛ яичного желтка», токсического гепатита у крыс, вызванного введением тетрахлорметана. Кроме того, антиоксидантную активность определяли методом катодной вольтамперо-метрии на полярографе ПУ-1 и компьютеризованном вольтамперометрическом анализаторе ТА-2 в отделе технохимического контроля и арбитражных методов анализа ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии (г. Москва).

Морфолого-анатомический анализ составных частей барды Морфологический и анатомо-диагностический анализ позволил установить, что, если для зерновок злаков характерен «набор» диагностических признаков (форма и вид зерновок, проницаемость эндосперма, слоистость алейронового слоя, крахмальные зерна, их связь с белковой матрицей), то для остатков зерновок твердой фазы барды-только крахмальные зерна (форма, относительные размеры, положение центра нарастания, слоистость) (рисунок 1). Кроме того, в пшеничной барде обнаружены волоски, в кукурузной барде - капли жирного масла.

щщг^

мнш^ 1 п

О

° а б"

Рисунок 1 - Результаты анатомо-диагностического анализа зерновок злаков (а) и остатков зерновок твердой фазы барды (б): 1 - пшеница обыкновенная, 2 -кукуруза обыкновенная, 3 - ячмень обыкновенный, 4 - просо посевное

Таким образом, в зависимости от растительного источника барду можно идентифицировать по крахмальным зернам. Их наличие, хотя и немногочисленное, свидетельствует о неполном извлечении крахмала при производстве спирта.

Изучение физико-химических характеристик и химического состава барды Для анализируемых видов барды определены физико-химические характеристики, по которым можно сделать заключение о кислом характере среды (рН 3,74-4,35), невысоком содержании сухих веществ (4,6-6,9%) и золы (1,351,80%), практическом отсутствии спирта (0,004-0,013%). В жидкой и твердой фазах барды найдены органические вещества, содержащие соответственно углерод (3,2-3,9%, 41,6-50,7%), азот (0,12-0,15%, 3,1-6,2%), водород (0,55-0,66%, 6,3-7,6%). Примечательно накопление в барде биогенных элементов (фосфора, калия, магния, кальция, натрия, железа, цинка, марганца) и низкое содержание тяжелых металлов (0,0038-0,0048%).

Качественный и количественный состав БАВ исследуемых видов барды представлен в таблице 1.

Как следует из таблицы 1, содержание белков и аминокислот в жидкой фазе барды, в зависимости от растительного источника, составляет 20,4-^46,4%, в твердой фазе - 2,1^-2,5%, достигая наибольшего значения для пшеничной барды. Различия в содержании белков и аминокислот объясняются тем, что методом Кьельдаля определяется общая сумма азотсодержащих соединений, методом СФ - сумма аминокислот, методом ВЭЖХ - сумма аминокислот, стандартные образцы которых были в наличии. Из 14 обнаруженных аминокислот доминирует глутаминовая кислота (2,9-И 1,7%). Выявлено 8 незаменимых аминокислот: треонин, валин, лейцин, гистидин, фенилапанин, лизин, аргинин, изолейцин, составляющих в сумме 44% всех аминокислот.

Установлена неоднородность белковых фракций по молекулярной массе и растворимости в воде и растворах солей: в пшеничной, кукурузной и просяной барде преобладают нерастворимые белки (преимущественно проламины) со средней молекулярной массой (10000-500000), в ячменной барде - нерастворимые белки (глютелины и проламины) с высокой молекулярной массой (>500000).

Таблица 1 - Результаты изучения химического состава барды

Показатели Пшеничная барда Кукурузная барда Ячменная барда Просяная барда

Белки и аминокислоты, %:

- метод Къельдаля (по общему азоту) 46,4±2,3Ж; 2,5±0,Г 36,0±1,8Ж; 2,5±0,1т 27,5±1,3Ж; 2,2±0,Г 39,1±1,9Ж;2,1±0,Г

- СФ по реакции с нингидрином 35,7±1,7Ж 28,8±1,4Ж 21,7± 1,1ж 32,6±1,6Ж

- ВЭЖХ 30,9±1,5Ж 28,9±1,5Ж 20,4±1,0Ж 32,4±1,6Ж

в т.ч. незаменимые аминокислоты 12,4±0,4Ж 14,2±0,4Ж 10,1±0,3Ж 13,2±0,4Ж

Высоко-, средне- и низкомолекулярные белки (гель-хроматография), % 17,2:67,7:15,1 25,0:59,1:15,9 57,9:31,6:10,5 34,1:47,7:18,2

Альбумины, глобулины, проламины, глютелины (гель-хроматография), % 16,7:7,4:40,7:29,6 15,7:6,5:40,7:30,6 13,2:5,1:35,5:39,3 15,9:8,5:38,8:29,7

Восстанавливающие сахара (СФ по реакции с кислотой пикриновой), %* 16,6±0,8Ж; 1,9±0,10т 17,5±0,8Ж; 2,1±0,10т 13,1±0,6Ж; 1,6±0,07т 15,4±0,7Ж; 2,0±0,10т

Оптически активные углеводы (по-ляриметрия), %* 4,3±0,2Ж; 1,1±0,06т 5,5±0,2Ж; 1,3±0,077 3,9±0,2Ж; 0,8±0,04т 5,1±0,2Ж; 1,2±0,06т

Пентозы (гравиметрия), %* 3,5±0,2Ж; 0,42±0,02т 4,6±0,2Ж; 0,50±0,03т 4,2±0,2Ж; 0,49±0,03т 4,5±0,2Ж;0,61±0,03Т

Пентозаны (гравиметрия), %* 3,1 ±0,2*; 0,35±0,02т 4,1±0ДЖ; 0,44±0,02т 3,7±0,2Ж; 0,44±0,02т 4,0±0,2Ж; 0,54±0,02т

Урониды, %:

- СФ по реакции с карбазолом 1,1±0,06ж; 4,7±0,2Т 0,8±0,06ж; 4,3±0,2Т 0,9±0,06ж; 4,2±0,2Т 1,1±0,06ж; 4,5±0,2Т

- гравиметрия 1,4±0,07ж; 5,3±0,2Т 1,3±0,07ж; 5,1±0,2Т 1,1±0,06ж; 3,4±0,2Т 1,3±0,07ж; 4,9±0,2Т

Целлюлоза (гравиметрия), % 0,7±0,03т 0,5±0,02т 0,7±0,03т 0,9±0,04т

Жирное масло (гравиметрия), % 8,4±0,4 11,1 ±0,5 8,4±0,4 10,4±0,5

Аскорбиновая кислота (титримет-рия), мг % 6,2±0,3 11,4±0,5 - -

Токоферолы (УФ СФ), мг % 3,4±0,2 7,7±0,4 4,4±0,2 -

Флавоноиды (СФ по реакции с алюминия хлоридом), % 0,89±0,04 0,41 ±0,02 0,78±0,04 0,35±0,02

Примечание: «ж» - в жидкой фазе; «т» - в твердой ( эазе; «*» - данные относятся к барде Минераловодского заво-

да; для барды Суворовского завода они в 2,9 раз ниже.

Изучение углеводного состава барды с помощью качественных реакций с йодом, реактивом Фелинга, пикриновой кислотой, карбазолом и метода ТСХ в системе растворителей: этилацетат - спирт изопропиловый - вода (5:3,2:1,6) позволило установить наличие мальтозы, глюкозы, арабинозы, галактуроновой кислоты и отсутствие крахмала, декстринов. Поскольку крахмал связан с белковой матрицей, то расхождения в результатах его обнаружения гистохимической и химической реакциями объяснимы: для гистохимической реакции не требуется экстрагирования крахмала, а для химической реакции извлечение необходимо, но, видимо, оно не происходит.

Установлено, что содержание восстанавливающих Сахаров, в т.ч. оптически активных углеводов, пентоз и пентозанов, в жидкой фазе барды в 7 раз больше, чем в твердой фазе. При норме содержания восстанавливающих Сахаров в барде не более 0,4-0,5%, в соответствии с производственно-технологическими регламентами, можно сделать заключение о неполном протекании спиртового брожения и возможном окислении некоторых углеводов как одной из причин порчи барды при хранении. В пользу последнего свидетельствует факт более быстрой порчи Минераловодской барды, в 2,9 раз больше содержащей перечисленные углеводы. Большее в 4,4 раз накопление в твердой фазе барды по сравнению с жидкой фазой галактуронидов можно объяснить преимущественной локализацией их в клеточных стенках.

Из барды выделено жирное масло, наибольший выход которого отмечен для кукурузной барды. Масла представляют собой прозрачные, вязкие жидкости желто-коричневого цвета со специфическим запахом. Они являются полувысыхающими, поскольку на воздухе в тонком слое медленно густеют, не образуя плотной пленки.

Методом ГЖХ установлено, что жирными кислотами, содержащимися в маслах всех анализируемых видов барды, являются: миристиновая, пентадека-новая, стеариновая и линолевая кислоты. Примечательно высокое содержание незаменимых жирных кислот («витамин Б»): линолевой (35,7-45,9%) и линоле-новой (1,9-3,9%), особенно в масле из пшеничной барды. Характерно накопление пальмитиновой (18,8-27,0%) и олеиновой (14,1-19,9%) кислот в маслах из пшеничной и кукурузной барды.

Используя литературные данные о наличии в зерновках злаков витаминов с антиоксидантными свойствами (аскорбиновая кислота, токоферолы, кароти-ноиды), несомненный интерес представило изучение их сохранности в барде. Методом ТСХ в системе растворителей: этилацетат - ледяная уксусная кислота (4:1) установлено наличие в пшеничной и кукурузной барде аскорбиновой кислоты с относительно высоким содержанием, определенным титрованием 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия. В небольших концентрациях во всех анализируемых видах барды, кроме просяной, обнаружены токоферолы. Кароти-ноиды в кукурузной барде выявлены методом ТСХ в системе растворителей: хлороформ - спирт этиловый (19:1) только в виде «следов».

С помощью цианидиновой пробы, реакции с алюминия хлоридом и метода ТСХ в системе растворителей пропиловый спирт - аммиак конц. (2:1) в барде обнаружены флавонолы (кверцетин, рутин), флавоны (трицин, лютеолин), флавонгликозид (витексин). Относительно высоким содержанием флавоноидов отличаются пшеничная и ячменная барда.

Таким образом, в результате анализа химического состава различных видов барды раздельно по фазам можно отметить накопление в жидкой фазе: белков, аминокислот (в т.ч. незаменимых), восстанавливающих Сахаров, биогенных элементов, аскорбиновой кислоты; в твердой фазе - галактуронидов, высших жирных кислот (в т.ч. незаменимых), флавоноидов, токоферолов. Это создает перспективы для выделения суммы БАВ из каждой фазы.

Выделение из барды БАВ и изучение их химического состава

С целью обеспечения максимального выхода БАВ из обеих фаз различных видов барды, предложена схема комплексной переработки, предусматривающая разделение фаз центрифугированием. Путем мембранной фильтрации жидкой фазы, ее обработки охлажденным ацетоном в соотношении 1:3 выделена белково-минеральная (БМ) фракция «Биобардин БМ» с выходом 2,2-3,6% к фазе. Из твердой фазы с помощью 1% раствора оксалата аммония получено извлечение, из которого после обработки охлажденным спиртом этиловым 96% в соотношении 1:2 выделена углеводно-липидная (УЛ) фракция «Биобардин УЛ» с выходом 7,1-13,0% к фазе. Суммарный выход обеих фракций (4,2-6,2% к барде) свидетельствует о практически полном извлечении БАВ из барды. Установлено, что в отходах барды, полученных при этом, отсутствуют белки, аминокислоты, восстанавливающие сахара, галактурониды.

На основании статистической обработки экспериментальных данных по выделению целевых продуктов получены уравнения регрессии (1) и (2), адекватно описывающие зависимость технологических выходов Биобардина БМ (уь %) и Биобардина УЛ (у2, %) от соотношения концентрата и осадителя (х,), концентрации экстрагента (х2, %), продолжительности экстракции (Хз, час):

у, =-0,325 х2, - 0,43 х, + 3,48 (1)

у2 = 1,8 х2, + 2,786 х23 - 0,2 х22 + 0,6хгх3 + 0,44х,"х2 + 0,2х2-х3 (2) Адекватность зависимости параметров в уравнении (1) установлена с помощью нулевой гипотезы по коэффициенту общей корреляции (0,80), в уравнении (2) - по коэффициенту частной корреляции (0,89).

По внешнему виду Биобардин БМ представляет собой вязкую массу желто-коричневого цвета с запахом барды, легко растворимую в воде с образованием большого объема пены; Биобардин УЛ - аморфный порошок светло-бежевого цвета, легко растворимый в воде с образованием пены. Растворимость в воде Биобардина УЛ, содержащего в числе других липидные компоненты, объясняется тем, что указанные липиды связаны с гидрофильными остатками (углеводы, фосфаты, белки, фенольные соединения). Подобные связанные липиды в неполярных растворителях не растворяются (не экстрагируются), разрушение большинства связей в них возможно лишь при помощи сильнополярных растворителей (или неполярных растворителей, но только после кислотного гидролиза).

Установлены физико-химические характеристики Биобардинов БМ и УЛ соответственно: потеря в массе при высушивании (%)- 13,6-14,0; 12,0-12,7; рН (0,5% раствор) - 4,65-4,90; 4,00-4,20; характеристическая вязкость (1,0% раствор) (10"2 м3/кг) - 17,3-20,6; 2,1-2,6; общая зола (%) - 3,0-3,4; 1,5-2,0; сульфатная зола (10"2 %) - 5,0-8,0. Таким образом, по сравнению с Биобардином УЛ, Биобардин БМ отличается менее кислым характером среды, большей в 8 раз вязкостью, большим в 2 раза содержанием золы, а также более активным накоплением биогенных элементов: фосфора, калия, магния, кальция, натрия, железа, цинка, марганца. Оба Биобардина характеризуются низким содержанием тяжелых металлов. Химический состав Биобардинов приведен в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты изучения химического состава Биобардинов

Показатели Биобардин БМ из барды: Биобардин УЛ из барды:

пшеничной кукурузной ячменной просяной пшеничной кукурузной ячменной просяной

Белки и аминокислоты, %:

- СФ по реакции с нингидрином 53,0±2,6 69,0±3,4 45,0±2,3 49,0±2,4 21,0±1,1 12,0±0,6 13,0±0,6 18,0±0,8

-ВЭЖХ 45,8±2,2 66,9±3,3 41,0±2,0 45,2±2,2 18,0±0,9 11,1±0,5 11,8±0,5 16,0±0,8

в т.ч. незаменимые аминокислоты 8,4±0,4 18,2±0,9 7,5±0,4 8,6±0,4 4,2±0,2 1,9±0,1 2,7±0,2 4,0±0,2

Высоко-, средне- и низкомолекулярные белки (гель-хроматография), % 12,6:70,1: 17,3 19,8:63,4: 16,8 53,0:34,5: 12,5 31,2:49,1: 19,7

Альбумины, глобулины, прола-мины, глютелины (гель-хроматография), % 22,4:1,2: 45,6:30,1 13,5:11,2: 42,1:32,3 12,2:6,5: 38,8:41,4 13,7:15,6: 40,9:28,6

Восстанавливающие сахара (СФ по реакции с карбазолом), %* 15,6±0,7 11,3±0,6 9,4±0,5 15,2±0,7

Оптически активные углеводы (поляриметрия), %* 6,7±0,3 4,2±0,2 3,4±0,2 6,7±0,3

Пентозы (гравиметрия), %* 4,3±0,2 3,1 ±0,2 2,4±0,1 4,1 ±0,2

Пентозаны (гравиметрия), %* 3,8±0,2 2,7±0,1 2,1±0,1 3,6±0,2

Урониды, %:

- СФ по реакции с карбазолом - - - - 18,2±0,9 16,7±0,8 16,4±0,8 17,5±0,8

- гравиметрия - - - - 19,5±1,0 17,9±0,9 17,5±0,8 18,7±0,9

Жирное масло (гравиметрия), % 0,2±0,01 0,3±0,01 0,2±0,01 0,2±0,01 3,2±0,1 4,9±0,2 4,1±0,2 3,4±0,1

Аскорбиновая кислота (титри-метрия), мг % 17,4±0,9 36,8±1,7 - - - - - -

Токоферолы (УФ СФ), мг % - - - - 6,6±0,3 10,2±0,5 8,3±0,4 -

Каротиноиды (СФ по реакции с дихроматом калия), мг % - - - - 0,1 ±0,01 0,2±0,01 - -

Флавоноиды (СФ по реакции с алюминия хлоридом), % 0,7±0,03 0,2±0,01 0,5±0,03 0,5±0,02 1,5±0,08 0,6±0,03 1,3±0,06 1,0±0,05

Примечание: «*» - данные относятся к Биобардину БМ, полученного из барды Суворовского завода

16

полученному из барды Минераповодского завода; для они в 3,3 раз ниже.

Сравнивая Биобардины БМ и УЛ, можно отметить, что Биобардин БМ отличается большим в 3,4 раза содержанием белков и аминокислот, достигая максимального значения при выделении из кукурузной барды. Более половины белков являются среднемолекулярными, 75% белков нерастворимы в растворах солей (превалируют проламины). Из 15-ти обнаруженных аминокислот наиболее высокое содержание имеет глутаминовая кислота: 26,3-31,9% в Биобардине БМ, 7,2-11,3% - в Биобардине УЛ. 21-22% всех аминокислот составляют незаменимые аминокислоты: гистидин, фенилаланин, треонин, аргинин, валин, ме-тионин, лизин, лейцин, изолейцин, первые три из которых преобладают в Биобардине БМ, лизин - в Биобардине УЛ.

Наблюдаются различия и по углеводному составу Биобардинов: накопление восстанавливающих Сахаров, в т.ч. арабинозы, мальтозы, глюкозы в Биобардине БМ, галактуроновой кислоты - в Биобардине УЛ. Из пентоз обнаружена только арабиноза, составляющая 27% восстанавливающих Сахаров, остальное приходится на глюкозу, мальтозу.

Установлено накопление в Биобардине УЛ галактуронидов (16,4-19,5%), для которых (после удаления белков и аминокислот с помощью трихлоруксус-ной кислоты) установлены физико-химические характеристики: кислый характер среды (рН 4,15-4,25), низкая средняя молярная масса (1360-1840 г/моль) и степень полимеризации (8-11), выраженная сорбционная способность (272-295 мг РЬ2+/г), на 30% превосходящая действие свекловичного пектина.

По содержанию жирного масла интерес представляет Биобардин УЛ, особенно выделенный из кукурузной и ячменной барды. Масло богато незаменимыми высшими жирными кислотами: линолевой (42,4-49,4%) и линоленовой (1,8-4,0%), и, кроме того, олеиновой (9,4-30,7%) и пальмитиновой (12,0-20,2%) кислотами.

Несомненную ценность Биобардина БМ представляет наличие аскорбиновой кислоты, Биобардина УЛ - наличие токоферолов.

Из флавоноидов обнаружены: рутин (Биобардин БМ из всех источников), витексин (Биобардин БМ из кукурузной барды), трицин, кверцетин (Биобардин

УЛ из пшеничной, кукурузной, ячменной барды), лютеолин (Биобардин УЛ н кукурузной и просяной барды). Наблюдаемые различия связаны с накопление!* в Биобардине БМ гликозидов флавоноидов, в Биобардине УЛ - агликонов фла воноидов. Найдено более высокое в 2,4 раз содержание флавоноидов в Биобар дине УЛ.

Таким образом, сравнительный химический анализ Биобардинов показш преимущественное накопление в Биобардине БМ - биогенных элементов, бел ков, аминокислот (в т.ч. незаменимых), восстанавливающих Сахаров, аскорби новой кислоты; в Биобардине УЛ - олигогалактуронидов, высших жирных ки слот (в т.ч. незаменимых), флавоноидов, токоферолов. Наиболее ценным ис точником Биобардина БМ по содержанию белков и аминокислот, аскорбиново1 кислоты является кукурузная барда, восстанавливающих Сахаров - пшенична) и просяная барда. Из источников выделения Биобардина УЛ по содержанш уронидов и флавоноидов более интересной представляется пшеничная барда жирных кислот и токоферолов - кукурузная барда.

Изучение биологической активности Биобардинов

В связи с более частым использованием в спиртовом производстве пше ницы, объектами биологического исследования служили Биобардины, выде ленные из пшеничной барды.

При изучении острой токсичности Биобардинов БМ и УЛ установлен Ь050>5000 мг/кг, что, согласно классификации, позволило отнести их к практически нетоксичным веществам.

Введение крысам пентабарбитапа натрия после приема Биобардинов БМ и УЛ вызвало снижение продолжительности сна по сравнению с контролем (Р<0,01) на 36% и 46% соответственно, что свидетельствует об отсутствии ге-патотоксичности испытуемых препаратов.

Гастропротекторное действие Биобардинов оценивали по их влиянию на состояние слизистой оболочки, секреторной и протеолитической функций желудка у крыс на модели острой язвы, вызванной пероральным ведением преднизолона (20 мг/кг) (таблица 3).

Таблица 3 - Результаты изучения гастропротекторной активности Био-бардинов БМ и УЛ

Показатели Группы животных с язвой желудка, получавшие:

физраствор (контроль) Биобардин БМ Биобардин УЛ

Число поражений слизистой оболочки желудка на 1 крысу:

- язвы 2,8±0,5 0,6±0,2* 0,8±0,1 *

- эрозии 6,7±0,8 1,3±0,3* 2,5±0,2*

- мелкие кровоизлияния 6,2±0,5 4,0±0,4* 4,8±0,2*

- массовые кровоизлияния 2,7±0,3 1,2±0,1* 1,3±0,4*

Концентрация соляной кислоты в желудке, моль/л:

- свободной 0,40±0,02 1,03±0,05* 0,95±0,05*

- общей 3,03±0,16 7,85±0,41* 7,34±0,37*

- связанной с белками 2,63±0,14 6,82±0,35* 6,39±0,32*

Общая кислотность, моль/л 3,60±0,18 9,42±0,46* 8,81±0,45*

Концентрация белков, г/л 52,50±2,74 84,45±4,01* 72,42±3,52*

Примечание: «*» - достоверность различий по отношению к контролю <0,05.

По сравнению с контролем, оба Биобардина снижали число язвенно-геморрагических поражений слизистой оболочки желудка: язв - на 71-79%, эрозий - на 63-81%, массовых кровоизлияний - на 52-56%, мелких кровоизлияний - на 23-36%, а также увеличивали в 2,4-2,6 раз содержание соляной кислоты и общую кислотность, в 1,4-1,6 раз - концентрацию белков. Достоверные различия между Биобардинами наблюдались по уменьшению числа эрозий (Биобардин БМ на 48% активнее) и увеличению содержания белков (Биобардин БМ на 17% более эффективен).

Антиоксидантное действие Биобардинов исследовали на различных моделях (таблица 4). На модельной реакции электровосстановления кислорода установлена антиоксидантная активность обоих Биобардинов: по кинетическому критерию (количеству кислородных радикалов, прореагировавших за 1 мин с 1 мкмоль вещества в пересчете на кверцетин) Биобардин УЛ эффективнее Биобардина БМ на 30,0%. При увеличении концентрации Биобардинов и продолжительности взаимодействия наблюдалось уменьшение силы тока и смещение потенциала в положительную область, что, согласно Е.И. Коротковой, свидетельствует о взаимодействии по антирадикальному механизму.

Таблица 4 - Результаты изучения антиоксидантной активности Биобардино!

Модель Метод и определяемый показатель Контроль Вещество сравнения Биобардин БМ Биобардин УЛ

Электровосстановление кислорода Катодная вольт- амперометрия, кинетический критерий, мкмоль/л-мин Фоновый элекТролит - 0,35±0,03 0,50±0,05

ПОЛ олеиновой кислоты Фотометрия, показатель экс-тинкции Смесь без образцов 0,25±0,012 0,12±0,007 0,09±0,004

ПОЛ яичного желтка Хемилюминес-ценция, интенсивность свечения, мВ Смесь без образцов 0,532±0,085 Свекловичный пектин 0,256±0,019 0,224±0,011 0,179±0,014

Токсический гепатит у крыс Концентрация ТБК-активных продуктов в сыворотке крови, мкмоль/л Крысы, получавшие физраствор 6,31±0,22 Силибор 4,93±0,13 5,12±0,20 4,52±0,12

На моделях аскорбатзависимого ПОЛ олеиновой кислоты, ПОЛ яичног желтка, гепатита у крыс подтверждена более выраженная антиоксидантная а тивность Биобардина УЛ в сопоставлении не только с Биобардином Б (Р<0,05) (на 25,0%, 20,1%, 11,7% соответственно), но и с веществами сравнени (Р<0,05) (на 30,1% со свекловичным пектином, на 8,3% с силибором). Анали гистологических препаратов печени крыс с применением морфометрическог подсчета свидетельствовал об отсутствии крупнокапельного жирового гепатоз явлений жировой дистрофии, резком снижении числа дистрофированных кле ток на единицу площади среза под влиянием Биобардина УЛ.

Таким образом, проведенные испытания свидетельствуют о практическо! нетоксичности, гастропротекторном действии Биобардинов, особенно Биобар дина БМ, и антиоксидантной активности Биобардина УЛ.

Получение и стандартизация ЛС на основе Биобардинов Поскольку действующие ТУ 9296-248-00008064-98 «Барда зерновая» регла ментируют качество барды только по органолептическим и общим физико химическим показателям, предусматривая использование ее в животноводстве, нам! пересмотрены ТУ с целью применения пшеничной, кукурузной, ячменной, просяно барды (примерно равноценных по химическому составу) как сырья для производстве ЛС. При пересмотре ТУ дополнительно включены показатели: подлинность и коли чественное содержание белков и аминокислот, уронидов, флавоноидов, соблюдени которых обеспечит специфическое биологическое действие производимых ЛС.

Путем комплексной переработки жидкой и твердой фаз барды предложен способ получения Биобардинов БМ и УЛ. На основе Биобардина БМ разработаны таблетки состава: Биобардин БМ, лактоза, полиплаздоне, вода (1:1,2:1,2:1); Биобардина УЛ -таблетки состава: Биобардин УЛ, 10% спиртовой раствор калидона-25, 0,9% раствор стеарата кальция (1:2,5:15). Выбор состава таблеток обусловлен физическими свойствами субстанций и фармакологически активными дозировками известных аналогов.

В разработанные проекты ФСП «Биобардин БМ», «Биобардин БМ таблетки» в качестве основных показателей качества, обусловливающих гастро-протекторное действие лекарственного препарата, включены подлинность и количественное содержание белков и аминокислот. В проектах ФСП «Биобардин УЛ», «Биобардин УЛ таблетки» как показатели качества, обеспечивающие антиоксидантное действие лекарственного препарата, включены: подлинность и количественное содержание уронидов, флавоноидов.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Химическими, физико-химическими и биологическими методами доказано содержание в барде БАВ с выраженной фармакологической активностью, что перспективно для применения барды в качестве сырьевого источника ЛС.

2. Сравнительный морфологический и анатомо-диагностический анализ зерновок злаков и остатков зерновок барды позволил установить для каждого вида барды в качестве диагностического признака крахмальные зерна.

3. Установлен состав БАВ пшеничной, кукурузной, ячменной, просяной барды. Жидкая фаза барды содержит: белки и аминокислоты (20-46%); восстанавливающие сахара (5,6-17,5%); галактурониды (0,8-1,4%); аскорбиновую кислоту (6,211,4 мг %). Твердая фаза барды содержит: галактурониды (3,4-5,3%); жирное масло (8,4-11,1%) с преобладанием незаменимых жирных кислот; флавоноиды (0,4-0,9%); токоферолы (3,4-7,7 мг %); белки и аминокислоты (2,1-2,5%). Выявлено накопление биогенных элементов: фосфора, калия, магния, кальция, натрия, железа и др.

4. Предложен способ комплексной переработки жидкой и твердой фаз барды для получения суммы БАВ - соответственно Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

5. Установлен состав Биобардина БМ: белки и аминокислоты (41-69%); восстанавливающие сахара (3,5-15,6%); жирное масло (0,2-0,3%); флавоноиды (0,20,7%); аскорбиновая кислота (17-37 мг %). Определен состав Биобардина УЛ: уро-

ниды (16,4-19,5%); белки и аминокислоты (11-21%); жирное масло (3,2-4,9%), с< держащее незаменимые кислоты; флавоноиды (0,6-1,5%); токоферолы (6,6-10,2 N %); каротиноиды (0,13-0,21 мг %). Входящие в Биобардин УЛ урониды являют олигомерами с выраженной связывающей способностью (272-295 мг РЬ27г).

6. По тестам «острая токсичность» и «гепатотоксичность» в опытах i животных установлена безвредность Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

7. На моделях электровосстановления кислорода, ПОЛ олеиновой кислс ты, ПОЛ яичного желтка, гепатита у крыс доказано выраженное антиоксидан ное действие Биобардина УЛ, превышающее активность веществ сравнения н 8,3-30,1%; показано отсутствие явлений жировой дистрофии печени крыс по влиянием Биобардина УЛ. На модели «преднизолоновой язвы» желудка у кры установлено выраженное гастропротекторное влияние Биобардина БМ, пр явившееся в уменьшении числа язвенно-геморрагических поражений слизисто оболочки, стимуляции секреторной и протеолитической функций желудка.

8. Обоснован состав таблеток Биобардина БМ и Биобардина УЛ. Пер смотрены ТУ «Барда зерновая», разработаны проекты ФСП: «Биобардин БМ> «Биобардин БМ таблетки», «Биобардин УЛ», «Биобардин УЛ таблетки», регл ментирующие определение белков и аминокислот, уронидов, флавоноидов.

Основное содержание диссертационной работы изложено в публикациях:

1. Кайшев, А.Ш. Перспективы переработки спиртовых отходов / А.Ш. Кай шев // Изв. вузов. Сев.-Кав. регион. Естеств. науки. - 2009. -№ 2 (150). - С. 76-78.

2. Антиоксидантная активность биокомпозиций на основе спиртовых отхо дов / А.Ш. Кайшев [и др.] // Фармация. - 2009. -№ 5. - С. 7-10.

3. Кайшев, А.Ш. Исследование антиоксидантной активности биокомпози ций на основе спиртовых отходов / А.Ш. Кайшев // Изв. вузов. Сев.-Кав. реги он. Естеств. науки. - 2009. -№6(154). - С. 46-48.

4. Кайшев, А.Ш. Определение токсичности послеспиртовой барды для е оценки в качестве фармацевтического сырья / А.Ш. Кайшев, Ю.К. Василенко / Токсикологический вестник. - 2010. - № 6. - С. 52-59.

5. Пат. 2312520 РФ, МПК A23L 1/0524. Способ комплексной переработю послеспиртовой барды / Н.Ш. Кайшева, А.Ш. Кайшев, С.А. Парфейников (РФ) - № 2006100222; заявл. 10.01.06; опубл. 20.12.07, Бюл. № 35. - 8 с.

6. Пат. 2402242 РФ, МПК A23L 1/30. Способ комплексного получения био логически активных веществ из спиртовых отходов / Н.Ш. Кайшева, А.Ш. Кай шев (РФ). - № 2008148693; заявл. 09.12.08; опубл. 27.10.10, Бюл. № 30. - 9 с.

7. Пат. 2403566 РФ, МПК G01N 33/15. Способ количественного определе ния восстанавливающих Сахаров / Н.Ш. Кайшева, А.Ш. Кайшев, Т.В. Орлов екая (РФ). - № 2008149186; заявл. 12.12.08; опубл. 10.11.10, Бюл. № 31. - 14 с.

8. Пат. 2404766 РФ, МПК А61К 31/375. Антиоксидантное лекарственное средство на основе зерновой послеспиртовой барды / Н.Ш. Кайшева, А.Ш. Кайшев (РФ). - № 2009107155; заявл. 27.02.09; опубл. 10.09.10, Бюл. № 33. - 9 с.

9. Кайшев, А.Ш. Получение фармацевтических средств путем утилизации послеспиртовой барды / А.Ш. Кайшев // Аптека 2007: тез. докл. мед.-фармац. конгр. 23-26 окт. 2007 г. - М., 2007. - С. 133-134.

10. Кайшев, А.Ш. Изучение возможности утилизации послеспиртовой барды для производства фармацевтических средств / А.Ш. Кайшев // Социально-мед. аспекты экологич. состояния Центрального экономич. района России: Все-рос. науч. конф. с междунар. участием (2007; Тверь): материалы ... - Тверь,

2007.-С. 336-337.

11. Исследование некоторых физико-химических свойств отходов спиртового производства / А.Ш. Кайшев [и др.]. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармац. продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2008.-Вып. 63. - С. 153-154.

12. Теоретическое и экспериментальное обоснование необходимости утилизации отходов спиртового производства / А.Ш. Кайшев [и др.]. // Там же. -

2008.-Вып. 63.-С. 154-155.

13. Использование отходов спиртового производства в фармации / А.Ш. Кайшев [и др.]. // Человек и лекарство: тез. докл. 15 Рос. нац. конгр. 14-18 апр. 2008 г.-М., 2008.-С. 631.

14. Иванова, Л.И. Исследование химического состава отходов спиртового производства/ Л.И. Иванова, В.А. Челомбитько, А.Ш. Кайшев // Химический анализ: тез. докл. Всерос. конф. 21-25 апр. 2008 г. - М.: ИОНХ, 2008. - С. 129-130.

15. Кайшев, А.Ш. Перспективы переработки послеспиртовой барды для сохранения экологически благоприятной среды / А.Ш. Кайшев // Саратовский мед.-фармац. вестн. - 2008. - № 5 (397). - С. 20-24.

16. Кайшев, А.Ш. Перспективы применения в качестве лекарственного средства аминокислотно-углеводного комплекса, получаемого на основе спиртовых отходов / А.Ш. Кайшев // Там же. - 2008. - № 11 (403). - С. 31-34.

17. Кайшев, А.Ш. Исследование некоторых биологических свойств жидкой фракции послеспиртовой барды / А.Ш. Кайшев, C.B. Москаленко, И.И. Клиши-на // Там же. - 2008. - № 11 (403). - С. 34-36.

18. Кайшев, А.Ш. Биологическая активность жидкой фракции послеспиртовой барды / А.Ш. Кайшев // Фармация из века в век: сб. науч. тр. - СПб., 2008.-Ч. IV.-С. 38-41.

19. Кайшев, А.Ш. Перспективы использования отходов (барды) спиртового производства как источника аминокислот и пектинов / А.Ш. Кайшев, Л.А. Бережная, В.А. Челомбитько // Разработка, исследование и маркетинг новой фармац. продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 160-161.

20. Разработка биокомпозиций на основе послеспиртовой барды / А.Ш. Кайшев [и др.]. // Там же. - Пятигорск, 2010. - Вып. 65. - С. 191-192.

21. Исследование химической и микробиологической безопасности отходов спиртового производства / А.Ш. Кайшев [и др.]. // Регион, мед. - фармац. вестн. - 2010. - № 25 (29). - С. 34-36.

22. Разработка лекарственных средств на основе отходов спиртового производства / А.Ш. Кайшев [и др.]. И Там же. - 2010. - № 30 (34). - С. 38-41.

КАЙШЕВ АЛЕКСАНДР ШАЛИКОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ОТХОДОВ СПИРТОВОГО ПРОИЗВОДСТВА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «13» января 2011 г. Формат бумаги 60x84/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Актуальность темы. В настоящее время основным источником природных БАВ является растительное лекарственное сырье. Однако его ресурсы ограничены по ряду причин, главными из которых являются снижение площадей их культивирования и уменьшение объема заготовок дикорастущих растений.

В то же время практически неограниченным источником природных БАВ являются отходы пищевой промышленности. К таким источникам следует отнести послеспиртовую зерновую барду. Это видно из того, что в России ежегодно, по данным статистики [106, 108], образуется около 10 млн. м3 по-слеспиртовой барды. Только 10% указанного количества барды используется в качестве кормовой добавки для скота [98]. Несмотря на скудные литературные сведения о химическом составе послеспиртовой барды [98], следует сказать о возможно богатом составе БАВ барды. Такая предпосылка базируется на том, что барда получается из растительных источников, а именно цельных зерновок злаковых растений. Кроме того, возможно образование новых БАВ в результате ферментативных процессов брожения.

Таким образом, послеспиртовая зерновая барда может быть ценным источником природных биологических веществ. Однако в таком аспекте послеспиртовая барда до настоящего времени не рассматривалась. Возможной причиной этого является то, что химический состав барды мало изучен, особенно с точки зрения состава БАВ. Проводя аналогию между содержанием БАВ исходного зернового сырья и учитывая возможности его изменения в ходе ферментативного спиртового брожения, следует считать, что в результате глубокого химического исследования можно обосновать использование послеспиртовой зерновой барды в качестве нового источника БАВ и получения JTC на их основе.

Решение указанного вопроса позволит получить не только новый источник БАВ, но и хотя бы частично решить вопрос утилизации отходов спиртовой технологии.

Поэтому изучение химического состава послеспиртовой зерновой барды, разработка методов получения суммы БАВ из нее и создание лекарственных препаратов на их основе является актуальной проблемой для фармацевтической науки.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось химическое и фармакологическое изучение послеспиртовой зерновой барды, обоснование возможности комплексного использования сырья для получения ЛС антиокси-дантного и гастропротекторного действия и разработка нормативной документации на ЛС.

В задачи исследований входило: сравнительный анатомо-диагностический анализ зерновок злаков и остатков зерновок твердой фазы барды; исследование физико-химических характеристик и химического состава жидкой и твердой фаз барды, обоснование норм ее качества; оптимизация выделения суммы БАВ: Биобардина БМ («белково-минерального») - из жидкой фазы барды, Биобардина УЛ («углеводно-липидного») - из твердой фазы барды; определение химического состава Биобардина БМ и Биобардина УЛ; сравнительное исследование токсичности, гастропротекторной и анти-оксидантной активности Биобардина БМ и Биобардина УЛ; обоснование норм качества субстанций и таблеток Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

Научная новизна работы. Изучен химический состав пшеничной, кукурузной, ячменной, просяной барды и доказана возможность выделения суммы БАВ из жидкой и твердой фаз барды.

Установлена взаимосвязь между составом БАВ в зерне и в послеспиртовой зерновой барде.

В результате сравнительного анатомо-диагностического изучения зерновок злаков и остатков зерновок твердой фазы барды установлено, что диагностическим признаком зерновок пшеничной, кукурузной, ячменной, просяной барды являются крахмальные зерна.

Методами хроматографии (гель-хроматография, ВЭЖХ, ГЖХ, ТСХ), спектрофотометрии, поляриметрии, титриметрии, гравиметрии доказан химический состав жидкой и твердой фаз пшеничной, кукурузной, ячменной, просяной барды. Показано, что в составе жидкой фазы барды содержатся: белки (главным образом среднемолекулярные и нерастворимые в растворах солей), 14 аминокислот (с преобладанием глутаминовой кислоты), из которых 8 являются незаменимыми, биогенные элементы, восстанавливающие сахара, аскорбиновая кислота, а в твердой фазе барды - олигогалактурониды, жирное масло (с накоплением незаменимых жирных кислот), флавоноиды, токоферолы.

Установлена возможность получения суммы БАВ (белков, аминокислот, биогенных элементов, восстанавливающих Сахаров, аскорбиновой кислоты) под названием «Биобардин БМ» из жидкой фазы барды путем ее мембранной фильтрации и обработки охлажденным ацетоном в соотношении 1:3. Показана возможность выделения суммы БАВ (олигогалактуронидов, жирного масла, флавоноидов, токоферолов), названной «Биобардин УЛ», из твердой фазы барды путем экстракции 1 % раствором оксалата аммония и обработки извлечения охлажденным спиртом 96% в соотношении 1:2. Выведены уравнения регрессии, адекватно отражающие выход Биобардинов в зависимости от технологических условий.

При изучении химического состава суммы БАВ, выделенных из жидкой и твердой фаз барды, показано преобладание в составе Биобардина БМ белков (среднемолекулярных и нерастворимых в растворах солей); наличие 15 аминокислот (с накоплением глутаминовой кислоты), из которых 9 являются незаменимыми; элементов; аскорбиновой кислоты; восстанавливающих Сахаров. Установлено преимущественное содержание в Биобардине УЛ олигогалактуронидов; жирного масла с накоплением ненасыщенных высших жирных кислот, в т.ч. незаменимых; флавоноидов, токоферолов, каротиноидов.

В опытах на мышах установлено, что Биобардин БМ и Биобардин УЛ относятся к практически нетоксичным веществам.

Доказана выраженная антиоксидантная активность Биобардина УЛ, превышающая активность веществ сравнения: силибора на 8,3%, свекловичного пектина на 30,1%; установлен антирадикальный механизм действия Биобардина УЛ и отсутствие под его влиянием жировой дистрофии печени крыс с модельным токсическим гепатитом.

Установлено выраженное гастропротекторное действие Биобардина БМ, проявившееся в уменьшении числа язвенно-геморрагических поражений слизистой оболочки, стимуляции секреторной и протеолитической функций желудка крыс.

Результаты изучения химического состава и биологических свойств выделенных БАВ явились основанием для разработки ЛС антиоксидантного (Биобардин УЛ таблетки) и гастропротекторного (Биобардин БМ таблетки) действия. Обоснованы методы, показатели и нормы качества субстанций и таблеток Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

Новизна исследований подтверждена 4 патентами РФ на изобретения.

Практическая значимость результатов исследования. Пересмотрено ТУ «Барда зерновая», регламентирующее качество барды как сырья для получения ЛС.

Предложен способ комплексной переработки жидкой и твердой фаз барды для получения суммы БАВ: соответственно Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

На основании выявленной способности Биобардина БМ уменьшать степень язвенно-геморрагических поражений слизистой оболочки желудка, стимулировать секреторную и протеолитическую функции желудка, разработано ЛС гастропротекторного действия «Биобардин БМ таблетки».

В результате установленной способности Биобардина УЛ ингибировать процессы свободнорадикального ПОЛ разработано ЛС антиоксидантного действия «Биобардин УЛ таблетки».

Материалы внедрения

1. Проект ТУ «Барда зерновая послеспиртовая», пояснительная записка к нему. Справка о передаче проекта ТУ и акт о внедрении методик для стандартизации барды получены от ООО «Казачье» (Минераловодский район Ставропольского края).

2. Проекты ФСП «Биобардин БМ» и «Биобардин БМ таблетки», пояснительные записки к ним. Акты об апробации методик показателей качества субстанции и таблеток Биобардина БМ получены от ООО Научно-производственной фирмы «Пекто» (г. Нальчик).

3. Проекты ФСП «Биобардин УЛ» и «Биобардин УЛ таблетки», пояснительные записки к ним. Акты об апробации методик показателей качества субстанции и таблеток Биобардина УЛ получены от ООО Научно-производственной фирмы «Пекто» (г. Нальчик).

Положения, выдвигаемые на защиту:

- теоретическое и экспериментальное обоснование использования по-слеспиртовой зерновой барды (пшеничной, кукурузной, ячменной, просяной) для выделения суммы БАВ с целью разработки на их основе ЛС;

- результаты изучения анатомо-диагностических признаков, физико-химических свойств и химического состава барды, обоснование норм качества;

- данные по исследованию физико-химических характеристик и химического состава выделенных из барды БАВ - субстанций Биобардина БМ и Биобардина УЛ;

- результаты изучения безопасности, антиоксидантной и гастропротек-торной активности Биобардина БМ и Биобардина УЛ;

- обоснование норм качества субстанций и таблеток Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

Апробация работы. Фрагменты работы доложены и обсуждены на международных научных конференциях (Краснодар, 2005; Тверь, 2007); Всероссийской конференции (Москва, 2008); научно-практической конференции молодых ученых (Анапа, 2006) и 3 региональных научных конференциях по проблемам фармации, фармакологии и подготовки кадров (Пятигорск, 2008-2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе 4 патента РФ на изобретения и 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Росздрава» (номер государственной регистрации 01200108441).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 187 страницах, состоит из введения, пяти глав, общих выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 29 рисунками и 58 таблицами. Библиография включает 159 наименований, из которых 26 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Химическими, физико-химическими и биологическими методами доказано содержание в барде БАВ с выраженной фармакологической активностью, что перспективно для применения барды в качестве сырьевого источника ЛС.

2. Сравнительный морфологический и анатомо-диагностический анализ зерновок злаков и остатков зерновок барды позволил установить для каждого вида барды в качестве диагностического признака крахмальные зерна.

3. Установлен состав БАВ пшеничной, кукурузной, ячменной, просяной барды. Жидкая фаза барды содержит: белки и аминокислоты (20-46%); восстанавливающие сахара (5,6-17,5%); галактурониды (0,8-1,4%); аскорбиновую кислоту (6,2-11,4 мг %). Твердая фаза барды содержит: галактурониды (3,45,3%>); жирное масло (8,4-11,1%) с преобладанием незаменимых жирных кислот; флавоноиды (0,4-0,9%); токоферолы (3,4-7,7 мг %); белки и аминокислоты (2,1-2,5%о). Выявлено накопление биогенных элементов: фосфора, калия, магния, кальция, натрия, железа и др.

4. Предложен способ комплексной переработки жидкой и твердой фаз барды для получения суммы БАВ - соответственно Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

5. Установлен состав Биобардина БМ: белки и аминокислоты (41-69%); восстанавливающие сахара (3,5-15,6%); жирное масло (0,2-0,3%); флавоноиды (0,2-0,7%); аскорбиновая кислота (17-37 мг %). Определен состав Биобардина УЛ: урониды (16,4-19,5%); белки и аминокислоты (11-21%); жирное масло (3,2-4,9%), содержащее незаменимые кислоты; флавоноиды (0,6-1,5%); токоферолы (6,6-10,2 мг %); каротиноиды (0,13-0,21 мг %). Входящие в Биобардин УЛ урониды являются олигомерами с выраженной связывающей способностью (272-295 мг РЬ2+/г).

6. По тестам «острая токсичность» и «гепатотоксичность» в опытах на животных установлена безвредность Биобардина БМ и Биобардина УЛ.

7. На моделях электровосстановления кислорода, ПОЛ олеиновой кислоты, ПОЛ яичного желтка, гепатита у крыс доказано выраженное антиокси-дантное действие Биобардина УЛ, превышающее активность веществ сравнения на 8,3-30,1%; показано отсутствие явлений жировой дистрофии печени крыс под влиянием Биобардина УЛ. На модели «преднизолоновой язвы» желудка у крыс установлено выраженное гастропротекторное влияние Биобардина БМ, проявившееся в уменьшении числа язвенно-геморрагических поражений слизистой оболочки, стимуляции секреторной и протеолитической функций желудка.

8. Обоснован состав таблеток Биобардина БМ и Биобардина УЛ. Пересмотрены ТУ «Барда зерновая», разработаны проекты ФСП: «Биобардин БМ», «Биобардин БМ таблетки», «Биобардин УЛ», «Биобардин УЛ таблетки», регламентирующие определение в барде белков и аминокислот, уронидов, флаво-ноидов; в Биобардине БМ - белков и аминокислот; в Биобардине УЛ - уронидов, флавоноидов.