Изучение антител к ДНК и их гидролизующих свойств при аутоиммунном тиреоидите с использованием нанотехнологий

Подшивалина, Елена Юрьевна

Диссертации по медицине → Эндокринология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Изучение антител к ДНК и их гидролизующих свойств при аутоиммунном тиреоидите с использованием нанотехнологий

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Подшивалина, Елена Юрьевна Самара 2008 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.03

Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение антител к ДНК и их гидролизующих свойств при аутоиммунном тиреоидите с использованием нанотехнологий

На правах рукописи

0034532БЬ

ПОДШИВАЛИНА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ К ДНК И ИХ ГИДРОЛИЗУЮЩИХ СВОЙСТВ ПРИ АУТОИММУННОМ ТИРЕОИДИТЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОТЕХНОЛОГШ1

14.00.03 - эндокринология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Самара-2008

003453266

Работа выполнена в ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Росз драва».

Научный руководитель: заслуженный врач РТ, президент ассоциации эндокринологов РТ, доктор медицинских наук, профессор Анчикова Лидия Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик Талантов Всеволод Васильевич, Академия Наук Республики Татарстан;

кандидат медицинских наук, доцент Хасанов Энгель Насимович, ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава».

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава».

Защита состоится «10» декабря 2008 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 208.085.05 при ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: пр. К. Маркса 165 «б».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава» (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан «_»___2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Захарова Н.О.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальност ь проблемы. Аутоиммунный тиреоидит (АИТ) - классическое аутоиммунное заболевание, является распространенной тиреоидной патологией после йоддефицитных заболеваний щитовидной железы (Валдина Е.А.,2001; Балаболкин М.И.,2002). Большинство исследователей отмечают тенденцию к увеличению заболеваемости ЛИТ в течение последних десятилетий (Braverman L.E., 1997; Кандрор В.И., 1999). По данным ряда последователен, от 4 до 11% населения страдает аутоиммунным тиреоидитом (Зефирова Г.С., 1999, Петушша H.A., 2002). Патогенез аутоиммунных заболеваний, в том числе АИТ, изучен недостаточно. До настоящего времени отсутствуют патогенетически обоснованные подходы в лечении данного заболевания.

Согласно Рекомендациям Российской ассоциации эндокринологов (Дедов И.И. и др., 2003) для диагностики АИТ имеет значение совокупность «больших» диагностических признаков: наличие антител к ткани щитовидной железы, УЗИ-признаков аутоиммунного поражения щитовидной железы и первичного гипотиреоза. В отсутствии хотя бы одного из критериев диагноз АИТ носит вероятностный характер. Однако антитела к тиреопероксидазе могут обнаруживаться при других заболеваниях щитовидной железы, а также у здоровых людей (Mariotti S. Et al., 1990; Ladenson P.W. et al., 2000). Ультразвуковая картина не всегда позволяет дифференцировать АИТ от эндемического и узлового зоба; гипотиреоз может развиться вследствие генетически обусловленных дефектов, а также в рамках эндемического поражения щитовидной железы.

Таким образом, в настоящее время поиск новых методов диагностики АИТ является весьма актуальным.

Методом электрофореза (Новинский Г.А. и др., 2000) и линейного дихроизма (Сучков С.В. и др., 2001) показано, что аутоантитела к ДНК, обладая гидролизующими свойствами ферментов, по-видимому, принимают участие в процессе апоптоза (Сучков С.В. и" др., 2001), скорость которого при АИТ многократно возрастает (Кандрор, 2001). Сегодня ДНК-гидролизующие аутоантитела рассматриваются в качестве кандидата одного из ключевых факторов в патогенезе развития аутоиммунного процесса. Изучение этих процессов возможно и требует использования высоко точных и наукоемких технологии.

Определение содержания аутоантител к ДНК в сыворотке крови в настоящее время проводится методом ИФА для диагностики СКВ (Z. Amirghofran et al., 2000; W. Egner, 2000). В литературе имеется сообщение об обнаружении антител к нативной ДНК в сыворотке крови методом иммуноферменткого анализа (ИФА) у 50% больных АИТ в состоянии эутиреоза (Pedro A.B. и др., 2006), что, возможно, обусловлено низкой чувствительностью метода. Представляло клинический интерес изучить чувствительность двух методов определения аутоантигел к ДНК в сыворотке крови больных АИТ: с помощью ИФА и нанобиосенсора - пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора.

Актуальность развития нанотехнологий получила свое отражение в национальных проектах Правительства России и создании отдельного Министерства по вопросам бионанотехнологий, функцией которого является разработка новых методов диагностики заболеваний и внедрение их в медицинскую практику. Следовательно, разработка и внедрение в клиническую практику высоко чувствительных, специфичных и точных методов определения как содержания аутоантител к ДНК, так и их гидролизующих свойств, с использованием нанотехнологий необходимы для совершенствования диагностики аутоиммунных заболеваний, в том числе АИТ, и контроля качества лечения.

Целью настоящей работы являлось изучение содержания ДНК-связьгвающих антител в сыворотке крови и их ДНК-гидролизующего действия в качестве диагностического критерия аутоиммунного тиреоидита. Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать содержание антител к нативной ДНК (AT к нДНК) и антител к денатурированной ДНК (AT к дДНК) классов IgG и IgM в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом иммунофермеитного анализа.

2. Оценить содержание антител к нативной и денатурированной ДНК класса ^О в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом ИФА в зависимости от функционального состояния щитовидной железы и уровня антител к тиреопероксидазе.

3. Провести экспериментальную оценку возможности определения антител к нативной ДНК в сыворотке крови с использованием нанобиосенсора - пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора для диагностики аутоиммунного тиреоидита и системной красной волчанки.

4. Провести оценку чувствительности и специфичности определения антител к нативной ДНК методом ИФА и с использованием пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора.

5. Изучить гидролизующие свойства антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом, нанозондовым методом атомно-силовой микроскопии.

Научная новнзна. Впервые для диагностики аутоиммунных заболеваний, в том числе АИТ, предложен высокочувствительный, специфичный, экономичный экспресс-метод на основе нанобиосенсора - пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора по определению аугоантител к нативной ДНК в сыворотке крови больных; получено значительное повышение АТ к нДНК в сыворотке крови у больных АИТ и СКВ.

Впервые методом иммуноферментного анализа проведено изучение содержания АТ к нативной и денатурированной ДНК классов и в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом в зависимости от функционального состояния щитовидной железы и уровня антител к тиреоидной пероксидазе (АТ к ТПО). Показано увеличение содержания АТ к нативной ДНК класса у больных аутоиммунным тиреоидитом, что имеет значимость для верификации диагноза. Содержание АТ к нДНК класса 1§0 в сыворотке больных АИТ положительно коррелирует с уровнем АТ к ТПО.

Впервые применен ианозондовый метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) для визуального изучения взаимодействия молекул нативной ДНК и выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом аутоантител к нативной ДНК. Установлено присутствие в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом антител к нативной ДНК класса проявляющих ДНК-гидролизующую активность и имеющих

непроцессивный механизм действия.

Результаты исследования, полученные методом атомно-силовой микроскопии, являются основанием для проведения дальнейших исследований патогенетической роли ДНК-гидролизующих атител при аутоиммунном тиреоидите.

Научно-практическая значимость. Определение содержания АТ к нативной ДНК класса в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа может использоваться в качестве дополнительного диагностического критерия аутоиммунного тиреоидита.

Пьезокварцевый ДНК-иммуносенсор может применяться как высокочувствительный и высокоспецифичный метод определения АТ к нативной ДНК в сыворотке крови у больных аутоиммунным тиреоидитом.

Для диагностик)! аутоиммунных заболеваний (аутоиммунного тиреоидита, системной красной волчанки) рекомендуется внедрять в медицинскую практику методы нанотехнологий с использованием пьезокварцевого биосенсора и атомно-силового микроскопа.

Внедрение результатов нсследовашш. Выдан патент на изобретение РФ X» 2315313 «Способ определения аутоантител к ДНК и способ диагностики аутоиммунного тиреоидита», приоритет изобретения от 03 марта 2006г.

Основные результаты исследования внедрены в практическую деятельность НУЗ «Отделенческая больница на ст. Казань» ОАО «РЖД», ГУ «Межрегиональный клинико-диагностический центр».

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры эндокринологии ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Росздрава».

Апробация работы проведена на ХИ Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола - Казань - Москва, 2005), VIII Европейском конгрессе эндокринологов (Глазго, Англия, 2006), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), заседании научного общества эндокринологов Республики Татарстан (2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 работы в журналах, рецензированных ВАК РФ, выдан 1 патент РФ на изобретение. Почтожсшш, выносимые на защиту.

1. У больных аутоиммунным тирсоидитом в сыворотке крови определяется повышенное содержание ЛТ к нДНК классов IgG и IgM методом иммуноферментиого анализа. Содержание антител к нДНК в сыворотке крови больных АИТ имеет взаимосвязь с уровнем антител к тиреопероксидазе.

2. Пьезокварцевый ДНК-иммуносенсор является высокоспецифичным и чувствительным экспресс-методом, позволяющим определять AT к нативной ДНК в сыворотке крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями (АИТ и СКВ).

3. Метод атомно-силовой микроскопии дает возможность визуально изучать гидролизующие свойства AT к нативной ДНК при аутоиммунном тиреоидите, имеющие непроцессивный характер.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список литературы содержит 319 источников, из них 79 работ на русском и 240 на иностранном языках. Работа иллюстрирована 28 рисунками и 22 таблицами.

Благодарности за помощь в работе. Автор выражает искреннюю благодарность за всестороннюю помощь в работе научному руководителю д.м.н. Анчнковой Л.И., д.б.и., профессору кафедры биохимии КГУ Абрамовой З.И., к.ф.-м.н., доценту кафедры спектроскопии и нанофотоники КГУ Коноваловой O.A., к.б.н., ассистенту кафедры биохимии КГУ Невзоровой Т.А., к.б.н., ассистенту кафедры биохимии КГУ Фахруллину Р.Ф., к.б.н., врачу-лаборанту ГУ «МКДЦ» Саттаровой Л.И., врачу-лаборанту Сокол П.Е.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектом исследования были больные и здоровые лица, находившиеся на амбулаторном обследовании в поликлинике НУЗ «Отделенческая больница на ст. Казань» ОАО «РЖД» и ГУ «Межрегиональный клинико-диагностический центр».

Комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование проведено у 148 женщин, страдавших аутоиммунным тиреоидитом в возрасте от 18 до 53 лет. Группы контроля составили 40 практически здоровых женщин, не имевших патологии ЩЖ, и 15 женщин, страдавших системной красной волчанкой (СКВ), рандомизированных по возрасту.

Диагноз аутоиммунного тиреоидита устанавливался на основании данных ультразвукового исследования (УЗИ) ЩЖ, определения антител к тиреоидпой пероксидазе (ТОО) в сыворотке крови, оценки функционального состояния ЩЖ по содержанию тиреотропного гормона (ТТГ), свободного тироксина (св.Т4) и свободного трийодтиронина (св.Тз) в сыворотке крови (Дедов и др., 2003). ТТГ, св.Т4, св.Т3, AT к ТПО в сыворотке крови определялись иммунохемилюминесцентным методом с использованием наборов фирмы «Immulitc» на автоматическом анализаторе «Immulite» («Diagnostic Products Corporation», США). Ультразвуковое исследование щитовидной железы проводилось в режиме серой шкалы и цветового доплеровского картирования на аппаратах Acusón 128 ХР/10 и Sequoia-512 (Siemens, Германия) с использованием линейных датчиков 7,5-10 МГц. Тонкоигольная

пункционная биопсия щитовидной железы под контролем УЗИ проводилась по показаниям в рамках диагностического поиска при наличии узловых образований в щитовидной железе. Дифференциальный диагноз между диффузным токсическим зобом и АИТ проводился по результатам УЗИ щитовидной железы и в отдельных случаях титра антител к рецепторам ТТГ в сыворотке крови. Активность аутоиммунного процесса в щитовидной железе оценивалась по уровню AT к ТПО в сыворотке крови. Диагноз СКВ устанавливался на основании общепринятых методов.

Определение уровня антител к нагивной ДНК и денатурированной ДНК классов lgG и IgM в сыворотке крови методом нммуноферментного анализа (ИФА) проводилось на автоматическом анализаторе «EL 808 Bio-Tek Instruments, Inc.» («Diagnostic Products Corporation», США) с использованием наборов «IgG-Antibodies to double-stranded DNA», «IgG-Antibodies to single-stranded DNA», «IgM-Antibodies to double-stranded DNA» для количественного определения антител классов lgG и IgM («Orgentec», Германия).

Определение антител к нативной ДНК в сыворотке крови с использованием ньезокварцевого бносенсора проводили в газовом и проточно-инжекционном режимах. Для анализа в газовом режиме использовались кварцевые микровесы, разработанные и изготовленные доцентом кафедры общей физики КГУ К.Ю.Нагулиным, доцентом кафедры оптики и канофотоники О.А. Коноваловой, и пьезокварцевые резонаторы (ПКР) 8 МГц с золотыми электродами (АО «Морион», С,- Петербург) (рисЛА). Исходно измеряли базовую частоту колебаний ПКР, на электрод наносили водный раствор поли-Ь-лизина (1,75 мг/мл), помешали во влажную камеру на 4 часа, отмывали и высушивали при 37° С. На сформированный слой поли-Ь-лизина наносили раствор нативной ДНК (50 мкг/мл в буфере 0,0 VM Tris-HCl, 0,01М ЭДТА, рН 7,2), инкубировали во влажной камере, отмывали и высушивали. Сыворотку крови разводили в соотношении 1:100 в буфере 0,01М Tris-HCl, 0,01М ЭДТА, pIT 7,2, наносили на электрод, инкубировали во влажной камере, отмывали, высушивали и измеряли частоту колебаний резонатора. После завершения измерений электрод очищали 20 мкл 1 М НС1, ополаскивали водой и высушивали.

Кварцевые микровесы

'tsrer3

—осциллятор

А Б

Рис. 1 Кварцевые микровесы для проведения анализа с использованием ньезокварцевого биосенсора: А в газовом режиме: Б- в проточно-инжекционном режиме

Для определения антител к нДНК в проточно-инжекционном режиме использовали кварцевые микровесы QCM 200 фирмы Stanford Research Systems (США), Г1КР 5 МГц с золотым электродом (Рис. 1Б). Управление и фиксирование результатов экспериментов осуществляли с помощью компьютерной про1раммы LabView 1.0. ПКР устанавливали в проточную ячейку и соединяли ее с инжектором и перистальтическим насосом. Раствор поли-Ь-лизина (0,1 мг/мл в 0,05 М NaOH-глициновом буфере, рН 0,6) наносили на электрод, инкубировали, ополаскивали и высушивали. ПКР помещали в проточную ячейку и пропускали через нее рабочий буфер до стабилизации сигнала и фиксации базовой линии. В систему вносили раствор нативной ДНК (50 мкг/мл в 0,05 М Tris-HCl буфере, рН 7,2). После стабилизации частоты колебаний ПКР через ячейку пропускали рабочий буфер. 1% раствор

бычьего сывороточного альбумина (БСА) в трис-солевом буфере (ГСБ), и отмывали ТСБ. Сыворотки крови прогревали при +56° в течение 40 мин, разводили в фоефатно-солевой буфере с твином (ФСБТ) до конечной концентрации белка 0,1 мг/мл, которую измеряли спектрофотометром при длине волны 280 нм, и пропускали через проточную ячейку. После эксперимента резонатор выдерживали в 2% растворе додецилсульфата натрия (Ds-Na), ополаскивали, выдерживали в 1 M HCl и обрабатывали ультрафиолетом 10 мин.

ДНК-гидролизующую актипность сывороток крови больных аутоиммунным тнреоидитом, системной красной волчанкой и здоровых лиц оценивали по превращению суперскрученной плазмидной ДНК pBR 322 в кольцевую и линейную формы методом электрофореза в 0,7% агарозном геле с окрашиванием ДНК этидий бромидом и получением депситограмм, используя программу Scion Image 4.0.2 (beta).

Гидролиз плазмидной ДНК pBR 322 сыворотками крови больных АИТ, СКВ и здоровых лиц осуществляли при 37° С в реакционной смеси, содержащей 25 мМ трис- HCl, pH 7,5, 5 мМ MgCh ' 6 Н2О, 50 мМ NaCl, 12,5 мкг/мл суперскрученной плазмидной ДНК pBR 322. Во время инкубации отбирали пробы через 1, 3 и б часов, которые замораживали для предотвращения дальнейшего гидролиза.

Изучение ДНК-шдролизующей активности антител к иатнвной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тнреоидитом, методом атомно-сшювой микроскопии. Выделение из сыворотки крови AT к нДНК заключалось в высаливании IgG сульфатом аммония, гель-фильтрации на Акрилексе-Рб, аффинной хроматографии на микрокристаллической цДНК-целлюлозе, подготовленной по методу Lítman (1968) в модификации, предложенной Невзоровой (2005). Гомогенность выделенных AT- IgG исследовали с помощью электрофореза (прибор для электрофореза АВГЭ-1, «Хийу калур», Эстония) в полнакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия с последующим окрашиванием белков нитратом серебра (Остерман, 1981). Концентрацию AT к нДНК оценивали методом ИФА с использованием наборов «IgG-Antibodies to double-stranded DNA» для количественного определения антител класса IgG («Orgentec», Германия) на автоматическом анализаторе «EL 808 Bio-Tek Instruments, Inc.» («Diagnostic Products Corporation», США). Выделенные антитела разводили 25 мМ трис-HCl буфером, pH 7,5, добавляли 5 мМ MgCh до конечной концентрации 0,2 - 2,0 мкг/мл ДНК и 2,6 - 4,3 мкг/мл AT, инкубировали при +37° С в течение 18 часов. Гидролиз нативной ДНК эритроцитов цыплят (Rcana!, Венгрия) антителами к нДНК, выделенными из сыворотки крови больных АИТ, исследовали методом АСМ. Образец в объеме 5 мкл наносили на свежерасщепленную пластину слюды (1x1см) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре, промывали 1 мл деионизованной стерильной водой и высушивали струей сжатого воздуха и над силикагеле.м. Визуализацию поверхности образцов проводили на атомно-силовом микроскопе Solver Р47Н кремниевыми кантилеверами NSG 11 (длина кантилевера 100 мкм, радиус иглы 10 нм, коэффициент упругости 11,5 Н/м, резонансная частота 190 и 255 кГц) (ЗАО «НТ-МДТ», Россия) в полуконтактиом режиме на воздухе при комнатной температуре. Сканирование осуществляли с разрешением 512x512 точек и рабочей амплитудой колебаний кантилевера 923 нм. Обработку АСМ изображений проводили с помощью программного обеспечения Nova RC 1.0.26.878 компании ЗАО «НТ-МДТ», Россия. Подсчет длины молекул ДНК проводили с помощью программы DNA Processing Aplication 2.6. Объем выборки контрольных групп составлял по 50 молекул ДНК, опытной -100 молекул ДНК.

Статистический анализ проводился с использованием программы Statistica 6.0. Оценку симметричных выборок проводили с использованием параметров «среднее» и «стандартное отклонение». Для оценки различий между отдельными выборками вычисляли t-критерий Стьюдента. Для характеристики и сравнения данных, не подчиняющихся закону нормального распределения, использовали непараметрические методы. Оценку среднего значения проводили с использованием структурной характеристики - медианы (Me). Для характеристики разброса данных использовали 2,5 персентиль (2,5П) и 97,5 персентшхь

(97,5П), между которыми расположено 95% всех значений. Достоверность различий оценивали с помощью ранговых критериев: Т-критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса. Статистически достоверными считали различия при значении р < 0,05.

Результаты н их обсуждение

Проведено обследование 148 женщин, страдавших АИТ. Преобладающее количество больных имело возраст более 40 лет (57,4%).

При пальпации щитовидной железы выявили зоб 1 степени по ВОЗ у 27 % больных АИТ, зоб 2 степени - у 64,9 %, без увеличения объема ЩЖ - 8 %. Зоб 2 степени преобладал у больных АИТ, имеющих нарушения функционального состояния ЩЖ, как в сторону гипофункции, так и в сторону ее повышения (табл. 1). Диффузное увеличение щитовидной железы обнаружено у 75,7 %, смешанная (диффузно-узловая) форма - у 12 %, узловая - у 6,1 % больных АИТ.

Таблица I.

Объем щитовидной железы по классификации ВОЗ в зависимости от ее функционального состояния

Группы Всего больных п= 148 Зоба нет 1 степень 2 степепь

п= 12 % 1-2 п= 44 % 1-3 п= 92 % 1-4

1 2 3 4

Эутиреоз 44 5 11,4 22 50,0 17 38,6

Субклинический гипотиреоз 34 3 5,9 8 23,5 23 67,7

Гипотиреоз 51 4 7,8 7 13,8 40 78,4

Субклинический гипертиреоз 7 4 57,1 3 42,9

Тиреотоксикоз 12 - - 3 25,0 9 75,0

При ультразвуковом исследовании диффузное увеличение объема ЩЖ до 20,7+ 2,2 мл наблюдалась у 35,8 % больных, узловая (очаговая) форма - у 14,9 % (23,7+ 2,5 мл), смешанная (диффузно-узловая) форма - у 15,5 % (21,1+ 1,6 мл), атрофическая форма - у 4,7 % больных (2,7+ 0,6 мл).

Таким образом, по сравнению с данными пальпации ЩЖ при ее ультразвуковом исследовании увеличилась выявляемость узловых и смешанных форм, что связано с выявляемостью непальпируемых узловых образований размером менее 1 - 1,5 см в диаметре. Кроме того, при смешанной форме заболевания может иметь место сочетание аутоиммунного гиреоидита и эндемического зоба, что показано Вагаповой Г.Р. (2007) при исследовании ЩЖ методом магнито-резонансной томографии.

Анализ клинико-лаборатоных данных с определением содержания ТТГ, св. Т4, св. Тз в сыворотке крови позволил установить эутиреондное состояние у 29,7 % больных АИТ, субклинический гипотиреоз - у 22,9 %, манифестный гипотиреоз был выявлен у 34,5 %, субклиничсский гипертиреоз - у 4,7 %, тиреотоксикоз - у 8,1 % пациентов (табл. 2).

Таблица 2.

Распределение больных АИТ по группам в зависимости от функционального состояния гипофиз-тиреоидной системы

Показатели функции щитовидной железы Медиана (2,5П; 97,5П) % Р

Контроль (группа здоровых) п= 40

ТТГ, мкМЕ/мл 1,4 (0,5;3,0) - -

Св.Тз нмоль/л 4,6 (3,1;5,8) - -

Св.Т4, нмоль/л 13,6 (10,7; 19,6) - -

Эутнреоз п= 44

ТТГ, мкМЕ/мл 1,9 (0,8;3,4) 135,7 >0,05

Св.Тз, нмоль/л 4,8 (3,7;5,8) 104,3 <0,5

Св.Т4, нмоль/л 14,1 (10,6;20,2) 103,7 <0,5

Субклинический гипотиреоз п=34

ТТГ, мкМЕ/мл 5,6 (4,2;8,4) 400 <0,001

Св.Т.?, нмоль/л 4,5 (2,6;6,9) 91,3 <0,5

Св.Т4, нмоль/л 12,8 (10,4; 15,0) 94,1 <=0,05

Гипотиреоз п= 51

ТТГ, мкМЕ/мл 14 (!,12;24,6) 1000 <0,001

Св.'Гз, нмоль/л 4,0 (1,9;4,7) 86,9 <0,001

Св.Т4, нмоль/л 8,9 (3,7;12,1) 65,4 <0,001

Субклнничсскин гипертиреоз п= 7

ТТГ, мкМЕ/мл 0,1 (0,02; 0,3) 7,1 <0,001

Св.Тз, нмоль/л 5,3 (4,6;6,5) 115,2 <0,05

Св.Т4, нмоль/л 17,2 (12,7,21,4) 126,5 >0,05

Гирсотиксикоз п= 12

ТТГ, мкМЕ/мл 0,02 (0,01 ;0,1) 1,4 <0,001

Св.Тз, нмоль/л 7,2 (5,9;15,4) 156,5 <0,001

Св.Т4, нмоль/л 28,7 (16,6;72,6) 390,3 <0,001

%, р - сравнение с контрольной группой

Таблица 3.

Уровень АТ к ТПО в сыворотке крови у больных АИТ в зависимости от функционального состояния щитовидной железы

Группы Эутирео 3 Субклинически й гипотиреоз Гипотиреоз Суб клинический гипертиреоз Тиреотоксикоз

Медиан а (2,5 П; 97,5П) Р 1-2 Медиана (2,5 П; 97,5П) Р 1-3 Медиана (2,5 П; 97,5П) Р 1-4 Медиана (2,5 П; 97,5П) Р 1-5

1 2 3 4 5

Антител а к ТПО, МЕ/мл 612,5 (127,2; 1098,8) 898,5 (102,3; 1417,8) >0,5 1000,0 (124,3; 1197,4) <0,5 303 (114,4; 1071,0) >0,5 1000,0 (242,3; 1396) >0,5

Анализ содержания АТ к ТПО не выявил достоверной разницы между группами больных АИТ с различным функциональным состоянием ЩЖ (табл. 3) Полученные результаты согласуются с данными МапоШ в. и соавт. (1990), которые обнаружили наиболее высокие титры АТ к ТПО у больных с манифестным гипотиреозом, но не выявили прямой зависимости от степени выраженности функциональных нарушений ЩЖ.

Исследование содержания антител к нативной и денатурированной ДНК класса 1ц(» в сыворотке крови больных АИТ методом ИФА проведено у 148 больных АИТ, 15 больных СКВ (положительный контроль) и 40 здоровых доноров (отрицательный контроль). Медиана содержания АТ к нДНК в группе больных АИТ составила 5,3 Ед/мя (2,5П - 1,8; 97,5П - 19,2) и была на 116% выше (р<0,001 по критерию Манна-Уитни) значений в группе здоровых - 2,45 Ед/мл (2,5П -1,3; 97,5П- 6,3). В группе больных СКВ уровень АТ к нДНК составил 25,8 Ед/мл (2,5П - 14,85; 97>5П - 35,44) и при сравнении со значением у больных АИТ был достоверно выше (р<0,01 но критерию Манна-Уитни)(рис.2).

26 ■ 20

* о

Рис. 2. Содержание АТ к нДНК класса а сыворотке крови больных АИТ, СКВ и здоровых лиц, полученные методом ИФА • - медиана АТ к нДНК у больных АИТ по сравнению с группой здоровых, р < 0,001 о - медиана АТ к нДНК у больных АИТ по сравнению с группой больных СКВ, р •

0,01

С целью выявления возможных изменений в содержании ДНК-связывающих антител в зависимости от функционального состояния ЩЖ, больные были разделены на группы. Содержание АТ к нДНК у больных АИТ, находившихся в состоянии эутиреоза, составила 5.9 Ед/мл (2,5П - 1,8; 97,5П - 14,3), субклинического гипотиреоза - 6,1 Ед/мл (2,5П - 2,2; 97,511 - 2.4,2), манифестного гипотиреоза - 6,5 Ед/мл (2,511 - 1,8; 97.5П -21,1), субклинического гипертирсоза - 5,2 Ед/мл (2,5П - 2,4; 97,5П -9,2), тиреотоксикоза - 5,3 Ед/мл (2,5П - 1,3; 97,5Г1 - 14,4). Было выявлено повышение данного показателя у больных АИТ, находившихся в стадии эутиреоза, субклинического гипотиреоза, манифестного гипотиреоза, субклинического гипертиреоза и тиреотоксикоза по сравнению с группой здоровых лиц (р<0,05). При этом не выявлено значимых различий по уровню АТ к нДНК в сыворотке крови между группами больных АИТ с разным функциональным состоянием ЩЖ (рис.3). В группах больных АИТ «субклинический гипотиреоз» и «манифестный гипотиреоз» и «тиреотоксикоз» наблюдалось увеличение вариабельности показателей АТ к нДНК и сторону повышения их значений.

АТ к нДНК

о о

Рис. 3. Содержание АТ к нДНК класса ¡%С в сыворотке крови больных ЛИТ в зависимости от функционального состояния щитовидной железы * - содержание АТ к нДНК в группах больных АИТ п зависимости от функционального состояния щитовидной железы по сравнению с группой здоровых, р < 0,05

- сравнение содержания АТ к нДНК между группами больных АИТ в зависимости от функционального состояния щитовидной железы, р > 0,05

Таким образом, больные АИТ характеризовались повышенным уровнем антител к нДНК класса 1^0 в сыворотке крови при исследовании методом ИФА.

Медиана концентрации АТ к дДНК в группе больных АИТ составила 4,32 Ед/мл (2,5П

- 1,4; 97,5П - 9,1) и не отличалась от значений у здоровых лиц - 4,5 Ед/мл (2,511 - 1,8; 97,5П

- 6,75), но была ниже ( р<0,01) показателей в группе больных СКВ - 12,8 Ед/мл (2,5П -10,27; 97,5П- 24,56).

Медиана уровня АТ к дДНК в группах больных АИТ в состоянии эутиреоза составила 4,3 Ед/мл (2,5П - 1,4: 97,5П - 9,1), субклинического гипотиреоза - 2,95 Ед/мл (2,5П - 1,1; 97,5П - 19,1), манифестного гипотиреоза - 3,22 Ед/мл (2,5П - 1,1; 97,511 - 8,8), субклинического гипертиреоза - 4,27 Ед/мл (2,5П - 1,4; 97,5П - 6,4), тиреотоксикоза - 4,2 Ед/мл (2,5П --■ 1,2; 97,5П - 1! ,2). Концентрация АТ к дДНК в группах больных АИТ в состоянии эугиреоза, субклинического гипертиреоза и тиреотоксикоза не отличалась от группы здоровых (р>0,05), тогда как у больных АИТ в состоянии субклинического гипотиреоза и манифестного гипотиреоза данный показатель был ниже по сравнению со здоровыми лицами (р<0,05) Анализ содержания АТ к дДНК в сыворотке крови не выявил значимых различий между показателями в группах больных АИТ с разным функциональным состоянием ЦЦЖ (р>0,05).

Было проведено исследование зависимости между содержанием А'Г к нативной ДНК в сыворотке крови у больных АИТ и степенью активности аутоиммунного процесса в щитовидной железе. Корреляционный анализ показал наличие положительной, нелинейной связи между содержанием АТ к нДНК и АТ к ТПО в сыворотке крови у больных аутоиммунным тиреоидитом (рис.4).

О 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 AT к ТПО (M С/МЛ)

[ ♦ AT к иди К-Экспоненциальный (AT к нДН ю]

Рис. 4. Положительная нелинейная зависимость меж.Оу содержанием AT к ТПО и AT к нДНК в сыворотке кроен больных аутоиммунным тиреоидитом (коэффициент корреляции Спирмена г, = 0,99, р < 0,0001, t фактический - 120,67, t критический - 3.98, коэффициент аппроксимации = 0,87).

Pedro A.B. и соавт. (2006) обнаружили антитела к нативной ДНК у 50% эутирсоидных больных АИТ, уровень которых положительно коррелировал с тигром AT к ТПО и концентрацией тиреотропного гормона. Взаимосвязь между концентрацией антител к нативной ДНК класса IgG и уровнем антител к тиреопероксидазе может указывать на непосредственное участие данных антител в патогенезе аутоиммунной деструкции щитовидной железы.

Анализ содержания ДНК-связывающих антител класса JgG в сыворотке крови у больных АИТ показал преобладание пула антител к нДНК. Полученные результаты согласуются с данными ряда исследователей (Shlomchik et al., 1990; Putterman et al., 1997; Egner et al., 2000), которые считают, что первоначальным в холе аутоиммунного ответа является образование антител к лДИК. Увеличение соматических мутаций по мере развертывания аутоиммунного процесса приводит к выработке B-лимфоцитами антител к нДНК. Базарный и соавт. (2004) отмечают, что среди -здоровых уровень носительства антител к нДНК составил 0 %, антител к дДНК - 8 %, причем наибольшее число «серопозитивных» лиц выявлено в группе женщин старше 50 лет Показано, что антитела к ДНК могут находиться в крови здоровых людей в связанном состоянии, что предполагает наличие системы, способной связывать аутоантитела к ДНК и ингибироватг. их активность. При возникновении нарушений в системе связывания, или ее истощении, проявляется активность аутоантител, что приводит к развитию аутоиммунного процесса (Леках, 1996).

Таким образом, анализ содержания ДНК-связываюших антител в сыворотке крови методом ИФА показал целесообразность определения антител к нативной ДНК класса IgG у больных для диагностики аутоиммунного тиреоидита.

В литературе существует предположение о том, что в норме активность высокоафинных ААТ к нативной ДНК lgG-класса «замаскирована» и регулируется низкоаффинными lgM-аптителами к ДНК на основе антиидиотипического взаимодействия антител. Аутоангитела lgM-класса могут выполнять в организме набор физиологических функций, необходимых для сохранения равновесия между состоянием здоровья и аутоиммунной патологией. Нарушения в работе ангиидиотипической сети могу т приводить к срыву контроля аутореактивности и появлению IgG-AAT к нативной ДНК (S. Lacroix-Desttuwxs et al., 1998). С другой стороны, lgM-антитеда проявляют выраженную полиреактивность и изначально направлены против широкого круга аутоантигенов и антигенов окружающий среды, в том числе инфекционных возбудителей, обладающих свойствами молекулярной мимикрии. Не исключается, что образование аутоантител класса IgG является следствием кросс-реактивности природных (gtvl-антител (C.B. Сучков, 2001).

Мы исследовали содержание антител к нативной ДНК класса ig.M в сыворотке крови 33 больных АИТ и 20 здоровых лиц методом ИФА. Содержание IgM-AT к нДНК у

больных АИТ составила 10,3 Ед/мл (2,5Г1 - 4,3; 97,5П - 33,8) и была на 32 % выше по сравнению с группой здоровых (рис.5). Разделение больных АИТ по функциональному состоянию щитовидной железы выявило тенденцию к снижению уровня IgM-AT к нДНК при манифестном гипотиреозе (рис.6). Можно предположить, что в процессе развития аутоиммунной реакции у больных аутоиммунным тиреоидитом первоначально активно нарабатываются антитела IgM, которые являются «предшественниками» для высокоаффинных IgG-антитед. В ходе аутоиммунной деструкции щитовидной железы уровень IgM-антител снижается и начинают преобладать антитела класса igG, что клинически проявляется развитием манифестного гипотиреоза. С другой стороны, повышение AT к нДНК класса IgM у больных АИТ в стадии эутиреоза и формирующегося субклиничсского гипотиреоза может иметь некий компенсаторный характер. Witte Т. и соавт. (1998) у пациентов СКВ повышение содержания IgM антител к нДНК рассматривали как защитный фактор, снижающий риск развития нефрита. Авторы предполагали, что IgM-антитела связывают циркулирующую нативную ДИК и ингибируюг образование патологических иммунных комплексов, содержащих IgG-антитела, которые вызывают развитие нефрита.

IgM AT нДНК

2 а 20

Рис. 5. Содержание IgM-AT к нДНКв сыворотке крови больных АИТ методом ИФА « - медиана концентрации IgM-AT к нДНК у больных АИТ по сравнению с группой здоровых, р< 0,05

Содержание AT к нативной ДНК класса IgG в сыворотке у больных АИТ методом ИФА было выше по сравнению с группой здоровых, однако показатели не превышали верхней границы референсных значений нормы, которая составляет 20 Ед/мл. В связи с этим проводился поиск альтернативного метода определения антител к нативной ДНК в сыворотке крови больных АИТ. С развитием нанотехнологий активно изучаются возможности использования различного типа биосснсоров для диагностики заболеваний. Для определения антител к нативной ДНК в сыворотке крови в данной работе был применен инновационный метод - нанобиосенсор на основе пьезокварцевого анализатора. Отличительной особенностью пьезокварцевых иммуносенсоров является сочетание высокой чувствительности, определяемой наноуровнем, и селективности. Данный метод обеспечивает возможность прямой иммунной реакции без применения дополнительных ферментных меток, что упрощает процесс анализа и уменьшает вероятность недостоверных результатов.

1дМ АТ нДНК

#л +

* +

# *

15;

10 I

о ■

5 -

Рис. 6. Содержание ¡%М-А Т к нДИК в сыворотке крови больных АИ1 в зависимости от функционального состояния щитовидной железы методом ИФА

И - содержание М-АТ к нДНК в группах больных АИТ в зависимости от функционального состояния щитовидной железы по сравнению с группой здоровых, р < 0,05 * - содержание ^М-АТ к нДНК в группах больных АИТ в зависимости от функционального состояния щитовидной железы по сравнению с группой здоровых, р~> О,05

- сравнение содержания !<>М-ЛТ к нДНК между группами больных АИТ в зависимости от функционального состояния щитовидной железы, р - 0,05

+ - сравнение содержания ¡¿М-АТ к нДНК между группами больных АИТ в зависимости от функционального состояния щитовидной железы, р > 0,05

Определение содержания антител к нДНК в сыворотке крови при помощи пьезокварцевого биосенсора. На начальном этапе определение антител к нДНК проводили с использованием пьезокварцевого бносенсора в газовом режиме. Была проведена иммунизация кроликов комплексом ДНК-ДНКаза I с целью моделирования аутоиммунного заболевания. Методом ИФА было показано, что иммунизация индуцировала образование у кроликов АТ к нДНК: до иммунизации содержание АТ к нДНК в сыворотке крови составило 0,216 + 0,03 опт. ед., после иммунизации - 0,646 + 0,07 опт. ед. (р<0,001). Сыворотки крови иммунизированных животных были протестированы на содержание антител к нДНК с помощью пьезокварцевого ДНК-иммуносенеора. Аналитическим сигналом служил сдвиг частоты колебаний пьезокварцевого резонатора при изменении массы биосенсора вследствие образования на электроде комплекса ДНК-антитело. Сдвиг частоты ДНК-биосенсора при анализе сывороток крови кроликов (разведение 1:50) после иммунизации составил 24,2 + 1,3 Гц, что достоверно выше (р<0,01) по сравнению с сыворотками крови до иммунизации - 6,1 + 2,2 Гц. Таким образом, предварительные исследования иммунизированных кроликов показали возможность использования пьезокварцевого биосенсора для определения антител к нДНК в сыворотке крови.

Следующим этапом с помощью пьезокварцевого иммуноевдеора на содержание АТ к нДНК были исследованы сыворотки крови 30 больных АИТ, 10 больных СКВ и 15 здоровых лиц. Все больные АИТ имели клинические проявления гипофункции щитовидной железы, уровень ТТГ составлял 11,3 мкМЕ/мл (2,5П - 6,9; 97,511 - 24,6), св. Т„ - 9,7 нмоль/л (2,5П -7,2; 97,5П - 10,1) и содержание ЛТ к 'ГПО 821 МЕ/мл (2,5П - 490,6, 97.5Г1 - 1050). Сдвиг частоты биосенсора после инкубации с сывороткой больных АИТ составил 122,1 Гц (2,5П -67,9; 97,5П- 139,7), с сывороткой больных СКВ - 168,7 Гц (2,5П- 127,6; 97,5П - 189,1), ив группе здоровых - 74,1 Гц (2,5П - 50,2; 97,5Г1 - 87,3). При этом сдвиг частоты в группе больных АИТ был достоверно выше (р<0,05) значений, наблюдавшихся у здоровых лиц, но

ниже показателей в группе больных СКВ (р<0,05)(рис.7). Полученные результаты показали, что пьезокварцевый ДНК-иммуносенсор может использоваться для определения АТ к нДНК в сыворот ке крови и позволяет дифференцировать больных АИТ и СКВ от здоровых лиц.

АТ к нДНК

Рис. 7. Сдвиг частоты ДНК-биосенсора при анализе сывороток крови больных АИТ, СКВ и здоровых лиц в газовом режиме.

* - сдвиг частоты биосенсора в группах больных АИТ и СКВ по сравнению с группой здоровых, р<0,005

4 ' сдвиг частоты биосенсора в группе больных АИТ по сравнению с группой больных СКВ, р<0,01

Проточно-инжекционньш режим является более перспективным и активно развивающимся направлением с применением пьезокварцевых биосенсоров (Marx, 2003). В связи с этим ДНК-иммуносенсор был апробирован при ирогочно-инжекционном анализе сывороток крови 30 больных АИТ, 10 СКВ и ¡5 здоровых доноров. Все больные АИТ находились в состоянии гипотиреоза, уровень ТТГ составлял 14,4 мкМЕ/мл (2,5П - 7,6; 97,5П - 25,6), св. Т.| - 8,9 нмоль/л (2,5П - 7,9; 97,511 - 10,1) и содержание АТ к ТПО 783,5 ME/мл (2,5П - 395,6; 97,511 - 1010,0). Сдвиг частоты биосенсора в группе больных АИТ составил 34,1 Гц (2,5П-21,7; 97,5П-62,1) и был выше (р<0,005) по сравнению с показателями в группе здоровых - 4,2 Гц (2,5П-2,2; 97,5П-14,1), и ниже (р<0,01) по сравнению с больными СКВ - 87,5 Гц (2,5П-53,6; 97,5П-100,4) (рис.8).

В процессе анализа различия в сдвиге частоты колебаний пьезокварцевого биосенсора в зависимости от концентрации антител к нДНК в исследуемых сыворотках крови становятся значимыми уже в течение первых 10-15 минут (рис.9).

4 140

5 120

й юо i ^ ео § 60 40 20

АТ к нДНК

Рис. 8. Сдвиг частоты ДНК-биосенсора при анализе сывороток крови больных ЛИТ,

СКВ и здоровых лиц в проточно-инжекционном режиме. * - сдвиг частоты биосенсора в группах больных А ИТ и СКВ по сравнению с группой здоровых, р<0,005

' сдвиг частоты биосенсора в группе больных ЛИТ по сравнению с группой больных СКВ,р<0,01

_ ^ Ввод пробы

Рис. 9. Типичный отклик ДНК-биосенсора в проточно-инжекционном режиме при

анализе сывороток крови больных ЛИТ (2), СКВ (1) и здорового донора (3).

Результаты анализа с использованием пьезокварцевого биосенсора коррелируют с данными иммуноферментного анализа (рис. 10, 11 ).

♦ АИТ Г □ здоровые

10 20 30 40

число наблюдений

Рис. 10. Показатели содержания АТ к нДНК в сыворотке крови у больных ЛИТ и здоровых методом ИФА Нами установлена более высокая специфичность метода определения антител к нативной ДНК с помощью ДНК-иммуносенсора по сравнению с методом ИФА для диагностики аутоиммунного гиреиодита: диагностическая чувствительность метода ИФА составила 94,2%, диагностическая специфичность - 64%, при использовании пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора - 96,6% и 87,5% соответственно (таблица 4).

О 10 20 30 40

число наблюдений

Рис. 11. Показатели сдвига частоты пьезоквар11евого биосенсора в проточно-инжекционном режиме при анализе содержания AT к нДНК в сыворотке крови у больных

ЛИТ и здоровых

В исследованиях Калмыковой E.H. (2007) была показана возможность применения пьезокварцевого биосенсора на основе ДНК для выявления аутоиммунных (СКВ и ревматоидный полиартрит) и инфекционных (иерсиниоз) болезней. Отмечена более высокая чувствительность определения антител с использованием иммуносенсора по сравнению с реакцией пассивной гемагглютинации и иммуноферментным анализом.

Таблица 4.

Сравнение определения антител к натявной ДНК методом ИФА

и с помощью пьезокварцевого ДНК-иммуносенсо ра для диагностики АИТ (%)

ИФА ДНК-иммуносенсор

Диагностическая чувствительность 94,2 96,6

Диагностическая специфичность 64 87,5

11редсказательная ценность 87,8 93

Предсказательная ценность - 92,5 93

Проведенные нами исследования характеризуют анализ с использованием пьезокварцевого биосенсора в проточно-инжекционном режиме как высокоспецифичный, чувствительный, экономичный по времени (экспресс-анализ) и финансовым затратам метод определения антител к нДНК в сыворотке крови, позволяющий дифференцировать больных АИТ и СКВ от здоровых лиц.

Изучение ДНК-гидролизующен активности антител к нативной ДНК. На первом этапе ДНК-гидролизующая активность сывороток крови больных АИТ. СКВ и здоровых лиц оценивалась по способности превращать суперскрученнуто форму нлазмидной ДНК рВЯ 322 в кольцевую и линейную формы. Сыворотки крови предварительно подвергались прогреванию при +56° С в течение 40 минут. На электрофореграмме (рис. 12) видно, что сыворотки крови больных АИТ и СКВ гидролизуют суперскрученную форму ДНК до кольцевой и линейной. В таблице 5 представлены результаты реакции плазмидной ДНК с исследуемыми сыворотками крови: у здорового донора не происходит накопления кольцевой и линейной форм, а у больных АИТ и СКВ суперскрученная форма перешла в кольцевую и линейную, что подтверждает процесс гидролиза ДНК.

Таким образом, АТ сыворотки крови больных АИТ и СКВ проявляют термостабильную ДНК-гидролизующую активность. Полученные результаты согласуются с данными Невзоровой Т.А. и соавт. (2003) о том, что после прогревания при +56° С в течение 40 минут сыворотки крови здоровых лиц утрачивают способность гидролизовать

суперскрученную плазмидную ДНК, тогда как сыворотки больных СКВ ДНК-гидролизующую активность сохраняют.

Таблица 5.

Продукты реакции гидролиза плазмидной ДНК

Время 1 час 3 часа 6 часов

СС* К Л СС К Л СС К Л

аит, 73,4 ГгЦ 0 57,6 42,4 0 21,6 78,4 0

аит2 63,2 36,8 0 28,2 71,8 0 0 93,2 6,8

аитт 69,4 30,6 0 53,8 0 44,6 55,4 0

аит, 68,9 31,1 0 59,9 40,1 0 53,6 46,4 0

СКВ 16,5 83,5 0 0 91,! Г 8,9 0 83,5 16,5

Здоровый донор 90,4 9,6 0 86,0 14,0 0 77,2 22,8 0

Контроль - - - " - - 84,5 15,5

* - формы плазмидной ДНК: СС - суперскрученная: К - кольцевая: Л - линейная.

Таким образом, можно сделать предположение о присутствии термостабильных ДНК-гидролизующих антител в сыворотке крови у больных аутоиммунным тиреоидитом. Результаты согласуются с данными Гололобова Г.В. и соавторов (1995), согласно которым у больных АИТ в сыворотке крови присутствуют иммуноглобулины, обладающие ДНКазной и РНКазной активностью, и уровень активности ДНК-абзимов у больных АИТ коррелирует с клинико-лабораторными показателями. Бреусов A.A. с соавторами (2001) выделили антитела из сыворотки крови, обладающие ДНКазной активностью, у 65 % больных АИТ и показали прямую положительную связь между уровнем активности lg G ДНК-абзимов и концентрацией антител к ТГ. Наибольшую ДНК-гидролизующую активность проявляли антитела сыворотки крови больных АИТ в состоянии гипотиреоза.

СС

к П, П2 Пз

61 36 1 36 136ч Рис. 12. Электрофорешический анализ ДНК-гидролизующей активности AT сывороток крови больных АИТ и СКВ.

К плазмидная ДНК без сыворотки через 6 часов реакции: Я/ — плазмидная ДНК + сыворотка больной АИТ 4: П2 - плазмидная ДНК + сыворотка больной АИТ 3; П3 -плазмидная ДНК + сыворотка больной СКВ

Вторым этапом была проведена оценка способности AT к нДНК, выделенных из сыворотки крови больных АИТ, гидролизовать нативную ДНК эритроцитов цыплят.

По данным большинства исследователей, прог-рессирование клинической картины при аутоиммунных заболеваниях связано с появлением в крови больных патологических AT к нативной ДНК, которые относятся к классу IgG (R.H. Shmerling, 2003; J. Cortes-Hernandez

й а!., 2004). В связи с этим, мы провели выделение 1цС-антител, которое заключалось в осаждении из сыворотки крови сульфатом аммония, гель-фильтрации осадка на

акрилексе Р-6 с последующей очисткой АТ к нативной ДНК методом аффинной хроматографии на микрокристаллической нДНК-целлюлозе.

Электрофорез в полиакриламидном геле показал, что выделенные антитела представляют собой с молекулярной массой 150 кДа. Выделенные АТ к нДНК подвергались совместной инкубации с нативной ДНК при 37°С в течение 18 часов. Для исключения возможного влияния инкубации на изменение длины молекул ДНК проводилось исследование двух препаратов нативной ДНК, один из которых инкубировали при 37° С в течение 18 часов, а другой не подвергали такому воздействию (рис. 13).

2000

I 1500

5 1000

то

I 500 о

Рис. 13. Длина молекул нативной ДИК при взаимодействии с выделенными антителами к нДНК методом АСМ

* - длина молекул ДНК неинкубированных и подвергшихся инкубации при 37 С, р'->0,05

# - сравнение длины молекул ДИК инкубированных без антител и молекул ДИК инкубированных после добавления выделенных AT-IgG, р<0,05

Методом АСМ были получены изображения выделенных антител Ig G шаровидной формы с диаметром 9,8-24,4 нм и средним значением высоты 1,1 нм (рис. 14). На изображениях контрольных препаратов молекулы ДНК имели нитевидную форму с шириной 15,3 нм и высотой 0,71 нм (рис. 15). После инкубации нативной ДНК с выделенными антителами было обнаружено появление низкомолекулярных фрагментов ДНК. Длина молекул ДНК, инкубированных с антителами, составила 295,15 нм (2,5П - 102,25 нм; 97,5 П -1171,27 нм) и была значимо меньше по сравнению с длиной .молекул ДНК контрольных образцов - 806,0 нм (2,5П - 172,45 нм; 97,5П - 1941,5 нм) (р<0,05).

Места посадки антител на нитях ДНК характеризовались большими размерами по сравнению со свободной молекулой ДНК. При этом, одни антитела располагались в центре средних по длине молекул ДНК (рис. 16), а другие - на концах коротких и средних по длине молекул ДНК (рис. 17). Взаимодействие антител к ДНК, выделенных из сыворотки крови больных АИТ, и нативной ДНК имело непроцессивный характер, так как после реализации ДНК-гидролиза молекулы антител оставались связанными с нитью ДНК.

Таким образом, впервые методом атомно-силовой микроскопии визуально показано наличие у больных аутоиммунным тиреоидитом антител к нДНК класса Ig G, проявляющих ДНК-гидролизующую активность. Механизм действия ДНК-гидролизующих АТ носит непроцессивный характер. Исходя из того, что одни из антител располагаюсь в центре средних по длине молекул ДНК, а другие - на концах средних и коротких молекул ДНК, можно предположить наличие у больных АИТ двух типов антител: ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих.

ДНК эритроцитов цыплят

ДНК инкубированные при 37С без AT

ДНК инкубированная при 37С с

добавлением AT

Рис. 14. АСМ-изображения Рис. 15. А СМ- изображение

антител к нДНК (указаны нашивной ДНК эритроцитов

стрелками). цыплят.

Рис 16. АСМ-изображения взаимодействия антител к нДНКсДНК. Локализация антител в центре нитей ДНК показана стрелками.

Рис 17. АСМ-изображения взаимодействия антител к нДНК с ДНК. Локализация антител на концах нитей ДНК показана стрелками.

Результаты исследования согласуются с данными Невзоровой Т.А. (2005), которая также обнаружила непроцессивный характер взаимодействия ДНК и антител, выделенных из сыворотки крови больных системной красной волчанкой. Она высказала предположение, что ДНК-абзимы имеют два участка, один из которых обеспечивает специфичность взаимодействия антител и ДНК, а другой отвечает за реализацию каталитической активности.

Говоря о возможной роли ДНК-абзимов при АИТ, с одной стороны, можно предположить прямой защитный механизм их каталитического действия, который заключается в утилизации избытка нуклеосомной ДНК апоптозных клеток. В литературе имеются сообщения о повышенном уровне ДНК в кровотоке при АИТ (Шевчук, 200-1). С другой стороны, абзимы могут преодолевать клеточную стенку, связываться с нуклеопротеинами и таким образом участвовать в процессах пролиферации и апоптоза клеток (Власов и др., 1999). РепЮп СТ.. и соавторы (2000) выявили антитела к внутриядерному белку р53 в крови у пациентов с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы, что может указывать на повышение поврежедний ДНК и апоптоза при данной патологии.

Патогенетические механизмы развития аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, и в частности аутоиммунного тиреоидита, не ограничиваются органоснсцифическим уровнем. Повышение антител к ДНК у больных АИТ может указывать на вовлечение в патологический процесс более глубоких системных механизмов нарушения аутоиммунитета, что сопряжено с повышенным риском развития системных аутоиммунных заболеваний. Известно, что аутоиммунный тиреоидит в 2,5 раза чаще встречается у больных витилиго (Кокоигоп Т. м а!., 2005), диагностируется у 4% детей с сахарным диабетом 1 типа (Яас1е1П в. с! а!., 1995), сочетается с рассеянным склерозом, ревматизмом, ревматоидным артритом, а также может входить в комплекс аутоиммунного полигландуляркого синдрома (Вейег1е С. е! а1., 2003).

При аутоиммунном тиреоидите встречаются «предранние» внетиреоидные аутоантитела, обладающие низким уровнем аффинности, но способные связываться с антигенами щитовидной железы и оказывать цитотоксический эффект (С1поуа1о Ь. еГ а1„ 2003, \Veetman А.Р., 2005). Имеются основания предполагать, что аутоантитела к нативной ДНК, участвуя в регуляции процесса апоптоза, могут отражать начальные изменения в системе иммунологического надзора и выступать в качестве раннего диагностического признака аутоиммунной патологии.

Методом атомно-сштовой микроскопии показано повреждающее действие ДНК-гидролизующих антител класса ^О на молекулы нативной ДНК, что может указывать на их непосредственное участие в патогенезе аутоиммунного тиреоидита в качестве дополнительного фактора развития патологии. Гидролизуюшие свойства антител к ДНК требуют дальнейшего изучения, поскольку могут иметь не только фундаментальное

значение для более глубокого понимания механизмов развития аутоиммунной патологии, но и найти практическое применение для разработки новых методов иммунодиагностики. Анализ функциональной активности ДНК-абзимов может открыть дополнительные возможности для диагностики аутоиммунного тиреоидита, а исследование ДНК-гидролизующих антител в динамике позволит контролировать течение заболевания и оценивать адекватность проводимого лечения.

Выводы

1. Методом иммуноферментного анализа доказано повышение содержания антител к нативной ДНК класса IgG на 116% и IgM на 31% в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом. В качестве диагностического критерия аутоиммунного тиреоидита целесообразно использовать определение AT к нДНК класса IgG,

2. Содержание антител к нативной ДНК класса Ig G в сыворотке крови больных АИТ положительно коррелирует с уровнем антител к тиреопероксидазе. Отмечено повышение содержания антител к нативной ДНК класса Ig G без существенной разницы между группами больных с различным функциональным состоянием щитовидной железы.

3. Определение AT к нативной ДНК в сыворотке крови на основе нанобиосенсора -пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора может использоваться в качестве экономичного экспресс-метода диагностики аутоиммунных заболеваний (АИТ, СКВ).

4. Диагностическая чувствительность методов определения антител к нДНК в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом с использованием ИФА и пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора существенно не отличалась и составила 94,2 и 96,6 %. Для верификации аутоиммунного тиреоидита диагностическая специфичность метода с использованием пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора составила 87,5 %, что значительно выше по сравнению с иммуноферментным анализом - 64,0 %.

5. Методом атомно-силовой микроскопии показано присутствие в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом антител к нативной ДНК класса IgG, проявляющих ДНК-гидролизующую активность. Установлен непроцессивный механизм действия ДНК-гидролизуюш,их антител.

Практические рекомендации

1. Определение концентрации AT к нДНК класса IgG иммуноферментным методом рекомендуется в качестве дополнительного диагностического критерия аутоиммунного тиреоидита.

2. Льезокварцевый ДНК-иммуносенсор может быть использован в качестве высокоспецифичного и чувствительного экспресс-метода определения AT к нДНК в сыворотке крови больных с аутоиммунными заболеваниями.

3. Метод атомно-силовой микроскопии возможно применять для изучения ДНК-гидролизующей активности антител при аутоиммунных заболеваниях.

Список публикаций

I. Коновалова O.A. Разработка оптимальной иммобилизации покрытий и контроль чувствительных слоев пьезокварцевого наносенсора / O.A. Коновалова, К.Ю. Нагулин, Л.И. Анчикова, Р.Ф. Фахруллин, ЕЛО. Подшивалина // Аналитика России: сб. тез. докл./ Всероссийская конф. по аналитической химии. - Москва, 2004. - С. 103.

2. Коновалова O.A. Возможности диагностики аутоиммунного тиреоидита методом пьезокварцевого микровзвешивания / O.A. Коновалова, А.И. Шагададина, К.Ю. Нагулин, Е.Ю. Подшкваяика, Д.С. Налимов // Структура и динамика молекулярных систем: сб. тез. докл. / Материалы XII Всероссийской конференции. - Йошкар-Ола - Казань - Москва, 2005. -С. 105.

3. Анчикова Л.И. Возможности определения антител к ДНК в крови больных аутоиммунным тиреоидитом с помощью пьезокварцевого биосенсора / Л.И. Анчикова, О А. Коновалова,

А.И. Щагададина, Е.Ю. Подшивалина, К.Ю. Нагулин, В.Г.Винтер, Г.Р. Вагапова, М.Х. Салахов // Ремедиум: Эндокринология. Спец. вып. для врачей. - 2005. - С. 89 - 90.

4. Анчикова Л.И. Применение пьезокварцевого наносенсора и атомно-силового микроскопа для диагностики аутоиммунного тиреоидита / Л.И. Анчикова, Д.С. Налимов, O.A. Коновалова, А.И. Шагададнна, Е.Ю. Подшивалина, К.Ю. Нагулин, Г.Р. Вагапова, В.Г. Винтер, М.Х. Салахов // Сборник статей IX международной молодежной научной школы «Когерентная оптика и оптическая спектроскопия». - Казань, 2005. - Вып. 9. - С. 212 -216.

5. Подшивалина Е.Ю. Каталитические антитела к ДНК у больных аутоиммунным тиреоидитом / Е.Ю. Подшивалина, Л.И. Анчикова, Г.Р. Вагапова, З.И. Абрамова // Материалы X Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века».-М., 2006.-С. 158.

6. Подшивалина Е.Ю. Каталитическая активность антител к ДНК у больных аутоиммунным тиреоидитом / Е.Ю. Подшивалина, Г.Р. Вагапова, З.И. Абрамова // Сб. научн. трудов научно-практ. конференции молодых ученых КГМА. - Казань, 2006. - С. 92 - 93.

7. Фахруллин Р.Ф. Наногравимезрический ДНК-биосенсор: формирование биорецепторной пленки и определение антител к ДНК / Р.Ф. Фахруллин, В.Г. Винтер, З.И. Абрамова, Л.И. Анчикова, Е.Ю. Подшивалина, O.A. Коновалова, К.Ю. Нагулин, М.Х. Салахов // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. - 2006. - №.8 - 9. - С. 69 — 77.

8. Vagapova G.R. Application of new technology of anti-DNA antibodies detection in diagnostics of autoimmune thyroiditis / G.R. Vagapova, L.I. Anchikova, O.A. Konovalova, L.I. Sattarova, E.J. Podshivalina, V.G. Vinter, M.H. Salahov // Materials of 8th European Congress of Endocrinology. -Glasgo, 2006. - P. 843.

9. Подшивалина Е.Ю. ДНК-гидролизующие антитела при аутоиммунном тиреоидите / Е.Ю. Подшивалина // Тезисы докладов XII Всероссийской научно-практ. конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2007. - С. 222 - 223.

10. Коновалова O.A. Исследование иммунных комплексов ДНК-абзим и ДНК при аутоиммунном тиреоидите методом атомно-силовой микроскопии / O.A. Коновалова, Налимов Д.С., Анчикова Л.И., Подшивалина Е.Ю., Невзорова Т.А., Салахов М.Х. // Сборник тезисов XIV Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». -Йошкар-Ола-Казань-Москва, 2007. - С. 119.

11. Подшивалина Е.Ю. Изучение ДНК-гидролизутощей активности антител при аутоиммунном тиреоидите методом атомно-силовой микроскопии / Е.Ю. Подшивалина, Л.И. Анчикова, O.A. Коновалова, Г.Р. Вагапова, Т.А. Невзорова, Д.С. Налимов, Н.И. Акберова, З.И. Абрамова, М.Х. Салахов // Казанский медицинский журнал. - 2007. - Т. 88. -№4,- С. 65-67.

12. Подшивалина Е.Ю. Изучение каталитической активности антител к ДНК при аутоиммунном тиреоидите методом атомно- силовой микроскопии / Е.Ю. Подшивалина, O.A. Коновалова, Г.Р. Вагапова // Сб. научн. трудов научно-практ. Конференции молодых ученых КГМА. - Казань, 2007. - С. 149 - 150.

13. Подшивалина Е.Ю. Изучение ДНК-гидролизующей активности антител при аутоиммунном тиреоидите методом атомно-силовой микроскопии / Е.Ю. Подшивалина, Л.И. Анчикова, O.A. Коновалова, Г.Р. Вагапова, Т.А. Невзорова, Д.С. Налимов, Н И. Акберова, З.И. Абрамова, М.Х. Салахов // Казанский медицинский журнал. - 2008. - Т.89. - № 2. - С. 128- 131.

14. Анчикова Л.И. Новый метод определения ДНК-связывающих аутоантител при аутоиммунном тиреоидите с использованием нанотехнологий / Л.И. Анчикова, Подшивалина Е.Ю., Г.Р. Вагапова, O.A. Коновалова, К.Ю. Нагулин, В.Г. Винтер, Р.Ф. Фахруллин, М.Х. Салахов //Практическая медицина. -2008. -X» 03(27). - С. 22-25.

Слисок сокращений

ААТ - аутоантитела

АИТ - аутоиммунный тиреоидит

АГ - антигены

АТ - антитела

АТ к дДНК - антитела к денатурированной ДНК

АТ к нДНК - антитела к нативной ДНК

АТ к ТГ - антитела к тиреоглобулину

АТ к ТГЮ - антитела к тиреопероксидазе

АСМ - атомно-силовая микроскопия

ДТЗ — диффузный токсический зоб

ИЛ-1р-интерлейкин 1р

ИФА - иммунофермен тный анализ

ИФН-у - интерферон у

ПКР - пьезокварцевый резонатор

Св. Т4- свободный Т4

Св. Тз- свободный Тз

СКВ - системная красная волчанка

ТГ - тиреоглобулин

ТТГ - тиреотропный гормон

ФНО-а — фактор некроза опухоли а

ЩЖ - щитовидная железа

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59,541-76-41,541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением М11ТРРФ. Подписано в печать 24.10.2008г. Усл. п.л 1,5 ЗаказМ К-6586. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать -риюграфия.

Оглавление диссертации Подшивалина, Елена Юрьевна :: 2008 :: Самара

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные представления о патогенезе аутоиммунного тиреоидита.

1.2. Атитела к ДНК и их значение при аутоиммунной патологии.

1.3. Открытие природных аутоантител с функциональным каталитическим ресурсом.

1.4. Новый метод определения аутоантител к ДНК с использованием пьезокварцекого биосенсора.

1.5. Использование атомно-силовой микроскопии в биологии и медицине.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ, ОБЪЕМ И

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объем исследования.

2.2. Определение содержания антител к нативной ДНК и денатурированной ДНК в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа.

2.3. Метод определения антител к нативной ДНК в сыворотке крови с использованием пьезокварцевого биосенсора.

2.3.1. Анализ с помощью пьезокварцевого биосенсора в газовом режиме.

2.3.2. Иммунизация кроликов комплексом ДНК-ДНКаза 1.

2.3.3. Определение антител к нативной ДНК с использованием пьезокварцевого биосенсора в проточно-инжекционном режиме.

2.4. Определение ДНК-гидролизующей активности сывороток крови больных аутоиммунным тиреоидитом, системной красной волчанкой и здоровых лиц.

2.5. Изучение ДНК-гидролизующей активности антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом.

2.5.1. Выделение антител к нативной ДНК из сыворотки крови больных АИТ.

2.5.2. Визуализация взаимодействия ДНК и антител методом атомно-силовой микроскопии.

2.6. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Клиническая характеристика больных аутоиммунным тиреоидитом.

3.2. Определение антител к нативной и денатурированной ДНК класса IgG в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом иммуноферментного анализа.

3.3. Определение антител к нативной ДНК класса IgM в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом иммуноферментного анализа.

3.4. Определение антител к нативной ДНК в сыворотке крови при помощи пьезокварцевого биосенсора.

3.4.1. Определение антител к нДНК с использованием пьезокварцевого биосенсора в газовом режиме.

3.4.1.1. Определение антител к нДНК в сыворотке крови кроликов.

3.4.1.2. Определение антител к нДНК в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом, системной красной волчанкой и здоровых лиц.

3.4.2. Определение антител к нДНК с использованием пьезокварцевого биосенсора в проточно-инжекционном режиме.

3.5. Исследование ДНК-гидролизующей активности сывороток крови больных аутоиммунным тиреоидитом, системной красной волчанкой и здоровых лиц.

3.6. Исследование ДНК-гидролизующей активности антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки больных аутоиммунным тиреоидитом, методом атомно-силовой микроскопии.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Эндокринология", Подшивалина, Елена Юрьевна, автореферат

Актуальность темы. Аутоиммунный тиреоидит (АИТ) относят к одной из наиболее частых форм тиреоидной патологии после йодцефицитных заболеваний щитовидной железы (Валдина Е.А., 2001; Балаболкин М.И., 2002). Большинство исследователей отмечают тенденцию к увеличению заболеваемости АИТ в течение последних десятилетий (Braverman L.E., 1997; Кандрор В.И., 1999). По данным ряда исследователей, от 4 до 11% населения страдает аутоиммунным тиреоидитом (Зефирова Г.С., 1999, Петунина Н.А., 2002). Среди причин первичного гипотиреоза АИТ занимает лидирующую позицию и манифестный первичный гипотиреоз является ведущим клиническим проявлением заболевания (Касаткина Э.П., 1999; Фадеев В.В. и др., 2000). Патогенез аутоиммунных заболеваний, в том числе АИТ, изучен недостаточно. До настоящего времени отсутствуют патогенетически обоснованные подходы в лечении данного заболевания.

Согласно Рекомендациям Российской ассоциации эндокринологов (Дедов И.И. и др., 2003) для диагностики АИТ имеет значение совокупность «больших» диагностических признаков: наличие антител к ткани щитовидной железы, УЗИ-признаков аутоиммунного поражения щитовидной железы и первичного гипотиреоза. В отсутствии хотя бы одного из критериев диагноз АИТ носит вероятностный характер. Однако антитела к тиреопероксидазе (ТПО) могут обнаруживаться при других заболеваниях щитовидной железы, а также у 8-16 % здоровых людей (Mariotti S. Et al., 1990; Ladenson P.W. et al., 2000). Ультразвуковая картина не всегда позволяет дифференцировать АИТ от эндемического и узлового зоба; гипотиреоз может развиться вследствие генетически обусловленных дефектов, а также в рамках эндемического поражения щитовидной железы.

В настоящее время показано методом электрофореза (Невинский Г.А. и др., 2000) и линейного дихроизма (Сучков С.В. и др., 2001), что аутоантитела к ДНК, обладая гидролизующими свойствами ферментов, по-видимому, принимают участие в процессе апоптоза (Сучков С.В. и др., 2001), скорость которого при АИТ многократно возрастает (Кандрор, 2001). Сегодня ДНК-гидролизующие аутоантитела рассматриваются в качестве кандидата одного из ключевых факторов в патогенезе развития аутоиммунного процесса. Изучение этих процессов возможно и требует использования высокоточных и наукоемких технологий.

Определение содержания аутоантител к ДНК в сыворотке крови в настоящее время проводится методом ИФА для диагностики СКВ. В литературе имеется сообщение об обнаружении антител к нативной ДНК в сыворотке крови методом ИФА у 50% больных АИТ в состоянии эутиреоза (Pedro А.В. и др., 2006), что возможно обусловлено низкой чувствительностью метода. В связи с этим, представляло клинический интерес сравнить чувствительность двух методов определения аутоантител к ДНК в сыворотке крови больных АИТ: с помощью ИФА и нанобиосенсора -пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора.

С развитием нанотехнологий активно изучаются возможности использования пьезокварцевого биосенсора для диагностики заболеваний. Метод с использованием пьезокварцевых иммуносенсоров характерезуется сочетанием высокой чувствительности, определяемой наноуровнем, селективности, простотой проведения анализа (Luppa Р.В. et al., 2001; Калмыкова Е.Н., 2007).

Цель работы. Изучить содержание ДНК-связывающих антител в сыворотке крови и их ДНК-гидролизующие свойства в качестве диагностического критерия аутоиммунного тиреоидита.

Задачи исследования.

2. Оценить содержание антител к нативной и денатурированной ДНК класса IgG в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом методом ИФА в зависимости от функционального состояния щитовидной железы и уровня антител к тиреопероксидазе.

3. Провести экспериментальную оценку возможности использования нанобиосенсора - пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора для определения антител к нативной ДНК в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом и системной красной волчанкой.

5. Изучить гидролизующие свойства антител к нативной ДНК, выделенных из сыворотки крови больных АИТ, нанозондовым методом с использованием атомно-силовой микроскопии.

Научная новизна.

Впервые для диагностики аутоиммунных заболеваний, в том числе АИТ, предложен высокочувствительный, специфичный, экономичный экспресс-метод на основе нанобиосенсора - пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора по определению аутоантител к нативной ДНК в сыворотке крови больных; получено значительное повышение AT к нДНК в сыворотке крови у больных АИТ и СКВ.

Впервые методом иммуноферментного анализа проведено изучение содержания AT к нативной и денатурированной ДНК классов IgG и IgM в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом в зависимости от функционального состояния щитовидной железы и уровня антител к тиреоидной пероксидазе. Показано увеличение содержания AT к нативной ДНК у больных аутоиммунным тиреоидитом, что имеет значимость для верификации диагноза.

Впервые применен нанозондовый метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) для визуального изучения взаимодействия молекул нативной ДНК и выделенных из сыворотки крови больных аутоиммунным тиреоидитом аутоантител к нативной ДНК. Установлено присутствие в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом антител к нативной ДНК класса IgG, проявляющих ДНК-гидролизующую активность и имеющих непроцессивный механизм действия.

Результаты исследования, полученные методом атомно-силовой микроскопии, являются основанием для проведения дальнейших исследований патогенетической роли ДНК-гидролизующих антител при аутоиммунном тиреоидите. Научно-практическая значимость.

Определение содержания AT к нативной ДНК класса IgG в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа и отношения AT к нДНК/ AT к дДНК может использоваться в качестве дополнительного диагностического критерия аутоиммунного тиреоидита.

Пьезокварцевый ДНК-иммуносенсор может применяться как высокоспецифичный, чувствительный, экономичный экспресс-метод определения AT к нативной ДНК в сыворотке крови у больных аутоиммунным тиреоидитом и системной красной волчанкой.

Для диагностики аутоиммунных заболеваний (аутоиммунного тиреоидита, системной красной волчанки) рекомендуется внедрять в медицинскую практику методы нанотехнологий с использованием пьезокварцевого биосенсора и атомно-силового микроскопа. Внедрение результатов исследования.

1. Выдан патент РФ на изобретение № 2315313 «Способ определения аутоантител к ДНК и способ диагностики аутоиммунного тиреоидита», приоритет изобретения от 03 марта 2006г.

2. Основные результаты исследования внедрены в практическую деятельность НУЗ «Отделенческая больница на ст. Казань» ОАО «РЖД», ГУ «Межрегиональный клинико-диагностический центр» г. Казань.

3. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры эндокринологии ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Росздрава».

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на XII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола — Казань - Москва, 2005), VIII Европейском конгрессе эндокринологов (Глазго, Англия, 2006), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), научном обществе эндокринологов Республики Татарстан (2007). Публикации результатов исследования.

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, выдан 1 патент РФ на изобретение. Положения, выносимые на защиту.

1. У больных аутоиммунным тиреоидитом в сыворотке крови определяется повышенное содержание AT к нДНК классов IgG и IgM методом иммуноферментного анализа. Содержание антител к нДНК в сыворотке крови больных АИТ имеет взаимосвязь с уровнем антител к тиреопероксидазе.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список литературы содержит 319 источника, из них 79 работ на русском и 240 на иностранном языках. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 20 таблицами.

Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение антител к ДНК и их гидролизующих свойств при аутоиммунном тиреоидите с использованием нанотехнологий"

Выводы

1. Методом иммуноферментного анализа доказано повышение содержания антител к нативной ДНК класса IgG на 116 % и IgM на 31% в сыворотке крови больных аутоиммунным тиреоидитом. В качестве диагностического критерия аутоиммунного тиреоидита целесообразно использовать определение AT к нДНК класса IgG.

3. Определение AT к нативной ДНК в сыворотке крови на основе пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора может использоваться в качестве экономичного экспресс-метода диагностики аутоиммунных заболеваний (АИТ, СКВ).

Практические рекомендации

1. Определение концентрации антител к нативной ДНК класса IgG иммуноферментным методом рекомендуется в качестве дополнительного диагностического критерия аутоиммунного тиреоидита.

2. Пьезокварцевый ДНК-иммуносенсор может быть использован в качестве высокоспецифичного, чувствительного и экономичного экспресс-метода определения антител к нативной ДНК в сыворотке крови больных с аутоиммунными заболеваниями.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Подшивалина, Елена Юрьевна

1. Азаренок К.С. Иммуноглобулины класса G с гиалуронидазной активностью и возможные механизмы их образования / К.С. Азаренок, И.И. Генералов, Э.А. Доценко и др. // Иммунология. 1989. - №2. - С. 15-17.

2. Андриевская О.А. Иммуноглобулины класса М из сыворотки больных системной красной волчанкой эффективно расщепляют РНК / О.А. Андриевская, В.Н. Бунева, В.Г. Забара // Мол. Биол. 1998. - Т. 32 (5). - С. 908-915.

3. Андриевский Р.А. Наноструктурные материалы / Р.А. Андриевский, А.В. Рагуля. М.: Академия, 2005. - 192 с.

4. Базарный В.В. К вопросу о диагностическом значении детекции аутоантител / В.В. Базарный, Е.П. Амон, Н.С. Афонькина и др. // Медицинская иммунология. 2004. - Т. 6. - № 3 - 4. - С. 278 - 279.

5. Балаболкин М.И. Дифференциальная диагностика и лечение эндокринных заболеваний: Руководство / М.И. Балаболкин Е.М. Клебанова, В.М. Креминская. М.: Медицина, 2002. - 752 с.

6. Баранова О.В. Сравнительная клинико-морфологическая характеристика узлового зоба, аденом и аутоиммунного тиреоидита: автореф. дисс. канд. мед. наук / О.В. Баранова. М., 1999. - 25 с.

7. Барановский А.Г. ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из крови больных различными формами вирусного гепатита / А.Г. Барановский, В.Г. Матюшин, А.В. Власов и др. // Биохимия. 1997. - Т. 62. - № 12. - С. 1590-1599.

8. Барановский А.Г. Поликлональные антитела из крови и спинномозговой жидкости больных рассеяным склерозом эффективно гидролизуют ДНК и РНК / А.Г. Барановский, Т.Г. Кашышкова, А.С. Могельницкий и др. // Биохимия. 1998.-Т. 63. -№11.-С. 1459-1469.

9. Березин В.А. Тиреоглобулин / В.А. Березин, J1.B. Гербильский, И.Н. Корниловская // Проблемы эндокринологии. 1993. - №. 4. - С. 54 - 59.

10. Бунева B.H. Динамика уровня нуклеазной активности антител крови женщины во время беременности и лактации / В.Н. Бунева, А.Н. Кудрявцева, А.В. Гальвита и др. // Биохимия. 2003. - Т. 68. - №8. - С. 1088-1100.

11. Вагапова Г.Р. Разработка и внедрение в клиническую практику новых алгоритмов диагностики аутоиммунного тиреоидита: автореф. дисс. докт. мед. наук / Г.Р. Вагапова . Казань, 2007. - 47с.

12. Валдина Е.А. Заболевания щитовидной железы / Е.А. Валдина. С.-Пб.: Питер, 2001.-397 с.

13. Власов А.В. Субстратная специфичность ДНК- и РНК-гидролизующих антител в крови больных полиартритом и аутоиммунным тиреоидитом / А.В. Власов, А.Г. Барановский, Т.Г. Канышкова и др. // Мол. Биол. 1998. - Т. 32. - №3. - С. 559-569.

14. Власов А.В. .Особенности гидролиза тРНК аутоантителами из сыворотки крови больных некоторыми аутоиммунными и вирусными заболеваниями / А.В. Власов, М. Хельм, В.А. Наумов // Мол. Биол. 1999. - Т. 33 (5). - С. 866 -872.

15. Волкова Н.И. По материалам Европейского конгресса «Щитовидная железа и аутоиммунитет» (Нордвик, Нидерланды, июль 2006) / Н.И. Волкова // Клиническая и экспериментальная тиреодология. 2006. - Т. 2. - № 4. - С. 2-9.

16. Галлямов М.О. Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот / М.О. Галлямов, И.В. Яминский. М.: МГУ им. М.В. Ломоносова, центр перспективных технологий, 1998. - 50с.

17. Генералов И.И. Комплексная оценка абзимной активности поликлональных IgG при аутоиммунных, вирусных и онкологическихзаболеваниях / И.И. Генералов // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2000. - №3. - С. 7-12.

18. Генералов И.И. Поликлональные каталитические иммуноглобулины: причины появления, механизмы действия, патогенетическое и клиническое значение / И.И. Генералов // Иммунопатология, аллергология, инфектология.-2002.-№2.-С. 19-37.

19. Герасимов Г.А. Влияние ионизирующей радиации на щитовидную железу / Г.А. Герасимов // Проблемы эндокринологии. 1991. - №. 4. - С. 64 - 68

20. Герасимов Г.А. Йод и аутоиммунные заболевания щитовидной железы / Г.А. Герасимов, Н.А. Петунина // Проблемы эндокринологии. 1993. - №3. -С. 52-54.

21. Глонти С.З. Ультразвуковая доплеросонография в диагностике аутоиммунного тиреоидита: автореф. дисс. канд. мед. наук / С.З. Глонти. -М., 1996.-25 с.

22. Горснова В.А. Иммуноферментный метод определения аутоантител к микросомальным антигенам тиреоцитов человека / В.А. Горснова // Проблемы эндокринологии. 1990. - Т. 36. - №.6. - С. 8 - 11.

23. Дедов И.И. Клинические рекомендации Российской ассоциации эндокринологов по диагностике и лечению аутоиммунного тиреоидита у взрослых / И.И. Дедов, Г.А. Мельниченко, Г.А. Герасимов и др. // Проблемы эндокринологии. 2003. - Т.49. - № 6. - С.50.

24. Добродеева Л.К. Аутоантитела у практически здоровых людей / Л.К. Добродеева, Г.А. Суслонова // Иммунология.- 1990. -№2. -С. 52-55.

25. Зефирова Г.С. Антитиреоидные антитела в диагностике аутоиммунного тиреоидита / Г.С. Зефирова, Г.В. Ибрагимова, Л.В. Кондратьева и др. // Вопросы эндокринологии. -М., 1986. С. 119-121.

26. Зефирова Г.С. Заболевания щитовидной железы / Г.С. Зефирова. — М.: Арт Бизнес - Центр, 1999.-215с.

27. Ибрагимов А.Р. Гены аутоантител / А.Р. Ибрагимов // Мол. Биол. 1989. -Т. 23(1). - С. 5-32.

28. Калмыкова Е. Н. Пьезокварцевые иммуносенсоры для определения биологически активных веществ и клинической диагностики: автореф. . докт. хим. наук / Е.Н. Калмыкова. Воронеж, 2007. - 41 с.

29. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / B.C. Камышников. М.: МЕДпресс-информ, 2004. - С. 124-127.

30. Кандрор В.И. Современные проблемы тиреодологии / В.И. Кандрор // Проблемы эндокринологии. 1999. - №. 1. - С. 3 - 8.

31. Кандрор В.И. Молекулярно-генетические аспекты тиреоидной патологии / В.И. Кандрор // Проблемы эндокринологии. 2001. - Т. 47. - № 5. - С. 3 -10.

32. Касаткина Э.П. Ультразвуковое исследование щитовидной железы / Э.П. Касаткина, Д.Е. Шилин, М. И. Пыков. -М.: Видар, 1999. 56 с.

33. Кит Ю.Я. Существуют ли каталитически активные антитела у здоровых людей? (Протеинкиназная активность slgA антител из молока человека) / Ю.Я. Кит, Д.В. Семенов, Г.А. Невинский // Молекуляр. биология. 1995. - Т. 29.-№4.-С. 893-905.

34. Коликова Ю.О. Аутоантитела к ДНК: половой деморфизм и возрастная динамика их содержания в сыворотке крови здоровых лиц / Ю.О. Коликова, П.В. Фурманова, Д.Г. Ишмухаметова и др. // Иммунология. 2003. - № 4. -С. 250-251.

35. Крюкова И.Б. Тиреоидные антитела при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы и их зависимость от присутствия аутоантигенов / И.Б. Крюкова, Э.Н. Базарова, М.П. Бирюкова и др. // Проблемы эндокринологии. 1998. - №.4. - С. 19 - 22.

36. Кузнецова Н.Н. Методы генной инженерии / Н.Н. Кузнецова, В.Г. Винтер. -М.: Биоинформсервис, 1997. 180 с.

37. Кульберг А.Я. О протеолитической активности в препаратах очищенного иммуноглобулина G и антител кролика / А.Я. Кульберг, Ю.В. Дочева, И.А. Тарханова и др. // Биохимия. 1969. - Т. 34. - № 6. - С. 11781183.

38. Кульберг А.Я. О катаболизме иммуноглобулина G / А.Я. Кульберг, Ю.В. Дочева, М.Н. Свирежева и др. // Вестник АМН СССР. 1970. - Т. 7 - С. 1525.

39. Кульберг А.Я. Влияние IgG с различным сродством к переходным металлам на спонтанную бласттрансформацию in vitro / А.Я. Кульберг, Ю.Б. Беркун, С.Б. Чекнкв // Иммунология. — 1997. № 6. - С.7 - 9.

40. Левит И.Д. Аутоиммунный тиреоидит: (Этиология, патогенез, клиника, диагностика, лечение). — Челябинск, 1991. — 256с.

41. Леках И.В. Антитела к ДНК в препаратах иммуноглобулинов и сыворотках крови здоровых людей находятся в свободном и связанном состояниях / И.В. Леках, A.M. Поверенный // Молекулярная биология. -1996. Т. 30. - №. 3. - С. 707 - 713.

42. Малов В.В. Пьезорезонансные датчики / В.В. Малов // М: Энергоатомиздат, 1986. 272 с.

43. Малюченко Н.В. Исследование структурных особенностей белков прерывисто-контактным методом атомно-силовой микроскопии / Н.В. Малюченко, А.Г. Тоневицкий, М.Н. Саватеев и др. // Биофизика. 2003. -Т. 48. -№5.-С. 830-836.

44. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сембрук. М.: Мир, 1984.-399 с.

45. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии / В.Л. Миронов. Н. Новгород: РАН Институт физики микроструктур, 2004. - 114 с.

46. Невзорова Т.А. Особенности ДНК-гидролизующей активности антител при системной красной волчанке / Т.А. Невзорова, Д.А. Темников, В.Г. Винтер // Биохимия. 2003. - Т.68. - №12. - С. 1616-1623.

47. Невзорова Т.А. ДНК-гидролизующая активность антител к ДНК при системной красной волчанке: автореф. дисс. канд. биол. наук / Т.А. Невзорова. Казань, 2005. - 23 с.

48. Невинский Г.А. Природные каталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии / Г.А. Невинский, Т.Г. Канышкова, В.Н. Бунева // Биохимия.-2000.-Т. 65.-Вып. 6.-С. 1473-1487.

49. Невинский Г.А. Каталитически активные антитела и их возможная биологическая функция / Г.А. Невинский, Т.Г. Канышкова, Д.В. Семенов и др. // Вестник РАМН. 2001. - Т.2. - С. 38-45.

50. Осипов А.П. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.П. Осипов // М.: Высшая школа, 1991. 288 с.

51. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование / Л.А. Остерман. М.: Наука, 1981.-286 с.

52. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. М.: Наука, 1985. - 536 с.

53. Петунина Н.А. Клиника, диагностика и лечение аутоиммунного тиреоидита / Н.А. Петунина // Проблемы эндокринологии. 2002. - Т.48. - № 6.-С. 16-21.

54. Поверенный A.M. Почему антитела к ДНК являются показателем аутоиммунного процесса / A.M. Поверенный // Иммунология.-1986. № 6. -С. 86-88.

55. Потемкин В.В. Эндокринология / В.В. Потемкин. М.: Медицина, 1999. -638 с.

56. Раскин A.M. Аутоиммунные процессы в патологии щитовидной железы / A.M. Раскин. Ленинград, 1973. - 222с.

57. Расовский Б.Л. Система HLA и заболевания щитовидной железы / Б.Л. Расовский, Н.И. Кустова // Проблемы эндокринологии. — 1990. №.5. - С. 85 -90.

58. Рафибеков Д.С. Аутоиммунный тиреоидит. Клинико-иммунологические аспекты и иммунокоррегирующая терапия: автореф. дис. докт. мед. наук / Д.С. Рафибеков. -М., 1995. с.42.

59. Сатарова Л.И. Оптимизация иммуноферментной тест-системы для определения антител к ДНК / Л.И. Сатарова, Л.А. Гафиятуллина, Д.Г. Аглиуллина, В.Г. Винтер // Биотехнология. 1994. - №11-12. — С. 38-41.

60. Сатарова Л.И. Аутоантитела к нуклеиновым кислотам в норме и при развитии опухолей: автореф. дис. канд. биол. наук / Л.И. Сатарова — Казань, 1995.- 16с.

61. Серпуховитин С.Ю. Хирургическое лечение аутоиммунного тиреоидита (лекция) / С.Ю. Серпуховитин // Проблемы эндокринологи. 1992. - №2. - С. 37-39.

62. Сидорская Е.В. Каталитическая активность препаратов IgG при заболеваниях щитовидной железы / Е.В. Сидорская, И.И. Генералов, А.Н. Окороков // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2000. - №1. -С. 57-61.

63. Старкова Н.Т. Клиническая эндокринология / Н.Т. Старкова. М.: Медицина, 1991. -512 с.

64. Сулаева Н.И. Иммуноглобулины приобретают способность взаимодействовать с ДНК после хроматографирования на QAE-сефадексе / Н.И. Сулаева, И.В. Леках, A.M. Поверенный // Биохимия. 1986. - Т. 51. - №. 4.-С. 574-578.

65. Сучков С.В. ДНК-абзимы и механизмы цитотоксичности при СКВ / С.В. Сучков, А.Г. Габибов, Н.В. Глучев // Иммунология. 2001. - №4. - С. 47-51.

66. Сучков С.В. Механизмы цитотксичности анти-ДНК аутоантител / С.В. Сучков//Бюл. Экспер. Биол.-2001.-Т. 131(4).-С. 560-563.

67. Сучков С.В. ДНК-абзимы и их клиническое значение / С.В. Сучков, А.Г. Габибов, З.С. Алекберова // Тер. Архив. 2001. - №10. - С. 58-65.

68. Сучков С.В. Молекулярные основы патогенности ДНК-связывающих аутоантител / С.В. Сучков, Т.Е. Наумова, Е.Б. Третьяк и др. // Иммунология. 2004. - № 2. - С. 115-119.

69. Сучков С.В. Новые механизмы антителоопосредованной цитотоксичности и их возможная роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний / С.В. Сучков, Т.Е. Наумова, Н.А. Хитров и др. // Молекулярная медицина: научно-практический журнал. 2005. - №.1. — С. 32 - 36.

70. Тернер Э. Биосенсоры: основы и приложения / под ред. Э. Тернера // М.: Мир, 1987.-584с.

71. Уроки тиреоидологии: пособие для врачей / под ред. акад. РАЕН М.В. Велдановой. Петрозаводск: ИнтелТек, 2005. - 542 с.

72. Фадеев В.В. Гипотиреоз: Руководство для врачей / В.В. Фадеев, Г.А. Мельническо. М.: РКИ Соверо пресс, 2000. - 216 с.

73. Холодова Е.А. Болезни щитовидной железы: ранние признаки, дифференциальный диагноз / Е.А. Холодова, Л.И. Данилова. Минск: Высшая школа, 1991. - 39 с.

74. Чурилов Л.П. Стимуляция синтеза РНК, ДНК и митотической активности клеток коркового вещества надпочечников специфическими иммуноглобулинами против ядерных антигенов/Л.П. Чурилов. Ленингр. педиатр, мед. ин-т, 1988. - С. 134.

75. Шевчук Н.А. Времяразрешенный иммунофлуоресцентный анализ на ДНК и исследование содержания ДНК в сыворотке человека / Н.А. Шевчук // Вопросы медицинской химии. 2001. - №. 4. - С. 56 - 63.

76. Шустов С.Б. Функциональная и топическая диагностика в эндокринологии / С.Б. Шустов, Ю.Ш. Халимов // С.-Пб.: ЭЛБИ СПб., 2001. -237 с.

77. Aberl F. HIV serology using piezoelectric immunosensor / F. Aberl, H. Wolf, C. Koesslinger, S. Drost, P. Woias, S. Koch // Sens. Actuat. Chem. 1994. - V. 18. -P. 271 -275.

78. Aghini-Lombardi F. The spectrum of thyroid disorders in an iodin-deficient community: the Pescopagano survey / F. Aghini-Lombardi, L. Antonangeli, E. Martino et al. // J. Clin. Metab. 1999. - V. 84 (2). - P. 561-566.

79. Alaejos M.S. Application of amperometric biosensors to the determination of vitamins and a-amino acids / M.S. Alaejos, F.J.G. Montelongo // Chem. Rev. -2004. V. 104. - P. 3239 - 3265.

80. Alberdi F. Cross-reaction of lupus anti-dsDNA antibodies with protein translation factor EF-2 / F. Alberdi, J. Dadone, A. Ryazanov et al. // Clin. Immunol. 2001. - V. 98. - N. 2. - P. 293 - 300.

81. Allen E.M. The effect of iodide infestation on the development of spontaneous lymphocytic thyroiditis in the diabetesprone BB/w rat / E.M. Allen, M.C. Appel, L.E. Braverman//Endocrinology. 1986.-V. 118. - №5.-P. 1977-1981.

82. Amino N. Autoimmunity and hypothyroidism / N. Amino // Baillieres Clin. Endocrin. Metabol. 1988. - V. 2. -N.3. -Р/ 591 - 617.

83. Arscott P.L. Apoptosis and thyroiditis / P.L. Arscott, J.R.Jr. Baker // Clinical Immunology and Immunopathology. 1998. - V.87. - P. 207 - 217.

84. Atashbar M.Z. QCM biosensor with thin polymer film / M.Z. Atashbar, B. Bejcek, A. Vijh et al. // Sensors and Actuator B. 2005. - V. 107. - P. 945-951.

85. Badenhoop K. Susceptibility and resistance alleles of human leukocyte antigen (HLA) DQA1 and HLA DQB1 are shared in endocrine autoimmune disease / K. Badenhoop, P.G. Wolfish, H. Ran et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1995. -V. 80(7).-P. 2112-2117.

86. Ballou S.P. Antinative DNA detection by the Crithidia luciliae method / S.P. Ballou, I. Kushner // Arthritis Rheum. 1979. - V. 22. - P. 321-328.

87. Banga J.P. Immunological and molecular characteristics of the thyroid peroxidase autoantigen / J.P. Banga, P.S. Barnet, A.M. McGregor // Autoimmunity. 1991. -V. 8. - P. 335 -343.

88. Benites M.M. A method of reversible biomolecular immobilization for the surface Plasmon resonance quantitative analysis of interacting biological macromolecules / M.M. Benites, J.S. Jimenes // Anal. Biochemistry. 2002. - V. 302.-P. 161-168.

89. Benvenga S. Circulating thyroid hormone autoantibodies / S. Benvenga, F. Trimarchi, J. Robbins // J. Endocrinol. Invest. 1987. - V. 10. - P. 605.

90. Betterle C. Update on autoimmune polyendocrine syndromes (APS) / C. Betterle, R. Zanchetta // Acta Biomed. Ateneo Parmeuse. 2003. - V. 74. - P. 9 -33.

91. Bijl M. Anti-CD3-induced and anti-Fas-induced apoptosis in systemic lupus erythematosus (SLE) / M. Bijl, G. Horst, P.C. Limburg, C.G. Kallenberg // Clin. Exp. Immunol. 2001. - V. 123. - № 1. - p. 127-132.

92. Binning G. Atomic force microscope / G. Binning, C.F. Quate, C. Gebert // Phys. Rev. Letts. 1986. - V. 56. - P. 930-933.

93. Blatt N.B. Anti-DNA autoantibodies and systemic lupus erythematosus / N.B. Blatt, G.D. Glick // Pharmacol. Therapeut. 1999. - V. 83. - P. 125 - 139.

94. Bootsma H. Prevention of relapses in systemic lupus erythematosus / H. Bootsma, P. Spronk, R. Derksen et al. // Lancet. 1995. - V. 345. - P. 15951599.

95. Bournaud C. Iodine excess and thyroid autoimmunity / C. Bournaud, J.J. Orgiassi // J. Endocrinol. Invest. 2003. - V. 26 (2). - P. 49 - 56.

96. Braverman L.E. Diseases of the thyroid / L.E. Braverman. New Jersey: Yumana Press Totowa, 1997. - 418 p.

97. Bresson D. Localization of the immunodominant region on human thyroid peroxidase in autoimmune thyroid disease: an update / D. Bresson, S.A. Rebuffat, S. Peraldi-Roux // J. Autoimmune Dis. 2005. - V. 2. - P. 2.

98. Bretz J.D. Inflamatory cytokine regulation of Fas-mediated apoptosis in thyroid follicular cells / J.D. Bretz, P.L. Arscott, А. Мус et al. // J. Biol. Chem. -1999. V. 274. - P. 25433 - 25438.

99. Bretz J.D. Apoptosis and autoimmune thyroid disease: following a TRAIL to thyroid destruction? / J.D. Bretz, J.R. Baker // Clin. Endocrinol. 2001. - V. 55 (l).-P. 1-11.

100. Burlingame R.W. The central role of chromatin in autoimmune responses to histones and DNA in systemic lupus erythematosus / R.W. Burlingame, M.L. Boey, G. Starkebaum et al. // J. Clin. Invest. 1994. - V. 94. - P. 184-192.

101. Cabral A. R. Autoantibodies in systemic lupus erythematosus / A.R. Cabral, D. Alarcon-Segovia 11 Curr. Opin. Rheumatol. 1998. - V. 10. - N. 5. - P. 409 -416.

102. Carter R.M. Quartz crystal microbalance detection of Vibrio cholerae О 139 serotype / R. M. Carter, J. J. Mecalanos, M. B. Jacobs, G. J. Lubrano, G. G. Guilbault// J. Immunol. Meth. -1995. V. 187.-P. 121-125.

103. Ceppellini R. A DNA-reacting factor in serum of a patient with lupus erythematosus diffuses / R. Ceppellini, E. Polli, F. Celada // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. - V. 96. - P. 572-574.

104. Cidade G.A.G. Atomic force microscopy as a tool for biomedical and biotechnological studies / G.A.G. Cidade, L.T. Costa, G. Weissmuller et al. // Artificial Organs. 2003. - V.27. - P. 447-451.

105. Chimenti D. Induction of anti-DNA antibodies in preautoimmune NZB x NZW F1 mice by immunization with a DNA-DNase I complex / D. Chimenti, B. Marchini S. Manzini et al. // J: of Autoimmunity. 2000. - V. 15. - P. 9-13.

106. Chiovato L. Antibodies producing complement-mediated thyroid cytotoxicity in patient with atrophic or goitrous autoimmune thyroiditis / L. Chiovato, P. Bassi, F. Santini et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1993. - V. 77. - P. 1700-1705.

107. Chiovato L. Disappearance of humoral thyroid autoimmunity after complete removal of thyroid antigens // L. Chiovato, F. Latrofa, L.E. Braverman // Ann. Intern. Med. 2003. - V. 2 (139). - P. 346 -351.

108. Chrisey L. A. Fabrication of patterned DNA surfaces / L. A. Chrisey, С. E. O'Ferrall, B. J. Spargo, C. S. Dulcey, J. M. Calvert // Nucleic Acids Res. 1996. -V. 24.-№ 15.-P. 3040-3047.

109. Cortes-Hernandez J. Antihistone and anti-double-stranded deoxyribonucleic acid antibodies are associated with renal disease in systemic lupus erythematosus /

110. J. Cortes-Hernandez, J. Ordi-Ros, M. Labrador et al. // Am. J. Med. 2004. - V/ 116.-P. 165- 173.

111. Custro N. Prospective study on thyroid autoimmunity and dysfunction related to chronic hepatitis С and interferon therapy / N. Custro, G. Montalto, V. Scafidi et al. // J. Endpcrinol. Invest. 1997. - V. 20 (7). - P. 374 - 380.

112. Dayan C.M. Chronic autoimmune thyroiditis / C.M. Dayan, G.H. Daniels // N. Engl. J. Med. 1996. - V. 335. - P. 99 - 107.

113. Desai D.D. Antigen specific induction of antibodies against native mammalian DNA in nonautoimmune mice / D.D. Desai, M.K. Krishnan, J.T. Swindle etal:.//J. Immunol. 1993.-V. 151.-P. 1614-1626.

114. Diamond B. The role of somatic mutation in the pathogenesis anti-DNA response / B. Diamond, J.B. Katz, E. Paul et al. // Ann. Rev. Immunol. 1992. -V.10.-P. 731-757.

115. Dvorak J.A. The application of the atomic force microscope to studies of medically important protozoan parasites / J.A. Dvorak, S. Kobayashi, K. Abe et al. // J. Electron. Microsc. 2000. - V. 49. - N. 3. - P. 429 - 435.

116. Egner W. The use of laboratory tests in the diagnosis of SLE / W. Egner // J. Clin. Pathol. 2000. - V. 53. - № 6. - P. 424-432.

117. Eguchi K. Apoptosis in autoimmune disease / K. Eguchi // Intern. Med. -2001. V. 40. - № 4. - P. 275-284.

118. Eila D. Anti-DNA autoantibodies: a puzzle of autoimmune phenomena / D. Eila, Y. Naparstek // Immunology today. 1998. - V. 20(8). - P. 339-342.

119. Emlen W. Accelerated in vitro apoptosis of lymphcytes from patients with systemic lupus erythematosus / W. Emlen, J. Neibur, R. Kadera // J. Immunol. -1994.-V. 152.-P. 3685-3692.

120. Engler H. Diagnostic value of autoantibodies against microsoma thyroid peroxidase (anti-TPO) / H. Engler, W.F. Reisen, B. Keller // Sch-weiz. Med. Wschr. 1992. - V. 122 (51 - 52). - P. 1976 - 1980.

121. Fawcett N. C. A quartz crystal detector for DNA / N. C. Fawcett, J. A. Evans, L.C. Chen, K.A. Drozda, N. Flowers // Anal. Lett. 1988. - V. 21. - P. 10991110.

122. Fenton C.L. Autoantibodies to p53 in sera of patients with autoimmune thyroid disease / C.L. Fenton, A. Patel, M. Tuttle et al. // Ann. Clin. Lab. Sci. -2000.-V. 30- N.2.-P. 179-183.

123. Fisfalen M. Graves' disease and autoimmune thyroiditis / M. Fis'falen, LJ. Degroot // Molecular Endocrinology: Basic concepts and clinical correlations In: Weintraub B.D. ed.. New York: Raven Press, 1995. - P. 313 - 363.

124. Franklin H. E. Antibodies to DNA / H.E. Franklin // The new England Journal of Medcine.- 1998.- V.338 №19. - P. 1359-1368.

125. Frederix P. Atomic force bio-analytics / P. Frederix, T. Akiyamay, U. Staufery et al. // Cur. Opin. Chem. Biol. 2003. - V. 7. - P. 641-647.

126. Fung Y. S. Piezoelectric crystal Piezoelectric crystal for sensing bacteria by immobilizing antibodies on divinylsulphone activated poly-m-aminophenol film / Y. S. Fung, S. H. Si, D. R. Zhu // Talanta. 2000. - V. 51. - P. 151 - 158.

127. Gainan E., Simple goiter and autoimmune thyroiditis: environmental and genetic factors / E. Gainan, R.S. Cooksey, J. Legan // Ckin. Ecol. 1990. - V.3 -№2.- P. 158-166.

128. Garcia R. Dynamic atomic force microscopy methods / R. Garcia, R. Perez // Surface Science Reports. 2002. - V.47. - P. 197-201.

129. Gilkeson G.S. Induction of cross-reactive anti-dsDNA antibodies in preautoimmune NZB/NZW mice by immunization with bacterial DNA / G.S. Gilkeson, A.M. Pippen, D.S. Pisetsky // J. Clin. Invest. 1995. - V. 95. - N. 3. -P. 1398- 1402.

130. Gilliam A.C. Antibodies to double-stranded DNA: purification and characterization of binding specificies / A.C. Gilliam, D. Lang, J.J. Lo Spalluto // J. of Immunol. 1980. - V. 125. - P. 2874 - 2885.

131. Giordano C. Potential involvement of Fas and its ligand in the pathogenesis of Hashimoto's thyroiditis / C. Giordano, G. Stassi, R. De Maria et al. // Science. -1997.-V. 275.-P. 960-965

132. Gololobov G.V. DNA-protein comolexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies / G.V. Gololobov, S.Y. Mikhalap, A.V. Starov et al. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. -V. 47. - P. 305-315.

133. Gololobov G.V. Cleavage of supercoiled plasmid DNA by autoantibody Fab-fragment: application of the linear dichroism technique / G.V. Gololobov, E.A. Chernova, D.V. Schourov et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. -P. 254-257.

134. Hammond L. J. Analysis of apoptosis in relation to tissue destruction associated with Hashimoto's autoimmune thyroiditis / L.J. Hammond, M.W. Lowdell, P.G. Cerrano et al. // J. of Pathology. 1997. - V. 182. -P. 138 - 144.

135. Hanh B.H. Antibodies to DNA / B.H. Hanh // New Engl. J. Med. 1998. - V. 338. - №7. -P. 1359-1368.

136. Hansma H.G. Surface biology of DNA by atomic force microscopy / H.G. Hansma // Annu. Rev. Phys. Chem. 2001. - V. 52. - P. 71-92.

137. Herrmann M. Etiopathogenesis of systemic lupus erythematosus / M. Herrmann, R.E. Voll, J.R. Kalden // Immunol. Today. 2000. - V. 21. - N. 9. - P. - 424 - 426.

138. Hg H.P. Induction of autoimmune thyroiditis and hypothyroidism by immunization of immunoactive T-cell epitope of thyroid peroxidase / H.P. Hg, W.C. ICung // Endocrinology. 2006. - V. 147. - P. 3085 - 3092.

139. Hidaka Y. Increase in peripheral natural killer cell activity in patients with autoimmune thyroid disease / Y. Hidaka, N. Amino, Y. Iwatani et al. // Autoimmunity. 1992. - V. 11. - P. 239 - 246.

140. Hiemstra H.S. Cytomegalovirus in autoimmunity: T-cell crossreactivity to viral antigen and autoantigen glutamic acid decarboxylase /H.S. Hiemstra, N.C. Schloot, P.A. van Veelen et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. -N. 7.-P.-3988-3991.

141. Hoch S. Frequency of anti-DNA antibody produsing cells from normal and patients with sistemic lupus erythematosus / S. Hoch, P.H. Schur, J. chwaber // Clin. Immunol. Immunopathol. 1983. - V. 27(1). - P. 28 - 37.

142. Holborow J. A serum factor in lupus erythematosus with affinity for tissue nuclei / J. Holborow, D.M. Weir, G.D. Jonson // B.M.J. 1957. - V.2. - P. 732734.

143. Hoshino Y. Effect of ultrasound on DNA polymerase reactions: monitoring on a 27-MHz quartz crystal microbalance / Y. Hoshino, T. Kawasaki, Y. Okahata // Biomacromolecules. 2006. - V. 7. - P. 682 - 685.

144. Hu J. Imaging of single extended DNA molecules on flat (aminopropyl) triethoxysilane-mica by anomic force microscopy / J. Hu, M. Wang, H.-U. Weier //Langmuir. 1996. - V. 12. - №. 7.-P. 1697-1700.

145. Hunt P. Histocompatibility leucocyte antigens and closely immunomodulatory genes in autoimmune thyroid disease / P. Hunt, S.E. Marshall, A.P. Weetman et al. // Clin. Endocrinol. 2001. - V. 55. - P. 491 - 499.

146. Itoh N. Effect of Bcl-2 on Fas-mediated cell death / N. Itoh, Y. Tsujimoto, S. Nagata // J. Immunol. 1993. - V. 151. - Р/ 239 - 248.

147. Jacobs M.B. A piezoelectric biosensor for listeria monocytogenes / M. B. Jacobs, R. M. Carter, G. J. Lubrano, G. G. Guilbault // Am. Lab. 1995 - V. 27. -P. 26-28.

148. Jerne N.K. Towards a network theory of the immune system / N.K. Jerne // Ann. Immunol. Paris. 1974. - V. 125(1-2). - P. 373-389.

149. Jokoyama N. Thyroid peroxidase and thyroid microsomal autoantibodies / N. Jokoyama, A. Taurog, G. Klee // J. Clin. Endocrinol. 1989. - V. 68. - №.4. - P. 766-773.

150. Kawakami A. Thyroid-stimulating hormone inhibits Fas sntigen-mediated apoptosis of human thyrocytes in vitro / A. Kawakami, Eguchi K., N. Matsuoka et al. //Endocrinology. 1996. -V. 137. - P. 3163 -3168.

151. Kawakami A. Modulation of Fas mediated apoptosis of human thyroid epithelial cell by Ig G from patients with Graves' disease and idiopathic myxedema / A. Kawakami, K. Eguchi, N. Matsuoka et al. // Clin. Exp. Immunol. 1997. - V. 110. - P. 434 - 439.

152. Koesslinger C. Quartz crystal microbalance for immunosensing / C. Koesslinger, S. Drost, F. Aberl, H. Wolf// J. Anal. Chem. 1994. - V. 349. - P. 349-354.

153. Kohno Y. Autoantibodies to thyroid peroxidase in patients with chronic thyroiditis: effect of antibody binding on enzyme activities / Y. Kohno, Y. Hiyama, N. Shimojo et al. // Clin. Exp. Immunol. 1986. - V. 65. - №. 3.- P. 534 - 541.

154. Kohno Y. Thyroglobulin and thyroid peroxidase share common epitops recognized by autoantibodies in patients with chronic autoimmune thyroiditis / Y. Kohno, N. Naito, Y. Hiyama et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1988. - V. 67. -P. 899-907.

155. Kokouron Т. Increase prevalence of chronic autoimmune (Hashimoto's) thyroiditis in children and adolescents with vitiligo / T. Kokouron, C. Kanaka-Gantenbein, A. Papadopoulou // J. of the American Acad, of Dermatol. 2005. — V. 53(2).-P. 220-223.

156. Konig B. Development of a piezoelectric immunosensor for the detection of human erythrocytes / B. Konig, M. Gratzel // Anal. Chim. Acta. 1993. - V. 276. -P. 329-333.

157. Konig B. Detection of human T-lymphocytes with a piezoelectric immunosensor / B. Konig, M. Gratzel // Anal. Chem. 1993. - V. 281. - P. 13-18.

158. Konig B. A novel immunosensor for herpes viruses / B. Konig, M. Gratzel // Anal. Chem. 1994. - V. 66. - P. 341-344.

159. Konig B. A piezoelectric immunosensor for hepatitis viruses / B. Konig, M. Gratzel // Anal. Chim. Acta. 1995. - V. 309. - P. 19 -25.

160. Kotani T. Apoptosis in thyroid tissue from patients with Hashimoto's thyroididtis / T. Kotani, Aratake Y., K. Hirai et al. // Autoimmunity. 1995. - V. 20(4).-P. 231 -236.

161. Kozyr A.V. Novel functional activities of anti-DNA autoantibodies from sera of patient with lymphoproliferative and autoimmune desease / A.V. Kozyr, A.V. Kolesnikov, E.S. Aleksandrova et al. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. - V. 75(1).-P. 45-61.

162. Kozyr A.V. Autoantibodies to nuclear antigens: correlation between cytotoxicity and DNA-hydrolyzing activity / A.V. Kozyr, A.V. Kolesnikov, N.A. Zelenova//Appl. Biochem. Biotechnol. -2000. -V. 83(1-3). P. 255-268.

163. Knudsen N. Variation of ultrasonography of the thyroid gland for epidemiological purposes / N. Knudsen, B. Bols, I. Buelov et al. // Thyroid. -1999. V. 9(11). - P. 1069-1074.

164. Krieg A.M. Review: Retroviruses and autoimmunity / A.M. Krieg, A.D. Steinberg // J. Autoimmun. 1990. - V. 3. - P. 137 - 166.

165. Kuhr Т. Genetically determined target organ susceptibility in the pathogenesis aberrant expression of МНС-class II antigens and the possible role of virus / T. Kuhr, K. Hala, H. Dietrica et al. // J. Autoimmun. 1994. - V. 7. - P. 13 - 25.

166. Lacroix-Desmazes S. Self-reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals / S. Lacroix-Desmazes, S.V. Kaveri, L. Monton et al. // J. Immunol. Methods. 1998.-V. 216. - №1-2.-P. 117-137.

167. Lacroix-Desmazes S. The prevalence of proteolytic antibodies against factor VIII in hemophilia A / S. Lacroix-Desmazes, J. Bayry, N. Misra et al. // New Engl. J. Med. 2002. - V.346. - №9. - P. 662-667.

168. Lacroix-Desmazes S. Pathophysiology of catalytic antibodies / S. Lacroix-Desmazes, B. Wootla, S. Delignat et al. // Immunol. Lett. 2006. - V. 28. - N. 103 (l).-P. 3-7.

169. Ladenson P.W. American Thyroid Association Guidelines for Detection of Thyroid Dysfunction / P.W. Ladenson, P.A. Singer, K.B. Ain et al. // Arch Intern Med. 2000. - V. 160.-P. 1573-1575.

170. Latrofa F. Thyroglobulin-thyroperoxidase autoantibodies are polyreactive, not bispecific: analysis using human monoclonal autoantibodies / F. Latrofa, P. Pichurin, J. Guo et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003. - V. 88. - P. 371 -378.

171. Leclere J. Stress and autoimmune endocrine disease / J. Leclere, G. Weryha // Hormone Res. 1989. - V. 31/ - №. 1. - P. 90 - 93.

172. Letkowith J.B. Heterogeneity and clinical significance of glomerular-binding antibodies in systemic lupus erythematosus / J.B. Letkowith, M. Kiehl, J. Rubenstein et al. // J. Clin. Invest. 1996. - V. 98. - P. 1373-1380.

173. Li L. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies / L. Li, S. Kaveri, S. Tyutyulkova et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1995. - V. 29. - N. 764. - P. 570 -572.

174. Lin J.D. The role of apoptosis in autoimmune thyroid disorders and thyroid cancer / J.D. Lin // B.M.J. 2001. - V. 322. - P. 1525 - 1527.

175. Lion G. Anticorps anti-peroxidase en pathologie thyroidienne / G. Lion, L. Tilmaut, P. Fialdes et al. // J. Med. Nucl. et Biophys. 1992. - V. 16. - №. 3. - P. 277.

176. Litman R.M. A deoxyribonucleic acid polymerase from Micrococcus luteus (Micrococcus lysodeikticus) isolated on deoxyribonucleic acid- cellulose / R.M. Litman//J. Biol. Chem. 1968. -V. 243. - P. 6222-6233.

177. Liu G. High-resolution imaging of bacteria by atomic force microscopy / G. Liu, S. Mobashery // Abstr. Intersci Conf. Antimicrob. Agents Chemother. 1999. -V. 39.-P. 757.

178. Liu Y.-C. Comparison of Different protein immobilization methods on quartz crystal microbalance surface in flow injection immunoassay / Y.-C. Liu, C.-M. Wang, K.- P. Hsiung // Anal. Biochem. 2001. - V. 299. - P. 130-135.

179. Lisi S. Thyroglobulin in orbital tissues from patients with thyroid-associated ophthalmopathy: predominant localization in fibroadipose tissue / S Lissi, M. Marino, Pinchera A. et al. // Thyroid. 2002. - V. 12. - P. 351 - 360.

180. Loviselli A. Circulating antibodies to DNA-related antigens in patients with autoimmune thyroid disorders / A. Loviselli, F. Vellizzi, R. Pala et al. // Autoimmunity. 1992. - V. 14 (1). - P. 33 - 36.

181. Lundell G. Thyroid antibodies and hypothyroidism in I therapy for hyperthyroidism / G. Lundell, Jonsson J. // Acta Radiol. 1973. - V. 12. - P. 443.

182. Luppa P.B. Immunosensors principles and applications to clinical chemistry / P.B. Luppa, L. J. Sokoll, D.W. Chan // Clinica Chimica Acta. - 2001. - V. 314. -P. 1-26.

183. Madaio M.P. Cellular penetration and nuclear localization of anti-DNA antibodies: mechanisms, consequences, implication and applications / M.P. Madaio, K. Yanase // J. Autoimmun. 1998. - V. 11. - P. 535 - 538.

184. Mahmoud I. Direct toxic effect iodine in exess an iodine-deficient thyroid glands / I. Mahmoud, I. Colin, M. Many et al. // Exp. Mol. Pathol. 1986. - V. 44. - P. 259-271.

185. Makowsky G.S. Selective detection of autoimmune antibodies to single- and double- stranded DNA by enzyme immunoassay /G.S. Makowsky, M. Ramsby // Anal. Clin. Lab. Sci.-2003. V. 33(2).-P. 142-148.

186. Mariotti S. Antithyroid peroxidase autoantibodies in thyroid disease / S. Mariotti, P. Caturegli, P. Piccolo et. al. // J. of clin. Endocrinol. And metabol. -1990.-V. 71.-P. 661 -669.

187. Marx K.A. Quartz crystal microbalance: a useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution-surface interface / K.A. Mark // Вiomacromolecules. 2003. - V. 4(5). -P. 1099-1120.

188. Mason L.J. Immunopathogenesis of SLE / L.J. Mason, D.A. Isenberg // Baillieres Clin. Rheum. 1998. -V. 12(3). - P. 385-403.

189. McGregor A.M. Carbimazole and autoantibody synthesis in Hashimoto's thyroiditis / A.M. McGregor et al. // Brit. Med. J. 1980. - V. 281 (6246). - P. 968 -969.

190. McLachlan S.M. The molecular biology of thyroid peroxidase: cloning, expression and role a autoantigen in autoimmune thyroid disease / S.M. McLachlan, B. Rapoport // Endocr. Rev. 1992. - V. 13. - P. 192 - 206.

191. McLachlan S.M. Why measure thyroglobulin autoantibodies rather than thyroid peroxidase autoantibodies? / S.M. McLachlan, B. Rapoport // Thyroid. -2004. V. 14 (7). - P. 510 - 520.

192. Minunni M. A quartz crystal microbalance displacement assay for Listeria monocytogenes / M. Minunni, M. Mascini, R. M. Carter, M. B. Jacobs, G. J. Lubrano, G. G. Guilbault / Anal. Chim. Acta. 1996. - V. 325. - P. 169-174.

193. Misaki Y. Mechanism of autoantibody production / Y. Misaki // Rinsho Biori. -2001.-V. 49. -№6.-P. 556-570.

194. Mohan C. Lupus: key pathogenic mechanisms and contributing factors / C. Mohan, S.K. Datta // Clin. Immunol. Immunopathol. 1995. - V. 77. - P. 209220.

195. Moreno-Herrero F. DNA height in scanning force microscopy / F. Moreno-Herrero, J. Colchero, A.M. Baro // Ultramicroscopy. 2003. - V. 96. - P. 167-174.

196. Morimoto C. Correlation between clinical activity of systemic lupus erythematosus and the amounts of DNA in DNA/anti-DNA antibody immunocomplexes / C. Morimoto, H. Sano, T. Abe et al. // J. Immunol. 1982. -V. 132.-P. 1960-1965.

197. Muller D.J. Biomolecular imaging using atomic force microscopy / D. J. Muller, K. Anderson // Trends Biotechnol. 2002. - V. 20. - №. 8. - P.46.49.

198. Muramatsu H. Piezoelectric biosensor system for detection of E. coli / H. Muramatsu, Y. Watanabe, M. Hikuma, T. Ataka, I. Kubo, E. Tamiya, I. Karube // Anal. Lett. 1989. -V. 22. - P. 2155-2166.

199. Okosieme O.E. Thyroglobulin autoantibodies in iodized subjects: relationship between epitope specificities and longitudinal antibody activity / O.E. Okosieme,

200. D. Premawardhana, A. Jayasinghe et al. // Thyroid. 2005. - V. 15 (9). - P. 1067- 1072.

201. O' Sullivan C.K. Commercial quartz crystal microbalances theory and applications / C.K. O' Sullivan, G.G. Guilbault // Biosens. Bioelectron. -1999. -V.14. - P. 663-670.

202. Patel V.A. Apoptosis during goiter involution the role of Bcl-2 / V.A. Patel, D.J. Hill, M.C. Sheppard et al. II J. Endocrinol. - 2000. - V. 164. - P. 323 - 330.

203. Paul S. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody / S. Paul, D. Voile, C. Beach // Science. 1989. - V. 244 (4090). - P. 1158-1162.

204. Paul S. Characterization of thyroglobulin-directed and polyreactive catalytic antibodies in autoimmune disease / S. Paul, L. Li, R. Kalaga et al. // J. Immunol. 1997.-V. 1. — N. 159.-P. 1530- 1536.

205. Paul S. Mechanism and functional role of antibody catalysis / S. Paul // Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. - V. 75 (1). - P. 13-24.

206. Pearce E.N. Thyroiditis / E.N. Pearce, A.P. Farwell, L.E. Braverman // New England J. of Medicine. 2003. - V. 348. - P. 2646 - 2655.

207. Pinchera A. Iodine and autoimmune thyroid disease. In: Iodine prophylaxic following nuclear accidents / A. Pinchera, G. Fenzi, S. Mariotti et al. // Oxford: Pergamon Press, 1988. P. 39 - 44.

208. Pisetsky D.S Specificity and immunochemical properties of antibodies to bacterial DNA / D.S. Pisetsky // Methods. 1997. - V. 11. - P. 55 - 61.

209. Pisetsky D.S. Antibody responses to DNA in normal immunity and aberrant immunity / D.S. Pisetsky // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. - V. 5. -N. 1. - P. 1-6.

210. Pisetsky D.S. Anti-DNA and autoantibodies / D.S. Pisetsky // Curr. Opin. Rheumatol. 2000. - Vol. 12.-N. 5. - P. 364 - 368.

211. Pisetsky D.S. Immune response to DNA in systemic lupus erythematosus / D.S. Pisetsky // Isr. Med. Assoc. J. 2001. - V. 3. - N. 11. - P. 850 - 853.

212. Pope L.H. Atomic force microscopy studies of intercalation-induced changes in plasmid DNA tertiary structure / L.H. Pope, M.C. Davies, C.A. Laughton et al. // J. of microscopy. 2000. - V. 199. - P. 68-78.

213. Prusak-Sochaczewski E. Development of piezoelectric immunosensor for the detection of Salmonella typhimurium / E. Prusak-Sochaczewski, J. H. Loung, G.G. Guilbault//Enzyme Microb. Technol. 1990. - V.12. -P.173-177.

214. Putterman C. The structure and derivation of antibodies and autoantibodies / C. Putterman, P. Kuo, B. Diamond In: Wallace D.I., Hanh B.H., eds. // Dubois' lupus erythematosus. 5thed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1997. P. 383-396.

215. Putterman C. New approaches to the renal pathogenicity of anti-DNA antibodies in systemic lupus erythematosus / C. Putterman // Autoimmun. Rev. -2004.-V. 3.-P. 7- 11.

216. Pyun E.H. The fine specificity of monoclonal anti-DNA antibodies induced in normal mice by immunization with bacterial DNA / E.H. Pyun, D.S. Pisetsky, G.S. Gilkeson // J. Autoimmun. 1993. - V. 6. - P. 11-26.

217. Quismorio F.P.Jr. Clinical application of serologic abnormalities in systemiclupus erythematosus / F.P. Quismorio In: Wallace D.I., Hanh B.H., eds. //th

218. Dubois' lupus erythematosus. 5 ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1997. P. 925-942.

219. Radetti G. Frequency of Hashimoto's thyroiditis in children with type 1 diabetes mellitus / G. Radetti, C. Paganini, L. Gentili et al. // Acta Diabetologica. 1995. - №.2. - V. 32. - P. 121 - 124.

220. Rand J. H. Human monoclonal antiphospholipid antibodies disrupt the annexin A5 anticoagulant crystal shield on phospholipid bilayers // J.H. Rand, X.-X. Wu, A.S. Quinn et al. // Amer. J. of Patol. 2003. - V. 163. - P. 1193 - 1200.

221. Rapoport B. Thyroid autoimmunity / B. Rapoport, S.M. McLachlan // J. of Clinical Investigation.-2001.-V. 108.-P. 1253-1259.

222. Rebuffat S.A. The key residues in the immunodominant region 353 363 of human thyroid peroxidase were identified / S.A. Rebuffat, D. Bresson, B.Nguyen et al.//Int. Immunol. - 2006. - V. 18 (7).-P. 1091 - 1099.

223. Reeves W.H. Systemic lupus erythematosus: antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones / W.H. Reeves,M. Satoh, J. Wang et al. // Rheum. Dis. Clin. North Am. 1994. - V. 20. - P. 1-28.

224. Reichlin M. Characterization of anti-dsDNA antibodies: crossreaction with SnRNP polypeptides and cell-binding abilities / M. Reichlin, B. Hahn, E. Koren // The Immunologist. 1995. - V. 3. - N. 3. - P. 84-88.

225. Renee L. Piezoelectric quartz crystal biosensors / L. Renee, L. Bunde, E.J. Jarvi, J.J. Rosentreter // Talanta. 1998. - V. 46. - P.1223-1236

226. Ridgway W. M. Regulation of autoimmune response / W. M. Ridgway, H.L. Weiner, G.G. Fathman // Current Options in Immunology. 1994. - V.6. - P. 946 -955.

227. Robbins W.C. Complement fixation with cell nuclei and DNA in lupus erythematosus / W.C. Robbins, H.R. Holman, H. Deicher et al. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. - V. 96. - P. 575-579.

228. Rocco A. Incidence of autoimmune thyroiditis in interferon-alpha treated and untreated patients with chronic hepatitis С virus infection / A. Rocco, S. Gargano, A. Provenzano et al. // Neuroendocrinol. Lett. 2001. - V. 22 (1). - P. 39 - 44.

229. Rodien P. Antibody-depended cell-mediated cytotoxicity in autoimmune thyroid disease: relationship to antithyroperoxidase antibodies / P. Rodien, A.M. Madec, J. Ruf et al. // J. Clin. Metab. 1996. - V. 81 (7). - P. 2595 - 2600.

230. Rose N.R. Studies on organ specificity: changes in the thyroid glands of rabbit following active immunization with rabbit thyroid extracts / N.R. Rose, E. Witebsky//J. Immunol. 1956. -V. 76. - P. 417-427.

231. Rose N.R. The role of iodine in autoimmune thyroiditis / N.R. Rose, A.M. Saboori, L. Rasooly et al. // Crit. Rev. Immunol. 1997. - V. 17 (5 - 6). - P. 511 -517.

232. Rose N.R. Linking iodine with autoimmune thyroiditis / N.R. Rose, L. Rasooly, A.MK. Saboori et al. // Environ Health Perspect. 1999. - V. 107(5). -P. 749-752.

233. Rose N.R. Linking iodine with autoimmune thyroiditis / N.R. Rose, L. Rasooly, A.M. Saboori et al. // Environmental healt perspectives. 1999. - V. 107 (5).-P. 749-752.

234. Rose N.R. Autoantibodies to thyroglobulin in health and disease / N.R. Rose, Burek C.L. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2000. - V. 83 (1 - 3). - P. 245 - 251.

235. Roth C. Autoimmune thyroiditis in childhood: epidemiology, clinical and laboratory findings in 61 patients / C. Roth // Exptl. Clin. Endocrinol. Diab. -1997.-V. 105 (4).-P. 66-69.

236. Rubin R.L. Anti-DNA activity of IgG F(ab)' from normal human serum / R.L. Rubin, R.I. Carr // J. Immunol. 1979. -V. 122.-P. 1604-1607.

237. Ruf J. Bispecific thyroglobulin and thyroperoxidase autoantibodies in patients with various thyroid and autoimmune disease / J. Ruf, U. Feldt-Rasmussen, L. Hegedus et al. // J. clin. Endocrinol. And metabol. 1994. - V. 79. - №. 5. - P. 1404-1409.

238. Saboori A.M. Peptides of human thyroglobulin reactive with sera of patients with autoimmune thyroid disease / A.M. Saboori, N.R. Rose, S.C. Yuhasz et al. //The J. of Immunol. 1999. - V. 163.-P. 6244-6250.

239. Sany J. Pathogenic role of antinuclear antibodies in lupus disease / J. Sany // Ann. Med. Intern. 1990. -V. 141. - P. 222-226.

240. Sato M.N. Changes in the Plasmodium chabaundi and their implications in the reversal of clinical symptoms / M.N. Sato, P. Minoprio, S. Avrameas et al. // Clin. Exp. Immunol. 2000. - V. 119. - N. 2. - P. 333 - 339.

241. Sauerbrey G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wagung Dunner Schichten und zur Mikrowagung / G. Sauerbrey // Z. Physik. 1959. - V. 155. - P. 206-222.

242. Shlomchik M. Anti-DNA antibodies from autoimmune mice arise by clonal expansion and somatic mutation / M. Shlomchik, M. Mascelli, H. Shan et al. // J. Exp. Med.-1990.-V. 171.-№ l.-P. 265-292.

243. Shokat K.M. A new strategy for the generation of catalytic antibodies / K.M. Shokat, C.J. Leumann, R. Sugasawara et al. // Nature. 1989. - V. 338. - P. 269271.

244. Shons A. An immunospecific microbalance / A. Shons, F. Dorman, J. Najarian // J. Biomed. Mater. Res. 1972. - V. 6. - P. 565-570.

245. Smeenk R.J.T. Anti-dsDNA: choice of assay in relation to clinical value / R.J.T. Smeenk, H.G. van der Brink, K. Brinkman et al. // Rheumatol. Int. 1991. -V.ll.-P. 101-107.

246. Shmerling R.H. Autoantibodies in systemic lupus erythematosus there before you know it / R.H. Shmerling // N. Engl. J. Med. - 2003. - V. 349 (16). - P. 1499-1500.

247. Shuster A.M. DNA hydrolyzing autoantibodies / A.M. Shuster, G.V. Gololobov, O.A. Kvashuk et al. // Science. 1992. - V. 256. - P. 665-667.

248. Sinclair D. Clinical and laboratory aspects of thyroid autoantibodies / D. Sinclair//Ann. Clin. Biochem. -2006. V. 43. - P. 173 - 183.

249. Sinohara H. Does catalytic activity of Bence Jones proteins contribute to the pathogenesis of multiple myeloma? / H. Sinohara, K. Matsuura // Chemistry. -2001. V. 7(21). - P. 4604-4612.

250. Sreelekha T.T. In situ apoptosis in the thyroid / T.T. Sreelekha, V.M. Pradeep, K. Vijayalakshmi et al. // Thyroid. 2000. - V. 02. - N. 10. - P. 117 -122.

251. Stephens D.B. Polyclonal antibody catalytic variability / D.B. Stephens, R.E. Thomas, J.F. Stanton et al. // Biochem. J. 1998. - V. 332(1). - P. 127-134.

252. Su X. Piezoelectric quartz crystal based label-free analysis for allergy disease / X. Su, F. T. Chew, S. F. Y. Li // Biosens. Bioelectron. 2000. - V. 15. P. 629639.

253. Su X. Piezoelectric quartz crystal based screening test for porcine reproductive and respiratory syndrome virus injection in pigs / X. Su, S. F. Y. Li, W. Liu, J. Knaung // Analyst. 2000. - V. 125. - № 4. - P. 725-730.

254. Suri C. R. Development of piezoelectric crystal based microgravimetric immunoassay for determination of insulin concentration / C. R. Suri, P. K. Jain, G. C. Mushra // J. Biotechnology. 1995. - V. 39. - P. 27-34.

255. Susmel S. Human cytomegalovirus detection by a quartz crystal microbalance immunosensor / S. Susmel, С. K. O'Sullivan, G.G. Guilbault // Enzyme Microb. Technol. 2000. - V. 27. - P. 639 - 645.

256. Taki S. Somatically mutated IgG anti-DNA antibody clonally related to germ line encoded IgM anti-DNA antibody / S. Taki, S. Hirose, K. Kinoshita et al. // Eur. J. Immunol. 1992. - V.22. - P. 987-992.

257. Tektonodou M.G. Presence of sistemic autoimmune disorders in patients with autoimmune thyroid diseases / M.G. Tektonodou, M. Anapliotou, P.

258. Vlachoyiannopoulos et al. // Arm. of the Rheum. Dis. 2004. - V. 63. - P. 1159 -1161.

259. Theofilopoulos A.N. The basis of autoimmunity. Genetic predisposition / A.N. Theofilopoulos // Immunol. Today. 1995. -V. 16. - P. 150-159.

260. Thomas J.W. The natural autoantibody repertoire of nonobese diabetic mice is highly active / J.W. Thomas, P.L. Kendall, H.G. Mitchell // J. Immunol. 2002. -V. 169. - № 11. - P. 6617-6624.

261. Tomer Y. Infection, thyroid disease and autoimmunity / Y. Tomer, T.F. Davies//Endocr. Rev. 1993.- V. 14.-P. 107-120.

262. Tramontano A. Catalytic antibodies / A. Tramontano, K.D. Janda, R.A. Lerner // Science. 1986. - V. 234. - P. 1566 - 1570.

263. Trotsenburg P. Antibodies to «second colloid antigen». A study on the prevalence in sporadic forms of congenital hypothyroidism / P. Trotsenburg, T. Vulsma, A.M. Bloot // Acta Endocrinol. (Copenh.) 1989. - V. 121(5). - P. 659 -665.

264. Tsao B.P. Evidence for linkage of a candidate chromosome I region to human systemic lupus erythematosus / B.P. Tsao, R.M. Cantor, K.C. Kalinian et al. // J.Clin. Invest. 1997. - V. 99. - P. 725-731.

265. Tunbridge W. M.G. The spectrum of thyroid disease in a community: the Whickham survey / W. M.G. Tunbridge, R. Evered, R. Hall // Clin. Endocrinol. -1977.-V. 7.-P. 481-493.

266. Uttenthaler E. Quartz crystal biosensor for detection of the African Swine Fever disease / E. Uttenthaler, C. Koeslinger, S. Drost // Anal. Chim. Acta. 1998. V. 362.-P. 91-100.

267. Valtonen V.V. Serological evidence for the role of bacterial infections in the pathogenesis of thyroid diseases / V.V. Valtonen, P. Ruutu, K. Varis et al. // Acta. Med. Scand. 1986. - V. 219. - P. 105 - 111.

268. Vanderpump M.P.J. The incidence of thyroid disorders in the community: a twenty-year follow-up of the Whickham Survey / M.P.J. Vanderpump, W.M.G. Tunbridge, J.M. French // Clin. Endocrinol. 1995. - V. 43. - P. 55- 68.

269. Vesenka J. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope / J. Vesenka, M. Guthod, C.L. Tang et al. // Ultramicroscopy. 1992. - V. 42-44. - P. 1243-1249.

270. Vestergaard P. Smoking as arisk factor for Graves' disease, toxic nodular goiter, and autoimmune hypothyroidism / P. Vestergaard, L. Rejnmark, J. Weeke et al. // Thyroid. 2002. - V. 12 (1). - P. 69 - 75.

271. Vialettes B. Incidence rate and risk factors for thyroid dysfunction during recombinant interleukin-2 therapy in advanced malignancies / B. Vialettes, M.A. Guillerand, P. Viens et al. // Acta Endocrinol. 1993. -V. 129. - P. 31-38.

272. Vitale M. Iodide excess induces apoptosis in thyroid cells through a p53-independent mechanism involving oxidative stress / M. Vitale, T. Di Matola, F. D'Ascoli et al. // Endocrinol. 2000. - V. 141. - N. 2. - P. 598 - 605.

273. Vitti P. Thyroid autoimmunity and thyroid autonomy / P. Vitti, S. Mariotti, G. Barbesino et al. // Acta Med. Aust. 1990. - V. 17 (1). - P. 90 - 92.

274. Voinova M.V. «Missing mass» effect in biosensor's QCM applications / M.V. Voinova, M. Jonson, B. Kasemo // Biosensors and Bioelect. 2002. -V. 17. - P. 835-841.

275. Volpe R. Pathologenesis of autoimmune thyroid disease / R. Volpe, S. Ingbar, J. Braverman // The thyroid: a fundamental and clinical // Philadelphia: J.B. Lippincott Co, 1986. 747p.

276. Volpe R. Autoimmune thyroiditis / R. Volpe // Werner and Ingbar's the thyroid: a fundamental and clinical text. 6th ed In: Braverman L.E., Utiger R.D., eds.. Philadelphia: J.B. Lippincott, 1991. - P. 921 - 933.

277. Volpe R. A perspective on human autoimmune thyroid disease: is there an abnormality of the target cell which predisposes to the disorder? / R. Volpe // Autoimmunity. 1992. - V. 12. - P. 3 - 9.

278. Weetman A.P. Terminal complement complexes and Q/Ci inhibitor complexes in autoimmune thyroid disease / A.P. Weetman, S.B. Cohen, D.A. Oleesky et al. // Clin. Exp. Immunol. 1989. - V. 77. - P. 25 - 30.

279. Weetman A.P. Autoimmune thyroiditis: predisposition and pathogenesis / A.P. Weetman // Clin. Endocrinol. 1992. - V. 36. - №. 4. - P. 307 - 323.

280. Weetman A.P. Antithyroid drugs and release of inflammatory mediators by complement-attacked thyroid cells / A.P. Weetman, N. Tandon, B.P. Morgan // Lancet. 1992. - V. 340. - P. 633 - 636.

281. Weetman A.P. Autoimmune thyroid disease: further development in our understanding / A.P. Weetman, A.M. McGregor // Endocrin. Rev. 1994. - V. 15. -P. 788-830.

282. Weetman A.P. Non-thyroid autoantibodies in autoimmune thyroid disease / A.P. Weetman // Best. Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2005. - V. 19 (1). -P.-17-32.

283. Weinstein A. Antibodies to native DNA and serum complement (C3) levels: application to diagnosis and classification of systemic lupus erythematosus / A. Weinstein, B. Bordwell, B. Stone et al. // Am. J. Med. 1983. - V. 74. - P. 206216.

284. Wenzel B.E. Antibody to plasmid-encoated protein of enteropathic Yersinia in patients with autoimmune thyroid disease / B.E. Wenzel, J. Husemann, K.W. Wenzel et al. // Lancet. 1988. - V. 1. - P. 56.

285. Wilkin T.J. The primary lesion theory of autoimmunity: a speculative hypothesis / T.J. Wilkin // Ibid. 1990. - V. 7. - P. 225 - 235.

286. Williams R.C. Jr. Detection of nucleosome particles in serum and plasma from patient with systemic lupus erythematosus using monoclonal antibody 4H7 / R.C. Jr. Williams, C.C. Malone, C. Meyers et al. // J. Rheumatol. 2001. - V. 28. -№ l.-P. 81-94.

287. Witte T. IgM anti-ds DNA antibodies in systemic lupus erythematosus: negative assotiation with nephritis / T. Witte, K. Hartung, C. Sachse et al. // SLE Study Group. Rheum. Int. 1998. - V. 18(3). - P. 85-91.

288. Woeber K. The Thyroid: Contemporary Endocrinology, By S. Ingbar, eds. / K. Woeber, L. Braverman // New York, London: Plenium Med. Book Сотр., 1979.- V. l.-P. 77-117.

289. Xavier R.M. Antinuclear antibodies in healthy aging people: a prospective study / R.M. Xavier, Y. Yamauchi, M. Nakamura et al. // Mech. Ageing Dev. -1995.-V. 78.-P. 145-154.

290. Yanase K. Receptor- mediated cellular entry of nuclear localizing anti-DNA antibodies via myosin I / K. Yanase, R.M. Smith, A. Puccetti et al. // J. Clin. Invest.-1997.-V. 100.-P. 25-31.

291. Yoon S.-J. The effect of iodine restriction on thyroid function in patients with hypothyroidism due to Hashimoto's thyroiditis / S.-J. Yoon, Choi S.-R., Kim D.-M. et al. // Yonsei. Med. J. 2003. - V. 44 (2). - P. 227 - 235.

292. Yoshiuchi K. Stressful life events and smoking were associated with Graves' disease in women, but not in men / K. Yoshiuchi, H. Kumano, S. Nomura et al. // Psychosom. Med. 1998. -V. 60 (2). - P. 182- 185.

293. Yuahen F. Visualizing Robertsonian translocation with atomic force microscopy / F. Yuahen, E. Tan, E. Ercan et al. // Gazi Medical Journal. 1999. -V. 10.-P. 110-114.

294. Zhang C. Development of a new kind of dual modulatrd QCM biosensor / C. Zhang, G. Feng, Z. Gaot // Biosens. Bioelectron. 1997. - V. 12. - N. 12. - P. 1219-1225.

295. Zhang X. Atomic force microscopy measurement of leukocyte-endothelial interaction / X. Zhang, A. Chen, D.D. Leon et al. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2004. - V. 286. - P. 359 - 367.

296. Zhao Y. DNA- modified electrodes; part 4: optimization of covalent immobilization of DNA on self-assembled monolayers / Y. Zhao, D. Pang, S. Hu, Z. Wang, J. Cheng, H. Dai // Talanta. 1999. - V. 49 (4). - P. 751 - 756.

297. Zhou X. D. Detection of hepatitis В virus by piezoelectric biosensor / X. D. Zhou, L. J. Liu, M. Hu, L. L. Wang, J. M. Hu // J. Pharm. Biomed. Anal. 2002. -V. 27.-P. 341 -345.

298. Zophel K. Clinical value of a bicpecific antibody binding to thyroglobulin and thyroperoxidase (TGPO-aAb) in various thyroid disease / К. Ошибка! Ошибка связи., Т. Gruning, G. Wenderlich et al. // Autoimmunity. 1999. - V. 29. - P. 257 -262

299. Zouali M. The structure of human lupus anti-DNA antibodies / M. Zouali // Methods. 1997. - V. 11. - P. 27-35.

300. Zupan S. Piezoelectric immunosensor / S. Zupan, B. Filipic, M. Babic // Acta Pharm. 1992. - V. 42. - P. 361 - 366.

Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение антител к ДНК и их гидролизующих свойств при аутоиммунном тиреоидите с использованием нанотехнологий

Оглавление диссертации Подшивалина, Елена Юрьевна :: 2008 :: Самара

Введение диссертации по теме "Эндокринология", Подшивалина, Елена Юрьевна, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение антител к ДНК и их гидролизующих свойств при аутоиммунном тиреоидите с использованием нанотехнологий"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Подшивалина, Елена Юрьевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций