Изучение антимикобактериального действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов

Гвоздева, Юлия Викторовна

Диссертации по медицине → Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Изучение антимикобактериального действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Гвоздева, Юлия Викторовна Москва 2010 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.09

Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение антимикобактериального действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов

На правах рукописи

Гвоздева Юлия Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКОБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ КОМПЛЕКСА ПРИРОДНЫХ ЦИТОКИНОВ И ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ.

14.03.09. - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 к ОКТ 2010

Москва 2010

004610450

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский Государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор Михаил Александрович Владимирский

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук.

Леонид Васильевич Ковальчук

Лариса Николаевна Черноусова

Иван Генрихович Козлов

Защита диссертации состоится »СМ^^^Р 2010 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

Автореферат разослан »Юг.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

Т.Е. Кузнецова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования.

В настоящее время туберкулез приобретает все большее значение среди инфекционных заболеваний, приводящих к летальному исходу, что во многом связано с увеличением лекарственно устойчивых штаммов.

Туберкулез вызывают патогенные бактерии Mycobacterium tuberculosis при определенных условиях, и прежде всего, при снижении эффективности функционирования иммунной системы. M.tuberculosis как внутриклеточные патогены, способны выживать и размножаться в фаголизосомах макрофагов, уклоняясь от защитных иммунных механизмов. Развитие устойчивости микобактерий туберкулеза к основным противотуберкулезным препаратам является острой проблемой, диктующей необходимость разработки новых подходов к лечению туберкулеза, заключающихся как в прямом воздействии на возбудителя, так и опосредованном, через активацию внутриклеточных механизмов подавления микобактерий туберкулеза.

В последние годы большое внимание уделяют роли противомикробных пептидов (ПМП) в реакциях врожденного иммунитета. Известно, что ПМП служат первичной защитой от патогенов. В литературе описано более 1000 таких пептидов [Кокряков В.Н., 2007, Brogden К.А., 2005]. Они включают в себя молекулы многих тканей и клеток позвоночных, беспозвоночных растений и грибов. У млекопитающих охарактеризованы такие ПМП, как дефенсины, кателицидины и другие. Особое место среди кателицидинов занимают катионные ПМП свиньи нейтрофильного происхождения - протегрины. Протегрины впервые были открыты отечественными учеными во главе с Кокряковым В.Н [Кокряков В.Н., 1999].

ПМП вызывают прямое ингибирование метаболических процессов и нарушение целостности клеточной мембраны [Brogden К.А., 2005]. В работах зарубежных исследователей продемонстрировано антимикобактериальное действие ПМП. Роберт Лерер показал угнетение роста M.tuberculosis при воздействии ПМП (дефенсинов, выделенных из нейтрофилов человека и

кролика, и проте гринов свиньи) [R. I. Lehrer, Miyakawa Y., 2009]. Другие ученые исследовали прямое действия а-дефенсина человека (HNP-1) на M.tuberculosis H37Rv и опосредованное в культуре зараженных макрофагов крысы. Результаты выявили бактерицидное действие в отношении M.tuberculosis [Sharma S., I. Verma, G.K. Khuller, 2000].

В связи с этим нам представлялось важным изучить антимикобактериальное действие комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат суперлимф).

Препарат суперлимф (молекулярная масса до 35 кД) представляет собой комплекс природных цитокинов: интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6), фактора некроза опухоли а (ФНО-а), фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (МИФ), трансформирующего фактора роста (ТФРр). Наряду с цитокинами, в низкомолекулярной фракции суперлимфа идентифицированы пептиды, подобные катионным противомикробным пептидам - протегринам. В экспериментах in vitro было показано прямое антибактериальное действие суперлимфа в отношении Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes [Ковальчук Л.В., Ганковская JI.B., Мороз А.Ф. и др., 2004],[Ковальчук JI.B., Ганковская Л.В., Аведова Т.А. и др., 2006], а также противовирусное действие в отношении вируса простого герпеса [Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В. и др., 2005].

Цель исследования.

Изучение действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат суперлимф) на M.tuberculosis и на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis.

Задачи исследования.

1. Выбор модели для изучения активности комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов.

2. Изучение действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост штаммов M.tuberculosis с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам в модели in vitro.

3. Оценка in vitro цитотоксического действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на интактные макрофаги мыши.

4. Изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост M.tuberculosis H37Rv, фагоцитированных макрофагами, в модели ex vivo.

5. Изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост лекарственно-устойчивых M.tuberculosis, фагоцитированных макрофагами, в модели ex vivo.

6. Оценка протективной активности комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов в отношении макрофагов, инфицированных M.tuberculosis ex vivo.

Научная новизна.

В работе впервые в одной модели проведено изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат суперлимф) на рост M.tuberculosis с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам и на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis. Впервые показано ингибирующее действие препарата суперлимф на рост in vitro лабораторного вирулентного штамма M.tuberculosis H37R.v. Впервые выявлено, что обработка макрофагов суперлимфом до инфицирования микобактериями туберкулеза, приводит к снижению роста чувствительного штамма M.tuberculosis H37Rv и штамма M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, фагоцитированных макрофагами, а также уменьшает цитопатогенный эффект, оказываемый ими на макрофаги.

Действие КПЦ и ПМП на микобактерии туберкулеза опосредуется двумя путями. Прямой антимикобактериальный эффект обусловлен низкомолекулярной фракцией, содержащей протегрин-подобные пептиды. Основой другого механизма является регуляция функции макрофагов, фагоцитировавших микобактерии туберкулеза. В этом случае бактерицидная активность фагоцитов стимулируется цитокинами, что приводит к усилению

выработки ими активных форм кислорода и азота, продукции аутологичных цитокинов, способствуя, таким образом, разрушению патогенов.

Полученные результаты расширяют представления о механизмах врожденного иммунного ответа на микобактерии туберкулеза. Что может служить основой для разработки новых методов иммунокоррекции на основе противомикробных пептидов и цитокинов.

Практическая значимость.

Практическая значимость работы определяется важностью поиска новых лекарственных средств на основе биотехнологических продуктов для лечения туберкулезной инфекции. Изучение влияния КПЦ и ПМП на модели макрофагов, инфицированных микобактериями туберкулеза, позволит лучше понять механизмы протективного иммунного ответа на возбудителя болезни. Полученные данные об антимикобактериальном эффекте препарата суперлимф обосновывают клиническую перспективность этого лекарственного средства.

Положения, выносимые на защиту.

1. Сочетание экспериментов in vitro и ex vivo позволяет оценить активность препарата не только в отношении возбудителя туберкулеза, но и определить действие, оказываемое им на эффекторные клетки, играющие центральную роль в противотуберкулезной защите.

2. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов при воздействии in vitro и ex vivo ингибирует рост M.tuberculosis H37Rv. Степень угнетения роста зависит от дозы препарата. Максимальный эффект оказывает препарат в концентрации 5 мкг/мл.

3. На рост штамма M.tuberculosis с МЛУ комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов оказывает ингибирующее влияние только на микобактерии, фагоцитированные макрофагами в модели ex vivo.

4. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов не оказывает цитотоксического действия на интактные МФ и проявляет протективный эффект в отношении МФ, инфицированных M.tuberculosis, снижая цитопатогенный эффект микобактерий на МФ.

5. Антимикобактериальная активность МФ повышается при предварительной 24-часовой инкубации (до инфицирования) с комплексом природных цитокинов и противомикробных пептидов, что подтверждается снижением подавляющей рост концентрации препарата до 1 мкг/мл в отношении чувствительного штамма МЛиЪегси1сн1$ Н37Яу и появлением ингибирующего эффекта на рост М. 1иЪегси\о$1$ с МЛУ.

Внедрение результатов исследования.

Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре иммунологии ГОУ ВПО Российского Государственного медицинского университета Росздрава.

Апробация работы.

Диссертация апробирована на совместной научной конференции кафедры иммунологии, кафедры эндокринологии, отдела иммунологии ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава», отдела микробиологии Центрального научно-исследовательского института туберкулеза РАМН 24 июня 2010 г.

Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава», на заседаниях секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), на 4 конгрессе Международного союза борьбы против туберкулеза и легочных болезней (Латвия, Рига, 2007), на 20 европейском конгрессе клинической микробиологии и инфекционных болезней (Австрия, Вена, 2010г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций

и списка литературы, включающего 11 отечественных и 124 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 13 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Изучение антимикобактериального действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост M.tuberculosis проводили в модели in vitro (на агаризированной среде Дюбо и в жидкой питательной среде RPMI 1640) и в модели ex vivo при воздействии КПЦ и ПМП на перитонеальные макрофаги мышей. В работе использовали лабораторный вирулентный штамм M.tuberculosis H37Rv, чувствительный к противотуберкулезным препаратам и клинический штамм M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью CN37 из музея ЦНИИТ РАМН. Исследования выполнены на мышах инбредной линии С57В1/6. В эксперименте использовались 60 мышей, весом 21-24 грамма, в возрасте 2-4 месяцев.

Концентрацию М. tuberculosis определяли 2 методами:

1) На агаре Дюбо (Difco) при посеве 10-кратных разведений исходной суспензии культуры М. tuberculosis подсчитывали число микроколоний на 4 день культивирования. Концентрацию M.tuberculosis в суспензии выражали числом колониеобразующих единиц М. tuberculosis на 1мл среды (КОЕ/мл).

2) Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для определения КОЕ M.tuberculosis методом ПЦР использовали стандартную панель ДНК, соответствующую определенному количеству КОЕ М. tuberculosis (Рис.1).

Макрофаги выделяли из перитонеального экссудата мышей C57BL/6 через 5-6 дней после внутрибрюшинного введения 2 мл 3% пептона. Для удаления других клеток осуществляли адгезию макрофагов на пластиковых чашках Петри и многократную отмывку оставшихся в среде клеток. Прикрепившиеся к пластику макрофаги переводили из монослоя в суспензию раствором Версена. Макрофаги предварительно инкубировали с КПЦ и ПМП в течение суток. Инфицирование макрофагов M.tuberculosis проводили в плоскодонных 96-луночных планшетах в среде RPMI 1640 (Sigma) с 5%

эмбриональной телячьей сывороткой без антибиотиков в термостате в атмосфере 5% С02, в соотношении 1 МФ и 5 клеток М.ШЬегси1о$'1$ (1 х 105 кл/мл : 5 х 105 КОЕ/мл). КПЦ и ПМП использовали в концентрациях 0,1, 1,0 и 5 мкг/мл.

1800 ^ 1600 £ 1400 | 1200 И 1000 $ 800 ё 600 э а 400 2 200 - _ - - - - - - 1 -г" 4_. I - I \

\г 1

| ' \ I

А 1

- - - I - - _ - - - - 1 Т - ■у X 4- ™ ! 1 т .. ...

(

( -

1 ■ ! I

! ) ! I .1

> 1 ( |

( ! ) : / I

.. - _ - рГ - .У X 1/ _ -

Р 0 ч- ! Т' Ьэ т i Г

( 1 < * 1 ! !

-200) 1 1 д.1 4-1 ! 1

0 2 4 6 8 1012 1416 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 Сус1е

сдпайопсьелш: 0,998 яре -3,321 ивгерс. 39,577 *г-зд21х*зи7? о и»ккжм

РСЯВМепсу; • ;$омМ|

3: 4 5 6 7 8

Юз 501в)а <3«1Му, сору тиЬе

Рис.1. Подсчет количества КОЕ микобактерий с помощью ПЦР в режиме реального времени.

А. Кинетические кривые зависимости накопления продукта амплификации от цикла амплификации.

Б. Стандартная кривая для подсчета КОЕ М/и6ет-си/о.ш Н37Яу.

Оценку роста микобактерий туберкулеза проводили на 7 день с помощью ПЦР в режиме реального времени по накоплению продуктов амплификации (тест-система ДНК M.tuberculosis-M.bovis «ДНК-Технология») и выражали в десятичном логарифме числа КОЕ (lgKOE). ДНК выделяли с помощью набора «Проба НК» (ДНК-Технология). Амплификация и детекция результатов проводилась на термоциклере с оптическим модулем Bio-Rad ICycler IQ4. Стандартные кривые построены в зависимости накопления ПЦР-продукта от числа КОЕ M.tuberculosis с помощью программного обеспечения "Bio-Rad". Стандартная кривая использовалась в дальнейшем для количественного определения содержания КОЕ M.tuberculosis в исследуемом образце.

Цитотопатогенный эффект M.tuberculosis на макрофаги оценивали по высвобождению из поврежденных макрофагов в культуральную среду фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) с помощью набора Promega's CytoTox 96® (Promega) согласно инструкции.

Процент специфического лизиса вычисляли по формуле:

А -А

О/ __эксп. среды

специфич.лизиса , , _ . 4.1 \_í Л _ Л

\ mama-i. корр. / ' \ МФспонт. среды

где: Аэксп. - средняя оптическая плотность в лунках с МФ + суперлимф

Асреды - средняя оптическая плотность в лунках с культуральной средой

АТОТал - средняя оптическая плотность в лунках с МФ полностью разрушенными в результате добавления 0,8% Тритона Х100

АКОрр. - средняя оптическая плотность в лунках с культуральной средой + Тритон Х100

Амфспонт. - средняя оптическая плотность лунках с МФ

Для изучения воздействия препарата в жидкой питательной среде RPM 1640 на микобактерии туберкулеза и макрофаги проведено три варианта экспериментов.

Первый вариант опытов заключался в прямом воздействии препарата суперлимф на микобактерии туберкулеза.

При втором варианте опытов одновременно инфицировали макрофаги и вносили в культуру препарат суперлимф.

Третий вариант предусматривал предварительную инкубацию интактных макрофагов с препаратом суперлимф в течение 24 часов и последующее заражение макрофагов микобактериями туберкулеза.

В качестве контроля использовали:

- интактные макрофаги;

- макрофаги, обработанные суперлимфом (контроль цитотоксичности препарата);

- макрофаги, зараженные микобактериями туберкулеза (определение инфекционной активности);

- микобактерии туберкулеза без препарата (контроль).

Для контроля эффективности использованных тест-систем использовали рифампицин (5мкг/мл) как активный стандартный препарат в отношении микобактерий туберкулеза.

Оценку влияния суперлимфа на рост M.tuberculosis на авизированной среде Дюбо проводили колориметрическим методом по нитратредуктазной активности микобактерий туберкулеза с использованием реактива Грисса на 10 день после посева микобактерий.

Все измерения выполнены в трипликатах.

Для оценки статистической значимости различий средних величин применяли параметрический критерий Стьюдента. Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения "Bio-Rad" и "MS Office Excel". Результаты выражали как среднее арифметическое для анализируемой

группы показателей ± стандартное отклонение. Различия между показателями считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.Изучение антимикобактериального действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост МЛиЬегси1оы$ т \itro. 1.1. Влияние суперлимфа на рост МЛиЬегсиШ'к Н37Яу на агаризированной среде Дюбо.

На первом этапе работы был проведен эксперимент по изучению антимикобактериального действия препарата на рост чувствительного лабораторного штамма МлиЬегсхйойз Н37Яу колориметрическим методом на агаризированной среде Дюбо. Рост оценивали по окрашиванию среды при добавлении реактива Грисса на 10 день после посева микобактерий в 24х-луночные планшеты. В эксперименте использовали суперлимф в концентрациях 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 мкг/мл и контрольные препараты рифампицин в концентрациях 100, 50, 25, 12,5, 6,25 3 мкг/мл и изониазид в концентрациях 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 мкг/мл. После автоклавирования готовую среду Дюбо остужали до 55С, добавляли стерильный бычий сывороточный альбумин и олеат натрия и затем препараты. После чего вносили суспензию одиночных микобактериальных клеток Н37Яу на среду Дюбо. Через 10 дней готовили водный раствор реактива Грисса и закапывали реактив в лунки планшетов. О росте микобактерий на среде с препаратами и в контрольных лунках судили по окрашиванию среды в розово-красный цвет.

Данный метод позволяет определять наличие микобактерий с использованием нитратредуктазной активности МБТ в качестве критерия их роста. Культуры микобактерий туберкулеза, обладающие положительной редуктазной активностью, характеризуются способностью редуцировать нитраты в нитриты. В качестве индикатора разложения нитрата калия используется стандартный реактив Грисса в виде водного раствора. При закапывании реактива Грисса на среду с микобактериями происходит его

взаимодействие с образовавшимися нитритами и поверхность среды окрашивается в розово-красный цвет.

Результаты проведенного эксперимента показали, что в лунках с МЛиЬегси1оз\з Н37Яу без препаратов отмечался рост культуры. В контрольных лунках с противотуберкулезными препаратами рифампиципом и изониазидом рост микобактерий отсутствовал.

В лунках с исследуемым препаратом во всех концентрациях замечено окрашивание среды в розово-красный цвет, что свидетельствовало об отсутствии антимикобактериального эффекта на микобактерии туберкулеза.

Рис.2. Детекция роста M.tuberculosis H37Rv колориметрическим методом при воздействии суперлимфа и контрольных препаратов рифампицина (R) и изониазида (Н) in vitro на среде Дюбо

A. Рост M.tuberculosis H37Rv на среде Дюбо без препаратов.

B. Рост M.tuberculosis H37Rv на среде Дюбо с различными концентрациями суперлимфа и контрольных препаратов.

Проанализировав полученные данные, мы предположили, что отсутствие антимикобактериального эффекта может быть связано с термолабильностью препарата суперлимф, т.к. температура среды Дюбо при внесении препарата составляла около 55С.

Поэтому представилось целесообразным проводить дальнейшие работы по изучению влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на M.tuberculosis в жидкой питательной среде, не требующей

нагревания до высоких температур в процессе приготовления и внесения препарата.

С этой целью была выбрана модель, включающая прямое воздействие различных концентраций препарата на микобактерии туберкулеза in vitro и заражение культуры перитонеальных макрофагов мышей микобактериями ех vivo в среде RPMI 1640 с обогащающими добавками.

Сочетание экспериментов in vitro и ex vivo позволяет оценить активность препарата не только в отношении возбудителя туберкулеза, но и макрофагов, обеспечивающих элиминацию патогена.

1.2. Влияние суперлимфа на рост M.íuberculosis H37Rv в жидкой питательной среде in vitro

Проведенные исследования по изучению прямого антимикобактериального действия в среде RPMI 1640 показали, что на 7 день культивирования количество M.íuberculosis H37R.v в контрольных лунках увеличилось на логарифм с 5,3±0,03 до 6,1±0,1 lgKOE. Контрольный препарат рифампицин достоверно (р=0,0005) ингибировал рост чувствительного штамма M.íuberculosis H37R.v и значение логарифма составило 5,3±0,04. При исследовании роста клеток микобактерий было выявлено достоверное (р=0,008) ингибирующее воздействие суперлимфа на M.íuberculosis H37Rv в концентрации 5 мкг/мл (lg КОЕ = 5,7±0,07). Снижение концентраций суперлимфа до 1 мкг/мл и 0,1 мкг/мл приводило к уменьшению эффекта на рост микобактерий. Количество M.íuberculosis H37Rv в лунках за 7 дней культивирования с суперлимфом в концентрации 1 мкг/мл составило lgKOE МБТ 5,9±0,19 и lgKOE МБТ 6,1±0,1 при культивировании с исследуемым препаратом в концентрации 0,1 мкг/мл. Однако выявленное снижение роста было недостоверным по сравнению с величиной lgKOE в контрольных лунках с M.íuberculosis H37Rv.

Результаты проведенных исследований показали, что препарат суперлимф при воздействии in vitro ингибирует рост M.íuberculosis H37Rv.

Степень угнетения роста зависела от дозы препарата. Максимальный эффект оказывал препарат в концентрации 5 мкг/мл (Рис.3).

I II III IV V VI

а 1 - M.tub H37RV исх ■ II - M.tub H37Rv без прел

□ Ш- M.tub H37RV+ супврлимфО, 1 мкгУмл в IV - M.tub H37Rv + суперлимф 1 мкг/мл ■ V - M.tub H37Rv + суперлимф 5 мкг/мл в VI - M.tub H37Rv + рифмпицин 5 мкг/мл

Рис.3. РостM.tuberculosis H37Rv при прямом воздействии препарата суперлимф в концентрациях 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл и контрольного препарата рифампицина в концентрации 5 мкг/мл (lgKOE).

1.3. Влияние суперлимфа на рост M.tuberculosis с МЛУ в жидкой питательной среде in vitro.

Культивирование в течение 7 дней M.tuberculosis с МЛУ без препаратов приводило к увеличению количества микобактерий с 5,4±0,1 lgKOE до 6,2±0,11 lgKOE. Добавление суперлимфа ни в одной концентрации не вызывало существенного снижения роста M.tuberculosis с МЛУ по сравнению с культивированием микобактерий без препаратов. Величина lgKOE МБТ при различных концентрациях препарата колебалась от 5,9±0,19 (конц. 5 мкг/мл) до 6,15±0,20 (конц. 0,01 мкг/мл). Эти результаты достоверно не отличались от роста микобактерий в среде без препаратов, где значение lgKOE МБТ составило 6,21+0,11. Также рост устойчивого к рифампицину штамма M.tuberculosis с МЛУ не угнетался при добавлении в среду контрольного препарата рифампицина в концентрации 5 мкг/мл, и количество КОЕ МБТ в среде с

препаратом достоверно не отличалось от роста микобактерий без рифампицина (6,12+0,12 lgKOE МБТ)(рис.4).

В I- M.tub CN37 исх у II- M.tub CN37 без преп

у III - M.lub CN37 + суперпимф0,1 мкг/мл и IV- M.tub CN37 + суперлимф 1 м к г/мл а V- M.tub CN37 + суперлимф 5 мкг/мл □ vi - M.tub CN37 +рифампицин 5мкг/мл

Рис.4. Рост М. tuberculosis CN37 при прямом воздействии препарата суперлимф в концентрациях 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл и контрольного препарата рифампицина в концентрации 5 мкг/мл (lgKOE).

Изучение действия комплекса природных цитокинов и птивомикробных пептидов на штамм М.tuberculosis с МЛУ показало, что препарат не влиял на рост микобактериальных клеток.

2. Изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов в модели ex vivo на макрофаги,

инфицированные М.tuberculosis H37Rv И M.tuberculosis с МЛУ.

Изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов в модели ex vivo на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis с МЛУ включало следующие эксперименты:

- оценка цитотоксического эффекта суперлимфа на интактные макрофаги;

- изучение влияние суперлимфа на рост M.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis с МЛУ, фагоцитированных макрофагами;

- изучение влияния суперлимфа на макрофаги, инфицированные М.tuberculosis H37R.v и M.tuberculosis с МЛУ;

- оценка предварительной инкубации интактных макрофагов с суперлимфом на рост M.tuberculosis H37R.v и M.tuberculosis с МЛУ, фагоцитированных макрофагами;

- оценка предварительной инкубации на усиление протективного эффекта суперлимфа на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis H37R.v и M.tuberculosis с МЛУ.

Изучение антимикобактериального действия препарата суперлимф на рост микобактерий туберкулеза, фагоцитированных макрофагами начали с определения повреждающего действия суперлимфа на интактные макрофаги. Цитотоксический эффект оценивали визуально и по уровню ЛДГ, высбождаемой из поврежденных макрофагов в культуральную среду. Результаты микроскопии в световом инвертированном микроскопе показали, что в культуре макрофагов, обработанной препаратом суперлимф, не наблюдалось видимых изменений морфологии клеток. Макрофаги сохраняли характерную для прикрепленных клеток веретенообразную форму независимо от концентраций препарата, используемого в эксперименте, и не отличались от морфологии клеток в контроле.

Специфический лизис макрофагов, оцененный по уровню ЛДГ, достоверно не отличался при воздействии всех концентраций суперлимфа от спонтанного лизиса, который характеризовал естественное разрушение макрофагов в процессе культивирования на протяжении 7 дней. Процент специфического высвобождения ЛДГ при культивировании макрофагов составил 37,34,3%, при культивировании макрофагов с препаратом в концентрации 0,1 мкг/мл - 40,4*1,4%, при концентрации 1 мкг/мл - 41,5*4,2% и 41,7*4,1% при концентрации препарата 5мкг/мл (табл.1)

Таблица 1.

Оценка цитотоксического эффекта суперлимфа на интактные макрофаги.

Группы Показатель цитотоксичности I МФ без препарата II МФ+суперлимф 0,1 мкг/мг III МФ+суперлимф 1 мкг/мл IV МФ+суперлимф 5 мкг/мл

Процент специфического лизиса макрофагов, % 37,3±1,3 40,4±1,4 Р(1Ы) > 0,05 41,5±4,2 Р(ш-п > 0,05 41,7±4,1 Р(1У-п > 0,05

Для изучения влияния суперлимфа на макрофаги, зараженные микобактериями, инфицировали макрофаги микобактериями чувствительного штамма МЛиЬегыйох'и Н37Яу и резистентного штамма М.шЬегсиЬзи с МЛУ. Оценку роста МлиЬегсиШ'и проводили с помощью ПЦР в режиме реального времени по накоплению продуктов амплификации ДНК микобактерий. Цитопатогенный эффект, оказываемый микобактериями на макрофаги, оценивали по разрушению макрофагов, определяя выход в культуральную среду фермента макрофагов - лактатдегидрогеназы.

При исследовании роста МАиЬегси^'м Н37Яу, фагоцитированных МФ, выявлен ингибирующий эффект препарата в концентрации 5 мкг/мл (^КОЕ составил 5,4*0,12, р=0,02). Культивирование МФ, фагоцитировавших микобактерии, в течение 7 суток в присутствии суперлимфа в концентрациях 1 и 0,1 мкг/мл, не оказывало ингибирующего воздействия на рост микобактерий. Значение ^КОЕ составило 6,0±0,12 при концентрации 0,1 мкг/мл и 5,9±0,14 при концентрации 1 мкг/мл, по сравнению с культивированием фагоцитированных макрофагами микобактерий без препарата (значение 1§КОЕ МБТ, 5,9±0,16.). Контрольный препарат рифампицин достоверно ингибировал

рост чувствительного к рифампицину штамма M.tuberculosis H37Rv (lgKOE=4,9,p=0,001) (рис.5).

Рис.5. Рост МлиЬегси^з Н37Яу в МФ Рис.6. Рост МгиЬегси/ода Н37Яу в МФ при воздействии суперлимфа после предварительной инкубации МФ с

без предварительной инкубации. суперлимфом в течение 24 часов.

Изучение специфического лизиса МФ, зараженных M.tuberculosis H37Rv, показало, что суперлимф в концентрации 5 мкг/мл снижал цитопатогенный эффект, вызываемый микобактериями. Специфический лизис МФ, зараженных M.tuberculosis H37Rv, в отсутствии препаратов составил 90,3±6,13%. При добавлении суперлимфа в концентрации 5 мкг/мл отмечалось достоверное снижение значения специфического лизиса до 65,7±7,03%. Таким образом, наблюдалось стимулирующее действие суперлимфа на жизнеспособность МФ (табл.2).

Предварительное культивирование макрофагов с препаратом привело к снижению выживаемости M.tuberculosis H37Rv в макрофагах. Выявлено ингибирующее действие суперлимфа на рост M.tuberculosis H37Rv не только в концентрации 5 мкг/мл (lgKOE 4,9±0,1, р=0,0006), но и при более низких концентрациях 1 мкг/мл (lgKOE 4,93±0,07, р=0,00005) и 0,1 мкг/мл (lgKOE 5,1±0,09, р=0,001), по сравнению с ростом M.tuberculosis H37Rv в макрофагах без обработки суперлимфом (lgKOE 6,07±0,18) (рис.6).

Таблица 2.

Протективный эффект суперлимфа на макрофаги, инфицированные МЛиЬегсЫоьк Ю7Я

Группы Показатель цитотоксичности I МФ без препарата II МФ + Н3711У III МФ +1137^ + рифапмицин 5мкг/мл IV МФ + Н37ЯУ + суперлимф 5мкг/мл V МФ + Н37Яу + суперлимф 1 мкг/мл VI МФ + Н37К.у + суперлимф 0,1 мкг/мл

процент специфического лизиса МФ без предварительной инкубации с суперлимфом, % 37,3±1,3 90,3±6,1 39,3±0,6 Р(1п-п) = 0,0001 65,7±7,03 Р(1у-п) = 0,010 88,5±2,9 Р(у-п) = 0,67 91,1±5,4 Р(ум1) = 0,87

процент специфического лизиса МФ после предварительной инкубации с суперлимфом, % 37,1±0,9 96,5±9,3 46,2±2,3 Р(Ш-П) = 0,0008 37,5±0,8 Р(1У-П) = 0,0004 48,2±7,4 Р(у-п) =0,002 57,9±4,2 Р(УШ) =0,002

Одновременное определение цитопатогенного эффекта микобактерий на макрофаги в этой же модели показало, что предварительная обработка суперлимфом препятствует разрушению макрофагов микобактериями туберкулеза, так как процент специфического лизиса макрофагов составил 37,5±0,84% при обработке препаратом в концентрации 5 мкг/мл, 48,2±7,5% при 1 мкг/мл и 57,9±4,2, % при ОД мкг/мл, тогда как специфический лизис макрофагов, зараженных M.tuberculosis H37Rv, без препарата, составлял 96,51±9,32%. Полученные результаты свидетельствуют о достоверном снижении лизиса макрофагов, инфицированных M.tuberculosis H37Rv (табл.2).

Культивирование макрофагов, инфицированных M.tuberculosis с МЛУ в течение 7 суток в присутствии суперлимфа не оказывало достоверного ингибирующего воздействия на рост M.tuberculosis (рис.7).

|У11

I II II IV V И VI

В I - М.!иЬ СN37 ига ВII - M.UJb CN37 6« tiren

В III - М.иФ -437-Wi п ■ >> :СМ37-МФ.Суп.рпи«Ф 0. Iu.'/ил

В V - H.luB СМ37.Мф.Суп^1ЙМф1мт1МЛ ■ VI - M.tub СШ?'МФ.Супвртииф 5««/МП ■ VII- М.ШЬСГШ.МФ.рчЦвипищн 5м«г'шз

а I -M.lub CfJ37 VKI в Я - M.tub CN37 би пизз

QII -1." ' 7.МФ В IV- и.1иЬСМ37.Мф.Супврш«фО,1ып17ип

■ V- М.1иЬСЮ7»Мф.Су(з.рт»1&1шг/ыл щ VI - M.lub С1*37*Мф.Суп«[*31Иф5 иг/иг. ovil - M.lub СН37.Мф.|»4импицин SunrfWI

Рис.7. Рост M.tuberculosis с МЛУ в МФ Рис.8. Рост M.tuberculosis с МЛУ в МФ

при воздействии суперлимфа после предварительной инкубации МФ с

без предварительной инкубации. суперлимфом в течение 24 часов

Однако при оценке цитопатогенного действия выявлен протективный эффект на макрофаги, зараженные устойчивым штаммом M.tuberculosis с МЛУ. Процент специфического лизиса макрофагов, инфицированных M.tuberculosis с МЛУ, составил 98,5±17,47%, в то время как добавление суперлимфа в концентрации 5мкг/мл достоверно снижало процент разрушения макрофагов до 61,8±3,2%., в концентрации 1мкг/мл до 71,3±13,5, а концентрация 0,1мкг/мл не оказывала эффекта и специфический лизис составил 97,3±4,4% (табл.3).

Таблица 3

Протективиый эффект суперлимфа на макрофаги, инфицированные М.шЪегси1о$1$ СЮ7.

Группы Показатель цитотоксичности I МФ без препарата II МФ + СЮ7 III МФ + С№7 + рифапмицин 5мкг/мл IV МФ + СЫ37 + суперлимф 5мкг/мл V МФ + СЮ7 + суперлимф 1 мкг/мл VI МФ + СЮ7 + суперлимф 0,1 мкг/мл

процент специфического лизиса МФ без предварительной инкубации с суперлимфом, % 37,1 ± 1,6 98,5 ± 17,4 90,9 ± 8,04 Р(ш-п) = 0,53 61,8 ±3,29 Р(1у-п) = 0,02 71,3 ± 13,5 Р(\Ч1) = 0,10 97,3 ±4,4 Р(У1-П) = 0,91

процент специфического лизиса МФ после предварительной инкубации с суперлимфом, % 39,2 ±4,8 97,02 ± 4,3 91,2 ±2,18 Р(ш-п) =0,11 36,7 ± 8,09 Р(1У-Н) = 0,0003 41,08 ±5,8 Р(У-П) =0,0001 51,9 ±9,7 Р(УШ) =0,0018

Предварительная инкубация макрофагов с препаратом суперлимф выявила снижение роста М. tuberculosis с МЛУ, фагоцитированных макрофагами. Угнетение роста было замечено при обработке суперлимфом в концентрации 5мкг/мл, значение IgKOE составило 5,7±0,¡, р=0,03. Снижение концентрации суперлимфа до 1 мкг/мл также приводило к ингибированию роста (IgKOE 5,7±0,13, р=0,07), однако оно было недостоверным, по сравнению со значением роста микобактерий, фагоцитированных макрофагами без обработки препаратом (рис.8).

При оценке цитопатогенного действияи выявлено, что M.tuberculosis с МЛУ разрушают макрофаги. Предварительная обработка макрофагов суперлимфом в различных концентрациях приводила к снижению цитотоксического эффекта M.tuberculosis с МЛУ на макрофаги (процент специфического лизиса интактных макрофагов составил 36,7±8,09%, при 5 мкг/мл, 41,08±5,8% при 1 мкг/мл и 51,9±9,7%) по сравнению с процентом специфического лизиса макрофагов, инфицированных M.tuberculosis с МЛУ в отсутствии препаратов, который составил 97,02±4,3% (табл.3).

Таким образом, действие суперлимфа на микобактерии туберкулеза может реализоваться, по крайней мере, через два механизма. В случае с чувствительным штаммом M.tuberculosis проявляется прямое антимикобактериальное действие, опосредуемое противомикробными пептидами, входящими в состав препарата, которые при взаимодействии с мембраной микроорганизмов вызывают ее деполяризацию и нарушение целостности, приводящее к гибели. Тогда как эффект на резистентный штамм M.tuberculosis связан с регуляцией функций макрофагов, фагоцитировавших M.tuberculosis. В этом случае бактерицидная активность фагоцитов стимулируется цитокинами, что приводит к усилению выработки ими активных форм кислорода и азота, продукции аутологичных цитокинов, что способствует киллингу внутриклеточных патогенов.

Полученные данные свидетельствуют о важной роли как цитокинов, так и противомикробных пептидов в противомикробной защите организма.

Выводы.

1. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов в концентрации 5 мкг/мл подавлял рост лабораторного вирулентного штамма M.tuberculosis H37Rv in vitro.

2. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов в концентрациях 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл не оказывал цитотоксического действия на интактные макрофаги мыши.

3. Культивирование комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов в концентрации 5мкг/мл с макрофагами, инфицированными M.tuberculosis H37Rv, приводило к подавлению роста микобактерий и снижению цитотопатогенного эффекта микобактерий на макрофаги мыши.

4. Культивирование комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов с макрофагами, инфицированными M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, не оказывало влияния на жизнеспособность микобактерий, однако уменьшало цитопатогенный эффект микобактерий на макрофаги.

5. Предварительная обработка интактных макрофагов мыши в течение 24 часов комплексом природных цитокинов и противомикробных пептидов усиливала антимикобактериальный эффект, который проявлялся в отношении фагоцитированных микобактерий (чувствительного штамма M.tuberculosis H37Rv при концентрациях 5 мкг/мл и 1 мкг/мл и M.tuberculosis с МЛУ при концентрации 5 мкг/мл).

6. Предварительная обработка интактных макрофагов мыши комплексом природных цитокинов и противомикробных пептидов в течение 24 часов усиливала протективное действие препарата на макрофаги при их последующем инфицировании M.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis с МЛУ.

Практические рекомендации.

Использованная модель для изучения влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов in vitro и ex vivo позволила оценить

активность препарата, как в отношении возбудителя туберкулеза, так и макрофагов мыши, инфицированных M.tuberculosis. Предложенный методический подход может быть рекомендован в качестве модели для комплексной оценки влияния вновь создаваемых препаратов на макрофаги человека и внутриклеточные патогены.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Лаврова Ю.В. (Гвоздева Ю.В.), Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Черноусова Л.Н./Влияние комплекса природных цитокинов (препарат суперлимф) на рост M.tuberculosis H37Rv in vitro.// Материалы VIII Российского съезда фтизиатров. - 2007. -С.121.

2. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Лаврова Ю.В (Гвоздева), Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Черноусова Л.Н. / Изучение цитотоксического действия препарата суперлимф на макрофаги, инфицированные Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro. //Материалы VIII конгресса Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. Российский Аллергологический Журнал - 2007. - №3 Прилож. 1. - С.56.

3. Ковальчук Л.В., Гвоздева Ю.В., Ганковская Л.В., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е. /Ингибирующее действие комплекса природных цитокинов и катионных противомикробных пептидов на рост M.tuberculosis H37Rv in vitro. //Журнал микробиологоии, эпидемиологии и иммунобилогии. -2008. - №6 - С.35-39.

4. Ковальчук Л.В., Гвоздева Ю.В., Черноусова Л.Н., Ганковская Л.В., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Соколова Е.В., Левченко В.А. /Регуляторное действие комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на мышиные макрофаги, инфицированные клиническим штаммом M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. - №3 - С.52-56.

5. J. Lavrova (Gvozdeva), Т. Smirnova, Е. Larionova, L. Kovalchuk, L. Chernousova, L. Gankovskaya. /Antimycobacterial effect of Superlimph, //4th

Congress of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease, Europe Region - 2007. - Riga, Latvia. - p.80.

6. J. Gvozdeva, L. Kovalchuk, T. Smirnova, L. Gankovskaya, L. Chernousova/ Inhibition of macrophage ingested MDR M.tuberculosis growth by the complex of natural cytokines plus antimicrobial peptides (CNCplusAMP). //20th European Congress of clinical microbiology and infection diseases. - 2010. - Vienna, Austria.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ИЛ - интерлейкин

ИНФ - интерферон

КОЕ - колониеобразующая единица

КПЦ - комплекс природных цитокинов

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МБТ - микобактерии туберкулеза

МФ - макрофаг

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

ПМП - противомикробные пептиды

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТФР - трансформирующий фактор роста

ФНО - фактор некроза опухоли

Подписано в печать: 24.09.10 Объем: 1,5 усл.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 7698546 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г.Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Оглавление диссертации Гвоздева, Юлия Викторовна :: 2010 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНРШЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ И MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

1.1. Возбудитель туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis.

1.2. Антимикобактериальная активность макрофагов.

1.3. Антимикобактериальные эффекты цитокинов.

1.4. Противомикробные пептиды в защите от M.tuberculosis.

1.5. Пути уклонения M.tuberculosis от иммунной системы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Получение суперлимфа и его характеристика.

2.2. Микобактериальные штаммы.

2.3. Линейные мыши.

2.4. Получение суспензии одиночных клеток микобактерий туберкулеза.

2.5. Получение перитонеальных макрофагов мышей.

2.6. Оценка антимикобактериального действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов

2.6.1. Оценка роста M.tuberculosis нитратредуктазным методом на агаризированной среде Дюбо.

2.6.2. Оценка роста M.tuberculosis в жидкой питательной среде RPMI 1640.

2.6.3. Оценка цитопатогенного действия M.tuberculosis на Макрофаги.

2.7. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКОБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ КОМПЛЕКСА ПРИРОДНЫХ ЦИТОКИНОВ И ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ НА РОСТ М. TUBERCULOSIS in vitro.

3.1. Влияние суперлимфа на рост М. tuberculosis H37Rv на агаризированной среде Дюбо.

3.2. Влияние суперлимфа на рост M.tuberculosis H37Rv в жидкой питательной среде in vitro.

3.3. Влияние суперлимфа на рост M.tuberculosis с МЛУ в жидкой питательной среде in vitro.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КОМПЛЕКСА ПРИРОДНЫХ ЦИТОКИНОВ И ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ В МОДЕЛИ ex vivo НА МАКРОФАГИ, ИНФИЦИРОВАННЫЕ М. TUBERCULOSIS.

4.1. Влияние суперлимфа на рост M.tuberculosis H37R.V и M.tuberculosis с МЛУ, фагоцитированных макрофагами.

4.2. Оценка предварительной инкубации макрофагов с суперлимфом на рост M.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis с МЛУ, фагоцитированных макрофагами.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ КОМПЛЕКСА ПРИРОДНЫХ ЦИТОКИНОВ И ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ НА МАКРОФАГИ, ИНФИЦИРОВАННЫЕ M.TUBERCULOSIS ex vivo.

5.1. Оценка цитотоксического эффекта суперлимфа на интактные макрофаги.

5.2. Протективное действие суперлимфа на макрофаги, инфицированные М.tuberculosis H37Rv и M.tuberculosis с МЛУ.

5.3. Усиление протективного эффекта суперлимфа на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis H37Rv к M.tuberculosis с МЛУ.

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Гвоздева, Юлия Викторовна, автореферат

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ.

В настоящее время туберкулез приобретает все большее значение среди инфекционных1 заболеваний, приводящих к летальному исходу, что во многом связано с увеличением лекарственно устойчивых штаммов.

Туберкулез вызывают патогенные бактерии Mycobacterium tuberculosis при определенных условиях, прежде всего, при снижении эффективности функционирования иммунной системы. Кроме того, M.tuberculosis, как внутриклеточные патогены, способны выживать и размножаться в фаголизосомах фагоцитов, уклоняясь от защитных иммунных механизмов. Появление устойчивости микобактерий туберкулеза к основным противотуберкулезным препаратам является* острой проблемой диктующей необходимость разработки новых подходов к лечению туберкулеза, заключающихся как в прямом воздействии на возбудителя, так и опосредованном, через активацию внутриклеточного механизма подавления микобактерии туберкулеза.

В последние годы большое внимание уделяют роли противомикробных пептидов (ПМП) в реакциях врожденного иммунитета. Известно, что ПМП служат первичной защитой от патогенов и задействованы в системе врожденного иммунитета. На сегодняшний день охарактеризовано более 1000 таких пептидов. Они включают в себя молекулы многих тканей и типов клеток позвоночных, беспозвоночных, растений и грибов. У млекопитающих охарактеризованы такие ПМП, как дефенсины, кателицидины и другие. Особое место среди кателицидинов занимают катионные ПМП свиньи нейтрофильного происхождения -протегрины. Протегрины впервые были открыты отечественными учеными во главе с Кокряковым В.Н [8, 9]. ПМП вызывают прямое ингибирование метаболических процессов и нарушение целостности клеточной мембраны [31]. В работах зарубежных исследователей продемонстрировано антимикобактериальное действие ПМП. P. Jlepep показал угнетение роста M.tuberculosis при воздействии ПМП (дефенсинов человека и кролика, протегринов свиньи) [85]. Другие ученые исследовали прямое действия а-дефенсина человека (HNP 1) на M.tuberculosis H37Rv и опосредованное в культуре зараженных макрофагов (МФ) крысы. Результаты выявили бактерицидное действие в отношении M.tuberculosis [110].

В связи с этим нам представилось важным изучение прямого антимикобактериального действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарата суперлимф), а также опосредованного макрофагами действия после их обработки препаратом ех vivo.

Препарат суперлимф (молекулярная масса до 35 кД) представляет собой комплекс природных цитокинов: интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6), фактора некроза опухоли а (ФНО-а), фактора, ингибирующего миграцию , макрофагов (МИФ), трансформирующего фактора роста (ТФР(3). Наряду с цитокинами, в низкомолекулярной фракции суперлимфа идентифицированы пептиды, подобные катионным противомикробным пептидам — протегринам, с прямым противовирусным и противомикробным действиями. В экспериментах in vitro было показано прямое антибактериальное действие препарата в отношении Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes [5,6], а также противовирусное действие в отношении вируса простого герпеса [7].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью работы явилось изучение действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат суперлимф) на M.tuberculosis и на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Выбор модели для изучения активности комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов.

2. Изучение действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост штаммов М. tuberculosis с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам в модели in vitro.

5. Изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост лекарственно-устойчивых

M.tuberculosis, фагоцитированных макрофагами, в модели ex vivo.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

В работе впервые в одной модели проведено изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат суперлимф) на рост M.tuberculosis с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам и на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis. Впервые показано ингибирующее действие препарата суперлимф на рост in vitro лабораторного вирулентного штамма M.tuberculosis H37Rv. Впервые выявлено, что обработка макрофагов суперлимфом до инфицирования микобактериями туберкулеза, приводит к снижению роста чувствительного штамма М. tuberculosis H37Rv и штамма M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, фагоцитированных макрофагами, а также уменьшает цитопатогенный эффект, оказываемый M.tuberculosis на макрофаги.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

4. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов не оказывает цитотоксического действия на интактные макрофаги и проявляет протективный эффект в отношении макрофагов, инфицированных M.tuberculosis, снижая цитопатогенный эффект микобактерий на макрофаги.

5. Антимикобактериальная активность макрофагов повышается при предварительной 24-часовой инкубации (до инфицирования) с комплексом природных цитокинов и противомикробных пептидов, что подтверждается снижением подавляющей рост концентрации препарата до 1 мкг/мл в отношении чувствительного штамма M.tuberculosis H37Rv и появлением ингибирующего эффекта на рост М. tuberculosis с МЛУ.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Туберкулез представляет одну из важнейших проблем, поскольку на сегодняшний день его распространенность составляет 190,5 случая на 100 тысяч населения, заболеваемость 85,1 на 100 тысяч населения, смертность 17,9 на 100 тысяч. Практическая значимость работы определяется важностью поиска новых лекарственных средств на основе биотехнологических продуктов для лечения туберкулезной инфекции. Изучение влияния КПЦ и ПМП на модели макрофагов, инфицированных микобактериями туберкулеза, позволит лучше понять механизмы протективного иммунного ответа на возбудителя болезни. Полученные данные об антимикобактериальном эффекте препарата суперлимф обосновывают клиническую перспективность этого лекарственного средства.

Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение антимикобактериального действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов"

ВЫВОДЫ.

3. Культивирование комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов в концентрации 5мкг/мл с макрофагами, инфицированными M.tuberculosis H37Rv, приводило к подавлению роста микобактерий и снижению цитопатогенного эффекта микобактерий на макрофаги мыши.

4. Культивирование комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов ' с макрофагами, инфицированными M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, не оказывало влияния на жизнеспособность микобактерий, однако уменьшало цитопатогенный эффект микобактерий на макрофаги.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Использованная модель для изучения влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов in vitro и ex vivo позволила оценить активность препарата, как в отношении возбудителя туберкулеза, так и макрофагов мыши, инфицированных M.tuberculosis. Предложенный методический подход может быть рекомендован в качестве модели для комплексной оценки влияния вновь создаваемых препаратов на макрофаги человека и внутриклеточные патогены.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Гвоздева, Юлия Викторовна

1. Авербах М.М. Иммунология и иммунопатология туберкулеза // М. Медицина. 1976. - С.312.

2. Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г. Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В. Изучение ex vivo роста в макофагах штаммов разных генотипических кластеров // Пробл. туб. 2006. — №12. - С. 43-48.

3. Голышевская В .И., Иртуганова О.А., Смирнова Н.С., Домотенко Л. В. Сравнение нитратредуктазного и автоматизированного ВАСТЕС MGIT 960 AST методов определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулёза // Пробл. туб. 2003. - №8. - С.34-37.

4. Еремеев В.В., Майоров К.Б. Взаимодействие макрофаг-микобактерия в процессе реакции микроорганизма на туберкулезную инфекцию // Пробл. туберкулеза. 2002. - №3 - С.54-58.

5. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мороз А.Ф. и др. \1

6. Противостафилококковое действие комплекса природных цитокинов // Журн. микробиол. 2004. - №15 - С.5-59.

7. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Аведова Т.А. и др. Бактерицидное действие комплекса природных цитокинов на Streptococus pyogenes in vitro II Журн. микробиол. 2006. - №3 - С.67-71.

8. Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В. и др. Подавление цитопатического действия вируса герпеса простого 1 типа комплексом природных цитокинов (препаратом Суперлимф) in vitro II Журн. микробиол. 2005. - № 1 - С.57-60.

9. Кокряков В.Н. 1999. Биология антибиотиков животного происхождения //Монография. «Наука», Санкт-Петербург. 1999.

10. Кокряков В.Н. Ковальчук JI.B, Алешина Г.М, и др. Катионные противомикробные пептиды как молекулярные факторы иммунитета: мультифункциональность // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2006. №2 - С.98-105.

11. Кокряков В.Н., Ротова В.Е., Мазинг Ю.А. Морфобиохимические основы функциональной активности нейтрофилов млекопитающих // Морфофункциональные аспекты несиецифической резистентности и демиелинизирующих заболеваний. J1. — 1981. — С.31-45.

12. Тунгусова О.С., Марьяндышев А.О. Молекулярные механизмы формирования лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Пробл. туберкулеза. 2001. - №6 - С.48-49.

13. Abel В., Thieblemont N., Quesniaux V.J. et al. Toll-like receptor 4 expression is required to control chronic Mycobacterium tuberculosis infection in mice // J. Immunol. 2002. - Vol. 169(6) - P.3155-3162.

14. Aderem, A. and Ulevith. R. Toll-like receptors in the induction of the innate immune response // Nature. 2000. - Vol. 406 - P.782-787.

15. Akaki Т., Sato K., Shimizu Т., Tomioka H. Changes in antibacterial activity of murine peritoneal macrophages against Mycobacterium tuberculosis after prolonged in vitro precultivation // Kekkaku. 2000. - Vol. 75(7) - P.477-482.

16. Akira S, Takeda K, Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity //Nat. Immunol. 2001. - Vol.2 - P.675-680.

17. D'Arcy Hart, M.R. Young, M.M. Jordan Chemical inhibitors of phagosome-lysosome fusion in cultured macrophages // J.Exp.Med. 1989. - Vol.158 -P.477-492.

18. Ashitani J., Mukae H., Hiratsuka T. et al. Elevated levels of alpha-defensins in plasma and BAL fluid of patients with active pulmonary tuberculosis // Chest. -2002.-Vol. 121(2)-P.519-26.

19. Allen M.J., A. Laederach, PJ. Reilly, Mason R.J. Polysaccharide recognition by surfactant protein D: novel interactions of a C-type lectin with nonterminal glucosyl residues // Biochemistry. 2001. - Vol.40 - P.7789-7798.

20. Bafica A, Scanga CA, Feng CG, Leifer C, Cheever A, Sher A. TLR9 regulates Thl responses and cooperates with TLR2 in mediating optimal resistance to Mycobacterium tuberculosis // J. Exp. Med. 2005. - Vol.202 - P. 17151724.

21. Bals R., Wang X., Wu Z., Baftia V., Zasloff M. and Wilson J.M. Humman p-defensin 2 is a salt- sensitive peptide antibiotic expressed in hummah luhg // J. Clin. Invest. 1998. - Vol.l02 -P.874-880.

22. Bals, R., and J. M. Wilson. Cathelicidins—a family of multifunctional antimicrobial peptides // Cell. Mol. Life Sci. -2003. Vol.60 - P.711-720.

23. Barne.s P.P., LLI S., Abrams J.S., Wang E., Yamaniura M. Modlin R.I. Cytokine production at the site of disease in human tuberculosis // Infect. Immun. -1993 Vol.61 -P:3482-3489.

24. Berrington WR, Hawn TR. Mycobacterium tuberculosis, macrophages, and the innate immune response: does common variation matter // Immunol. Rev. 2007 - Vol.219 - P. 167-86.

25. Beutler B, et al. Genetic analysis of host resistance: Toll-like receptor signaling and immunity at large // Annu Rev. Immunol. -2006 Vol.24 -P.353-389.

26. Blackwell J.M., Searle S., Mohamed H., White J.K. Divalent cation transport and susceptibility to infectious and autoimmune disease: continuation of the1.y/Lsh/Bcg/Nramp 1 /Sic 1 lal gene story II Immunol. Lett. 2003. - Vol.85(2) -P. 197-203.

27. Boneca, I. G. The role of peptidoglycan in pathogenesis // Curr. Opin. Microbiol. 2005. - Vol.8 - P.46-53.

28. Branger J., Leemans J.C., Florquin S. et al. Toll-like receptor 4 plays a protective role in pulmonary tuberculosis in mice // Int. Immunol. 2004 — Vol. 16(3) -P.509-516.

29. Brennan, P. J. und Nikaido, H.: The envelope of mycobacteria // Annu Rev.Biochem. 1995. - Vol.64 -P.29-63.

30. Brightbill HD, et al. Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through toll-like receptors // Science. 1999 - Vol.285 - P.732-736.

31. Brogden K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria // Nat. Rev. Microbiol. 2005 - Vol.3 - P.238-250.

32. Brown GD. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor // Nat. Rev. Immunol. 2006 - Vol.6 - P.33-43.

33. Buwitt-Beckmann U, et al. Toll-like receptor 6-independent signaling by diacylated lipopeptides // Eur. J. Immunol. 2005. - Vol.35 - P.282-289.

34. Chertov O., Michiel D.F., Xu L., Wang J.M., Wooters J. et. al. Identification of defensin-1, defensin-2 and CAP37 / azurocidin as T-cells chemoattractant proteins released from IL-8-stimulated neutrophils // Chem. Biol. 1996. -Vol.271 -P.2935-2940.

35. Chertov О, Yang D, Howard OM, Oppenheim JJ. Leukocyte granule proteins mobilize innate host defenses and adaptive immune responses // Immunol. Rev. 2000. - Vol. 177 - P.68-78.

36. Cooper AM. Cell-mediated immune responses in tuberculosis // Annu. Rev. Immunol. 2009. - Vol.27 - P.393-^22.

37. Dao, D. N., L. Kremer, Y. Guerardel, A. Molano, W. R. Jacobs, Jr, S. A. Porcelli, V. Briken. Mycobacterium tuberculosis lipomannan induces apoptosis and interleukin-12 production in macrophages // Infect. Immun. -2004. Vol.72 - P.2067-2074.

38. Eckman L. Defence molecules in intestinal innate immunity against bacterial infections // Current Opinion Gastoenterology. 2005. - Vol. 2 - P. 147-149.

39. Ellis S.M. The spectrum of tuberculosis and non-tuberculous mycobacterial infection // Eur. Radiol. 2004. - Vol. 14 - P.34-42.

40. Fenhalls G, Wong A, Bezuidenhout J, van Helden P, Bardin P, Lukey PT. In situ production of gamma interferon, interleukin-4 and tumour necrosis factor alpha mRNA in human lung tuberculous granulomas // Infect. Immun 2000.- Vol.68 P.2827-36.

41. Flesch IE, Hess JH, Oswald IP, Kaufmann SH. Growth inhibition of Mycobacterium bovis by IFN-gamma stimulated macrophages: regulation by endogenous tumor necrosis factor-alpha and by IL-10 // Int. Immunol. 1994.- Vol.6 P.693—700.

42. Flynn JL, et al. Tumor necrosis factor-alpha is required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice // Immunity. — 1995.-Vol.2-P.561-572.

43. Flynn JL, Chan J. Immunology of tuberculosis // Annu Rev. Immunol. 2001. - Vol.19-P.93-129.

44. Flynn JL, Chan J. What's good for the host is good for the bug // Trends Microbiol. 2005. - Vol.13 - P. 98-102.

45. Flynn JL. Lessons from experimental Mycobacterium tuberculosis infections // Microbes Infect. 2006. - Vol.8 - P. 1179-1188.

46. Fortsch D, Rollinghoff M, Stenger S. IL-10 converts human dendritic cells into macrophage-like cells with increased antibacterial activity against virulent Mycobacterium tuberculosis // J. Immunol. 2000. - Vol.165 -P.978-87.

47. Fremond C.M., Yeremeev V., Nicolle D.M. et al. Fatal Mycobacterium tuberculosis infection despite adaptive immune response in the absence of MyD88 // J. Clin. Invest. 2004. - Vol.114(12) - P.1790-1799.

48. Fu LM. The potential of human neutrophil peptides in tuberculosis therapy // Tuberc. Lung Dis. 2003. - Vol.7(l 1) - P.l027-1032.

49. Gagneux S, DeRiemer K, Van T, Kato-Maeda M, de Jong ВС, Narayanan S, et al. Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2006. Vol.l03(8) -P.2869-2873.

50. Ganz T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity // Nat. Rev. Immunol. 2003. - Vol.3 - P.710-720.

51. Ganz, Т., M. E. Selsted, and R. I. Lehrer. Defensins // Eur. J. Haematol. -1990.-Vol.44-P. 1-8.

52. Gilleron, M,. L. Bala, T. Brando, A. Vercellone, and G. Puzo Mycobacterium tuberculosis H37Rv parietal and cellular lipoarabinomannans.

53. Characterization of the acyl- and glyco-forms // Biol. Chem. 2000. - Vol.l -P.677-684.

54. Gordon, A.H., P.D'Arcy Hart, and M.R Young. Ammonia inhibits phagosome-lysosome fusion in macrophages // Nature (London). -1980. — Vol.286-P.79-81.

55. Gray D, Gray M, Barr T. Innate responses // Eur. J. Immunol. -2007. Vol.37 -P.33 04-3310.

56. Hanekom WA, Abel B, Scriba TJ. Immunological protection against tuberculosis // S. Afr. Med. J. 2007. - Vol.97 - P.973-978.

57. Hancock R. E., Diamond G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences // Trends Microbiol. 2000. - Vol.8 - P.402—410.

58. Hazlett L, Wu M. Defensins and cathelicidins in lung immunity // Innate Immun. 2010. - Vol. 16(3) -P.l51-159.

59. Herr C., Shaykhiev R., Bals R. The role of cathelicidin and defensins in pulmonary inflammatory diseases // Expert Opin. Biol. Ther. 2007. -Vol.7(9) — P. 1449-1461.

60. Hill C.P., Yee J., Selsted M. E., Eisenberg D. С rystal structure of defensin HNP-3 ,an amphiphilic dimmer: mechanisms of membrane permeabilization // Science. 1991.-Vol. 251 -P. 1481-1485.

61. Hirsch CS, Ellner JJ, Russell DG et al. Complement receptor-mediated uptake and tumor necrosis factor-alpha-mediated growth inhibition of Mycobacterium tuberculosis by human alveolar macrophages // J. Immunol. -1994. Vol.152 - P.743-753.

62. Heldwein KA, Fenton MJ. The role of Toll-like receptors in immunity against mycobacterial infection // Microbes Infect. 2002. - Vol.4 -937-944.

63. Jenssen H, Hamill P, Hancock RE. Peptide antimicrobial agents // Clin. Microbiol. Rev. 2006. - Vol.19 - P.491-511.

64. Kamanaka M, Kim ST, Wan YY, Sutterwala FS, Lara-Tejero M, Galan JE, Harhaj E, Flavell RA. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse // Immunity. -2006. Vol.25 - P.941—952.

65. Kang PB, Azad AK, Torrelles JB et al. The human macrophage mannose receptor directs Mycobacterium tuberculosis lipoarabinomannan-mediated phagosome biogenesis // J. Exp. Med. 2005. - Vol. 202 - P.987-99.

66. Kaufmann SHE. Protection against tuberculosis: cytokines, T cells, and macrophages // Ann. Rheum. Dis. 2002. - Vol.61 - P.54-58.

67. Kaufmann SH, Cole ST, Mizrahi V, Rubin E, Nathan C. Mycobacterium tuberculosis and the host response // J. Exp. Med. 2005. - Vol.201(ll) -P.l 693-1697.

68. Kaufmann SH, Schaible UE. Antigen presentation and recognition in bacterial infections // Curr. Opin. Immunol. 2005. - Vol.17 - P.79-87.

69. Keertan Dheda, Stephan K. Schwander, Bingdong Zhu, Richard N.The immunology of tuberculosis: From bench to bedside // Respirology. 2010. -Vol.15-P.433-450.

70. Kokryakov V.N., Harwig S.S., Panyutich E.A. et al. Protegrins. Leukocyte antimivrobial peptides that combine features of corticostatic defensins and tachyplesins // FEBS Lett. 1993. - Vol.8 - P.327-331.

71. Lehrer R. I., Lichtenstein A. K., Ganz T. Defensins: antimicrobial;and cytotoxic peptides of mammalian cells // Annu. Rev.Immunol. -1993. -Vol.l 1 — P.105—128.

72. Lehrer R.I., The fungicidal mechanisms of human monocites. Evidence for myeloperoxidase-linked and myeloperoxidase-independet candidicidal mechanism // J. Clin. Invest. -1997. -Vol.55 P. 338-346.

73. Lehrer R. I., Ganz T. Defensins of vertebrate animals. // Curr. Opin. Immunol. 2002. - Vol.14 - P.96-102.

74. Lichtenstein A.K., Ganz Т., Selsted M. E., Lehrer R.I. In vitro tumor cell cytolysis mediated by peptide defensins of human and rabbit granucytes // Blood. 1986. - Vol.68 -P.l407—1410.

75. Lichtenstein A.K., Ganz Т.,Nguyen T.M. et al Mechanism of target cytolysis by peptide defensins // J. Immun. 1988. - Vol.140 - P.2686-2694.

76. Liu PT, Modlin RL. Human macrophage host defense against Mycobacterium tuberculosis // Curr. Opin. Immunol. 2008. - Vol.20 - P.371-376.

77. MacMicking J, Xie Q, Nathan C. Nitric oxide and macrophage function // Ann. Rev. Immunol. -1997. Vol.1: - P.323-350.

78. Manca С., Reed M.B., Freeman S. et al. Differential monocyte activation underlies strain-specific Mycobacterium tuberculosis pathogenesis // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72(9) - P.5511-5514.

79. Martineau A, Newton S, Wilkinson K, Kampmann D et al, Neutrophil-mediated innate immune resistance to mycobacteria // J. Clin. Invest. -2007. -Vol.117(7) P. 1988-1994.

80. Medzhitov R, Janeway С Jr. The Toll receptor family and microbial recognition // Trends Microbiol. 2000. - Vol.8 - P.452-456.

81. Mendez-Samperio P. Role of antimicrobial peptides in host defense against mycobacterial infections // Peptides. 2008. - Vol.29 - P.l836-1841.

82. Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, O'Garra A. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor // Annu Rev. Immunol. 2001. - Vol.19 - P.683-765.

83. Morr M, Takeuchi O, Akira S, Simon MM, Muhlradt PF. Differential recognition of structural details of bacterial lipopeptides by toll-like receptors // Eur. J. Immunol. 2002. - Vol.32 - P.3337-3347.

84. Murray PJ, Wang L, Onufryk C, Tepper RI, Young RA. T cell-derived IL-10 antagonizes macrophage function in mycobacterial infection // J. Immunol. -1997. -Vol.158 -P.315-321.

85. Nathan, C. und Shiloh, M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2000. - Vol.97 (16) - P.8841-8848.

86. Niederweis, M. Mycobacterial porins—new channel proteins in unique outer membranes // Mol. Microbiol. -2003- Vol.49 P. 1167-1177.

87. North R.J., Jung Y.J. Immunity to tuberculosis // Annu. Rev. Immunol. -2004. Vol.22. -P.599-623.

88. Parker L.C., Whyte M.K., Vogel S.N. et al. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 agonists regulate CCR expression in human monocytic cells // J. Immunol. 2004. - Vol. 172(8) - P.4977-4986.

89. Quesniaux V., Fremond C., Jacobs M. et al. Toll-like receptor pathways in the immune responses to mycobacteria // Microbes Infect. 2004. - Vol.6(10) — P.946-959.

90. Ratledge C. Iron, mycobacteria and tuberculosis // Tuberculosis (Edinb). -2004. Vol.84(l—2). - P. 110-130. ;

91. Reed MB, Domenech P, Manca C, Su H, Barczak AK, Kreiswirth BN, et al. A glycolipid of hypervirulent tuberculosis strains that inhibits the innate immune response // Nature. 2004. - Vol.431(7004) - P.84-87.

92. Reiling N, et al. Cutting edge: Toll-like receptor (TLR)2- and TLR4-mediated pathogen recognition in resistance to air-borne infection with Mycobacterium tuberculosis // J. Immunol. 2002. - Vol.169 - P.3480-3484.

93. Riley L. Eds W. Rom, S. Garay.- II Tuberculosis // Boston. 1996. - P.281-289.

94. Rivas-Santiago, В., E. Sada, V. Tsutsumi, D. Aguilar-Leon, J. L. Contreras, and R. Hernandez-Pando. Beta-defensin gene expression during the course ofexperimental tuberculosis infection // J. Infect. Dis. 2006. - Vol.194 -P.697-701.

95. Rivas-Santiago, В., J. C. Contreras, E. Sada, and R. Hernandez-Pando. The potential role of lung epithelial cells and beta-defensins in experimental latent tuberculosis // Scand. J. Immunol. 2008. - Vol.67 - P.448-452.

96. Rojas M, Olivier M, Gros P, Barrera LF, Garcia LF. TNFa and IL-10 modulate the induction of apoptosis by virulent Mycobacterium tuberculosis in murine macrophages // J. Immunol. 1999. - Vol.162 -P.6122-6131.

97. Sanchez JF, et al. Overexpression and structural study of the cathelicidin motif of the protegrin-3 precursor // Biochemistry. 2002. - Vol.41 - P.21-30.

98. Schnappinger D, Schoolnik GK, Ehrt S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another // Microbes Infect. 2006. - Vol.8 - P.l 132-1140.

99. Selsted M. E. Investignation approaches for studyng the structures and biological functios of mysloid antimicrobial peptides // Genetic engineering. -1993.-Vol. 15-P.131-137.

100. Selsted ME, Brown DM, DeLange RJ, Lehrer RI. Primary structures of MCP-1 and MCP-2, natural peptide antibiotics of rabbit lung macrophages // J. Biol. Chem. 1983. - Vol 258 - P.14485-14489.

101. Schlesinger LS, Bellinger-Kawahara CG, Payne NR etal. Phagocytosis of Mycobacterium tuberculosis is mediated by human monocyte complement receptors and complement component C3 // J. Immunol. 1990. - Vol 144 -P.2771-2780.

102. Stenger, S., and R. L. Modlin. Control of Mycobacterium tuberculosis through mammalian Toll-like receptors // Curr. Opin. Immunol. 2002 - Vol 14 -P.452-457.

103. Stewart GR, Robertson BD, Young DB. Tuberculosis: a problem with persistence // Nat. Rev. Microbiol. 2003. - Vol 1 - P.97-105.

104. Storici P, et al.; Purification and structural characterization of bovine cathelicidins, precursors of antimicrobial peptides // Eur. J. Biochem. 1996. -Vol 238 -P.769-776.

105. Tailleux L, Schwartz O, Herrmann JL, Pivert E, Jackson M, Amara A, et al. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells // J. Exp. Med. 2003.- Vol 197(1) - P. 121-127.

106. Tapping, R. I., and P. S. Tobias. Mycobacterial lipoarabinomannan mediates physical interactions between TLR1 and TLR2 to induce signaling // Endotoxin Res. 2003. - Vol 4 - P.264-268.

107. Tecle T, Tripathi S, Hartshorn KL. Defensins and cathelicidins in lung immunity// InnateImmun.-2010.-Vol 16(3)-P.151-159.

108. Thoma-Uszynski S, et al. Induction of direct antimicrobial activity through mammalian toll-like receptors // Science. -2001. Vol 291 - P. 1544-1547.

109. Tosi MF. Innate immune responses to infection // J. Allergy Clin. Immunol. -2005.-Vol 116 -P.241-249.

110. Trias, J.; Jarlier, V. und Benz, R.: Porins in the cell wall of mycobacteria // Science. 1992. - Vol 258 - P. 1479-1481.

111. Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity // Nat. Rev. Immunol. .2003. - Vol 3 - P. 133-146.

112. Turner J, Frank AA, Brooks JV, Gonzalez-Juarrero M, Orme IM. The progression of chronic tuberculosis in the mouse does not require the participation of В lymphocytes or interleukin-4 // Exp. Gerontol. -2001. Vol 36-P.537-545.

113. Underhill DM, Ozinsky A, Smith KD, Aderem A. Toll-like receptor-2 mediates mycobacteriainduced pro-inflammatory signaling in macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol 96 -P.l4459-14463.

114. Vergne I., Chua J., Singh S.B., Deretic V. Cell biology of Mycobacteriumtuberculosis phagosome // Annu. Rev .Cell Dev. Biol. 2004. - Vol.20 1. P.367-394.

115. Wang J.E., A. Warris E.A. Ellingsen P.F. et al. Involvement of CD 14 and tolllike receptors in activation of human monocytes by Aspergillus fumigatus hyphae // Infect. Immun. 2001. - Vol.69 - P.2402-2406.

116. Yamada H, Mizumo S, Horai R, Iwakura Y, Sugawara I. Protective role of interleukin-1 in mycobacterial infection in IL1 alpha/beta double-knockout mice // Lab. Invest. 2000. - Vol 80 - P.759-767.

117. Yang D., Biragyn A., Kwak L.W., Oppenheim J. J. Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal // Trends in Immunol. 2002. - Vol 23 -P.287—291.

118. Yang CS, Shin DM, Kim KH et al; NADPH oxidase 2 interaction with TLR2 is required for efficient innate immune responses to mycobacteria via cathelicidin expression // J. Immunol. 2009. - Vol 182 - P.3696-3705.

119. Yim JJ, Lee HW, Lee HS, Kim YW, Han SK, Shim YS, et al. The association between microsatellite polymorphisms in intron II of the human Toll-like receptor 2 gene and tuberculosis among Koreans // Genes Immun. 2006. — Vol 7(2) — P. 150-155.

120. Zanetti M. Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity // J. Leukoc. Biol. 2004. - Vol 75 - Р.39-Ч8.

121. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organism // Nature. 2002. - Vol. 415 -P.389-395.

122. Zasloff, M. Antimicrobial peptides, innate immunity, and the normally sterile urinary tract // J. Am. Soc. Nephrol. 2007. - Vol 18 - P.2810-2816.

123. Zhang P, Summer WR, Bagby GJ, Nelson S. Innate immunity and pulmonary host defense // Immunol. Rev. 2000. - Vol 173 - P.39-51