Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Комплексный анализ противомикробных пептидов в биологических средах организма

На правах рукописи

Карташов Дмитрий Дмитриевич

КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ ЧЕЛОВЕКА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 Л ОКТ 2010

Моек в а-2010

004610440

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Ковальчук Леонид Васильевич Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Ганковская Людмила Викторовна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Козлов Иван Генрихович доктор медицинских наук, профессор Краснопрошина Людмила Ивановна

Ведущая организация:

ФГБУ "ГНЦ "Институт иммунологии" ФМБА России

Защита состоится «2^» 2010 г. в /4" ¿У? на заседании

диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу. 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Татьяна Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования:

Механизмы врожденного иммунитета представляют первую филогенетически наиболее древнюю линию защиты организма от различных патогенов. Врожденный иммунитет предотвращает развитие инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще не задействованы.

В течение последнего десятилетия активно изучаются биология, структура и функции нового класса эффекторных молекул врожденного иммунитета - противомикробных пептидов (ПМП).

ПМП представляют собой обширную группу небольших катионных белков, способных поражать различные микроорганизмы, среди которых вирусы, бактерии, грибы и простейшие.

Противомикробные пептиды, являясь естественными эндогенными антибиотиками, осуществляют функцию так называемого мгновенного иммунитета - «instant immunity». С другой стороны они являются сигнальными молекулами, вовлеченными в процессы регуляции и активации клеток иммунной системы и репарации тканей. ПМП формируют молекулярную основу врожденного иммунитета и участвуют в реализации ряда защитно-приспособительных реакций.

Полифункциональность ПМП в значительной степени определяет эффективность иммунных процессов, протекающих при воспалении, урогенитальных инфекциях (УГИ), септическом шоке и др.

В настоящее время урогенитальная инфекция рассматривается как одна

из основных причин развития хронических простатитов, бесплодия,

патологии беременности, таких как внутриутробное инфицирование плода,

невынашивание, неразвивающаяся беременность и др. Однако остается

неясным, почему одни и те же инфекционные агенты в одних случаях

вызывают реализацию внутриутробной инфекции и преждевременные роды,

1

а в других - практически не влияют на течение беременности. Это вызывает необходимость поиска новых подходов к изучению роли механизмов врожденного иммунитета при урогенитальной инфекции, разработки новых диагностических критериев.

Исследование экспрессии р-дефенсинов клетками слизистой урогенитального тракта и а-дефенсинов в плазме и в культуре нейтрофилов периферической крови здоровых доноров, больных с патологиями инфекционного генеза (урогенитальные инфекции, внутриутробное инфицирование, хронический простатит и другие) представляется актуальным так, как дает возможность понять роль противомикробных пептидов в защите репродуктивной системы от воздействия различных патогенов, широко представленных в урогенитальном тракте. Анализ дефенсинов на уровне экспрессии генов и синтеза белка позволит понять механизм нарушений в системе противомикробной защиты при урогенитальной инфекции, сепсисе, а также определить возможные маркеры прогноза течения данных заболеваний и эффективности проводимого лечения.

Цель работы: комплексное исследование противомикробных пептидов (дефенсинов) в биологических средах организма в норме и при инфекциях.

Задачи исследования:

1. Разработать лабораторные варианты систем ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов НВО-1 и НИР-1.

2. Определить уровень экспрессии гена НВО-1 в клетках слизистой урогенитального тракта мужчин и женщин в норме и при урогенитальной инфекции.

3. Оценить экспрессию НЕШ-1 в слизистой цервикального канала у женщин с физиологически протекающей беременностью и у беременных с урогенитальной инфекцией.

4. Определить уровень нейтрофильных пептидов Н№1-3 в плазме крови здоровых женщин и при патологии беременности инфекционного генеза.

5. Исследовать динамику экспрессии гена и выработки пептида (а-дефенсина НЫР-1) нейтрофилами периферической крови беременных с урогенитальной инфекцией и у больных сепсисом в сравнении с группой здоровых доноров.

Научная новизна работы

Разработан комплексный подход к оценке противомикробных пептидов у человека, основанный на изучении ПМП в различных средах организма. Анализ а-дефенсинов проведен на уровне экспрессии гена и синтеза молекулы пептида.

С помощью разработанных систем ПЦР в реальном времени исследован количественный уровень экспрессии генов р-дефенсина 1 (НВО-1) и а-дефенсина 1 (НЫР-1) у здоровых доноров и пациентов с урогенитальной инфекцией. Особую значимость представляют полученные данные об экспрессии генов ПМП в слизистой цервикального канала и в нейтрофилах крови при физиологически развивающейся беременности и при патологии беременности инфекционного генеза (внутриутробное инфицирование, неразвивающаяся беременность). При реализации внутриутробной инфекции наблюдается снижение экспрессии НВО-1 в клетках слизистой цервикального, что свидетельствует о нарушении противомикробной защиты слизистой репродуктивного тракта. Снижение концентрации нейтрофильных пептидов НИР 1-3 в плазме крови при неразвивающейся беременности может служить маркером для ранней диагностики данной патологии.

Определена роль противомикробных пептидов в развитии иммунодефицитного состояния при хроническом простатите на основе

3

данных о снижении уровня экспрессии гена (3-дефенсина - НЕШ-1 в эпителиальных клетках уретры и снижения концентрации нейтрофильных пептидов НЫР1-3 в секрете простаты.

Получены новые данные о нарушении экспрессии НЫР-1 в нейтрофилах больных сепсисом. Высокий уровень экспрессии гена НЫР-1 сопровождается резким снижением выработки этого пептида.

Практическая значимость работы

Выявленные изменения в экспрессии и продукции ПМП у больных УГИ помогают уточнить патогенез данной патологии, а при беременности могут служить прогностическими маркерами течения беременности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны лабораторные варианты систем ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов НВЭ-1 и НЫР-1 и гена «домашнего хозяйства» - р-актина.

2. С использованием разработанных систем были получены данные, свидетельствующие о том, что слизистая урогенитального тракта в норме защищена противомикробными пептидами. При урогенитальной инфекции происходит уменьшение экспрессии гена НВО-1 в клетках слизистой уретры и цервикального канала.

3. Физиологическое течение беременности сопровождается активацией системы противомикробных пептидов, что проявляется в увеличении экспрессии гена НВО-1 в слизистой цервикального канала и концентрации НЫР1-3 в периферической крови.

4. Разработанные тест-системы позволили выявить нарушения в системе противомикробных пептидов: на уровне экспрессии гена НЫР-1 и

выработки молекулы данного пептида при урогенитальной инфекции и сепсисе.

Внедрение результатов исследования

Разработаны и внедрены в клиническую практику системы на основе ПЦР-РВ для определения экспрессии генов противомикробных пептидов ( ß-дефенсина 1 (HBD-1) и а-дефенсина 1 (HNP-1).

С использованием разработанных систем определены маркеры развития преждевременных родов, внутриутробного инфицирования.

Получено положительное решение по заявке №2009108294/15 (011092) «Способ прогноза преждевременных родов»

Результаты исследования используются в практической работе родильного отделения ГКБ№8 и родильного дома №10 г. Москвы.

Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов кафедр иммунологии и акушерства и гинекологии РГМУ.

Апробация.

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции кафедры иммунологии, отдела иммунологии и кафедры эндокринологии лечебного факультета ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава» от 24 июня 2010 года.

Материалы диссертации представлены на II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, 2007; Конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике, Киев, Украина, 2007; XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 6-10 апреля 2009 г.; III Международном конгрессе по репродуктивной медицине, 2009г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 6 статей в центральной печати и патент №2009108294/15 (011092) «Способ прогноза преждевременных родов» Структура и объем диссертационной работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, заключения, выводов, указателя литературы, содержащего 93 отечественных и 124 зарубежных источников. Работа выполнена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами и 37 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы

Исследование проводилось в 2007-2010 гг. на кафедре иммунологии РГМУ (заведующий кафедрой д.м.н., профессор, академик РАЕН Ковальчук J1.B.) и на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ (заведующий кафедрой д.м.н., профессор, заслуженный врач РФ Макаров О.В.). Было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 40 беременных женщин с урогенитальной инфекцией, находящихся в родильном доме при 8-ой городской больнице. Диагностика УГИ осуществлялась с помощью ПЦР. У беременных была выявлена вирусная инфекция (цитомегаловирус, вирус герпеса простого, вирус папилломы человека), уреаплазма и микоплазма, так же С. albicans. Критериями отбора в основную группу являлись: срок беременности (29-32 недели), наличие урогенитальной инфекции, отсутствие хронических инфекционных и системных аутоиммунных заболеваний.

Все пациентки основной группы были разделены на две подгруппы: беременные с урогенитальной инфекцией, родившие здоровых детей (22

пациенток) и беременные с реализацией внутриутробной инфекции (18 пациенток).

Контрольную группу составили 32 женщин в возрасте 19-39 лет с физиологически протекающей беременностью (срок беременности 29-32 недели - 20 пациенток; срок беременности 5-13 недели гестации - 12 пациенток).

Были обследованы 29 беременных с неразвивающейся беременностью.

Также были обследованы 20 здоровых небеременных женщин, 23 женщины с УГИ, находящихся под наблюдением в женской консультации при 10-ом родильном доме г. Москвы.

У женщин производили забор крови и слизи цервикального канала.

Иммунологические исследования больных хроническим бактериальным простатитом (ХБП) проводились совместно с аспирантом кафедры урологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава Д.Н. Суренковым

Было обследовано 15 больных ХБП и 12 здоровых мужчин (средний возраст составил 20±2,1 года).

Всего у больных ХБП было выделено и идентифицировано 19 штаммов бактерий: 68,4% грамположительных и 31,6% грамотрицательных.

Исследование экспрессии и продукции нейтрофильных пептидов Н№ проведено у 5 больных сепсисом, проходивших лечение на кафедре медицины катастроф Московского государственного медико-стоматологического университета.

Иммунологические и молекулярно-генетические методы исследования.

Исследование включало определения уровня экспрессии гена ШШ-1 в клетках слизистой цервикального канала женщин и уретры мужчин, изучение экспрессии гена Н№М нейтрофилами периферической крови и концентрации а-дефенсинов НИР 1-3 в плазме крови, секрете простаты и амниотической жидкости.

Для изучения экспрессии генов клеточный материал (клетки слизистой цервикального канала, уретры, нейтрофилы периферической крови) подвергались лизису в специальном буфере. Затем из лизата выделяли общую РНК и в реакции обратной транскрипции на ее матрице синтезировали кДНК. Для количественного определения кДНК использовали полимеразную цепную реакцию в реальном времени. Олигонуклеотидные праймеры и зонды для ПЦР-РВ подбирали с помощью компьютерной программы VectorNTI 8.0.

Определение концентрации HNP1-3 в биологических жидкостях осуществляли при помощи иммуноферментного анализа согласно методикам, предлагаемым производителями тест-систем (HyCult Biotechnology, Нидерланды).

Изучение динамики экспрессии гена HNP-1 и продукции белкового продукта проводилось на культуре нейтрофилов, выделенных из периферической крови.

Статистический анализ изменений числовых результатов проведен с помощью программы Microsoft Excel 2003 с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.

Для критерия Манна-Уитни достоверным считали уровень значимости 5% (вероятность ошибочной оценки р<0,05).

Результаты и обсуждение

Первой задачей исследования была разработка лабораторных вариантов систем ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов человека: HBD-1 и HNP-1.

Для постановки реакции использовались «наборы для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green 1» фирмы Синтол.

С помощью программы Vector NTI были подобраны праймеры для HBD-1, HNP-1 и р-актина и затем синтезированы фирмой Синтол. Оптимальные условия протекания реакции отработаны на амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия). При этом была подобрана температура отжига праймеров, равная 60°С.

Для регистрации флуоресценции специфического продукта в реакционную смесь добавлялись зонды. Подбор зондов также осуществлялся с помощью программы анализа нуклеотидных последовательностей Vector NTI. Выбор последовательности зонда определялся следующими критериями: комплементарность участку определяемого гена между прямым и обратным праймером, так же зонды не должны образовывать шпилек, димеров и взаимодействовать с праймерами. Кроме того, было необходимо подобрать оптимальную концентрацию зонда. По стандартным протоколам рекомендованы концентрации 10 пМ (2,7 оптических единицы для HNP-1; 2,8 оптических единицы - HBD-1; 2,5 оптических единицы - Р-актин).

Рис. 1. Зависимость интенсивности флуоресценции зонда для ИЧР-1 при двух концентрациях зонда для двух исследуемых образцов (1 и 2). К- -отрицательный контроль.

Флуоресценцию в пробе 1 отражают бирюзовая (3 оптических единицы зонда) и фиолетовая (5,9 оптических единицы) кривые. Флуоресценция в

пробе 2 описывается синей (3 оптических единицы) и сиреневой (5,9 оптических единицы) кривыми. Из данного графика видно, что нет существенных различий в значении порогового цикла амплификации и скорости нарастания флуоресценции между различными концентрациями зона. Аналогичные данные были получены для концентрации зонда 1 оптическая единица и зондов для НЕШ-1 и Р-актина.

Так, для уменьшения расхода зондов в качестве рабочей концентрации была выбрана концентрация в 1 оптическую единицу/мл.

Для оптимизации условий ПЦР-РВ, связанной с недостаточным количеством выделяемой РНК из небольших объемов клинического материала, был использован метод, позволяющий объединить реакцию обратной транскрипции и ПЦР-РВ. Такая модификация позволяет использовать всю кДНК, получаемую в реакции обратной транскрипции, а также снижает риск контаминации образцов. На рисунке 2 представлены графики, демонстрирующие преимущество такой модификации.

Рис. 2. Зависимость флуоресценции зонда для НЫР-1 от количества циклов амплификации. А - при отдельном проведении обратной транскрипции, Б -при совмещении обратной транскрипции и ПЦР-РВ.

С помощью разработанной системы полимеразной цепной реакции в реальном времени был исследован количественный уровень экспрессии гена НЕЮ-1 в слизистой цервикального канала у женщин с УГИ по сравнению с группой здоровых женщин. У женщин с урогенитальной инфекцией было выявлено снижение в 3 раза уровня экспрессии гена Р-дефенсина 1, который

А

Б

выполняет важные защитные функции (Рис.3). Возможно, именно уменьшение экспрессии этого гена влечет за собой ослабление локальных защитных механизмов и развитие инфекционного процесса.

При беременности возрастает роль врожденного иммунитета в защите от патогенов. Происходящее при беременности снижение активности адаптивного иммунитета компенсируется за счет активации факторов врожденного иммунитета, осуществляющих противомикробную защиту матери и плода. При этом увеличивается экспрессия распознающих сигнальных рецепторов системы врожденного иммунитета, относящихся к семейству То11-подобных рецепторов, которые распознают консервативные элементы патогенных микроорганизмов и активируют выработку провоспалительных цитокинов, хемокинов, противомикробных пептидов и др. Так в работах, выполненных на кафедре иммунологии показано, что у женщин с физиологически протекающей беременностью статистически достоверно возрастает в слизистой цервикального канала экспрессия генов ТЫ11, ТЫ12 и ТЬЯб по сравнению со здоровыми небеременными женщинами (Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., 2006).

Исследование количественного уровня экспрессии гена НВЭ-1 в слизистой цервикального канала у женщин с физиологически протекающей беременностью в сравнении со здоровыми небеременными женщинами показало увеличение экспрессии этого гена при беременности в 3 раза (Рис. 3).

Следующим этапом работы было изучение экспрессии гена НВВ-1 в слизистой цервикального канала у беременных женщин с урогенитальной инфекцией. В результате выявлено снижение в 2,5 экспрессии гена НВО-1 по сравнению со здоровыми беременными (Рис.3).

Можно предположить, что развитие урогенитальной инфекции у беременных спровоцировано изначально сниженной выработкой противомикробных пептидов клетками слизистой. Одной из объяснений этого может быть полиморфизм генов молекул врожденного иммунитета

(ТЬЛ, цитокинов, противомикробных пептидов, ферментов и др.). Описан полиморфизм промоторной области гена ШШ-1, мутации в которой могут снижать экспрессию гена на 40-50%.

Этим, по-видимому, можно объяснить неполноценность механизмов противомикробной защиты на уровне слизистой цервикального канала, следствием чего и является распространение инфекции.

У 40% обследованных беременных с урогенитальной инфекцией по данным ретроспективного анализа имела место реализация внутриутробной инфекции. У женщин, родивших детей с признаками внутриутробного инфицирования, наблюдалось наиболее выраженное угнетение экспрессии гена ШШ-1 (в 10 раз и более) по сравнению с группой беременных с урогенитальной инфекцией без реализации ВУИ (Рис. 3).

здоровые здоровые беременные с беременные с

небеременные беременные урогенитальной реализацией ин{{екцией внутриутробной инфекции

Рис. 3. Экспрессия гена НВО-1 клетками цервикального канала в исследуемых группах. По оси абсцисс представлены исследуемые группы, по оси ординат - количество копий хЮ3 кДНК НВО-1 (относительно экспрессии гена актина).

Исследовался уровень экспрессии гена НВО-1 клетками слизистой цервикального канала у женщин с неразвивающейся беременностью, однако, статистически значимых отличий от здоровых беременных выявлено не было.

Следующей задачей нашего исследования было определение уровня

экспрессии гена НВО-1 в слизистой уретры мужчин в норме и при

12

бактериальном хроническом простатите. Средний уровень экспрессии гена НВО-1 в группе здоровых мужчин составил 288,4±25,3 х 103 копий кДНК (Рис.4).

g 300

^ I 250 « 200

ж *

I fe 150 § g. 100 í С 50 ^ 0

здоровые мужчины хоонический поостатмт

больные хроническим простатитом

Рис.4. Экспрессия гена HBD-1 клетками слизистой уретры здоровых мужчин и мужчин с хроническим простатитом. По оси ординат представлено количество копий х10" кДНК HBD-1 (относительно экспрессии гена актина).

Обращает на себя внимание тот факт, что в клетках слизистой уретры здоровых добровольцев экспрессируются паттерн-распознающие рецепторы -TLR2, TLR4, TLR9 (Ганковская и др. 2009). Можно заключить, что слизистая уретры защищена как рецепторными компонентами врожденного иммунитета, так и эффекторными молекулами.

У больных с ХБП наблюдалось снижение экспрессии гена HBD-1(60,25±6,4*103 копий кДНК) (Рис. 4).

Как было показано ранее, уровень TLR2 у этих пациентов был снижен в 13,5 раза относительно показателя в группе здоровых добровольцев. Выраженное снижение уровня экспрессии гена TLR2 наблюдалось у больных ХБП с инфекцией, вызванной энтерококком или гемолитическим стрептококком. Известно, что патогены имеют механизмы ускользания от иммунной системы.

Показана резистентность стафилококков и энтерококков в мочеиспускательном канале к противомикробным пептидам. Эта резистентность коррелирует с тяжестью течения ХБП (Ivanov IB., 2005). Наряду с этим был обнаружен внеклеточный стафилококковый продукт, названный secretory inhibitor of platelet microbicidal protein (SIPMP). Данный

фактор вызывает локальное ингибирование антимикробного действия ПМП. (1уапоу 1В., 2006).

Таким образом, по результатам проведенных исследований можно сказать, что при урогенитальной инфекции уровень экспрессии НЕШ-1 снижается как в слизистой цервикального канала женщин, так и в слизистой уретры мужчин, что может служить одной из причин перехода инфекционного процесса в хроническую форму.

В отличие от Р-дефенсинов, экспрессируемых эпителиальными клетками слизистой, а-дефенсины (НИР 1-3) выделяются из азурофильных гранул нейтрофилов при инфекции и определяют в основном развитие системного воспалительного ответа. Показано, что эти катионные пептиды активируют миграцию и фагоцитоз нейтрофилов и макрофагов, стимулируют в тучных клетках высвобождение гистамина, увеличивают проницаемость сосудов секрецию ИЛ-8 клетками эндотелия.

В наших исследованиях не выявлено статистически значимых различий в концентрации НЫР1-3 в плазме крови здоровых доноров и больных с УГИ.

При физиологически протекающей беременности концентрация дефенсинов в плазме была достоверно выше, чем в группе небеременных женщин и составила 6,7+2,4 нг/мл (рис.5). Полученный результат можно объяснить активацией нейтрофилов - основных клеток, высвобождающих ЬГЫР1-3. При беременности происходит увеличение количества нейтрофилов в периферической крови и их активация (Окага1а Т., 2007). Ганковская Л.В. с соавторами показали, что в нейтрофилах периферической крови беременных увеличивается экспрессия ТЫ14 на уровне гена и на уровне молекулы белка (Ганковская, 2007). Известно, что передача сигнала с этого рецептора активирует секрецию биологически активных факторов нейтрофилов. Таким образом, можно предположить, что уровень а-дефенсинов в плазме крови коррелирует с активацией нейтрофилов в большей степени, чем с их количеством.

Следующий этап исследований включал определение а-дефенсинов Ю4Р1-3 в плазме периферической крови беременных женщин с урогенитальной инфекцией. Это исследование представляется актуальным так, как дает возможность понять роль противомикробных пептидов, действующих на системном уровне в защите репродуктивной системы женщины от воздействия различных патогенов, широко представленных в урогенитальном тракте.

У беременных с УГИ и ВУИ было выявлено снижение концентрации НМЧ-З в плазме крови (Рис. 5). Это говорит о снижении гуморальных компонентов врожденного иммунитета на системном уровне при беременности, осложненной УГИ.

здоровые здоровые беременные с УГИ беременные с ВУИ

небеременные беременные

Рис. 5. Концентрация НЫРЬЗ в плазме крови. По оси абсцисс представлены исследуемые группы, по оси ординат - концентрации.

У женщин с неразвивающейся беременностью была определена концентрация ШЧРЬЗ в плазме крови. Средние показатели НЫР1-3 у пациенток с неразвивающейся беременностью были достоверно ниже и составили 0,018+0,012 нг/мл.

При анализе индивидуальных данных было выявлено следующее:

«нулевые» значения ГПЧР1-3 в плазме женщин с неразвивающейся

беременностью встречались у 40% пациенток, концентрация нейтрофильных

пептидов до 0,1 нг/ мл - у 30% и более 0,1 нг/мл - лишь у 30% пациенток. В

то время как у здоровых беременных НИР 1 -3 определялись всегда, причем у

15

70% пациенток концентрация нейтрофильных пептидов была в диапазоне от 0,1нг/мл до 1,0нг/мл, а у 25% пациенток - выше 1,0 нг/мл

Следует обратить внимание, что в амниотической жидкости здоровых беременных уровень нейтрофильных противомикробных пептидов в 300 раз превышает их концентрацию в плазме крови.

При УГИ и ВУИ происходит снижение этого показателя примерно в 3 раза (рис. 6), что свидетельствует о снижении защитных механизмов врожденного иммунитета в амниотической полости

•с 3500 г

1 3000

2 2500 о.

здоровые беременные с УГИ беременные с ВУИ беременные

Рис. 6. Концентрация Н1ч1Р1-3 в амниотической жидкости. По оси абсцисс представлены исследуемые группы, по оси ординат - концентрация ШР1-3, нг/мл.

В работе были изучены концентрации ИЧР1-3 в секрете простаты. По содержанию НЫР1-3 в секрете простаты как здоровых мужчин, так и мужчин с хроническим простатитом можно разделить на две группы: менее 300 пг/мл и более 1000 пг/мл. У 44% здоровых мужчин концентрация НМЧ-З в секрете простаты составляла 232,6±54,9 пк/мл и у 56% - 1044,4±157,6 пг/мл. У больных хроническим простатитом это соотношение отличалось: у 29% концентрация ИЫР1-3 определялась на уровне 290,2±123,9 пг/мл и у 71% -1024,6±196,2 пг/мл.

У больных с ХБП чаще определяются высокие уровни НЫР1-3 в секрете простаты (более 1000 пг/мл) по сравнению со здоровыми донорами.

Следующей задачей исследования явилось изучение динамики уровня экспрессии гена а-дефенсина Н1ЧР-1 в культуре нейтрофилов периферической крови здоровых беременных женщин и беременных с урогенитальной инфекцией. Параллельно с этим с помощью иммуноферментного анализа в культуре нейтрофилов определяли концентрацию секретируемых НЫР1 -3.

При изучении динамики уровня спонтанной экспрессии гена НЫР-1 в культуре нейтрофилов периферической крови здоровых беременных женщин и беременных с урогенитальной инфекцией показано, что уровень спонтанной экспрессии данного гена существенно не отличается у этих двух групп и поддерживается на одном уровне независимо от времени культивирования. Лишь через сутки культивирования наблюдается тенденция к снижению экспрессии дефенсина (Рис. 7).

А Б

Рис.7. Динамика спонтанной экспрессии гена (А) и выработки белка (Б) НЫР-1 нейтрофилами периферической крови здоровых беременных и беременных с урогенитальной инфекцией. По оси абсцисс - время (часы), по оси ординат - (А) ^ (число кДНК НЫР-1) относительно ^ (1000 копий кДНК (5-актина), (Б) концентрация НЫР-1 в нг/мл.

-- - беременные с физиологически протекающей беременностью

.««•, - беременные с урогенитальной инфекцией

Особый интерес представляют данные по экспрессии нейтрофильных пептидов при системной воспалительной реакции в результате полиорганной травмы. На рисунке 8 представлена динамика экспрессии гена НЫР-1 в культуре нейтрофилов больных сепсисом и здоровых доноров. Через 3 часа культивирования экспрессия гена НЫР-1 нейтрофилами здоровых доноров

резко снижалась (приблизительно в 100 раз) и сохранялась на таком уровне до окончания эксперимента.

*-здоровые

сепсис

Рис.8. Экспрессия гена НЧР-1 в культуре нейтрофилов больных сепсисом и здоровых доноров. По оси абсцисс - время культивирования, по оси ординат - десятичный логарифм числа копий кДНК НЫР-1

Уровень экспрессии гена НЫР-1 нейтрофилами при сепсисе на момент начала культивирования на 10 раз превышал таковой в группе здоровых доноров. В процессе 24-часового культивирования экспрессия гена уменьшалась в 10 раз, оставаясь выше аналогичного показателя в норме.

У больных сепсисом наблюдалось отличие в динамике выработки Н1МР1-3, которое заключалось в сниженной продукции (в 5-10 раз) ЬП\[Р1-3 нейтрофилами больных сепсисом на 3-6 час культивирования. Можно предположить, что происходит истощение резервных потенциалов нейтрофилах при сепсисе. Однако при дальнейшем культивировании происходит восполнение пула НИР за счет достаточно высокого уровня экспрессии гена НИР.

выводы

1. Разработаны лабораторные варианты систем ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов HBD-1 и HNP-1.

2. По сравнению со здоровыми донорами при урогенитальной инфекции происходит снижение в 2-3 раза экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой цервикального канала и в клетках слизистой уретры мужчин.

3. Физиологическое течение беременности сопровождается увеличением экспрессии генов р-дефенсина HBD-1 в клетках слизистой цервикального канала и возрастанием концентрации нейтрофильных а-дефенсинов - HNP1-3 в периферической крови.

4. У беременных с урогенитальной инфекцией выявлено уменьшение экспрессии гена HBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала и снижение концентрации нейтрофильных пептидов HNP1-3 в плазме и амниотической жидкости.

5. При неразвивающейся беременности концентрация нейтрофильных пептидов HNP1-3 в плазме крови резко снижается, у 40% HNP1-3 не определяются.

6. В культуре in vitro изучена динамика экспрессии нейтрофилами дефенсина HNP-1 на уровне мРНК и белка. Спонтанная экспрессия гена не отличается у здоровых беременных и беременных женщин с урогенитальной инфекцией. Тогда как, секреция этого пептида у беременных с урогенитальной инфекцией происходит на 6 часов позднее, чем у здоровых беременных.

7. У беременных с урогенитальной инфекцией стимуляция нейтрофилов ЛПС в низкой дозе вызывала более выраженный рост экспрессии гена

НЫР-1, что может быть обусловлено праймингом клеток при урогенитальной инфекции.

8. Уровень экспрессии гена НИР-1 нейтрофилами при сепсисе в 10 раз превышал таковой в группе здоровых доноров, в то время, как выработка а-дефенсинов (НКР1-3) нейтрофилами в течение 6-ти часов культивирования была снижена более, чем в 15 раз по сравнению со здоровыми донорами.

Практические рекомендации

Предложенный способ оценки экспрессии гена Н1Ю-1 в клетках слизистой цервикального канала целесообразно включать при оценке показателей врожденного иммунитета для своевременного прогнозирования внутриутробной инфекции и преждевременных родов у беременных с урогенитальной инфекцией.

Снижение концентрации НЫР1 -3 в плазме крови ниже 30 пг/мл позволяет с высокой точностью отнести данных пациенток к группе высокого риска по развитию неразвивающейся беременности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фензелева В.А., Карташов Д.Д., Романовская В.В. Экспрессия мРНК ToII-подобного рецептора 2 и бета-дефенсина человека 1 при урогенитальной инфекции беременных // Материалы II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, 2007

2. Gankovskaya O.A., Pomanovskaya V.V.,Kusnecov P.A., Fenzeleva V.A., Kartashov D.D. TLR and antimicrobial peptide genes expression during prenatal infection // Abstract from Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics 20 - 22 of September 2007, Kyiv, Ukraine, 20-22 September, 2007, P. 165

3. Ганковская Jl.B. Ковальчук JI.B. Ганковская O.A. Макаров O.B. Лавров В.Ф. Карташов Д.Д. Кузнецов А.П. Экспрессия противомикробных пептидов клетками слизистой оболочки цервикального канала и нейтрофилами периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией // Вестник РГМУ, №5, 2008, с. 26-29

4. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Фензелева В.А., Карташов Д.Д., Ганковская O.A. Активация экспрессии генов ТоИ-подобных рецепторов и дефензинов клетками слизистой цервикального канала при беременности // Российский иммунологический журнал, т. 2(11), №2-3, 2008, стр. 286 - 287

5. Ганковская O.A., Ковальчук Л. В., Ганковская Л.В., Лавров В.Ф., Романовская В.В., Карташов Д.Д., Фензелева В.А. Роль ТоИ-подобных рецепторов и дефенсинов в противомикробной защите урогенитального тракта женщин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, №1,2008, с. 46-50

6. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Карташов Д.Д. Современные методы лечения при преждевременных родах // Российский вестник акушера - гинеколога, №2,2009, с.29-34

7. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Ганковская O.A., Романовская В.В., Карташов Д.Д., Макаров О.В.

Экспрессия генов То11-подобных рецепторов слизистой цервикального канала при нормальной и патологически протекающей беременности // Вестник РГМУ, №4,2009, с. 34-37

8. Макаров О.В., Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Кузнецов П.А., Романовская В.В., Щукина A.B., Ганковская O.A., Карташов Д.Д. Изменение показателей врожденного иммунитета слизистой цервикального канала при беременности и воспалительных заболеваниях органов малого таза // Сборник материалов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 6-10 апреля 2009 г., с.395

9. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Кузнецов П.А., Ганковская O.A., Карташов Д.Д. Показатели врожденного иммунитета слизистой цервикального канала при беременности // Проблемы репродукции, специальный выпуск «Материалы III международного конгресса по репродуктивной медицине», с. 97

10. Карташов Д.Д., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Ганковская О.А, Щукина A.B., Дворецкая Е.В. Анализ противомикробных пептидов человека в биологических жидкостях // Российский аллергологический журнал, №3, выпуск 1, 2009, с. 354

Патенты

Получено положительное решение по заявке №2009108294/15 (011092)

«Способ прогноза преждевременных родов» авторов Л.В. Ганковской, О.В.

Макарова, Л.В. Ковальчука, П.В. Кузнецова, Д.Д. Карташова

Список сокращений

ВУИ - внутриутробная инфекция ВПГ - вирус простого герпеса ИФА - иммуноферментный анализ ЛПС - липополисахарид ПМП - пртивомикробные пептиды

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени

УГИ - урогенитальная инфекция

ХБП - хронический бактериальный простатит

ЦМВ - цитомегаловирус

HBD (human beta defensine) - Д-дефенсин человека

HNP (human neutrophil peptide) - нейтрофильный пептид человека (а-дефенсин)

TLR (Toll like receptor) - То11-подобный рецептор

Подписано в печать: 24.09.10

Объем: 1,5 усл.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 766 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г.Москва, пр-т Вернадского,39 (495)363-78-90; www.reglet.ru

Актуальность темы

Механизмы врожденного иммунитета представляют первую филогенетически наиболее древнюю линию защиты организма от различных патогенов. Врожденный иммунитет предотвращает развитие инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще не задействованы, так как для реализации механизмов врожденного иммунитета не требуется предварительного контакта с антигеном (58).

В течение последнего десятилетия активно изучают биологию, структуру и функции нового класса эффекторных молекул врожденного иммунитета — противомикробных пептидов (ПМП).

ПМП представляют собой обширную группу небольших катионных белков, способных поражать различные микроорганизмы, среди которых вирусы, бактерии, грибы и простейшие (135).

Противомикробные пептиды представляют собой естественные эндогенные антибиотики и осуществляют функцию так называемого мгновенного иммунитета — «instant immunity». С другой стороны они являются сигнальными молекулами, вовлеченными в процессы регуляции и активации клеток иммунной системы и репарации тканей (28, 122). ПМП формируют молекулярную основу врожденного иммунитета и участвуют в реализации ряда защитно-приспособительных реакций.

Полифункциональность ПМП в значительной степени определяет эффективность иммунных процессов, протекающих при воспалении, урогенитальных инфекциях, септическом шоке и др.

В настоящее время урогенитальная инфекция рассматривается как одна из основных причин развития хронических простатитов, бесплодия, патологии беременности, таких как внутриутробное инфицирование плода, невынашивание,, неразвивающаяся беременность и др. (35). Однако остается' неясным, почему одни и те же инфекционные агенты в одних случаях вызывают реализацию внутриутробной инфекции и преждевременные роды, а в других - практически не влияют на течение беременности. Это вызывает необходимость поиска новых подходов к изучению роли механизмов врожденного иммунитета при урогенитальной инфекции, разработки новых диагностических критериев.

Исследование экспрессиии (3-дефенсинов клетками слизистой оболочки урогенитального тракта и а-дефенсинов в плазме и в культуре нейтрофилов периферической крови здоровых доноров, больных с патологиями инфекционного генеза (УГИ, ВУИ, хронический простатит и другие) актуально, так как дает возможность понять роль противомикробных пептидов в защите репродуктивной системы от воздействия различных патогенов, широко представленных в урогенитальном тракте. Исследование экспрессии дефенсинов на уровне генов и синтеза белка у беременных с урогенитальной инфекцией может иметь диагностическую и прогностическую значимость при невынашивании беременности и подозрении на внутриутробное инфицирование плода.

В связи с этим целью работы явилось комплексное исследование противомикробных пептидов (дефенсинов) в биологических средах организма в норме и при инфекциях.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) Разработать лабораторные варианты систем ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов HBD-1 и HNP-1.

2) Определить уровень экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой урогенитального тракта мужчин и женщин в норме и при урогенитальной инфекции.

3) Оценить экспрессию HBD-1 в слизистой цервикального канала у женщин с физиологически протекающей беременностью и у беременных с урогенитальной инфекцией.

4) Определить уровень нейтрофильных пептидов HNP1-3 в плазме крови здоровых женщин и при патологии беременности инфекционного генеза.

5) Исследовать динамику экспрессии гена и выработки пептида (а-дефенсина HNP-1) нейтрофилами периферической крови беременных с урогенитальной инфекцией и у больных сепсисом в сравнении с группой здоровых доноров.

Научная новизна

Разработан комплексный подход к оценке противомикробных пептидов у человека, основанный на изучении ПМП на системном и локальном уровнях. Анализ а-дефенсинов проведен на уровне экспрессии гена и синтеза молекулы пептида.

С помощью разработанного подхода и систем ПЦР-РВ для количественного определения уровня экспрессии генов исследована роль (3-дефенсина 1 (HBD-1) и а-дефенсина 1 (HNP-1) в защите от патогенов у здоровых доноров и у больных с урогенитальной инфекцией.

Особую значимость представляют полученные данные о экспрессии ПМП на уровне слизистой цервикального канала и в нейтрофилах крови при физиологически развивающейся беременности и при беременности, осложненной урогенитальной инфекцией (невынашивание, внутриутробное инфицирование, неразвивающаяся беременность). Показано, что при преждевременных родах и реализации ВУИ происходит снижение экспрессии HBD-1 в клетках слизистой цервикального канала и увеличение экспрессии TLR2. При неразвивающейся беременности существенное значение имеет снижение концентрации нейтрофильных пептидов HNP1-3 в плазме крови.

Обнаруженное снижение уровня экспрессии гена |3-дефенсина - HBD-1 в эпителиальных клетках уретры и снижения концентрации нейтрофильных пептидов HNP-1-3 в секрете простаты при хроническом простатите позволяет обозначить их роль в развитии иммунодефицитного состояния.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработаны лабораторные варианты систем ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов HBD-1 и HNP-1 и гена «домашнего хозяйства» - р-актина.

2. С использованием разработанных систем были получены данные, свидетельствующие о том, что слизистая урогенитального тракта в норме защищена противомикробными пептидами. При урогенитальной инфекции происходит уменьшение экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой уретры и цервикального канала.

3. Физиологическое течение беременности сопровождается активацией системы противомикробных пептидов, что проявляется в увеличении экспрессии гена HBD-1 в слизистой цервикального канала и концентрации HNP1-3 в периферической крови.

4. Разработанные тест-системы позволили выявить нарушения в системе противомикробных пептидов: на уровне экспрессии гена HNP-1 и выработки молекулы данного пептида при урогенитальной инфекции и сепсисе.

Практическая значимость работы

Выявленные изменения в экспрессии и продукции ПМП у больных УГИ помогают уточнить патогенез данной патологии, а при беременности могут служить прогностическими маркерами течения беременности.

Внедрение результатов работы в практику

Разработаны и внедрены в клиническую практику системы на основе ПЦР-РВ для определения экспрессии генов противомикробных пептидов (р-дефенсина 1 (HBD-1) и а-дефенсина 1 (HNP-1).

С использованием разработанных систем определены маркеры развития преждевременных родов, внутриутробного инфицирования. Создан комплекс маркеров на основе исследования экспрессии генов HBD-1 и TLR2 в цервикальном канале женщин, позволяющих с большей долей вероятности прогнозировать преждевременные роды и развитие внутриутробного инфицирования. Снижение концентрации HNP-1-3 в плазме крови менее 0,1 нг/мл ассоциировано с развитием неразвивающейся беременности. Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 6 статей в центральной печати, включая патент №2009108294 «Способ прогнозирования преждевременных родов инфекционного генеза» (положительное решение от 07.05.2010).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, указателя литературы, содержащего 178 источников. Работа выполнена на 104 страницах машинописного текста иллюстрирована 7 таблицами и 37 рисунками.

Выводы

1) Разработаны лабораторные варианты систем ПЦР в реальном времени для количественного определения экспрессии генов катионных противомикробных пептидов HBD-1 и HNP-1.

2) По сравнению со здоровыми донорами при урогенитальной инфекции происходит снижение bj 2-3 раза экспрессии гена HBD-Г в клетках слизистой цервикального канала и в клетках слизистой уретры мужчин.

3) Физиологическое течение беременности сопровождается увеличением экспрессии генов р-дефенсина HBD-1 в клетках слизистой цервикального канала и возрастанием концентрации нейтрофильных а-дефенсинов -HNP1-3 в периферической крови.

4) У беременных с урогенитальной инфекцией выявлено уменьшение экспрессии гена HBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала и снижение концентрации нейтрофильных пептидов HNP1-3 в плазме и амниотической жидкости.

5) При неразвивающейся беременности концентрация нейтрофильных пептидов HNP1-3 в плазме крови резко снижается, у 40% HNP1-3 не определяются.

6) В культуре in vitro изучена динамика экспрессии нейтрофилами дефенсина HNP-I на уровне мРНК и белка. Спонтанная экспрессия гена не отличается у здоровых беременных и беременных женщин с урогенитальной инфекцией. Тогда как, секреция этого пептида у беременных с урогенитальной инфекцией происходит на 6 часов позднее, чем у здоровых беременных.

7) У беременных с урогенитальной инфекцией стимуляция нейтрофилов ЛПС в низкой дозе вызывала более выраженный рост экспрессии гена HNP-1, что может быть обусловлено праймингом клеток при урогенитальной инфекции.

8) Уровень экспрессии гена HNP-1 нейтрофилами при сепсисе в 10 раз превышал таковой в группе здоровых доноров, в то время, как выработка а-дефенсинов (HNP1-3) нейтрофилами в течение 6-ти часов культивирования была снижена более, чем в 15 раз по сравнению со здоровыми донорами.

Практические рекомендации

Предложенный способ оценки экспрессии гена HBD-1 в клетках слизистой цервикального канала целесообразно включать при оценке показателей врожденного иммунитета для своевременного прогнозирования внутриутробной инфекции и преждевременных родов у беременных с урогенитальной инфекцией.

Снижение концентрации HNP1-3 в плазме крови ниже 30 пг/мл позволяет с высокой точностью отнести данных пациенток к группе высокого риска по развитию неразвивающейся беременности.