Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изоферментный профиль действия и активность нового индуктора ионоокснгеназнои системы печени гепазана при некоторых патологических состояниях

РГБ ОД

2 2 ЛПР 2и32

На правах рукописи

БАГМАНОВА ИННА ВЛАДИМИРОВНА

Изоферментный профиль действия и активность нового индуктора монооксигеназной системы печени гепазана при некоторых патологических состояниях

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени канди-тата медицинских наук

Уфа - 2002

Работа выполнена в Башкирском государственном медицинском университете Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Е.К. Алехин

Научный консультант:

доктор фармацевтических наук, профессор Ф.А.Халиуллин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских щук, профессор Х.М.Насыров

доктор медицинских наук, профессор Л.П.Ларионов

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «_» апреля 2002 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.006.03 при Башкирском государственном медицинском университете по адресу: 450000, г.Уфа, ул. Ленина,3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного медицинского университета.

1г. Р и !, "/ 7 Гс /<

Автореферат разослан «_» марта 2002 г. ¡~ * /, у г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор / а „ Э.И.Эткина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Постоянство внутренней среды - важнейшее условие жизнедеятельности организма. Одним из главных звеньев системы го-меостаза является цитохром-Р450-зависимая монооксигеназная система (МОС), контролирующая уровень липофильных регуляторов основных физиологических процессов (гормоны, жирные кислоты, витамины A, D, простагландины, лейкотриены, биогенные амины) и обезвреживающая множество экзогенных субстрата!! (Waxman D.J., 1999).

В ходе эволюции МОС приобрела способность реагировать на изменения внешней и внутренней среды модуляцией своей активности. Благодаря индуци-бельности и уникальному свойству перекрестной субстратной специфичности цитохромов Р450 (Р450) МОС обеспечивает быструю инактивацию агрессивных эндогенных биологически активных веществ, эндотоксинов и ксенобиотиков (Щербаков В.М., Тихонов A.B., 1995).

Однако большинство патологических процессов сопряжено с депрессией Р450 (Watanabe M., 1998; Blounin R.A. et al., 1999; Farrel G., 1999), что имеет следствием снижение резистентности к воздействию экзо- и эндотоксикантов, дисфункцию гуморальных регуляторных механизмов и, в конечном счете, усугубление патологических нарушений (Грек O.P. и соавт., 1999; Матюшин Б.Н. и соавт., 1997; Watanabe M., 1998). В подобных ситуациях патогенетически обоснованной является фармакологическая стимуляция M ОС (Новожеева Т.П., 1993). Ферменгивдуцирующей активностью обладают многие лекарственные препараты, однако в клинической практике реально применяют лишь индукторы фенобарбиталового типа: фенобарбитал, бензонал и реже кордиамин, который существенно уступает барбитуратам (Наджимутдинов К.Н. и соавт., 1992; Заводник Л.Б. и соавт., 1993; Вушма М.И. и соавт., 1999). Применение индукторов иных типов (глюкокортикоидного, метилхолантренового, пероксисомпро-лифераторного и этанольного) ограничено или невозможно из-за высокой токсичности, сопутствующей нежелательной биологической активности или способности активировать токсикофицирующие изоформы Р450 (Лукиенко П.И. и соавт., 1995; Denison M.S., Whitlock J.P., 1995).

Ограниченность выбора эффективных модуляторов МОС, с одной стороны, и наличие у них ряда серьезных побочных эффектов, с другой, обосновывает актуальность и важность поиска новых безопасных индукторов Р450.

В результате исследований по синтезу и изучению новых производных

азолов и ксантина в Башкирском государственном медицинском университете разработан новый индуктор МОС дигидрогиазолоксантин, получивший рабочее название гепазан.

Как показано сравнительными исследованиями, да ряду фармакологических характеристик гепазан существенно превосходит применяемый в клинике референтный индуктор бензонал (Алехин Е.К. и соавт., 1999). Выраженная активация Р450, отсутствие бимодальности эффекта в совокупности с высоким терапевтическим индексом позволяют рассматривать гепазан как перспективный оригинальный стимулятор МОС, требующий, однако, углубленного анализа влияния на систему Р450, дальнейшего изучения фармакологических свойств и фармакотералевтической эффективности.

Цель исследования. Охарактеризовать изоферменгный профиль МОС-индуцирующего эффекта дигидротиазолоксантина гепазана и экспериментально обосновать его применение в условиях патологии, сопряженной с синдромом снижения детоксицирующей функции печени.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние гепазана на содержание цитохромов Р450 и Ь5 в мик-росомальной фракции гепатоцигов.

2. Исследовать эффект индуктора на активность ЫАОРН-цитохром Р450-редуктазы.

3. Определить иммуноспецифичность микросомальных гемопротеидов, индуцируемьк гепазаном.

4. Охарактеризовать цитохром Р450-индуцирующий эффект гепазана по влиянию на каталитическую активность основных изоэнзимов.

5. Оценить МОС-корригирукмций эффект индуктора при остром токсическом гепатите.

6. Исследовать эффективность гепазана как индуктора МОС при обратимом подпеченочном и внутрипеченочном холестазах.

7. Экспериментально обосновать применение гепазана при гемолитической викасоловой пшербилирубинемии новорожденных 1фысят.

Научная новизна

Впервые изучено влияние дигидротиазолоксантина гепазана на содержание цитохромов Р450, Ь5 и активность КАБРН-цитохром Р450-редукгазы в печени лабораторных животных.

С помощью иммунохимических и биохимических методов исследования

впервые дана характеристика изоферментного профиля Р450-индуцирующего эффекта гепазана. Показано, что он является индуктором фенобарбиталового типа: подобно барбитуратам гепазан выраженно стимулирует каталитическую активность СУР2В1 и СУРЗА1, незначительно повышает катализ СУР1А1 и не влияет на активность СУР2Е1 и СУР1А2.

Получены данные о высокой МОС-корригирующей активности гепазана при остром тетрахлорметановом токсическом гепатите, обратимом подпече-ночном и внутрииеченочном холестазе. Показана высокая эффективность перинатальной профилактики гепазаном гемолитической гипербилирубинемии новорожденных крысят.

Дана сравнительная; характеристика лечебного и профилактического эффекта гепазана с эталонным индуктором МОС бензоналом. Научно-практическая значимость работы.

Впервые изучено влияние нового индуктора монооксигеназной системы гепазана на изоформы цитохромов Р450; установлен фенобарбигаловый тип индукции. Характеристика изоферментного профиля действия обеспечивает возможность направленного поиска сфер клинического использования гепазана.

Получены экспериментальные данные о высокой эффективности гепазана как средства активации систем детоксикации на фоне патологии, сопряженной с депрессией МОС. Обоснована перспективность дальнейшего изучения гепазана в этом качестве. Результаты работы являются основой материалов доклинических испытаний потенциального лекарственного средства «гепазан». Положения, выносимые на защиту.

1. Дигидропшолоксантин гепазан - новый оригинальный индуктор МОС фенобарбиталового типа, отличающийся от эталонного стимулятора фенобарбитала отсутствием активации СУР1А2 и влияния на центральную нервную систему.

2. При остром токсическом тетрахлорметановом гепатите гепазан сопоставимо с бензоналом увеличивает содержание цитохромов Р450 и Ь5 в микросо-мальной фракции гепатощгтов.

3. Гепазан достоверно повышает содержание и каталитическую активность цитохромов Р450 и Ь5 при синдроме холестаза и отличается от бензонала стабильным защитным эффектом.

4. Перинатальное профилактическое введение гепазана предупреждает развитие викасоловой гипербилирубинемии новорожденных.

б

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на 63-й, 65-й и 66-й конференциях молодых ученых БГМУ (Уфа, 1998-2000), V международном Симпозиуме, VI Чуйской научно-практической конференции, посвященных 10-летию НИИКиЭЛ СО РАМН и 65-летию проф. Э.Х.Акрамова «Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма» (Чолпон-Ата, 2001); IX Всероссийском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002).

Публикации.По теме диссертации опубликовано 9 работ, получены 2 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации.

Диссертация объемом 155 страниц иллюстрирована 18 рисунками, содержит 14 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 161 отечественных и 209 зарубежных источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Эксперименты выполнены на 400 беспородных половозрелых крысах, преимущественно самцах, массой 160-220 г, 220 половозрелых мышах-самцах и 84 пятидневных крысятах обоего пола, полученных из вивариев ГУП «Иммуно-препарат» (г. Уфа) и Новосибирской государственной медицинской академии. Гепазан и бензонал вводили животным внутрижелудочно в виде суспензии на 2% крахмальной слизи в дозах: бензонал - 1/20 LD50 (35 мг/кг), гепазан - 1/100 LD50 (для крыс-17 мг/кг, для мышей - 7 мг/кг) и дозе, эквимолярной бензоналу (35 мг/кг). Контролем служили животные, получавшие в эквиобъемных количествах крахмальную слюь. Гексеналовый тест, декапитацию животных и выделение микросомальной фракции печени проводили через сутки после заключительного введения соединений.

Влияние на монооксигеназную систему печени*.

Микросомальную фракцию печени получали путем дифференциального центрифугирования по методу A.Y.H. Lu, W. Levin (1972) или S.A. Kamath, К.A. Narayan (1972).

• часть исследований выполнена на базе Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

(директор - член-корр. РАМН Ляхович В.В.)

Содержание цитохромов Р450 и Ь5 в микросомальной фракции печени определяли по методу T. Omura и R. Sato (1964) на двулучевом спектрофотометре «Hitachi 556» (Япония), снабженном Х-Y-самописцем «Hitachi-057» или SPE-CORD «Carl Ceiss М400». Концентрацию микросомального белка в микросомальной фракции гепатоцитов определяли по методу O.Lowry (1968).

Активность NADPH-цитохром Р450-редуктазы определяли по восстановлению цитохрома С по методу А.Н. Phillips и R.G. Langdon (1962) с использованием спектрофотометра «Hitachi 556» (Япония).

Иммуноблоттинг (метод иммунных реплик) проведен согласно R Towbin (1979) с первоначальным электрофоретическим разделением микросомапьных белков по описанию U.K. Laemmli (1970) и последующей препиципитацией с моноклональными антителами мыши, анти-CYPlAl (клон 14Н5) и анти-CYP2B1 (клон 12С10).

Каталитическую активность основных изоэнзимов Р450 определяли по скорости О-деалкилирования алкоксирезоруфинов: 7-этоксирезоруфина (CYP1A1), 7-метоксирезоруфина (CYP1A2), 7-пентоксирезоруфина (CYP2B1) и 7-бензилоксирезоруфина (CYP2B1+CYP2C6), 6-гидроксилирования хлорзокса-зона (CYP2E1) (Burke M.D., Mayer R.T., 1983; Lucas D. 1993); интенсивности метаболизма мидазолама (Cyp3al + Сур2с) и альпразолама (СурЗа1) в тестах мидазоламового и альпразоламового сна (Perloff M.D. et al., 2000; Warrington J.S. et al., 2000).

Тест гексеналового сна использовали как общепринятый тест, позволяющий косвенно судить об активности МО С. Гексенал («Farms in teze», Латвия) вводили внутрибрюшинно крысам в дозе 70 мг/кг, новорожденным крысятам -в дозе 40 мг/кг и мышам-самцам - в дозе 75 мг/кг. Длительность сна оценивали по времени «бокового положения». Тестирование проводили в условиях звукоизоляции и изотермии (t=20°) (Николаев М.П., 1941; Новожеева Т.П., Сарати-ков A.C., 1999; Kim E.J. et ai., 2001).

По тесту хлоралгидратного сна косвенно судили о влиянии гепазана на активность ферментов II фазы биотрансформации (уридиндифосфатглюкуронил-трансферазы-УДФГТ).

Влияние па центральную нервную систему изучали с помощью теста «открытое поле» (Середенин С.Б., Ведерников A.A., 1979; Вальдман A.B., По-шивалов В.П., 1984; Атрошенко О.Н. и соавт., 1999).

Экспериментальные модели патологических состояний.

Острый токсический гепатит воспроизводили однократным внутрибрюшинным введением крысам-самцам 50% масляного раствора тетрахлорметана (ССЦ) («Реахим», Россия) на оливковом масле в дозе 0,3 мл/кг (Новожеева Т.П., Саратиков А.С., 1999).

Обратимый подпеченочный холестаз моделировали путем лигирования тонким кетгутом общего желчного протока выше его вхождения в двенадцатиперстную кишку (Новожеева Т.П., Саратиков А.С., 1999). Все манипуляции проводили под эфирным наркозом. Ложнооперированным животным производили лапаротомию без лигации холедоха.

Внутрипеченочнй холестаз вызывали однократным внутрижелудочным введением крысам-самцам а-нафтилизотиоцианата (АНИТ) в виде 4% масляного раствора на оливковом масле в дозе 100 мг/кг (Новожеева Т.П., Саратиков А .С., 1999).

Викасоловую гипербилирубинемию у 5-дневных крысят создавали однэ-кратным внутрибрюшинным введением викасола в дозе 150 мг/кг (Новожеева Т.П. и соавт., 1993). Через 5 суток определяли прирост массы тела, весовой коэффициент печени, длительность гексеналового сна и визуально оценивали окраску кожных покровов.

О степени развития патологии судили по выраженности цитолитического (активность сывороточных аланиновой (АЛТ) и аспарагиновой (АСТ) трансфе-раз) и холестатического (активность сывороточных у-глутамилтрансферазы (ГГТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), концентрация холестерина) синдромов, ги-пербилирубинемии (общий и прямой билирубин) и интенсивности белоксинте-тических процессов в гепатоцитах (содержание сывороточного альбумина).

Результаты обрабатывали с помощью методов вариационной статистики (Ла-кин Г.Ф., 1990), реализованных на базе пакета программ Microsoft Office 2000. Рассчитывали среднюю арифметическую (М), стандартную ошибку средней арифметической (m), нормальность распределения. Оценку значимости различий средних арифметических проводили с использованием параметрического t-критерия Стъю-дента и непараметрического %2. Достоверными считали различия при р<0,05.

Результаты и их обсуждение.

Деление индукторов на классы основано на особенностях их влияния на синтез Р450, Ь5 активность ЫАБРН-цитохром-Р450-редукгазы, иммунохимической ха-

рактеристики и каталитической активности индуцируемых изоформ Р450. Как показали проведенные эксперименты, гепазан является индуктором фенобарбитало-вого типа. Одним из веских аргументов в пользу этого положения выступает соче-танная стимуляция Р450 и НАБРН-цитохром Р450-редуктазы в печени лабораторных животных (табл. 1).

Таблица 1

Влияние двукратного введения гепазана на содержание Р450, Ь5

и активность NADPH-щггохром Р450-редуктазы в печени крыс

Показатель Контроль М±ш (п=8) Гепазан 35 мг/кг М±т (п=8) Гепазан 17 мг/кг М±т (п=8)

P450 (нмоль/мг белка) 0.62+0.009 0.83+0.054* 0.74+0.019*

Ь5 (нмоль/мг белка) 0.47+0.004 0.46+0.009 0.45+0.007

NADPH-цитохром Р450-редуктаза (пкмоль циг С/мин/мг белка) 57.14±4.561 110.17+7.399* 113.75+6.366*

Примечание: * - здесь и далее р<0.05 по отношению к контролю; п-количество животных.

Одновременная активация донора и акцептора электронов весьма специфична для индукторов фенобарбигалового типа. Так, фенобарбитал и его дериват бензонал, наряду со стимуляцией синтеза Р450, двукратно увеличивают активность флавопротеина (Новожеева Т.П., Ахмеджанов Р.Р. и соавт., 1993; Но-вожеева Т.П., 1998). Модуляторам метилхолашренового типа - метилхолан-трену, Р-нафтофлавону, напротив, свойственна индифферентность в отношении NADPH-щггохром Р450-редуктазы или ее угнтение (Ляхович В.В., Цырлов И.Б., 1981; Plewka A. et al, 1994).

Для идентификации индуцируемых гепазаном изоферментов Р450 в наших исследованиях использованы иммуноблоттинг, позволяющий выявить индукцию отдельных изоферментов даже с высокой степенью гомологии аминокислотных последовательностей, биохимический метод, основанный на определении скорости метаболизма маркерных субстратов изоформ Р450, а также тесты альпразоламового и мидазоламового сна (Glue Р, Clement R.P, 1999; Jansen Е.Н. et al, 1996; Rodrigues A.D, 1999; Pelkonen O, Raunio H, 1997).

Как видно из рисунка 1, иммунологические свойства индуцируемых гепа-заном гемопротеидов зависят от дозы. Так, при введении соединения в дозе 17 мг/кг микросомы преципитировали только с анти-С"УР2В1 антителами. В двукратно большей дозе индуктор стимулировал наработку гемопротеидов, реагирующих как с анти-СУР2В1, так и с аити-СУР1А1. Следовательно, с увеличением вводимой дозы гепазана возрастает вероятность экспрессии СУР1А1.

и

А 1 2 3 4 5 6 7

— МДО МИНЬ «ММ '

Б 1 2 3 4 5 6 7

Примечание: дорожка 1 - контроль; дорожка 2,3,4 - гепазан 35 мг/кг; дорожка 5,6,7 - гепазан 17 мг/кг.

Рис. 1 Иммуноблот-анализ микросомальной фракции печени крыс-самцов, получавших гепазан, с моноклональными антителами мыши анти-СУР1А1/2 (А) и анти-СУР2В1/2 (Б)

Однако определить тип индуцирующего влияния лишь по данным имму-ноблот-анализа весьма сложно, так как традиционная «иммунологическая» характеристика индукторов МОС достаточно условна. Принято считать, что стимуляторы фенобарбиталового типа вызывают пролиферацию микросомальных белков, преципитирующих с анш-СУР2В1, но не с анти-С¥Р1А1. Индукторы мегилхолашренового типа, напротив, индуцируют синтез микросомальных протеидов, преципитирующих исключительно с анти-СУР1А. Поэтому вполне закономерно, что современные иммунологические методы, позволяющие более тонко регистрировать индукцию Р450, выявляют эффект, не укладывающийся в рамки классической иммунологической характеристики индукторов МОС. Однако фенобарбитал - прототипный индуктор этого класса - у грызунов активирует изоформы Р450 нескольких подсемейств: СУР1А, СУР2А, СУР2В и СУРЗА, а наиболее чувствительны к его действию гемопротеиды СУР2В (Ре1к-опепО. а!., 1998).

Для более полной характеристики Р450-стимулирующего эффекта гепазана была изучена каталитическая активность тех изоформ Р450, активация которых

наблюдается под влиянием индукторов различных типов - СУР1А1/2, СУР2В1/2, СУРЗА1, СУР2Е1. Обнаружено, что он преимущественно стимулирует СУР2В1/2, о чем свидетельсгвовует многократное увеличение скорости деалкилирования пентокси- и бензилоксирезоруфина (до 55 и 44 раз соответственно) (табл. 2).

Таблица 2

Влияние гепазана на ЭРОД, МРОД, ПРОД, БРОД и ГХЗ микросом печени крыс

Группа ЭРОД М±ш МРОД М±ш ПРОД М±т БРОД М±т ГХЗ М±т

Контроль (п=8) 106.3 + 9.40 129.6 ±17.33 32.8 ±2.75 117.4 ±9.99 0.9±0.29

Гепазан 35 мг/кг (п=8) 217.3+36.28* 158.0+12.47 1636.7+311.80* 5165.9+1100.17* 1.0+0.46

Гепазан 17 мг/кг (п=8) 178.9±10.59* 137.6+10.36 420.4 ± 80.55* 442.6 ± 55.24* 0.9+0.08

Примечение: ЭРОД-7-этоксирезоруфин-О-деэтилазная активность, МРОД-7-метоксирезоруфин-О-деметилазная активность, ПРОД-7-

пенгоксирезоруфин-О-депеигалазная активность, БРОД-7-

бензилоксирезоруфин-О-дебензилазная активность (пкмоль/мин/мг белка), ГХЗ-хлорзоксазонгидроксилазная активность (нмоль/мин/мг белка).

Каталитическая активность СУР1А1 увеличивалась гораздо меньше (не более 2 раз) и не зависела от дозы. Отсутствие изменения скорости деалкилирования метоксирезоруфина и гидроксилирования хлорзоксазона свидетельствует об индифферентности гепазана в отношении СУР1А2 и СУР2Е1 (табл.2). Каталитическую активность СУРЗА изучали на мышах с помощью косвенных тестов альпра-золамового (С>рЗа1) и мидазоламового (СурЗа1 + Сур2с) сна (Рег1ой" М.Б. е! а1., 2000; Waшngton 1.8. с! а!, 2000). Гепазан значительно редуцировал сон животных, вызванный альпразоламом (на 89%), тогда как длительность мидазоламового сна была лишь на 36% меньше показателя контрольной группы, что, по-видимому, обусловлено участием в метаболизме этого субстрата Сур2с.

Одной из важных характеристик индукторов фенобарбиталового типа является активация ферментов П фазы биотрансформации (Новожеева Т.П., 1998,

Хакимов З.З., 1995). О влиянии гепазана на конъюгирующую систему печени судили по данным теста хлоралгидрагного сна. Обнаружено, что соединение достоверно снижает длительность хлоралгидратного наркоза у опытных животных: на 67% в дозе, эквимолярной бензоналу, и на 29% в дозе 1/100 ЬОя-

Таким образом, синхронная индукция СУР2В1/2, СУРЗА1 и СУР2С (с многократной стимуляцией СУР2В1/2), ЫА1)РН-щггохром Р450-редуктазы и ферментов П фазы биотрансформации свидетельствует о фенобарбиталовом типе Р450-индуцирующего влияния гепазана.

Одним из важных преимуществ гепазана является отсутствие влияния на ЦНС, поскольку большинство известных индукторов МОС (фенобарбитал, бен-зонал, бензобамил, кордиамин), хотя и в разной степени, обладает центральным эффектом. Об этом свидетельствуют данные теста «открытого поля», включающие анализ интегральных критериев поведения (ориентировочно-исследовательской активности и эмоциональной тревожности) и вероятностной оценки переходов из одного поведенческого акта в другой. Нами обнаружено, что гепазан не изменяет индивидуальное поведение опытных животных, сохраняя поисковый стимул и эмоциональный статус.

Очевидный интерес представляет изучение специфической ферменгинду-цирующей активности гепазана в условиях патологии. Свой выбор мы остановили на моделях поражения печени, поскольку она является «основной химической лабораторией организма» и служит главной мишенью для реализации токсичности ксенобиотиков. Кроме того, была использована модель гемолитической гипербилирубинемии новорожденных как состояние, при котором применение индукторов МОС жизненно необходимо.

МОС-корригирующее влияние гепазана на фоне экспериментальной патологии исследовали в сравнительном аспекте с эталонным индуктором Р450 бензоналсм. Выбор препарата сравнения обусловлен тем, что бензонал реально применяется в клинике для модуляции МОС, отличаясь от фенобарбитала более выраженным Р450-актавирующим действием и слабым гапноседативным эффектом (Машксв-ский М.Д., 1994; Новожеева Т.П., 1998). Индукторы начинали вводить спустя сутки после моделирования патологии ш единой схеме: четырехкратно внутрижелудочно с интервалом в 24 часа в эквимсяярных дозах (35 от/кг) на 2% крахмалыюй слизи.

В наших исследованиях С С-интоксикация приводила к резкому падению содержания Р450 и менее выраженному уменьшению концентрации Ь5 в печени опытных животных (табл.3). Параллельно снижалась фармакометаболизирую-

щая функция печени: длительность гексеналового сна у отравленных животных возрастала до 4 раз по сравнению с интактным контролем.

Характерный для токсического гепатита цитолиз проявлялся увеличением активности сывороточных AJ1T и ACT. Индикатором деструкции эпителия желчевыводящих путей и плазматических мембран гепатоцитов служила повышенная активность сывороточных ГТТ и ЩФ, синдрома холестаза - концентрация общего и прямого билирубина (табл.3).

Лечебное введение гепазана на фоне ССЦ-интоксикации оказывало позитивное влияние на метаболическую функцию печени. Под действием индуктора в печени токсифицированных крыс содержание Р450 и Ъ5 не только восстанавливалось, но и существенно превышало уровень шггактного кошроля. Одновременно увеличивалась каталитическая активность микросом (табл.3).

Таблица 3

Влияние гепазана на некоторые биохимические показатели крыс с острым токсическим ССЦ-гепатигом

Показатель Контроль М±ш (п=8) СОд-гепатит М±т (п=8) СС14-гепатат+гепазан M±m(n=8)

Микросомальный белок печени (мг/мл) 3.80 + 0.197 3.71 ±0.221 3.93 ±0.102

Р450 (нмоль/мг белка) 0.33+0.018 0.16 + 0.020* 0.82 ±0.103 *#

Ъ5 (нмоль/мг белка) 0.28 + 0.027 0.22 + 0.029 0.45 ±0.051 **

АЛТ (мккат/л) 0.49+0.028 0.82+0.081* 0.99 ±0.057*

ACT (мккат/л) 0.62 ±0.015 0.73 +0.013* 0.74 ±0.014

ГГТ (мкмоль/л* с) 0.19+0.012 0.61 ±0.079* 0.30 ± 0.038*#

ЩФ (мхмоль/л*с) 4.49 ±0.263 6.89 ±0.511* 3.44 ±0.267*"

Общий билирубин (мкмоль/л) 18.6 ±0.36 26.2 ±2.94* 37.8±4.03*#

Прямой билирубин (мкмоль/л) 14.3 ±1.79 20.0 ±2.60 20.0 ±1.73*

Альбумин (г/л) 19.1 ±1.01 21.5 + 1.21 22.2 ±0.32*

Гексеналовый сон (мин) 24.6 ±5.31 106.0 + 20.9* 12.0 ±0.63*

Примечание: здесь и далее *- р<0.05 по отношению к контролю, * - р<0.05 по отношению к «гепатиту».

Кроме того, гепазан проявляет умеренное гепатопротекторное действие.

Судя по существенному снижению активности сывороточных ГГТ и ЩФ, индуктор способствует реорганизации мембранных структур гепатоцитов, а небольшое, но достоверное увеличение альбумина в сыворотке леченных гепаза-ном животных указывает на стимуляцию белоксинтегических процессов. Однако гелазан не препятствует развитию циголигического синдрома (активность AJIT и ACT не снижается) и несколько увеличивает гипербилирубинемию, повышая содержание в сыворотке общего билирубина (табл. 3).

Бензонал проявлял схожий с гепазаном МОС-стимулирующий эффект и способствовал мембранной стабилизации (снижалась активность ГГТ и ЩФ), а также оказывал цитолротекторное действие, обнаруживаемое по нормализации активности АЛТ и ACT в сыворотке леченых животных (табл. 4).

Таблица 4

Влияние бензонала на длительность гексеналового сна и некоторые биохимиче-

ские показатели крыс с острым токсическим ССЦ-гепатитом

Показатель Контроль М±ш (п=8) ССЦ-гепатит М ±т (п=8) СС14-гепатит+бензонал M±m(n=8)

Микросомальный белок печет (мг/мл) 2.77+0.098 2.66 ±0.044 3.29 ±0.069 **

Р450 (нмоль/мг белка) 0.28 + 0.010 0.18 ±0.046* 0.71 ±0.113 *#

Ь5 (нмоль/мг белка) 0.46 ±0.027 0.39 ±0.033 0.61 ±0.054**

АЛТ (мккат/л) 0.49 ±0.028 0.82 ±0.081* 0.58 ± 0.047*

ACT (мккат/л) 0.62 ±0.015 0.73 ±0.013* 0.62 ± 0.023 *

ГГТ (мкмоль/л*с) 0.19±0.014 0.29 ±0.039* 0.19 ±0.026

ЩФ (мкмоль/л*с) 4.49 + 0.263 6.89 ±0.511* 2.72 ± 0.274 **

Общий билирубин (мкмоль/л) 18.6 ±0.36 26.2 ±2.94* 34.8 ±1.24 **

Прямой билирубин (мкмоль/л) 14.3 ±1.79 20.0 ± 2.60 17.9 + 1.79

Альбумин (г/л) 19.1 ±1.01 21.5 ±1.21 19.6 ±0.65

Гексеналовый сон (мин) 12.7 ±2.01 30.3 ± 5.65* 4.0 ±0.94*#

Уровень же общего билирубина при введении барбитурата увеличивался в равной степени с содержанием сывороточного билирубина у крыс, получавших гепазан.

Таким образом, гепазан успешно восстанавливает сниженную гидроксиди-рующую функцию при токсическом поражении печени и оказывает умеренный

мембраностабилизирующий эффект, превосходя бензонал по индукции Ь5.

Актуальной проблемой современной медицины остается фармакологическая коррекция депрессии МОС при синдроме холестаза, сопровождающего многие заболевания гепатобилиарной сферы (Земсков B.C. и соавт., 1988). Выделяют два основных типа холестаза: обструктивный и необструктивный.

В наших исследованиях обструктивный (подпеченочный) холестаз приводил к резкому сокращению содержания Р450 и Ь5 и падению фармакометаболи-зирующей функции печени (рис.7, 8). Прекращение оттока желчи сопровождалось гиперхолестеринемией и выраженной гипербилирубинемией с преобладанием неконьюгированной формы желчного пигмента, увеличением активности сывороточных ГТТ и ЩФ (табл. 5).

Под влиянием гепазана у крыс с холестазом значительно увеличивалось содержание в печени Р450, Ь5, а также нормализовывалась длительность гексе-налового сна (рис.7, 8). t

07 oe

я

I

е Q4 Ц 03

О

® Q2 01 о

250

А

rh

150 -

100

й.

о

Р450

□ Ь5

Примечание: 1-интактные;

2-ложнооперированные;

3-«холестаз»; 4-«холестаз»+гепазан.

Примечание: 1-интактные; 2-«холестаз»; 3 -«холестаз»+гепазан.

* - р<0.05 по отношению к контролю

л - р<0.05 по отношению к «холестазу»

Рис. 7. Влияние гепазана на содержание Рис. 8. Влияние гепазана на Р450 и Ь5 в печени крыс с обратимым длительность гексеналового сна крыс с подпеченочным холестазом. обратимым подпеченочным холестазом.

Несомненно положительным моментом действия гепазана явилось изменение пропорции свободного и связанного билирубина в пользу последнего, по-

скольку конъюгация увеличивает гидрофильность пигмента, способствует его выведению через почки и снижает его нейротоксичесхое действие. Повышение доли прямого билирубина при введении гепазана, вероятно, обусловлено активацией ферментов П фазы биотрансформации (в том числе и УДФГТ), хотя содержание общего билирубина статистически значимо не отличалось от значений суммарного билирубина как нелеченых «холестазных» животных, так и получавших бензонал (табл. 5). Весьма эффективно гепазан снижал активность сывороточной 11 Г. Однако активность ЩФ и содержание холестерина в сыворотке крыс, леченных гепазаном, оставались на уровне «холестазных» животных.

Таблица 5

Влияние гепазана на некоторые биохимические показатели крыс

с обратимым подпеченочным холестазом

Показатель Контроль М±т (п=8) ЛО М±т (п=6) ОПХ М±т (п=8) ОПХ+ гепазан М±т (п=8)

Микросомальный белок печени (мг/мл) 3.59 + 0.051 3.54 ±0.069 3.89 ±0.100*° 3.78 ±0.071*°

ГТТ (мкмоль/л*с) 0.19 ±0.012 0.17 ±0.019 1.42 ±0.054*° 1.05 ±0.147*°#

ЩФ (мкмоль/л*с) 3.09 ±0.401 4.41 ±0.612 7.75 ±0.740*° 9.65 ±0.817*°

Общий билирубин (мкмоль/л) 11.2 ±0.45 12.2 ±0.17 155.4 ±16.34*° 161.1 ±14.49*°

Прямой билирубин (мкмоль/л) 8.1 ±0.43 7.2 ±0.35 129.1 ±13.59*° 149.52 ± 12.29*°

Холестерин (ммоль/л) 2.78 ±0.322 1.09 ±0.146* 5.76 + 0.833*° 5.64 ±0.554*°

Примечание: здесь и далее *- р<0.05 по отношению к контролю, р<0.05 по отношению к ложнооперированным животным (ЛО); * - р<0.05 по отношению к «холестазу» (ОПХ).

Барбитурат оказывал схожий с гепазаном терапевтический эффект, но, в отличие от гепазана не восстанавливал содержание в печени Ь5 и не снижал активность ГГТ (табл. 6).

Таблица б

Влияние бензонала на некоторые биохимические показатели крыс с обратимым подпеченочным холестазом

Показатель Контроль М + т (п=8) ЛО М + т (п=6) ОПХ М + т (п=8) ОПХ + бензо- нал М + т (п=8)

Микросомальный белок печени (мг/мл) 3.59 + 0.051 3.54 + 0.069 3.89 + 0.100*° 3.81+0.065*°*

Р450(нмоль/мг белка) 0.49 + 0.044 0.39 + 0.031 0.19 + 0.016* 0.33+0.041 *

Ь5 (нмоль/мг белка) 0.44 + 0.027 0.42+0.023 0.37 + 0.013* 0.35+0.029*

ГГТ (мкмоль/л*с) 0.18 + 0.022 0.13 + 0.016 0.54+0.104' 0.62+0.129*

ЩФ (мкмоль/л*с) 3.09 + 0.401 4.41+0.612 7.75 + 0.740*" 10.54+1.211'

Общий билирубин (мкмоль/л) 11.2+0.45 12.2+0.17 155.4 + 16.34*° 145.8+12.52*°

Прямой билирубин (мкмоль/л) 8.1 + 0.43 7.16 + 0.35 129.1 + 13.59*° 111.5+9.77*°

Холестерин (ммоль/л) 2.78 + 0.322 1.09 + 0.146' 5.76 + 0.833*° 4.24+0.339*°

Несмотря на отсутствие выраженного гипохолестатического эффекта, оба индуктора успешно корригировали детоксицирующую функцию печени, что обосновывает перспективность их применения в комплексной терапии холеста-за, поскольку традиционно применяемые в клинике гепатопротекторы и анти-оксиданты в подобных ситуациях не приводят к нормализации показателей МОС (Венгеровский А.И., Саратиков A.C., 1994).

Второй тип холестаза (необструктивный) моделировали внутрижелудоч-ньш введением АНИТа. В наших экспериментах интоксикация АНИТ сопровождалась высокой летальностью опытных животных (8 из 15). На 5-ые сутки после затравки в печени крыс уменьшалось содержание микросомального белка, Р450 и Ь5, что приводило к снижению каталитической активности МОС и увеличению длительности гексеналового наркоза в 2,8 раза. Введение токсина вызывало развитие выраженной гипербилирубинемии с повышенной концентрацией общего и связанного билирубина, гиперхолестеринемии и увеличение активности ГГТ и ЩФ (табл. 7). Главным и самым значимым эффектом гепаза-

на при АНИТ-холестазе явилось повышение выживаемости животных: из 15 крыс с холестазом, получавших гепазан, погибла лишь 1 (р длях2 <0.05). Антитоксический эффект бензонала был менее выраженным: в группе животных леченных барбитуратом погибли 5 крыс из 15 (р длях2 >0.05).

Гепазан возвращал до уровня нормы количество микросомального белка в печени крыс с АНИТ-холестазом и фармакометаболизирующую функцию гепа-тоцитов, достоверно повышал содержание Р450 и Ь5. Под влиянием индуктора снижалась активность ГГТ, но достоверно не изменялось содержание холестерина. Примечательно, что, как и при СС14-гепатите, и гепазан, и бензонал, несильно углубляли гипербилирубинемию, причем коэффициент конъюгации в обоих случаях значимо не изменялся. Возможно, как и в случае токсического гепатита, в основе этого феномена лежит гиперпродукция электрофильных ин-термедиатов и свободных радикалов (табл.7).

Таблица 7

Влияние индукторов на некоторые биохимические показатели крыс

с внутрипеченочным АНИТ-холестазом

Показатель Контроль М + ш (п=8) АНИТ М + ш (п=7) АНИТ +гепазан М+ш (п=8) АНИТ +бензонал М+ш (п=8)

Микросомапьный белок печени (мг/мл) 2.77 + 0.098 2.33 + 0.069* 2.83 + 0.101* 2.77 + 0.141*

Р450 (нмоль/мг белка) 0.28 + 0.010 0.09 + 0.032* 0,21+0,038* 0.25 + 0.034*

Ь5 (нмоль/мг белка) 0.46 + 0.027 0.32 + 0.025' 0,43+0,038" 0.36 + 0.047

ГГТ (мкмоль/л*с) 0.19 + 0.014 0.42 + 0.014' 0.29 ±0.038'* 0.55 + 0.08Г

ЩФ (мкмоль/л*с) 12.58 + 1.734 17.27+0.087* 15.18 + 1.278 13.32+ 1.666

Холестерин (ммоль/л) 1.97+0.373 2.76+0.119 3,11 + 0,872 2.46 + 0.236

Общий билирубин (мкмоль/л) 14.7 + 0.59 23.1 +0.93* 32.1 + 2.89*# 26.4+1.6*

Прямой билирубин (мкмоль/л) 11.5+0.25 15.5 + 0.9* 14.1+0.78* 16.1+0.9*

Альбумин (г/л) 25.1 + 0.66 28.7+0.39' 25.74 + 0.74* 23.9+ 1.08"

Гексеналовый сон(мин) 12.7+2.01 36.7 + 8.16' 10.2 + 0.65* 6.5 + 0.24*"

Одним ¡п возможных механизмов антитоксического действия гепазапа является индукция СУР ЗА, которая участвует в биодеградации желчных кислот, являющихся главных« патогенетическим звеном холестазов (Хк V/., 2001; 81аис1тдег ег а1„ 2001).

Биохимические параметры у лечешгых бензоналом «холестазных» животных мало отличались от показателей крыс, получавших гепазан. Однако под влиянием барбитурата практически не увеличивалось содержание Ь5, а активность сывороточной ГГТ имела тенденцию к увеличению.

Таким образом, анализируя результаты влияния гепазана при синдроме хо-лестаза, необходимо отметить, что наряду с достоверным увеличением выживаемости, индуктор эффективно корригирует антитоксическую функцию печени и оказывает умеренное гепатопротекгорное действие.

Одной из наиболее важных сфер применения индукторов МОС в клинике являются патологические гяпербилирубинемии новорожденных. Показана высокая эффективность фенобарбитала, беюонала и кордиамина в комплексной терапии и профилактике этой патологии (Маркова И.В., Шабалов Н.П., 1993; Даминов Т.А., Ахмедова Д.И., 1990).

Традиционной экспериментальной моделью неонатальной патологической желтухи является викасоловая гемолитическая гипербилирубинемия новорожденных крысят (Новожеева Т.П. и соавг., 1993). В наших исследованиях введете токсических доз викасола 5-дневным крысятам вызывало выраженную ги-пербилирубинемию, регистрируемую по яркой желтушности кожных покровов, и интоксикацию организма, проявляющуюся увеличением летальности (до 64% по отношению к интакгаому контролю), торможением прироста веса и адина-мичностью животных. Индикатором поражения печени выступала длительность гексеналового наркоза (табл. 8).

Гепазан эффективно купировал токсический синдром: летальность уменьшалась до 28,6% по отношению к ингакгному контролю, значительно снижался дефицит массы тела. Гипобилирубинемияеское влияние проявлялось ослаблением желтушности кожных покровов. Механизм терапевтического эффекта гепазана, вероятно, обусловлен усилением гидроксилазной и конъюгирующей функции гепатоцитов (преимущественно УДФГТ).

Таблица 8

Влияние индукторов на прирост массы тела, весовой коэффициент печени и длительность гексеналового сна новорожденных крысят с викасоловой гипербшшрубинемией

Показатель Контроль М±т(п=13) ВГ М±т(п=16) ВГ + гепазан М±т(п=15) ВГ + бензона М±т(п=18;

Прирост массы тела ( г ) 3.65 ±0.308 0.79 ±0.122* 2.83 ±0.209*# 3.68 ± 0.246'

Весовой коффициент печени ( %) 2.66 ±0.191 3.33 ±0.157* 3.52 ± 0.101* 3.35 ±0.212'

Гексеналовый сон (мин) 33.9 ±3.72 120.4± 3.36* 64.9 ± 2.77*# 67.2 ±2.94*'

Сравнивая терапевтическое влияние гепазана и бензонала на модели викасоловой гипербилирубинемии новорожденных крысят, необходимо отметить практически равную эффективность индукторов; единственным различием является более выраженное влияние барбитурата на прирост массы тела новорожденных животных.

Таким образом, профилактическое введение гепазана беременным и кормящим самкам крыс уменьшает проявления викасол-индуцированной гипербилирубинемии: у потомства.

ВЫВОДЫ

1. Новый индуктор монооксигеназной системы гепазан увеличивает содержание щггохромов Р450, активность NАВРН-цитохром Р450-редуктазы и не влияет на количество цигохрома Ь5 в печени интактных животных.

2. Иммунохимический профиль, содержание цятохромов Р450, Ь5 и каталитическая активность изоэнзимов микросомальной фракции гепатоцигов 1фыс свидетельствует о фенобарбиталовом типе МОС-стимулирующего эффекта гепазана; особенностью является отсутствие индукции СУР1А2 и влияния на центральную нервную систему.

3. Способность гепазана индуцировать МОС сохраняется на фоне острого токсического гепатита, вызванного тетрахлорметаном у крыс, что выражается в повышении содержания и каталитической активности цитохромов Р450, а также, в отличие от интактных животных, и Ъ5.

4. При обратимом подпечгеночном холестазе гепазан эффективно восстанав-

ливает активность МОС, приближая к норме количество цигохромов Р450 и длительность гексеналового сна, увеличивает содержание цигохрома Ъ5 и повышает коэффициент конъюгации билирубина.

5. Введение гепазана животным с внутрипеченочным холестазом существенно увеличивает выживаемость животных, нормализует количество цигохромов Р450, Ь5„ активность МОС и снижает выраженность синдрома холестаза.

6. Профилактическое введение гепазана беременным и лактирующим самкам крыс значительно снижает легальность, дефицит массы тела и продолжительность гексеналового сна у новорожденных крысят с викасоловой гиперби-лирубинемией.

7. Гепазан не уступает бегооналу по способности корригировать депрессию цигохромов Р450 на фоне викасоловой гипербилирубинемии новорожденных крысят, токсическом СС14-гепатите, подпеченочном и внутрипеченочном холе-стазах и превосходит его по влиянию на цитохром Ь5 и выраженности мембра-ностабшшзирующего эффекта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Фармакологическая активность ряда азольных соединений // Вопросы теоретической и практической медицины: Тез. докл. конф. - Уфа, 1998. - С. 73 (соавт.: Никитин H.A.)

2. Дигидротиазолксаитин Х-68 - новый индуктор микросомальных ферментов печени // Фармакология и современная медицина: Тез. докл. конф.- СПб., 1999. - С. 5-6 (соавт.: Алёхин Е.К., Красилова И.Л., Никитин H.A.)

3. Новый индуктор микросомальных оксигеназ Н Вопросы иммунопатологии и иммунореабилитации: Тез. докл. конф. - Уфа, 1999. - С.87-88 (соавт.: Никитин H.A., Красилова И.Л., Алёхин Е.К.)

4. Способ получения б,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло(2,3-1)ксантина: Патент на изобретение №2161160 по заявке №99106256, дата поступления: 01.04.1999. Приоритет от 01.04.1999 (соавт.: Ха-лиуллин Ф. А., Алёхин Е.К., Красилова И.Л., Никитин H.A.)

5. Вещество, вызывающее индукцию микросомальных ферментов печени: Патент на изобретение №2168332 по заявке №2000113617, дата поступления: 26.05.2000. Приоритет от 01.04.1999. (соавт.: Алёхин Е.К., Красилова И.Л., Ха-лиуллин Ф.А., Никитин H.A.)

6. Влияние нового индуктора микросомальных ферментов гепазана на поведение неинбредных мышей // Вопросы теоретической и практической медицины: Тез. докл. конф. - Уфа, 2000,- С. 33 (соавг.: Никитин H.A.)

7. Оценка психотропной активности гепазана в тесте «Открытое поле» П Здравоохранение Башкортостана. -2001.-№1-2.-С.18-21 (соавт.: Никитина И.Л.)

8. Изоферментный профиль нового индуктора монооксигеназной системы печени гепазана // Вопросы теоретической и практической медицины: Тез. докл. 66-й Респ. молодежной науч. конф. - Уфа, 2001. - Т.2.-С.28 (соавт.: Никитина И. Л.)

9. Изоферментный профиль нового индуктора монооксигеназной системы гепазана // Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма: Материалы V Междунар. науч. симпозиума, VI Чуйской науч.-пракг. конф., посвященных 10-летию НИИКиЭЛ СО РАМН и 65-летию проф. Э.Х.Акрамова,- Чолпон-Ата, 2001.-Т.2.-С.56-60 (соавт.: Никитина И.Л., Алехин Е.К., Никитина И.Л., Халиуллин Ф.А.)

10. Эффективность профилактического введения гепазана на течение экспериментальной гемолитической гипербилирубинемии И Здравоохранение Башкортостана Спец. выпуск-2001.-№8.-С.12-14. (соавт.: Никитина И.Л.)

11. Действие нового индуктора монооксигеназной системы печени гепазана при экспериментальном обратимом подпеченочном холестазе // Человек и лекарство: Тез. докл. IX Всероссийского национального конгресса. -М., 2002. - С. (соавт.: Никитина И.Л., Алехин Е.К., Халиуллин Ф.А.)

БАГМАНОВА ИННА ВЛАДИМИРОВНА

Изоферментный профиль действия и активность нового индуктора моиооксигеназной системы печени гепазана при некоторых патологических состояниях

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени канди-тата медицинских наук

Издательская лицензия № 06788 от 01.11.2001.

Подписано в печать 27.02.2002. Формат 60x84/16. Бумага ксероксная. Усл. Печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 18.

Издательство «Здравоохранение Башкортостана» 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. Тел (3472)22-73-50.