Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Изменения клеточного состава и свободно-радикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза при введении экзогенного глюкокортикостероида на фоне гипокинетического стресса

На правах рукописи

СТРЕЛЬНИКОВА Лилия Алексеевна

Изменения клеточного состава и свободно-радикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза при введении экзогенного глюкокоргикостероида на фоне гипокинетического стресса

14.03.03- патологическая физиология 03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 ДПР 2013

Челябинск-2013

005057661

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководи гели: доктор медицинских наук, профессор

Осиков Михаил Владимирович доктор биологических наук, профессор Цейлнкман Вадим Эдуардович

Официальные оппоненты: Фролов Борис Александрович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Аглетдинов Эдуард Феликсович

доктор медицинских наук, профессор кафедры биологической химии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России

Всдущдо организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития России (г. Москва).

Защита состоится «_»_2013 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.117.02 при ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России

Автореферат разослан "_"_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Н.В. Тишевская

Актуальность исследования

Для вызванного гипокинезией стресса характерна активация гипоталамо-гипофизарно-иадпочечниковой системы (ГГАС), проявляющаяся в продолжительном увеличении содержания циркулирующих

глюкокортикостероидов (Коваленко Е.А., Гуровский H.H., 1980). Известно, что высокой чувствительностью к действию глюкокортикостероидов (ГКС) характеризуются органы иммуногенеза и кроветворения (Горизонтов П.Д. соавт., 1983; Дыгай A.M., Шахов В.П., 1989; Фролов Б.А., 1993; Волчегорский И.А. и соавт., 1999; Dhabar F. et al., 1996; Sapolsky R. et al, 2000; van den Brandt j. et al., 2004). Поэтому характерные для гипокинетического стресса изменения клеточного состава в тимусе, костном мозге и селезёнке, могут иметь ГКС-зависимый характер. При этом ГКС могут индуцировать апоптоз в тимусе, селезёнке и костном мозге (Opferman J.T., Korsmeyer S.J., 2003). Кроме того, ГКС способны влиять на перераспределение кариоцитов между органами системы крови. В частности, вызванная ГКС инволюция вилочкой железы может быть связана с миграцией Т-лимфоцитов из тимуса в костный мозг, с последующим формированием там «лимфоидЕЮго пика» (Дыгай A.M., Шахов В.П., 1989). Характерная для стрессорных воздействий мобилизация нейтрофильных гранулоцитов из костного мозга также регулируется ГКС (Горизонтов П.Д.и соавт., 1983; Цейликман В.Э., 1998). ГКС в органах кроветворения и иммуногенеза регулируют не только клеточный состав, но и процессы свободно-радикального окисления. На молекулярном уровне это проявляется в регуляции NF-kB сигнального пути (Sapolsky R. et al., 2000). Известно, что действие этого транскрипционного фактора сопряжено с активацией процессов свободно-радикального окисления (Morel А. et al., 1999). Кроме того, ГКС регулируют активность прооксидантных и антиоксидантных ферментов, таких как - НАДФН -оксидаза, ксантиноксидаза, СОД, каталаза (Vallelian F., et al., 2010). Важно отметить, что активация свободно-радикального окисления наблюдается при ГКС - индуцируемом апоптозе в тимусе.

Между тем, активация апоптоза при стрессе рассматривается в качестве основного механизма развития гипоплазии вилочковой железы (van den Brandt J. et al., 2004; Цейликман О.Б. и соавт., 2005). Кроме того появились сведения о способности продуктов свободно-радикального окисления влиять на чувствительность клеток к ГКС (Crousin N. et al., 2007). В связи с этим представляется уместной изучение роли двух основных звеньев свободно-радикального окисления - липопероксидацин и окислительной модификации белков в регуляции ГКС - зависимых эффектов гипокинетического стресса в органах кроветворения и иммуногенеза. Так как ГКС относятся к гормонам пролонгированного действия (Тепперман Дж„ Тепперман X., 1989) представляется целесообразным изучение зависимости ГКС - зависимых эффектов на органы кроветворения и иммуногенеза в зависимости от продолжительности гипокинетического стресса. Для этого целесообразно экспериментальное

моделирование односуточной и трёхсуточной гипокинезии, так как в этот период в большей степени, чем прп более поздних сроках воздействия выражена активация ГГАС (гогЬаэ У.О., 2000).

В связи с тем, что ГКС играют важную роль в адаптации организма к последующим стрессорным эпизодам (Барокку И. е1 а!., 2000), необходимо изучить влияние предварительного гипокинетического стресса на чувствительность клеточного состава, а также липопероксидации и карбонилирования белков к экзогенному ГКС. Для моделирования ГКС -зависимых изменений в органах кроветворения и иммуногенеза целесообразно использовать экзогенный глюкокортикостероид триамцинолона ацетонид, так как вследствие его пролонгированного действия на вилочковую железу и селезёнку, в них происходит непрерывно нарастающая гипоплазия (Волчегорский И.А. и соавт., 2000).

Цель работы

Изучить соотношение между продолжительностью острого гипокинетического стресса и выраженностью глюкокортикостероид - зависимых изменений клеточного состава и свободио-радикалыюго окисления в органах кроветворения и иммуногенеза.

Задачи исследования

1. Изучить клеточный состав в тимусе костном мозге и в селезёнке в течении первых 24 часов после завершения гипокинетического стресса

2. Изучить клеточный состав, в тимусе, селезёнке и костном мозге через 120 часов после завершения односуточной и трёхсуточной гипокинезии.

3. Исследовать влияние предварительной 1 суточной гипокинезии на глюкокортикостероид-зависимые изменения клеточного состава в тимусе, селезёнке и костном мозге

4. Исследовать влияние предварительной 3 суточной гипокинезии на глюкокортикостероид - зависимые изменения клеточного состава в тимусе, селезёнке и костном мозге.

5. Исследовать влияние односуточной и трехсуточной гипокинезии на глюкокортикостероид-зависимые изменения свободно-радикального окисления в тимусе, селезёнке и костном мозге.

6. Исследовать влияние предварительного гипокинетического стресса на глюкокортикостероид-зависимые изменения свободно-радикального окисления в тимусе, селезёнке и костном мозге.

Научная новизна исследования

Впервые получены данные, характеризующие соотношение между количеством кариоцитов в тимусе, в селезёнке, в костном мозге и процессами свободно-радикального окисления непосредственно, а также через 24 и 120 часов после завершения односуточной и трёхсуточной гипокинезии. Установлено, что в

момент прекращения односуточной и трёхсуточной гипокинезии, а также через 24 часа после ее завершения гипоплазия костного мозга и селезёнки связана со снижением количества нейтрофильных гранулоцитов и увеличением окислительной модификации белков. Обнаружено, что гипоплазия вилочковой железы развивается непосредственно после завершения односуточной и трёхсуточной гипокинезии и сохраняется через 120 часов после завершения воздействия. Установлено, что при введении экзогенного глюкокортикостероида на фоне предшествующего одно- и трехсуточного гипокинетического стресса, купируется глюкокортикостероид - зависимое увеличение содержания лимфоцитов в костном мозге и ограничивается супрессия эритропоэза. Установлено, что предварительная односуточная гипокинезия приводит к повышению чувствительности вилочковой железы к гипоплазирующему действию экзогенного глюкокортикостероида за счёт угнетения пролиферации и усиления апоптоза. Обнаружено, что в костном мозге, тимусе и селезёнке в ответ на введение экзогенного глюкокортикостероида снижалось карбонилирование белков при одновременном угнетении липопероксидации. Показано, что предварительная односуточная и трёхсуточная гипокинезия отменяла глюкокортикостероид -зависимое угнетение окислительной модификации белков в костном мозге и в тимусе и усиливало в селезёнке.

Теоретическое и практическое значение

Получехшые результаты уточняют механизм влияния глюкокортикостероидов па клеточный состав органов кроветворения и иммуногенеза при гипокинетическом стрессе. На основе полученных результатов обосновано представление о карбоншшровании белков в органах кроветворения и иммуногенеза как о биохимическом маркёре их чувствительности к глюкокортикостероидам. Результаты исследования могут быть использованы при разработке новых подходов к коррекции стресс-индуцированных изменений гемопоэза и иммуногенеза. Положения, выиосимые на защиту

1. Увеличение продолжительности гипокинетического стресса с 24 часов до трёх суток увеличивает выраженность гипоплазии и снижает уровень свободно-радикального окисления в вилочковой железе и в селезёнке.

2. Увеличение продолжительности гипокинетического стресса с 24 часов до трёх суток снижает чувствительность тимуса и костного мозга к гипоплазирующему действию экзогенного глюкокортикостероида.

3. Предварительная гипокинезия усугубляет глюкокортикостероид - зависимое снижение карбонилирования белков в селезёнке и предупреждает его развитие в костном мозге и в вилочковой железе.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения профессора Р.И.Лифшица (Челябинск, 2009); X съезде иммунологов Урала (Челябинск, 2011), на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011), на VII Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения в Челябинске» (Челябинск, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 5 - в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ (Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова; Российский иммунологический журнал; Вестник уральской медицинской академической науки; Омский научный вестник).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 222 источника: 123 - отечественных и 99 - зарубежных. Работа содержит 16 таблиц, 16 рисунков.

Материалы и методы

Исследования были выполнены на 117 белых беспородных крысах. Экспериментальные животные находились в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г., свободном доступе к пище и воде при 12-14-часовом световом дне. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с правилами гуманного отношения к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии, регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.).

Гипокинетический стресс моделировали путём помещения крыс в специальные клетки - пеналы, ограничивающие подвижность животных при свободном доступе к пище и воде (Коваленко Е.А., Гуровский H.H., 1980; Фёдоров И.В., 1984; Тигранян P.A., 1990; Миллер Е., Рупсовский М., Mrowicka М., Матушевский Т., 2007). Продолжительность воздействия составляла 1 сутки (ГК1) и 3 суток (ГКЗ).

Исследования проводили непосредственно после завершения ГК1 и ГКЗ, а также через 24 часа и 120 часов.

Для моделирования ключевого механизма стресса - активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы - применяли триамцинолона ацетонид («Кеналог», «Veb Berline Chemie», Германия) в соответствии с рекомендациями И.А. Волчегорского и соавт. (2000). Суспензию препарата вводили крысам подкожно в дозе 2 мг/кг однократно через 24 часа после завершения ГК1 и ГКЗ. Исследования проводили через 96 часов после введения препарата, в период ярко выраженной гипоплазии тимуса, костного мозга и селезёнки (Волчегорский И.А.,1993; Колесников О.Л., 1998; Цейликман В.Э., 1999). Гематологические методы

Изучение периферической крови проводилось общепринятыми методами (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., 1992) и заключалось в подсчете лейкоцитов в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу изучали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза (проводился подсчет не менее чем 200 клеток). Цитологический состав костного мозга и селезёнки определялся в мазках-отпечатках органов (проводился подсчёт не менее чем на 500 клеток). Мазки периферической крови, также как мазки-отпечатки костного мозга и селезёнки, перед окраской фиксировали метанолом. В вилочковой железе определяли уровень апоптоза и пролиферации (исследование выполнено совместно с к.б.н. H.H. Курчатовой) методом проточной цитофлуориметрии (Сибиряк C.B., Зурочка A.B., Хайдуков C.B. и др., 2008). На проточном цитофлуориметре «FACS С ALIBUR» (Becton Dickinson, США) в рамках программного обеспечения «CELL QUEST» в суспензии тимоцитов, окрашенных пропидием йодидом, определяли относительное содержание находящихся в апоптозе гипохромных клеток (суб Go/Gi;ronc M 1), клеток, находящихся в Go/Gi фазе клеточного цикла (Gi пик, М2) и количество митотически активных клеток (S+G2+M;tthk МЗ). Биохимические методы

Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогентатах тимуса, селезенки, костного мозга оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых тканей по методике Волчегорского И.А. и др. (1989). По методике Е.И. Львовской (1998) определяли уровень Ре+2/аскорбат - индуцированного ПОЛ. Окислительную модификацию белков (ОМБ) оценивали по уровню образования динитрофенилгидразонов по методу Е.Е. Дубининой (1995). Статистические методы

Для обработки результатов исследований использовали пакет прикладных программ "Statistica 6.0 for Windows". Статистически значимые различия между несколькими группами определялись с помощью критерия Краскелла-Уолиса (Kruskal-Wallis). Для определения статистически значимых различий между двумя сравниваемыми группами использовали критерии Манна-Уитни (U). Различия считали значимыми при р<0,05. Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (Rs) и Кенделлу (rk).

Результаты и обсуждение

1. Изменения клеточного состава в органах кроветворения и иммуногенеза после завершения одно- и трёхсуточной гипокинезии

Непосредственно после завершения ГК1 в вилочковой железе и селезёнке наблюдалось снижение содержания кариоцитов. При этом в костном мозге прослеживалась тенденция к снижению содержания кариоцитов (табл. 1).

Таблица 1

Влияние гипокинезии на клеточный состав органов кроветворения и

иммуногенеза

—-—„^Группы сравнения Показатели ^ Группа 1 Контроль (п=6) Группа 2 гкх (п=б) Группа 3 ГКЗ (л=6)

Количество лейкоцитов периферической крови (*109/л) 7,6±0,78 12,75±1,53 Р,.2=0,027 14,93±1,52 Р,.з=0,021

Ядросодержащие клетки тимуса (*106) 232,5±18,б 168,37±19,4 Г,.2=0,027 151,58±10,18 Р,.,=0,021

Ядросодержащие клетки селезёнки (*106) 695,62±13,47 519,8+15,14 Р,.1=0,027 476,95±9,45 Р,.1=0,021

Ядросодержащие клетки костного мозга (х106) 64,67±3,46 55,38+5,39 42,01±3,95 Р,.,=0,032

Примечание: Статистическая обработка произведена с использованием непараметрического критерия Манна-Уитнл (Ц).

В селезёнке при ГК1 наблюдалось снижение абсолютного числа лимфоцитов (с 377,2±45,63х106 в контроле (п=6) до 270,5±95,93х10б в опытной группе (п=6), Р=0,012) и нейтрофилов (с 18,94±5,25><106 в контроле (п=6) до 3,64±0,36х106 в опытной грутпте (п=6), Р=0,02811). В периферической крови обнаружен лейкоцитоз, обусловленный увеличением содержания нейтрофилов (с 0,9±0,081 х109/л до 1,49±0,098 хЮ' /л при ГШ (п=6, Р=0,035и)). Обращает на себя внимание наличие отрицательной корреляции между содержанием циркулирующих нейтрофилов и содержанием нейтрофилов в селезёнке (115= -0,587; р=0,0352).

В вилочковой железе в этот период не обнаружено статистически значимых изменений по уровню апоптоза и митотически активных клеток.

После завершения ГКЗ наблюдалась гипоплазия тимуса, проявлявшаяся в снижении количества тимоцптов. В костном мозге снижалось количество миелонуклеаров (табл. 1), обусловленное рекрутированием нейтрофильных гранулоцитов (их количество уменьшилось с 11,49±2,24* 106 в контроле (п=6) до 6,5±0,75х106в опытной группе (п=6), Р=0,02). Непосредственно после завершения

8

ГКЗ также наблюдалось снижение количества спленоцитов (табл.1), сопряжённое со снижением уровня нейтрофильных гранулоцитов (с 18,94±5,25><10 в контроле (п=6) до 4,42±0,86х106 в опытной группе (п=6), Р=0,04Ш) в органе. При этом зарегистрирован лейкоцитоз, сопровождающийся приростом содержания циркулирующих нейтрофилов (с 0,9±0,081 *109/л до 2,09±0,189><109/л при ГК1 (п=6, Р=0,025)). Следует отметить, что непосредственно после завершения ГК1 и ГКЗ статистически значимые различия выявлялись только по отношению к контролю. Между группами «ГК1» и «ГКЗ» не обнаружено статистически значимых различий по всем исследованным цитологическим показателям.

Полученные результаты свидетельствуют о гипоплазии вилочковой железы, селезёнки и отчасти костного мозга при ГК1 и ГКЗ. Это может быть связано с усилением апоптоза или миграцией клеток в кровоток. Скорее всего, развитие нейтрофилёза связано с мобилизацией нейтрофильных гранулоцитов из костного мозга и с нарушением их маргинализации в селезёнке. Снижение количества тимоцнтов и спленоцнтов может быть связано с активацией в этих органах апоптоза.

Таким образом, непосредственно после завершения ГК1 и ГКЗ наблюдается:

A. Гипоплазия вилочковой железы и селезенки

B. Снижение содержания нейтрофилов в костном мозге и селезёнке

C. Увеличение содержания циркулирующих нейтрофилов

2. Особенности свободно-радикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза непосредственно после завершения одно- и трёхсуточной гипокинезии

В тимусе непосредственно после завершения ГК1 наблюдалось усиление окислительной модификации белков (рис.1). После завершения ГКЗ на фоне повышенного уровня окислительной модификации белков также наблюдалось снижение содержания изопропанол-растворимых кетодиенов и сопряжённых трненов с 0,125±0,034 е.и.о. в контрольной группе (п=6) до 0,083±0,011 е.и.о. в группе ГКЗ (Р=0,014, п=6).

В селезёнке непосредственно после завершения ГК1 был увеличен базальный уровень карбонилирования белков (рис.1), а после завершеЕПм ГКЗ базальный уровень карбонилироваиных белков восстановился до контрольных значений.

Непосредственно после завершения ГК1 в костном мозге снижалась устойчивость к окислительному стрессу, что проявлялось в повышении уровня Ге^/НгОг - индуцированного карбонилирования белков с 1,497±0,192 мкМ/мл в контрольной группе (п=6) до 3,225±0,301 мкМ/мл в опытной (п=6, Р=0,023и). После завершения ГКЗ все исследованные показатели свободно-радикального окисления в костном мозге не отличались статистически значимо от показателей контроля.

шМ г&тне

4,5* 43537.52-И-

О'-

ГИМУС

шМ

I I~

СЕЛЕЗЕНКА

»

н- 1 *#• 5

йР1

1 I

- """?""......

Контроль ГК1

Рис. 1. Содержание карбонилированных белков в тимусе и селезенке после завершения гипокинезии

Примечание.: статистическая обработка проведена с использованием критерия Манна Уитни(1)). Различия между группами:* - "контроль" и "ГК1"; "контроль" и «ГКЗ»; **-между группами «ГК1» и «ГКЗ».

Таким образом, непосредственно после завершения ГК1 и ГКЗ наблюдается:

A. В тимусе усиливалось карбонилирование белков при одновременном снижении липопероксидации.

B. В селезёнке при ГК1 увеличивалось содержание карбонилированных белков на базальном уровне.

C. В костном мозге при ГК1 снижалась устойчивость к окислительному стрессу.

3. Изменения клеточного состава в органах кроветворения и иммуногенеза через 24 часа после завершения одно- и трёхсуточной гипокинезии

Через 24 часа после завершения ГЮ в вилочковой железе, селезёнке и костном мозге снижалось количество кариоцитов. В костном мозге наблюдалось снижение содержания нейтрофилов. В селезёнке наблюдалось снижение содержания лимфоцитов при одновременном увеличении количества нейтрофилов. В периферической крови наблюдался лейкоцитоз, обусловленный повышенным содержанием нейтрофилов (рис.2).

Через сутки после завершения ГКЗ наблюдалась более выраженная инволюция вилочковой железы, костного мозга и селезёнки по сравнению с ГК1. В селезёнке снижалось содержание лимфоцитов при одновременном увеличении количества нейтрофилов. В костном мозге наблюдалось снижение содержания нейтрофилов. В периферической крови зафиксирован нейтрофилыгый лейкоцитоз (рис.2).

120 -|— 100

80 4— 60 ]— 40 ]—

20 Г

Тимус

□яск Контроль ГК1

%

300

250 200

ЛИ

ЯСК Нф Лф

□ Контроль ПГК1 ОГКЗ

120 110 100

70 60 5 О 40

Костный мозг

Кровь

1ГТ

яск

□ Контроль

Нф

Рис. 2. Изменения клеточного состава в органах кроветворения и иммуногенеза через 24 часа после завершения гипокинезии

Примечание: все данные представлены в процентах от показателей контрольной грхппы. * - статистически значимые отличия от соответствующего показателя контрольной группы (критерий Майна - Уитни). ЯСК - ядросодерокащие клетки. Нф - нейтрофилы. Лф -лимфоциты. Лейк. - лейкоциты.

Таким образом, через 24 часа после завершения ГК1 и ГКЗ наблюдается:

A. Гипоплазия вилочковой железы, селезёнки и костного мозга

B. Снижение количества нейтрофилов в костном мозге

C. Нейтрофильный лейкоцитоз и увеличение количества нейтрофилов в селезенке.

4. Особенности свободно-радикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза через 24 часа после завершения одно- и трёхсуточной гипокинезии

Через сутки после завершения ГК1 и ГКЗ в тимусе и селезенке и костном мозге наблюдалось усиление ПОЛ и окислительной модификации белка (табл.2). Причём при ГКЗ эта тенденция имела более выраженный характер.

Таблица 2

Свободно-радикального окисление в органах кроветворения и иммуногенеза через 24 часа после завершения одно- и трёхсуточной _гипокинезии_

~~ Группы сравнения Показатели "---_ Группа 1 Контроль (п=8) Группа 2 ГК 1 (п=8) Группа 3 ГКЗ (п=8)_

ТИМУС

Кетодиены и сопряжённые трмеиы гептановая фаза, е.о.и. 0,098±0,001 0,146±0,013 Р,..2=0.041 0,198±0,023 Р,.1=0.02 Р2.,=0.031

Окислительная модификация белка мкмолъ/г белка 2,43±0,18 4,36±0,391 Р,.2=0,032 5,71 ±0,523 Р,.,=0.015

СЕЛЕЗЕНКА

Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и. 0,07±0,005 0,133±0,011 Р,.2=0,039 0,161±0,018 Р,.,=0.017 Р;.,=0,047

Окислительная модификация белка лпаюль/г белка 2,32±0,26 3,84±0,298 Р ,.2=0.012 5,98±0,441 Р,. ,=0.015

КОСТНЫЙ мозг

Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и. 0,082±0,007 0,110±0,015 Р,.3=0,024 0,09±0.008

Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и. 0,113±0,012 0,151^0,019 0,211 ±0,018 Р,.3=0,041 Р2.,=0,022

Окислительная модификация белка мкмоль/мл 2,21±0,19 3,8±0,291 Р,.2=0.013 5,9±0,602 Р,.,=0.033

В костном мозге через сутки после завершения ГК1 и ГКЗ также наблюдался статистически значимый прирост содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ. Кроме того, в органе через 24 часа после завершения ГК1 наблюдалось увеличение базального уровня карбонилированных белков в 2 раза, а после завершения ГКЗ - в четыре (табл.2).

Таким образом, через 24 часа после завершения ГК1 и ГКЗ наблюдается:

A. Усиление липопероксидации и карбоншшрования белков в тимусе, селезёнке и костном мозге.

B. После завершения ГКЗ уровень свободно-радикального окисления во всех исследованных органах выше, чем после завершения ГК1.

5. Изменения клеточного состава в органах кроветворения и иммуногенеза через 120 часов после завершения гипокинезии

Через 120 часов после завершения ГК1 в тимусе и в селезёнке отмечено снижение количества кариоцитов по сравнению с контролем (табл. 3).

Таблица 3

Количество кариоцитов в тимусе, селезёнке и костном мозге через 120 часов после завершения одно- и трёхсуточной гипокинезии

~ -----Группы сравнения Показатели -—_ Группа 1 Контроль (п=6) Группа 2 ГК 1 (4=6) Группа 3 ГКЗ (п=6)

Количество лейкоцитов периферической крови (хЮ'/л) 9,3±0,87 8,53±0,93 12,46±4,45

Ядросодержащие клетки тимуса <*Ю6) 232,5±28,4 159,37±29,65 Р,.1=0,018 135,34±19,25 Р, .1=0.021

Ядросодержащие клетки селезёнки (XI о6) 395,62±44,65 302,19±45,53 Р,.2=0,039 233,49±25,13 Р,.,=0,021

Ядросодержащие клетки костного мозга (хЮ6) 47,6±3,82 84,75±5,34 Р,.2=0.033 47,75±5,34

В костном мозге наблюдалось увеличение количества кариоцитов при увеличении на 77% суммарного количества клеток эритроидного ряда (Р=0,043) и на 18% клеток грануло-моноцитарного ряда (Р=0,043). Кроме того, в костном мозге на 21% повышено содержание нейтрофильных гранулоцитов (Р=0,043), а в селезёнке, напротив, отмечено четырёхкратное снижение содержания нейтрофильных гранулоцитов по сравнению с контролем (Р=0,014).

Как видно из таблицы 3, через 120 часов после завершения ГК1 содержание циркулирующих лейкоцитов не отличалось статистически значимо от контроля. Однако, анализ лейкоцитарной формулы показал, что на 81% увеличилось количество сегментоядерных нейтрофилов (Р=0,022) при отсутствии статистически значимых изменений со стороны палочкоядерных нейтрофилов. При этом также наблюдалось снижение на 25% количества циркулирующих лимфоцитов (Р=0,017).

Через 120 часов после завершения трёхсуточной гипокинезии наблюдалась гипоплазия вилочковой железы и селезёнки (см. табл.3). Анализ спленограммы показал, что в этот период в органе на 66% снижено количество лимфоцитов (Р=0,047) и на 52 % снижено количество нейтрофильных гранулоцитов (Р=0,033). Важно отметить, что в группе «ГКЗ+120ч» по сравнению с группой «ГК1+120ч.» отмечено снижение содержания кариоцитов в вилочковой железе (Р=0,049), селезёнке (Р=0,037) и в костном мозге (Р=0,02).

В костном мозге, через 120 часов после завершения ГКЗ также как и при односуточной гипокинезии наблюдалось усиление эритропоэза, что выражалось в увеличении на 50% общего содержания клеток эритроидного ряда (Р=0,011). Отличительной чертой трёхсуточной гипокинезии являлось угнетение грануло-моноцитопоэза, что проявлялось в снижении на 23% количества промиелобластов и миелобластов (Р=0,021) при одновременном уменьшении на 34% количества

миелоцитов (Р=0,017). При этом, содержание метамиелоцитов и нейтрофильных гранулоцнтов не отличалось статистически значимо от контрольных значений.

Характерное для ГКЗ угнетение грануло-моноцгггопоэза ассоциируется с развитием лейкоцитоза. Реципрокные отношения между этими двумя ростками гемопоэза могут быть обусловлены дополнительным вовлечением стволовых кроветворных клеток в дифференцировку по пути эритропоэза. Известно, что такие цитокнны как 1Ь-1, являются синергистами для ГМ-КСФ и антагонистами для эритропоэтинов (Aптlstrong Х\У., 1997). Напротив, для ГКС установлена способность к стимулированию эритропоэза. Поэтому отсроченные эффекты гипокинетического стресса по отношению к костному мозгу могут иметь ГКС -зависимый характер.

Таким образом через 120 часов после завершения ГК1 и ГКЗ наблюдается:

A. Гипоплазия вилочковой железы и селезёнки

B. Снижение количества нейтрофилов в селезёнке и увеличение в костном мозге

C. Увеличение количества циркулирующих нейтрофилов при одновременном снижении лимфоцитов.

6. Состояние свободно-радикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза через 120 часов после завершения одно- и трёхсуточной гипокинезии

В отличие от более ранних этапов, через 120 часов после завершения гипокинетического стресса гипоплазия тимуса и селезёнки не сопровождались усилением свободно-радикального окисления. Более того, в это время в основном наблюдалось снижение уровня липопероксидации и карбонилировапия белков. Так, через 120 часов после завершения ГК1 в тимусе наблюдалось снижение содержания изопропанол-растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов (табл. 4), а через 120 часов после завершения ГКЗ изопропанол-растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов и карбонилированных белков. Следовательно, в вилочковой железе отсроченным эффектом гипокинезии является угнетение свободно-радикального окисления. Причём, увеличение продолжительности гипокинетического стресса приводит к снижению липопероксидации и карбонилировапия белков. Более низкий уровень свободно-радикального окисления после ГКЗ обусловлен более высоким уровнем антиоксидантной защиты. Так у животных группы «ГКЗ+120 часов» по сравнению с группой «ГК1 + 120 часов» наблюдалось уменьшение уровня Ре2+ / Н202 - индуцированного карбонилировапия белков (табл. 4).

Таблица 4

Свободно-радикальное окисление в органах кроветворения и иммуногенеза через 120 часов после завершения одно- и трёхсуточной

гипокинезии_

--------- Группы сравнения Показатели —-—_ Группа 1 Ко1ггроль (п=8) Группа 2 ГК 1 (п=8) Группа 3 ГКЗ (п=8)

ТИМУС

Кетодиены и сопряжённые трнены изопропанольная фаза, е.о.и. 0,27*0,021 0,19*0,018 Р,..:=0,028 0,13*0,09 Р, .,=0.009 р2_,=0,047

Окислительная модификация белка мклюль/г белка 1,46±0,18 1,16*0,391 0.29±0,523 Р,.3=0.015 Р,.,=0.047

Окислительная модификация белка мкмоль/г белка, индукция Ре' /Н;0; 3,00*0,26 3,42*0.16 1,15±0,089 Р,.3=0,016 Р,.,=0,007

СЕЛЕЗЕ НКА

Окислительная модификация белка мклюль/г белка 9,32=0,78 4,89^0,298 Р,.,=0.007 2,64*0,441 Р, .¡=0.009

Окислительная модификация белка мкмоль/г белка, индукция Ге^ / Н2О2 15,60*1,41 12,74*1,17 6,16*0,71 Р, .3=0,016 Р;., = 0.007

К О С т н ы 1 МОЗГ

Окислительная модификация белка мкмоль/мл 6,16*0,59 7,9±0,544 3,4*0,23

Окислительная модификация белка мклюль/г белка, индукция Ре"' /НЮ? 17,82+1,063 18,84*2,611 9,67*0,871 Р,.,=0.007 Р;.}=0,023

Через 120 часов после завершения ГК1 в селезёнке наблюдалось двукратное снижение содержания карбонилированных белков (табл. 4), а после ГКЗ уровень карбонилировагшых белков снизился уже в 3 раза. При этом, в группе «ГКЗ + 120 ч» по сравнению с группой «ГК1+120 ч» содержание карбонилированных белков снижено в 2 раза. При этом у животных группы «ГКЗ+120 часов» по сравнению с группой «ГК1 + 120 часов» наблюдалось ограничение Ре2т / Н202 -индуцированного карбонилировання белков (табл. 4), что также, как и в тимусе, свидетельствует об усилении антиоксидантной защиты.

В костном мозге через 120 часов после завершения ГК1 не наблюдалось статистически значимых различий исследованных показателей свободно-радикального окисления по сравнению с контролем. Уместно напомнить, что в этот период в органе наблюдался повышенный уровень кариоцитов. Через 120 часов после завершения ГКЗ, на фоне угнетения грануло-монцитопоэза наблюдалось снижение уровня свободно-радикального окисления. Это проявлялось в двукратном уменьшении содержания карбонилированных белков (табл. 4). При этом в группе «ГКЗ+120ч» по сравнению с группой «ГК1+120 ч»

также снижено содержание карбонилированных белков. В связи с изложенным уместно обратить внимание на наличие положительной корреляционной связи между содержанием промиелобластов и миелобластов и уровнем карбонилированных белков после завершения трёхсуточной гипокинезии (ЛБ=0,51 1 ;Р=0,042).

В селезёнке наблюдалась положительная корреляционная связь между количеством кариоцитов и содержанием гептан-растворимых диеновых конъюгатов (118=0,567;Р=0,031) и обратная корреляционная зависимость между количеством лимфоцитов в органе и содержании изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов (К8=-0,612;Р=0,027). В тимусе, также как и в селезёнке, наблюдалась положительная корреляция между содержанием карбонилированных белков и количеством кариоцитов (1^=0,567; Р=0,031). Данные корреляционные зависимости обнаружены и при трёхсуточной гипокинезии, когда наблюдались гипоплазия тимуса и селезёнки и угнетение грануло-моноцитопоэза в костном мозге.

Таким образом через 120 часов после завершения ГК1 и ГКЗ наблюдается:

A. Ограничение окислительной модификации белков при одновременном усилении антиоксидантной защиты в тимусе, селезенке и костном мозге.

B. Через 120 часов после завершения ГКЗ уровень свободно-радикального окисления во всех исследованных органах ниже, чем через 120 часов после завершения ГК1.

В связи с тем, что изменения клеточного состава органов кроветворения и иммуногенеза в условиях стресса могут иметь ГКС - зависимый характер, можно предположить, что наблюдаемые изменения липопероксидации и карбонилирования белков отражают особенности свободно-радикального окисления клеток, устойчивых к проапоптогенному действию ГКС. Для проверки этого предположения исследовано влияние предварительной гипокинезии на изменения клеточного состава и свободно-радикального окисления после введения экзогенного ГКС пролонгированного действия.

7. Влияние предварительной одно- и трёхсуточной гипокинезии на глюкокортикстероид - зависимые изменения клеточного состава органов кроветворения и иммуногенеза

Введение экзогенного ГКС интактным животным привело к инволюции тимуса, что проявлялось снижением количества кариоцитов в органе (табл. 5). При этом наблюдалось усиление апоптоза, и угнетение пролиферации тимоцитов (табл.5). Предварительная ГК1 привела к повышению чувствительности вилочковой железы к гипоплазирующему действию экзогенного ГКС.

Таблица 5

Влияние предварительной гннокинезнн на глюкокоргнкстсроид - зависимые изменения количества кариоинтов, уровень апоптоза и пролиферации в

тимусе

~ ------ Группы сравнения Показатели ——__ Группа 1 Контроль Гп=6) Группа 2 ГКС (п=6) Группа 3 ГК 1+ ГКС (п=6) Группа 4 ГКЗ+ГКС (п=6)

Ядросодержащне клетки тимуса (хЮ'/л) 232,5±28,4 122,65+24,43 Р,.;=П,005 84,37+9,15 Р,.,=0.047 125,78+12,46 Р„=0,02

Пик М1 стоптоз (?•(>) 6,07+ 1,24 50,71+6,5 Р,.7=0,02! 77,37+2,42 Р2.,=0,027 54,41+7,31

Пик М2 покоящиеся клетки (%) 79.09±2,36 37.44+9,6 21,19±3,51 32,91+5,8

Пик МЗ делящиеся клетки(%) 14,52+2,0 10,4+2,57 Р,.2=0,014 1,32+0,14 Р;.,=0.023 12,51 + 1,75 Р.и=0,0.и

Так, после завершения односуточной гипокинезии последующее введение ГКС (группа «ГК1+ГКС») сопровождалось более выраженным снижением кариоцитов в вилочковой железе по сравнению группой «ГКС» (табл. 5). В группе «ГК1+ГКС» по сравнению с группой «ГКС» наблюдалось снижение пролиферирующих тимоцитов при одновременном увеличении количества апоптотических клеток. Предварительное воздействие ГКЗ не повлияло на ГКС -зависимую гипоплазию тимуса. В группе «ГКЗ+ГКС» не наблюдалось статистически значимых различий с группой «ГКС» по уровню апоптотических, пролиферирующих и не делящихся тимоцитов. При этом для «ГКЗ+ГКС» характерен более высокий уровень пролиферирующих клеток по сравнению с группой «ГК1+ГКС». В группе «ГКЗ+ГКС» по сравнению с группой «ГК1+ГКС» наблюдалось более высокое содержание кариоцитов в тимусе.

Гипоплазирующее действие экзогенного ГКС также затрагивало селезёнку. Анализ спленограммы показал, что это обусловлено снижением содержания лимфоцитов в органе на 11 % (Р=0,034; п=8). Вследствие этого в селезёнке наблюдалось увеличение относительного, но не абсолютного содержания нейтрофилов на 7% (Р=0,038; п=8). Предварительное воздействие ГК1 и ГКЗ не повлияло на выраженность ГКС - зависимой гипоплазии селезёнки. Также предварительная гипокинезия пе повлияла на выраженность ГКС - зависимых изменений в спленограмме.

Введение экзогенного ГКС интактным животным не сопровождалось статистически значимым снижением количества кариоцитов костного мозга. Тем не менее, отмечено снижение содержания эритроидных клеток на 14,5% (Р=0,014; п=8). Кроме того, в костном мозге отмечено увеличение содержание лимфоцитов на 50% (Р=0,018; п=8), что хорошо согласуется с представлениями о глюкортикоид - зависимом характере «лимфоидного пика» в органе (Дыгай A.M., Шахов В.П.,1989). Предварительная ГК1 привела к снижению количества кариоцитов в органе по сравнению с животными, получавшими экзогенный ГКС

без предварительного стрессирования на 21% (Р=0,023; п=8). Анализ миелограммы показал, что механизм гипоплазируюшего действия односуточной гипокинезии связан с предупреждением развития ГКС - зависимого «лимфоидного» пика. Но при этом у предварительно стрессированных животных ограничивается эритропоэз-супрессирующее действие ГКС. Предварительная ГКЗ также предупреждала развитие ГКС - зависимого «лимфоидного пика» и ограничивала ГКС - зависимую супрессию эритропоэза в костном мозге. При этом в группе «ГКЗ+ГКС» по сравнению с группой «ГК1+ГКС» увеличивалось содержание лимфоидных клеток в костном мозге на 6,4% (Р=0,016; п=8).

Введение экзогенного ГКС интактньш животным не сопровождалось изменением уровня циркулирующих лейкоцитов. При этом отмечалось пятикратное снижение количества циркулирующих лимфоцитов (Р=0,001; п=8), при десятикратном приросте количества циркулирующих нейтрофилов (Р=0,007; п=8). Предварительное воздействие ГК1 привело к двукратному снижению количества циркулирующих нейтрофилов (Р=0,009; п=8) за счёт снижения уровня сегментоядерных форм (Р=0,014; п=8). В группе «ГКЗ+ГКС» не наблюдалось статистически значимых различий по количеству лейкоцитов и по значению показателей лейкоцитарной формулы по сравнению с группой «ГКС». Тем не менее, в группе «ГКЗ+ГКС» по сравнению с группой «ГК1+ГКС» отмечен более высокий уровень циркулирующих лейкоцитов (Р=0,041; п=8), обусловленный более высоким содержанием циркулирующих нейтрофилов(Р=0,031; п=8), которое в свою очередь связано с приростом сегментоядерных форм(Р=0,024; п=8).

Таким образом, при введении экзогенного ГКС после завершения ГК1 и ГКЗ наблюдается:

A. Повышение чувствительности вилочковой железы к гипоплазирующему действию экзогенного ГКС после завершения ГК1.

B. Отсутствие изменений чувствительности вилочковой железы к гипоплазирующему действию экзогенного ГКС после завершения ГКЗ.

C. Отсутствие изменений чувствительности селезенки к гипоплазирующему действию экзогенного ГКС.

О. Предупреждение формирования ГКС - зависимого «лимфоидного» пика в костном мозге.

8. Влияние предварительной одно- и трёхсуточной гипокинезии на глюкокортикоид-зависимые изменения свободно-радикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза

Введение экзогенного ГКС привело к снижению содержания карбонилированных белков, а также изопропанол-растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов в тимусе (табл.6).

Предварительная гипокинезия модифицировала изменения свободно-радикального окисления в тимусе, вызванные экзогенным ГКС. В группе «ГК1+ГКС» по сравнению с группой «ГКС» наблюдался более высокий уровень

карбонилированных белков (Р=0,034). В связи с этим необходимо отметить наличие в этой группе отрицательной корреляции между содержанием карбонилированных белков и количеством тимоцнтов (Я5=-0,727; Р=0,014). Не исключено, что в данном случае увеличение содержания карбонилированных белков связано с усугублением ГКС - зависимого угнетения пролиферации с последующим вступлением клеток в апоптоз. Напротив, в группе «ГКЗ+ГКС» по сравнению с группой «ГКС» снижено содержание карбонилированных белков (Р=0,026). В данном случае между содержанием карбонилированных белков и количеством кариоцитов наблюдается прямая корреляция (Я5=0,645;Р=0,022). При этом содержание карбонилированных белков в группе «ГКЗ+ГКС» ниже чем в группе «ГК1+ГКС» (Р=0,035).

При введении экзогенного ГКС в селезёнке снижался уровень карбонилированных белков и гептан-растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов. Аналогичная ситуация наблюдалась после завершения одно- и трёхсуточной гипокинезии и является дополнительным аргументом в пользу того, что изменения липопероксидации, наблюдаемые при гипокинетическом стрессе, имеют ГКС- зависимый характер.

Предварительная гипокинезия модифицировала вызванные экзогенным ГКС изменениями уровня свободно-радикального окисления в селезенке. Так в группах «ГК1+ГКС» и «ГКЗ+ГКС» по сравнению с группой «ГКС» отмечено снижение содержания карбонилированных белков. Причём наиболее низкий уровень карбонилированных белков наблюдался в группе «ГК1+ГКС».

В то же время, введение экзогенного ГКС после гипокинезии привело к повышению содержания гептан-растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов. При этом в группе «ГК1+ГКС» обнаружена прямая корреляционная зависимость между содержанием гептан-растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов и количеством кариоцитов в селезёнке (1^=0,673;Р=0,019). Кроме того, в группе «ГКЗ+ГКС» обнаружена положительная корреляционная связь между содержанием этой же категории продуктов ПОЛ и количеством кариоцитов в органе (1^=0,605; Р=0,031), а также обратная корреляция между количеством кариоцитов и содержанием изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов (Я5= -0,711; Р=0,014). Так как данные изменения содержания молекулярных продуктов липопероксидации противоположны изменениям характерным для группы «ГКС» можно предположить, что они отражают десенситизацшо селезёнки к действию экзогенного ГКС.

В костном мозге введение экзогенного ГКС привело к снижению содержания карбонилированных белков. Предварительная гипокинезия модифицировала вызванные экзогенным ГКС изменениями уровня свободно-радикального окисления в костном мозге. В группах «ГК1+ГКС» и «ГКЗ+ГКС» по сравнению с группой «ГКС» наблюдался более высокий уровень карбонилированных белков. Важно отметить, что в группе «ГК1+ГКС» эта

тенденция более выражена по сравнению с группой «ГКЗ+ГКС» и по сравнению с контрольными животными.

Таблица 6

Влияние предварительной гипокинезии на глюкокортикстероид -зависимые изменения свободно-радикального окисления в органах _кроветворения и иммуногенеза __

" —-—^__ Группы сравнения Показатели ~—__ Группа 1 Контроль (п=8) Группа 2 ГКС (п=8) Группа 3 ГК 1+ ГКС (п=8) Группа 4 ГКЗ+ГКС (п=8)

ТИМУС

Окислительная модификация белка мкмоль/г белка 1,46*0,18 0,51±0,048 Р,.,=0.009 1,22±0,097 0,79±0,057

Кетодиены и сопряжённые триены изопропаиолышя фаза, е.о.и. 0,27±0,021 0,196±0,008 0,135±0,013 0,127*0,011

СЕЛЕЗЕНКА

Окислительная модификация белка мкмоль/г белка 9,32±0,78 3,87±0,025 Р,..1=0,007 1,98±0,21 Р1.з=0,012 Р!.з=0,031 3,12±0,271 Рц=0,023

Кетодиены и сопряжённые триены гептаповая фаза, е.о.и. 0,3 41 ±0,06 0,162±0,045 Р,.2=0,009 0,64±0,0175 Р,,з=0,006 Рг.,=0,045 0,591-0,116 Рг-4=0,013

КОСТНЫЙ мозг

Окислительная модификация белка мкиоль/мл 6,1б±0,59 4,21 ±0,32 Р,.:=0,033 8,05±0,63 Р,.,=0.021 7,05±0,46 Ри=0,017

Причём только в группе ГК1+ГКС наблюдалась обратная корреляция между содержанием карбонилированных белков и содержанием кариоцитов (Я5= -0,815;Р=0,009), а также между содержанием карбонилированных белков и количеством лимфоцитов в костном мозге -0,724; Р=0,011). Данные

корреляционные зависимости могут отражать роль дополнительного усиления карбонилирования белков в потенцировании гипоплазирующего действия экзогенного ГКС в костном мозге.

При обсуждении полученных результатов следует учесть, что исследованные временные промежутки гипокинетического стресса характеризуются повышенным уровнем кортикостерона (Тимофеева Т.Г.,2012) и нарушением регуляции гипоталамо-пшофизарно-адренокортикальной системы по механизму «длинной петли отрицательной обратной связи» (Стрельников И.В., 2013).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что гипоплазия тимуса и селезёнки непосредственно после завершения гипокинетического стресса сопряжена с повышенным уровнем карбонилированных белков. При этом показатели липоперокендацни увеличивались только через сутки после завершения гипокинетического стресса. Поэтому в условиях гипокинетического стресса, среди показателей свободно-радикалыюго окисления в качестве биохимических маркёров действия ГКС мы склонны рассматривать

20

карбоншшровагшые белки. С этим согласуются данные о способности ГКС активировать протеолиз в органах кроветворения и иммуногенеза (Горизонтов П.Д.,1976). Известно, что карбонилирование белков является одной из составляющих убиквотин-зависнмого протеолиза (Tsvetkov Т., 2007). Таким образом, процесс карбонилирования белков в вилочковой железе, костном мозге и селезёнке можно рассматривать в качестве биохимического маркёра чувствительности к глюкокортикоидам.

Однако, отсроченные эффекты гипокинетического стресса (120 часов после завершения воздействия) проявлялись в гипоплазии органов кроветворения и иммуногенеза на фоне снижения содержания в них карбоиилнрованных белков и органо-специфичным изменением уровня липопероксидащш. Так в тимусе и костном мозге наблюдалось снижение как гептан-растворимых, так и изопропанол-растворимых продуктов ПОЛ, а в селезёнке на фоне снижения содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ повышалось содержание изопропанол-растворимых кетодиеиов и сопряженных триенов. Это может быть обусловлено ГКС-зависимым угнетением активности фосфолипазы Л;, которая осуществляет транслокацию ацильных радикалов из фосфолипидного бислоя мембран, которое осуществляется путем ГКС- зависимого усиления синтеза липокортина (Тепперман Дж., Тепперман X., 1989).

В связи с изложенным, уместно обратить внимание на то, что после введение экзогенного ГКС в селезёнке наблюдалось аналогичное снижение содержания гептан-растворимых и увеличение содержания изопропанол-растворимых продуктов ПОЛ. Кроме того, после введения экзогенного ГКС, также как и в более отдалённые периоды после завершения гипокинетического стресса, наблюдалось снижение карбонилирования белков на фоне снижения содержания кариоцитов в тимусе и селезёнке и угнетения эритропоэза в костном мозге.

Известно, что в органах кроветворения и иммуногенеза карноциты характеризуются различной чувствительностью к проапоптогенному действию ГКС. Влияние экзогенного ГКС с пролонгированным действием на органы кроветворения и иммуногенеза может привести к элиминации ГКС-чувствительпых клеток. В настоящее время показано, что в тимусе, селезёнке и костном мозге клетки с низкой чувствительностью к проапоптогенному действию ГКС обладают высоким уровнем антиоксидаитной защиты (Лузикова Е.М., 2008; Li Y.F., 2012; Sato Y.,2010). Поэтому мы склонны считать, что наблюдаемые прн гипокинетическом стрессе и введении экзогенного ГКС изменения уровня липопероксидации и карбонилирования белков отражают «фенотип» свободно-радикального окисления клеток, устойчивых к апоптогениому действию ГКС (рис.3).

Рисунок 3

Глюкокортикоид-зависимые механизмы изменений клеточного состава и свободно-радикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза

ГИПОКИНЕТИЧЕСКИМ СТРЕСС

Активация ГГАС | глюкокортикостероидов

х ш о ш

м сп

ГЧ> О

X ш о о го

Органы кроветворения и иммуногенеза | Свободно-радикального окисления —> | Окислительной модификации белка -

| протеолиза

Элиминация ГКС-чувствительных клеток

АКТИВАЦИЯ апоптоза

ГИПОПЛАЗИЯ ОРГАНОВ КРОВЕТВОРЕНИЯ И

ИММУНОГЕНЕЗА

Увеличение относительного количества ГКС - резистентных клеток с высоким уровнем АОЗ

Ф Свободно -радикального окисления

СНИЖЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

к действию ГНС

выводы

1.Действие гипокинетического стресса на органы кроветворения и иммуногенеза проявляется гипоплазией органов кроветворения и иммуногенеза. Выраженность гипоплазии тимуса, селезёнки и костного мозга в течении первых суток после завершения гипокинетического стресса не зависит от его продолжительности.

2. В органах кроветворения и иммуногенеза отдалённые последствия гипокинетического стресса, регистрируемые через 120 часов после его завершения, определяются его продолжительностью. После завершения односуточного гипокинетического стресса в костном мозге наблюдалось повышение содержания миелокариоцнтов вследствие усиления эритропоэза и грануло-моноцитопоэза. После завершения трёхсуточной гипокинезии не наблюдалось увеличения количества мнелонуклеаров, вследствие угнетения грануло-моноцитопоэза на фоне повышенного содержания клеток-предшественниц эритроидного ряда. В тимусе по мере пролонгирования гипокинетического стресса увеличивается выраженность гипоплазии органа.

3. Предварительное воздействие односуточной гипокинезии усиливает вызванную экзогенным глюкокортикостероидом гипоплазию вилочковой железы за счёт дополнительной активации апоптоза и ингибирования пролиферации. После односуточной гипокинезии усугубляется выраженность глюкокортикостероид-индуцнрованной гипоплазии костного мозга за счёт снижения содержания лимфоцитов в органе.

4. Увеличение продолжительности гипокинетического стресса до трёх суток купирует вызванное острим гипокинетическим стрессом повышение чувствительности органов кроветворения и иммуногенеза к экзогенному глюкокортикостероиду в вилочковой железе на фоне более высокого уровня пролнферирующих клеток в тимусе и более высокого содержания лимфоцитов в костном мозге.

5. В течение первых 24 часов после завершения одно- и трёхсуточной гипокинезии гипоплазия тимуса, костного мозга и селезёнки сопровождается увеличением содержания карбонилированных белков при одновременном увеличении содержания гептан-растворимых кетодиенов и сопряжённых трненов. Через 120 часов после завершения одно- и трёхсуточной гипокинезии инволюция вилочковой железы и селезёнки ассоциируется со снижением в них уровня липопероксидации и окислительной деструкции белков.

6. При сочетании односуточной гипокинезии и воздействия экзогенного глюкокортикостероида усиливается карбонгснгрование белков в костном мозге и в тимусе по сравнению с животными, получавшими экзогенный глюкокортикостероид без предварительного стрессирования. В селезёнке, напротив, наблюдалось снижение содержания карбонилированных белков, а также нзопропанол - растворимых молекулярных продуктов ПОЛ, на фоне повышения содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ. На фоне предварительной трёхсуточной гипокинезии в тимусе, костном мозге и селезёнке снижается содержание карбонилированных белков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Стрельникова, J1.A. Влияние триамцннолона ацетоннда на окислительную модификацию белков в органах системы крови / Л.А. Стрельникова // «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» Материалы Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. Челябинск. - 2009. - С. 54-56.

2. Цейлнкман, В.Э. Иммуносупрессивное действие гипокинетического стресса и сенситизация вилочковой железы к глюкокортикоидам / В.Э. Цейлнкман, Т.А. Филимонова, С.В.Сибиряк, Л.А. Стрельникова, Д.А. Козочкин, А.И. Синнцкий // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова .-20П.Т.97.-№5.-С.532-537.

3. Синицкий А.И., Свободно-радикальное окисление в тимусе, селезенке и костном мозге при гипокинетическом стрессе / Синицкий А.И., Тимофеева Т.Г., Филимонова Т.А., Романов Д.А., Стрельникова JI.A // Вестник Уральской медицинской академической иауки.-2011.- №2 /1 (35) Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии - С. 6768.

4. Козочкин, Д.А. Соотношение между лнпопероксидацией и окислением белков в крови и головном мозге в динамике тридцатисуточной гипокинезии / А.И.Синицкий, Д.Л.Романов, Тимофеева Т.Г., Л.Л. Стрельников И.В. Стрельникова Л.А., Филимонова Т.Д., Цейлнкман В.Э. // Омский научный вестник. Серия. Ресурсы земли. Человек. 2011 №1(104).-С. 102-104.

5. Козочкин, Д.А. Повышение чувствительности вилочковой железы к глюкокортикоидам и панкреопротекгорное действие предварительной тридцатисуточной гипокинезии в условиях продиабетогениого действия аллоксана / Д.А. Козочкин, Д.А. Романов, Л.А. Стрельникова, И.В. Стрельников, Т.Л. Филимонова, Л.Ф. Чарная, К.В. Маляр // Вестник Уральской медицинской академической науки 2011 №2/1 (35) Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. - С. 37-38.

6. Стрельникова, Л.А. Влияние однодневной гипокинезии на показатели дексаметазонового теста, уровень апоптоза, окислительного стресса и чувствительность вилочковой железы к гипоплазирутощему действию г.иококортикоидов/ Л.А. Стрельникова., И.В. Стрельников, Н. Н., Курчатова, М. В. Осиков, Д. А. Козочкии, А. И. Синнцкий, В. Э. Цейлнкман, О. Б. Цейлнкман // Российский иммунологический журнал.-2012.-т.6(14). - №3(1).-С.143-145.

Список использованных сокращений:

ГК1(3) - одно- и трехсуточная гипокинезия

ГКС - глюкокортикостероид

ПОЛ - перекисное окисление липидов

Работа проведена в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы, Соглашение N«8275 от 23.10.2012 (НОЦ " Проблемы фундаментальной и клинической медицины ").

На правах рукописи

СТРЕЛЬНИКОВА Лилия Алексеевна

Изменения клеточного состава и свободно-радикального окисления в органах кроветворения и иммуногенеза при введении экзогенного глюкокортикостероида на фоне гипокинетического стресса

14.03.03- патологическая физиология 03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2013

Подписано в печать 21.03.2013 г. Отпечатано в типографии ООО фпрма "Прессто" 22.03.2013 г. Формат 60*84 1/16. Гарнитура Times New Roman Су г. Бумага офсетная. Лазерная печать. Объем 1,63 усл. пл. Тираж 100 экз.