Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патогенетическое обоснование коррекции нарушений в эритроидном звене системы крови при экзоинтоксикациях и стрессе с помощью арабиногалактана

На правах рукописи

ГАВРИЛОВА Ольга Владимировна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ В ЭРИТРОИДНОМ ЗВЕНЕ СИСТЕМЫ КРОВИ ПРИ ЭКЗОИНТОКСИКАЦИЯХ И СТРЕССЕ С ПОМОЩЬЮ АРАБИНОГАЛАКТАНА. (экспериментальное исследование)

14 00 16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2007

003162069

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет МЗ и СР РФ»

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Васильева Людмила Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Скворцова Раиса Григорьевна Иркутский государственный диагностический центр

доктор биологических наук

Дубровина Валентина Ивановна

Иркутский Ордена Трудового Красного Знамени Противочумный институт Ведущая организация:

ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

заседании диссертационного совета Д001.054,01 при ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН» по адресу 664003, г Иркутск, ул Тимирязева, 16

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН»

Автореферат разослан « / » оеТяИ'/г-и 2007 г

Защита состоится

в 9 часов на

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность- Эритроидное звено системы крови играет важную роль в патогенезе практически всех заболеваний, снабжая кислородом, и соответственно, энергией клетки, осуществляющие защитные реакции Хорошо известно, что недостаток кислорода приводит к гипоксии, ишемии, тканевому ацидозу, нарушению энергетического обмена, что ослабляет резистентность тканей и организма в целом к действию повреждающих факторов (НМ Новиков, 1989, Исследование системы крови в клинической практике, под ред Г И Козинца и В.А Макарова, 1997)

Установлено, что эритроидное звено чувствительно к действию эндо- и экзотоксинов (П.Д Горизонтов, 1981) Интоксикационный синдром, вызванный эндоинтоксикацией, наблюдают в клинике при различных формах соматической патологии, а также при чрезмерном или длительном воздействии стрессорных факторов, когда обнаруживаются нарушения на уровне соматических функций, и в сосудистом русле накапливаются токсичные продукты (Б В. Иоффе, 1979, ЛЕ Панин, 1983, ЕС. Цукерман, 1989, НВ Мамылина, 1995; G. Cruzan, 2004, ЕМ Caravati, 2005) Кроме того, в организм постоянно извне поступают вещества, обладающие избирательной токсичностью Среди них по механизму действия можно выделить, по меньшей мере, две группы экзотоксикантов К первой группе относятся токсины, действующие как в неизменном виде, так и после их биотрансформации (например, этиленгликоль) и вызывающие нарушение энергетических, метаболических, синтетических процессов в клетках (И К Асаулюк, 1989, Л А Кожемякин, 1991, ИВ Маркова, 1999, ЮЮ Бонитенко и соавт, 1991) Другую группу составляют токсины, действующие опосредовано, образуя, в результате взаимодействия с молекулой-мишенью, высокоактивные реагенты К ним можно отнести некоторые лекарства (фенацетин, нитроглицерин, викасол, некоторые сульфаниламиды, противомалярийные средства, анестетики) и химические вещества (фенилгидразин), образующие, в результате химических взаимодействий, сильные окислители, провоцирующие гиперактивацию процессов липопероксидации (ТЛ Корсова, 1989, А А Познанская, 1989, ТЕ Белокриницкая, 1992)

Эритроидное звено системы крови при различных интоксикациях наименее изучено (кроме интоксикаций, вызванных гемолитическими агентами) в связи с тем, что основное внимание уделяется адсорбционной и симптоматической терапии, а патогенетические принципы лечения разработаны значительно меньше Вместе с тем, важное патогенетическое значение токсических нарушений эритроцитов и эритропоэза требует их детального изучения и поиска путей коррекции В связи с этим, выяснение механизмов развития процессов повреждения и восстановления эритроидного звена системы крови при стрессе и экзогенных интоксикациях и поиск методов их коррекции представляет актуальную проблему современной медицины

В настоящее время активно развивается новое направление, основанное на использовании природных полисахаридов с медицинскими целями Существенный интерес представляет изучение биологических эффектов арабиногалактана,

з

полученного из лиственницы сибирской Из единичных работ известно, что арабиногалактан стимулирует фагоцитарную систему, иммуногенез, ограничивает гемолиз эритроцитов и обладает гемопротекторным действием (E.H. Медведева, 2003; ИМ Борисов, 2002; В.И Дубровина, 1999, 2001, 2004; Т.Д. Четверикова, 2003). Это дает основание апробировать арабиногалактан для коррекции нарушений эритроцитарного звена, развивающихся в условиях стресса и интоксикаций, вызванных агентами различной природы

Цель работы

Выявление нарушений эритроидиого звена системы крови, вызванных иммобилизационным стрессом, интоксикацией фенилгидразином и этиленгликолем, и патогенетическое обоснование их коррекции с помощью арабиногалактана

Задачи:

1) Исследование влияния иммобилизационного стресса на состояние эритроцитов периферической крови, эритропоэза и структуры красной пульпы селезенки.

2) Изучение реакции красной крови, эритроидиого ростка и красной пульпы

селезенки в динамике интоксикации этиленгликолем

3) Исследование закономерных изменений показателей красной крови, эритрона и структуры красной пульпы селезенки в динамике фенилгидразиновой гемолитической анемии

4) Выявление корригирующих эффектов арабиногалактана при нарушениях в

эритроидном звене системы крови, вызванных иммобилизационным стрессом и интоксикацией фенилгидразином и этиленгликолем

Научная новизна

В эксперименте на крысах установлено, что общими закономерностями нарушений эритроидиого звена системы крови, индуцированных иммобилизационным стрессом и интоксикацией фенилгидразином и этиленгликолем, являются развитие эритропении, снижение осмотической резистентости эритроцитов и нарушение эритропоэза

Доказано, что при экзоинтоксикациях специфические особенности реакции эритроидиого звена заключаются в перестройке эритропоэза на гетеробластический путь и истощении эритроидиого ростка на фоне торможения пролиферации клеток эритрона при фенилгидразиновой анемии и прогрессирующего угнетения созревания эритроцитов при интоксикации этиленгликолем Особенностью нарушений эритроидиого звена при иммобилизационном стрессе является десятикратное снижение осмотической резистентности эритроцитов и кратковременная депрессия эритропоэза

Приоритетными являются данные о эритропротекторном и эритропоэтическом действии арабиногалактана, который при стрессе и зкзоиктоксигсациях повышает осмотическую устойчивость эритроцитов, уменьшает гемолиз и нарушения

эритропоэза, предупреждает истощение эритроидного ростка под действием фенилгидразина и этиленгликоля.

Теоретическая и практическая значимость

Доказано что, ключевым звеном развития эритропении при иммобилизационном стрессе является снижение осмотической резистентости эритроцитов, а при интоксикациях фенилгидразином и этиленгликолем, наряду с этим, важное значение имеет угнетение эритропоэза с последующим истощением эритроидного ростка

Установлено, что нарушения в эритроидном звене системы крови, вызванные этиленгликолем и его метаболитами, имеют прогрессирующий характер и могут составлять одно из звеньев патогенеза этиленгликолевой интоксикации Выявленный при отравлении этиленгликолем гиперретикулоцитоз может служить диагностическим и прогностическим критерием

На основании полученных данных патогенетически обоснована коррекция нарушений в эритроидном звене системы крови, вызванных иммобилизационным стрессом и экзотоксинами, с помощью арабиногалактана

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Снижение осмотической резистентности эритроцитов при иммобилизационном стрессе является ключевым звеном патогенеза эритропении, при действии фенилгидразина эти сдвиги сочетаются с угнетением пролиферации клеток эритропоэза и истощением эритроидного ростка, а при интоксикации этиленгликолем происходит прогрессирующее истощение бластных форм эритрона и нарушение созревания эритроцитов, что проявляется гиперретикулоцитозом

2 Введение арабиногалактана повышает осмотическую устойчивость эритроцитов, уменьшает нарушения эритропоэза, нормализует костномозговой резерв эритроцитов, предупреждает истощение бластных форм под действием экзотоксинов, что обусловливает уменьшение выраженности эритропени

Апробация основных положений работы

Результаты исследований опубликованы в 8 работах, 3 из них в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, и доложены на заочной электронной конференции «Современные проблемы науки и образования» (Москва, 2004), Всероссийском конгрессе «Человек и здоровье» (Иркутск, 2004), VII конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация» (Красноярск, 2005), на расширенном заседании кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ИГМУ, на заседании проблемной комиссии ИГМУ «Морфология, физиология и общая патология» 11 сентября 2007г

Структура и объём работы

Диссертация состоит из 184 страниц, введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, описания собственных результатов, обсуждения результатов, выводов, указателя литературы и приложения Полученные результаты представлены в 9 таблицах приложения и иллюстрированы 109 рисунками (рисунки, графики, микрофотографии) Библиография включает 218 источников, из них 58 иностранных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты выполнены на 380 половозрелых белых крысах-самцах (масса 170200 г) в осенне-зимний период Животные содержались в стандартных условиях вивария, на полнорационной сбалансированной диете для лабораторных животных (ГОСТ Р 50258-92) Экспериментальные исследования проводились согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000 3-96 и 51000 4-96)

В соответствии с поставленными задачами, 10 животных оставались интактными (1 группа), остальным создавали модель патологического состояния -гемолитическую фенилгидразиновую анемию (216 крыс), острую интоксикацию этиленгликолем (84 крысы) или иммобилизационный стресс (70 крыс) Половина подопытных животных получала инъекции арабиногалактана (АГ) в различных режимах Животным, не получавшим АГ, в соответствующие сроки инъецировали физиологический раствор (1 мл в/м)

Известно, что АГ в дозе 200 мг/кг понижает интенсивность процессов ПОЛ, стабилизирует мембраны эритроцитов при гемолитической анемии (Т.Д Четверикова, 2003, И М Красникова, 1999, А О Лойт, 1996), поэтому АГ вводился в дозе 200 мг/кг в/м

Модель гемолитической анемии и сроки наблюдения

Гемолитическую анемию моделировали путем двукратного внутримышечного введения солянокислого фенилгидразина (ФГ) в суточной дозе 35 мг/кг массы тела (ТЕ Белокриницкая и др, 1992) Токсическое действие ФГ проявляется внутрисосудистым гемолизом (Phenilhydrazine, 2002) Пик анемии развивается к пятым суткам после начала введения ФГ Животным 2-ой (а, б, в) группы, кроме фенилгидразина, вводили физиологический раствор, животным 3, 4, 5 групп, вводили АГ 3-ей группе - двукратно, одновременно с инъекциями ФГ, для изучения возможного профилактического действия АГ, 4-ой группе - однократно, через 6 часов после пика анемии (5 сутки интоксикации), для изучения терапевтического действия АГ, 5-ой группе - пятикратно, начиная со второй инъекции ФГ и далее ежедневно, для изучения пролонгированного действия АГ Материал для исследования брали в пик анемии, а затем, через 1, 3, 5, 15 суток после него

Модель острой интоксикации этиленгликолем и сроки наблюдения

Острую интоксикацию этиленгликолем (ЭГ) моделировали путем одноразового введения ЭГ в виде 60% водного раствора в желудок через зонд в дозе 8 г/кг Доза ЭГ выбиралась экспериментально. По данным литературы, полулетальная доза ЛД50 составляет от 6,6 г/кг до 11 г/кг (Ю Ю Бонитенко, 1990, ЦИ. Коркач, 1990; Б.Ф. Почебыт, 1975, L Schladt, 1998) При используемой дозе 8 г/кг клинические проявления интоксикации соответствовали описанным в литературе При попадании внутрь ЭГ действует как сосудистый и протоплазмагический яд, вызывающий отек, набухание и некроз клеток и тканей (К Л. Коноплицкая, 1993; Л И Петрова, 1976, Ю А Тарасов, 1992, A Sydor, 1996) Животным 6-ой группы, кроме введения ЭГ, инъецировали физиологический раствор, животным 7-ой группы через 6 часов после интоксикации вводили АГ однократно Животных выводили из эксперимента, в соответствии с описанием клинической картины отравления, через 1. 3, 5, 15 суток после введения ЭГ

Модель иммобилизационного стресса и сроки наблюдения

Иммобилизационный стресс моделировали по Н Selye (1936) путем иммобилизации ненаркотизированных крыс на спине в течение 6 часов однократно При этой модели стресса стадия тревоги продолжается 36-39 часов, в течение которых развивается максимальная вторичная альтерация органов и тканей (В В Малышев, 1985, В А Петрова, 1985, О М Ощепкова, 1995) После 39 часов развивается стадия резистентности, во время которой постепенно восстанавливается гомеостаз и нормализуется структурно-функциональное состояние органов Животные 8-ой группы после иммобилизации получали инъекцию физиологического раствора, животные 9-ой группы через 6 часов после иммобилизации получали АГ однократно Животных выводили из эксперимента через 39 часов (момент перехода стадии тревоги в стадию резистентности), 4, 5 и 7 суток после окончания иммобилизации (стадия резистентности)

Материал для исследования

В указанные выше сроки брали периферическую кровь из хвостовой вены, затем крыс декапитировали, извлекали бедренную кость (для изготовления мазка красного костного мозга) и селезенку Исследовали периферическую кровь (как эффекторное звено эритроидной системы), красный костный мозг (как центральный орган кроветворения), селезенку (как основной орган разрушения эритроцитов)

Лабораторные методы исследования

В периферической крови определяли количество эритроцитов в 1 мкл Подсчет клеток проводили в камере Горяева (Е А Кост, 1975)

По методу Яновского определяли осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ) в гипотоническом растворе 0,5% хлорида натрия По результатам подсчета в камере Горяева вычислялся процент устойчивых (сохранившихся) эритроцитов по отношению к общему количеству их в 1 л крови (Е А Кост, 1975)

Количество гемоглобина определяли на спектрофотометре по набору «Гемоглобин - Агат» Принцип метода основан на том, что гемоглобин крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетонциангидрином цианметгемоглобин, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и измеряется при длине волны 540 нм (Клиническая биохимия)

Цитологические методы исследования.

Мазки крови и костного мозга окрашивали по Паппенгейму (Е А Кост, 1975) В мазках крови дифференцировали и подсчитывали количество микроцитов, нормоцитов и макроцитов (на 100 эритроцитов), в мазках костного мозга подсчитывали миелограмму (на 1000 клеток) Высчитывали индексы пролиферации (ИП) и созревания (ИС) клеток эритропоэза по формулам РШ=[(ПроЭр*0+БН*1+ПН*2)/'(ПроЭр+БН+ПН)]*£,

ИС=[(ПН*0+ОН*1+Эр*2)/(ПН+ОН+Эр)]*2, где ПроЭр - количество проэритробластов, БЫ - количество базофильных нормобластов, ПН - количество полихроматофильных нормобластов, ОН - количество оксифильных нормобластов, Эр - количество зрелых эритроцитов в костном мозге, X - сумма всех клеток эритроидного ряда (О А Макарова, 2003)

В мазках крови, окрашенных азуром-П по методу Г А Алексеева, подсчитывали ретикулоциты (Е А Кост, 1975)

Морфологические, i истохимические и морфометрические методы.

Ткань селезенки фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин Срезы толщиной 7 мкм окрашивали следующими методами

1) гематоксилин-эозином для морфометрических исследований,

2) выявление кислой фосфатазы по методу Гомори для регистрации активных макрофагов (О В Волкова, 1971),

3) выявление гемосидерина берлинской лазурью по Перлсу (О А Меркулов, 1969)

Морфометрию срезов проводили на световом микроскопе МБИ-15 с применением окулярной сетки по Г Г Автандилову (1990) В селезенке определяли объемную долю красной пульпы, эритроцитов в ней, гемосидерина и активных макрофагов

Методы статистической обработки.

Полученные цифровые данные обработаны статистически с использованием пакета программ «Excel» и «Statistica-б» Для оценки результатов исследования использовали t-критерий Стьюдента и коэффициент корреляции Пирсона (Э Ллойд, 1980, В А Медик, 2000) Отличия считались статистически значимыми при р<0,05 и коэффициенте корреляции больше 0,5

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В настоящем исследовании на первом этапе изучалась реакция эритроидного звена системы крови при трех различных по этиологии и механизму действия патологических состояниях: 1 - при отравлении гемолитическим ядом фенилгидразином, 2 - при интоксикации негемолитическим ядом этиленгликолем, 3 - при иммобилизационном стрессе. На втором этане исследования была изучена возможность коррекции выявленных нарушений в эритроидном звене с помощью введения арабиногалактана.

Полученные данные показали, что у животных всех групп развивалась эритропения, но ее выраженность и динамика были различными В ранние сроки наблюдения (при ФГ-интоксикации - 1 сутки после пика анемии, при ЭГ - 1 сутки после отравления, при стрессе - 39 часов после иммобилизации) наиболее глубокая эритропения развивалась при интоксикации ФГ количество эритроцитов снижалось на 47% (рис. 1). в соответствии с этим уменьшалось на 60% и количество гемоглобина (рис 2) Несколько менее выражена была эритропения при иммобилизационном стрессе количество эритроцитов снизилось на 35% при неизмененном количестве гемоглобина При отравлении ЭГ эритропения была незначительной количество эритроцитов снизилось на 17% при нормальном содержании гемоглобина Таким образом, негемолитические агенты вызывают эритропению, но не нарушают синтез гемоглобина, тогда как ФГ не только вызывает гемолиз эритроцитов, но и существенно нарушает синтез гемоглобина

В качестве главных механизмов развития эритропении можно выделить снижение устойчивости мембран эритроцитов и нарушение эритропоэза Устойчивость мембран оценивалась по ОРЭ и активности разрушения эритроцитов в селезенке Полученные результаты показали, что минимальное количество осмотически устойчивых эритроцитов (рис 3) регистрируется при иммобилизационном стрессе (8%), чуть больше - при интоксикации ФГ (16%), больше всего - при интоксикации ЭГ (33%) Обнаружена высокая отрицательная корреляция ОРЭ с возникающим в крови микроцитозом (рис 4) при фенилгидразиновой анемии (г=-0,65) и при отравлении ЭГ (г=-0,85) При стрессе эта взаимосвязь приобретает обратную направленность (г=+0,72), что можно объяснить наименьшей устойчивостью мембран эритроцитов В работах многих авторов указывается на значительную активацию процессов липопероксидации под действием ФГ - в мембранах эритроцитов (Биохимия гидразинов, ред НИ Портяная, 2005, В Goldberg, 1979, H Itano, 1975, S К Jain, 1979), под действием стрессорных факторов - в мембранах различных клеток (Э M Микаелян, 1988), под действием ЭГ - в паренхиме печени (Л О Гуцол, 2006) На основании этих данных можно предположить, что ведущим механизмом снижения ОРЭ является лабилизация мембран эритроцитов при активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) Различная степень снижения ОРЭ в используемых нами экспериментальных моделях обусловлена, вероятно, специфичностью и силой воздействия агентов, вызывающих активацию ПОЛ

абс Иг/л

«да пж 1с(М9ч) Зс /С-4с) 5с (05с) 15с(С-7с)

—•—С —•—ЭГ - + -Стресс

Рис ! Количество эритроцитов в крови в динамике ФГ-анемии, интоксикации ЭГ и иммобипизационного стресса

120

ш як 1с(С39ч) Зс(&4с) 5с (05с) 16с (С-7с) —•—ФГ —»-ЭГ - Стресс

Рис 3 Осмотическая резистентность эритроцитов в крови в динамике ФГ-анемии, интоксикации ЭГ и иммобилизационного стресса

200 180 160 МО IÍJ1

i 1

1 Ti

120 100 - \--- 1 -f-

80 60

40 20 - - J

0

ИНТ ГШ -¿-W 1с(С-39ч) Зс((Мс) 5с(C-5cJ —•— ЭГ -♦-Стресс 15с (С-7с)

Рис 2 Количество гемоглобина в крови в динамике ФГ-анемии, интоксикации ЭГ и иммобилизационного стресса

Рис 4 Количество микроцитов в крови в динамике ФГ-анемии, интоксикации ЭГ и иммобилизационного стресса

В селезенке структурные характеристики красной пульпы изменялись неодинаково При ФГ-интоксикации существенно увеличивались и объемная доля красной пульпы (рис 5), и концентрация эритроцитов в ней (рис 6), что косвенно указывает на интенсификацию гемолитической функции селезенки, характерную для действия гемолитического яда (ЕМ АШетап, 1981, В Б ОогпГез!:, 1992) Это

подтверждается и возникающим в крови микроцитозом (рис. 4), который имеет высокую положительную корреляцию с концентрацией эритроцитов в красной пульпе селезенки (г=+0,83) Вероятно, эритроциты с низкорезистентной мембраной, проходя через красную пульпу селезенки, теряют участки цитоплазмы При ЭГ-интоксикации объемная доля красной пульпы не изменялась, а концентрация эритроцитов существенно уменьшалась, что можно трактовать как снижение процессов гемолиза в селезенке При иммобилизационном стрессе уменьшались и объемная доля красной пульпы, и концентрация в ней эритроцитов, что также говорит о слабом гемолизе в селезенке При обсуждении последнего факта необходимо учесть данные литературы о многочисленных очагах кровоизлияний, формирующихся при иммоболизационном стрессе во внутренних органах, особенно в легких (ВВ Малышев, 1988, ОМ Ощепкова, 1995; Л.А Украинская, 2002,) Вероятно, при иммобилизационном стрессе потеря эритроцитов из кровяного русла происходит вследствие этих кровоизлияний и внутритканевого постгеморрагического гемолиза

ИНГ п» 1с(М9ч] Зс(С-4с) 5с(С-5с) 15с(С-7с)

-♦-ФГ -*-ЭГ + Стресс

Рис 5 Объемная доля красной пульпы Рис 6 Концентрация эритроцитов в красной

селезенки в динамике ФГ-анемии пульпы селезенки в динамике ФГ-

интоксикации ЭГ и стресса анемии, интоксикации ЭГ и стресса

В красном костном мозге в ранние сроки наблюдения численность клеток эритроидного ряда при ФГ-интоксикации составляет 52,6% от их числа у интактных животных, при иммобилизационном стрессе - 71%, при ЭГ-интоксикации - 83% (рис 7) При этом костномозговой резерв зрелых эритроцитов уменьшился (по сравнению интактными животными) при ФГ-интоксикации в 2,0 раза, при иммобилизационном стрессе в 1,6 раза, при ЭГ-интоксикации в 1,8 раза

Следовательно, во всех моделях патологических состояний численность утраченных эритроцитов в крови частично восполняется за счет использования костномозгового резерва этих клеток С другой стороны, уменьшение резерва

эритроцитов в костном мозге связано и с нарушением эритропоэза При ФГ-интоксикации эритропоэз существенно угнетается, снижаются в 2 раза и пролиферация, и созревание клеток эритрона (рис. 8), часть эритроцитов образуется по гетеробластическому пути, и в кровь выходят макроциты (рис 9) При ЭГ-интоксикации пролиферация клеток эритрона не страдает, но их созревание существенно угнетается, эритропоэз идет частично по гетеробластическому пути, в кровь выходят большое количество ретикулоцитов (рис 10), макроцитов (рис. 9) и мнкроцитов (рис 4). Следует отметить, что микроцитоз при отравлении ЭГ имеет другую природу, чем при действии ФГ, не связан с гемолизом в селезенке, а обнаруживает высокую прямую корреляцию с индексом созревания клеток эритрона (г=+0,96), следовательно, обусловлен нарушением процесса созревания эритроцитов. При иммобилизационном стрессе угнетение эритропоэза выражено существенно меньше, пролиферация и дифференцировка идут относительно активно, эритроциты образуются только гомобластическим путем

Из представленных данных следует, что при ЭГ-интоксикации наименьшая выраженность эритропении обусловлена более высокой устойчивостью мембран эритроцитов, низкой гемолитической активностью селезенки, сохранением высокой пролиферативной активности клеток эритрона При этом их созревание существенно снижалось, что обусловило характерную особенность состава эритроцитов крови - выраженный анизоцитоз и повышенное содержание ретикулоцитов При иммобилизационном стрессе эритропения связана, в основном, с потерей устойчивости мембран эритроцитов, феноменом их постгеморрагического гемолиза и умеренной депрессией эритропоэза Размеры эритроцитов крови остаются в диапазоне нормы При ФГ-интоксикации анемия обусловлена торможением синтеза гемоглобина, низкой устойчивостью мембран эритроцитов, активацией гемолиза этих клеток внутри сосудов и в селезенке, существенным угнетением пролиферации и созревания клеток эритрона, сокращением костномозгового резерва зрелых эритроцитов, несмотря на частичную перестройку эритропоэза на гетеробластический путь Эритроцитарный состав крови отличается высоким содержанием и микро-, и макроцитов

В поздние сроки наблюдения (при ФГ-интоксикации — 15 сутки после пика анемии, при ЭГ — 15 сутки после отравления, при стрессе - 7 сутки после иммобилизации) происходит частичное восстановление эритроцитарной системы При интоксикации ФГ количество эритроцитов и гемоглобина нормализуется (рис 1, 2), но мембраны эритроцитов остаются низкорезистентными к осмотическому давлению (рис 3) Таким образом, даже через 2 недели проявляется мембранолабилизирующее действие фенилгидразина При отравлении ЭГ эритропения, наоборот, углубляется, количество эритроцитов составляет 70% от физиологической нормы, хотя ОРЭ незначительно увеличивается При иммобилизационном стрессе на 4 сутки наблюдения в крови возникает кратковременный микроцитоз (рис 4) Начиная с 5 суток и до конца эксперимента, развивается компенсаторный зритроцитоз, и количество эритроцитов превышает их уровень > игггактных животныл ОРЭ повышается, но не достигав нормы Количество гемоглобина снижается

Рис.7. Количественное соотношение клеток эригрошшого ряда в красном костном мозге в динамике ФГ-ане,чаиг кятшЕСккаши ЭГ и стресса

Рис.8. Индекс пролиферации (И1!) и индекс созревания (ИС) клеток эритроидного ряда в красном костном мозге в динамике ФГ-анемик, интоксикации ЭГ и стресса

Обозначении: ПроЭр - прбэритроблгеты, ВН - оазофнльные нормой ласты,

¡1Н - поли х ром атофильные нормобласты, ОН - оксифильныс нормоблас! ы. Эр - зрелые эритроциты

Рис». Количество макроцнтов в крови в динамике Ф1'-анемии, интоксикации ЭГ и стресса

Рис.10. Количество ретикулоииюв к крови в динамике ФГ-анемии. интоксикации ЭГ И стресса

ir

!

М; т 3S

И ! А

0.7 i I' \

'. V . it

0.5

м /.']■ W ■■•■■} к

15

л L . ------------—-------(

М пк fejtsp) fclCJCf 5C¡CÍC| tíc|Wt)

—ФГ -т-Сграз: —»-ЭГ

В селезенке экспериментальных животных структурные характеристики красной пульпы при ФГ-интоксикации и при стрессе нормализовались (рис 5, 6), при ЭГ-интоксикации остались на прежнем уровне, без изменений

В красном костном мозге в поздние сроки наблюдения при ФГ-интоксикации существенно увеличилась пролиферация и, особенно, созревание клеток эритрона (рис. 8), что привело к истощению бластных форм эритроидных клеток Тем не менее, депо зрелых эритроцитов восстановилось (рис 7), что обеспечило увеличение числа этих клеток в крови и нормализацию их размеров При ЭГ-интоксикации эффективность эритропоэза осталась низкой, пролиферация и, особенно, созревание клеток эритрона снизились, что привело к накоплению полихроматофильных нормобластов, снижению резерва зрелых эритроцитов, углублению эритропении, сопровождающейся анизоцитозом и ретикулоцитозом (рис 4, 9, 10). При иммобилизационном стрессе эритропоэз значительно стимулируется, пролиферация и дифференцировка клеток эритрона идут активно, возрастает количество бластных форм (кроме оксифильных нормобластов) и зрелых эритроцитов, что обеспечивает эритроцитоз, сопровождающийся макроцитозом (рис.9), связанным со стимуляцией эритропоэза

Выявленные отличия в динамике эритропении, возникающей под действием ФГ, ЭГ и стресса связаны со специфическими свойствами повреждающих агентов Известно, что ФГ после поступления в организм накапливается в эритроцитах и способствует образованию метгемоглобина и свободных радикалов кислорода, нарушающих целостность мембран и приводящих к набуханию и гемолизу эритроцитов (Биохимия гидразинов, ред НИ Портяная, 2005, В Goldberg, 1979, Н Itano, 1975, S К Jain, 1979) В литературе встречаются две точки зрения на механизм, приводящий к накоплению свободных радикалов Согласно одной из них, токсическое действие ФГ на кровь связано с торможением активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах (В Э Колла, 1976, Общая токсикология, ред Б А Курляндский, 2002) Согласно другой точке зрения, ФГ может непосредственно взаимодействовать с гемоглобином путем окислительно-восстановительных реакций (В В Овчинников, 1967, S К Jain, 1979, A Valenzuela, 1981) В Goldberg (1975, 1976) показал, что оксигемоглобин действует как пероксидаза на ФГ, окисляя его до фенилдиазина, что приводит к образованию перекисного аниона В результате разрушается гемоглобин и эритроциты Таким образом, специфичность ФГ заключается в направленном действии на мембраны эритроцитов через образование свободных перекисных радикалов в процессе взаимодействия ФГ с гемоглобином В свою очередь, эти радикалы могут оказывать различные токсические эффекты, в том числе и усиливать процессы ПОЛ (АХ Авакян, 1990; Биохимия гидразинов, ред НИ Портяная, 2005, В Goldbeig, 1979, Н Itano, 1975, SК Jam, 1979) Этот механизм действия ФГ имеет несколько последствий, которые зарегистрированы и в наших исследованиях 1) уменьшение количества гемоглобина, 2) снижение ОРЭ, 3) разрушение эритроцитов (гемолиз) Одним из специфических проявлений токсического действия ФГ является, внутрисосудистый гемолиз, а также увеличении сечезенки в 4-5 раз (Б В Иоффе, 1979, НВ Коровин, 1980, ЕС Цукерман ¡989)

В процессе фенилгидразиновой гемолитической анемии существенно нарушается эритропоэз. По данным КГ Газаряна и АС Кульминской (1975), анемизация фенилгидразином индуцирует так называемый резервный эритропоэз. Авторы отмечали истощение властных форм эритрона По нашим данным, в начальный период анемии эритропоэз угнетался, что сопровождалось подключением гетеробластического пути производства эритроцитов и через 2 недели приводило к истощению бластных форм клеток эритроидного ряда Таким образом, полученные нами результаты согласуются с данными литературы и позволяют выделить отличительные особенности фенилгидразиновой гемолитической анемии, существенное снижение гемоглобина, числа эритроцитов в крови и их осмотической резистентности, анизоцитоз, внутрисосудистый и интраспленальный гемолиз, выраженное угнетение эритропоэза и частичное переключение его на гетеробластический путь.

При ЭГ-интоксикации яд не депонируется в органах и тканях При этом отмечается, что его содержание в крови выше, чем в печени, почках, мышцах, легких и жире (ЮЮ Бонитенко, 1990) Механизм токсического действия ЭГ достаточно сложен Большая часть всосавшегося ЭГ подвергается метаболизму ЭГ и продукты его метаболизма являются осмотически активными веществами, проникают в клетки и вызывают их гидропические изменения ЭГ действует как сосудистый и протоплазматический яд, подавляет окислительные процессы, вызывает отек, набухание и некроз мелких сосудов, нарушает тканевое кровообращение (SW Frantz, 1966, ЕЮ Бонитенко, 2003, G Cruzan, 2004, Е М Caravati, 2005) Из единичных данных литературы известно, что экзогенная интоксикация ЭГ изменяет картину периферической крови, нарушает соотношение клеток миело-и эритропоэза в костном мозге (О Н Шашкова, 2000) При отравлении ЭГ поражение костного мозга носит реактивный характер (F Michot, 1987) По нашим данным, при отравлении ЭГ наблюдается медленно углубляющееся развитие нарушений эритроидного звена системы крови Эти нарушения выражаются в постепенно нарастающем торможении воспроизводства и, в большей степени, созревания клеток Эритроидного ряда, снижении костномозгового резерва зрелых эритроцитов, развитии эритропении на фоне выраженного снижения ОРЭ, устойчивого анизоцитоза и гиперретикулоцитоза Такая динамика эритропении обусловлена, вероятно, постепенным образованием токсических метаболитов ЭГ, усиливающих повреждение клеток эритроидного ростка, что приводит в конечном итоге к истощению пролиферирующего пула эритрона

При действии стрессоров многие авторы отмечают разрушение эритроцитов, изменения касаются их внутримембранных перестроек (R L Hauger, 1988, В Д Новиков, 1990) Существует мнение, что при действии экстремальных факторов происходит образование и разрушение малостойких молодых клеток, которые обусловливают феномен постгеморрагического гемолиза (Исследования системы крови, ред Г И Козинец и В И Макаров, 1997) Известно, что при длительном действии физических факторов наблюдаются уменьшение концентрации эритроцитов, их осмотической резистентности, содержания гемоглобина, снижение гематокрита (О А Макарова, 2003), глубокие изменения со стороны

структурно-функциональных комплексов костного мозга (Б В Медяник, 1994). Тем не менее, конкретный механизм регуляции кроветворения недостаточно ясен, придается значение как специфическим, так и общеадаптационным факторам регуляции гемопоэза в экстремальных условиях, которые, изменяя, в частности, состояние ПОЛ, способствуют росту пролиферативной активности клеток кроветворной ткани Известно, что продукты метаболизма катехоламинов (КА) активируют мобилизацию депонированных жиров и процессы ПОЛ (Ф 3. Меерсон, 1981, Н.А Удинцов, 1984, В А. Барабой, 1992), что составляет основу стрессорного повреждения биомембран (Ф.З Меерсон, 1981; ДН Маянский, 1989) К повреждающему действию продуктов ПОЛ присоединяются катаболичгские эффекты избыточных доз глюкокортикоиДных гормонов (ГК) (Л Е Панин, 1983, А Агшопо, 1986, В В Малышев, 1988). ГК и КА усиливают метаболическое и мембранотропное действие друг друга и в избыточной концентрации создают основу для формирования стрессорных повреждений. Важно отметить, что йзменения активности процессов ПОЛ при стрессе соответствуют по времени фазам развития стресса, причем наиболее выраженная активация процессов ПОЛ наблюдается в момент перехода стадии тревоги стресс-реакции в стадию резистентности, когда уровень продуктов ПОЛ превышает контрольный в 3,6-3,7 раза (Ф.З Меерсон, 1989, 1990, Т И Белова, Ю92)

По нашим данным, при иммобилизационном стрессе наиболее существенные нарушения в эритроидком звене наблюдаются в конце стадии тревоги я проявляются глубоким снижением ОРЭ, кратковременной эритропенией, характеризующейся нормоцитозом, и умеренной депрессией эритропоэза В соответствии с динамикой стресса, после окончания стадии тревоги эти изменения устраняются и в стадию резистентности сменяются стимуляцией эритропоэза и эритроцитозом, который полностью компенсирует потерю эритроцитов с низкой резистентностью мембраны

Таким образом, все повреждающие агенты, используемые в пашем эксперименте, активируют процессы ПОЛ, но механизмы активации различны В соответствии со степенью активации ПОЛ снижается ОРЭ Фенилгидразин и стресс вызывают гиперактивацию ПОЛ, механизмы которой описаны выше, в результате повреждения мембран продуктами ПОЛ максимально снижается ОРЭ При ЭГ-интоксикации механизмы активации ПОЛ мало изучены, хотя факт активации этих процессов в печени установлен (Л О Гуцол, 2006) Предполагается, что активация ПОЛ происходит под действием токсичных метаболитов ЭГ, которые вызывают тканевой ацидоз, индуцирующий снижение активности дыхательных ферментов и дефицит энергии, что приводит к снижению активности антиооксидантных систем и, в конечном итоге, к активации ПОЛ На основании этих данных, представляется вполне вероятной и активация ПОЛ в мембранах эритроцитов, учитывая, что их антиоксидантные системы являются ферментными (С А Сторожок, 1997) Следовательно, возможна и взаимосвязь между повреждающим действием продуктов ПОЛ и снижением ОРЭ Результатом снижения ОРЭ является увеличение разрушения эритроцитов и развитие эритропенпп или апемии (в случае действия ФГ) Из этого следует что вещества, обладающие антиоксидантными и мембранопротекторными свойствами, способны

достаточно эффективно корригировать эритропению, особенно при стрессе, когда основным механизмом развития эритропении является снижение ОРЭ При отравлении ФГ или ЭГ необходимо учитывать и их токсическое действие не только на мембраны эритроцитов, но и на клетки, эритрона и эритропоэз в целом.

Арабиногалактан, по данным литературы, обладает мембранопротекторным, антиоксидантным, иммуномодулирующим свойствами (В.И. Дубровина с соавт, 1999, Т Д. Четверикова с соавт, 2003), кроме того, он может вступать в комплексные соединения с различными веществами-, в том числе с токсинами (Л О. Гуцол, 2006), что позволяет предполагать достаточно высокую эффективность применения этого полисахарида для коррекции выявленных нарушений эритроидного звена

При анализе полученных данных мы приняли во внимание формакодинамику арабиногалактана, концентрация которого в крови, по данным МС Дудкина (1991), через 3-3,5 суток резко уменьшается Именно этот период (3-4 суток) после введения АГ мы учитывали для оценки его корригирующего влияния на эритроцитарное звено системы крови: при ФГ-интоксикации - до 3 суток после пика анемии, при ЭГ - до 3 суток после отравления, при стрессе - до 4 суток после иммобилизации При фенилгидразиновой анемии была оценена гематопротекторная эффективность трех вариантов введения АГ, а затем выбран вариант пятикратного введения, как наиболее эффективный

Введение АГ при ФГ-анемии существенно уменьшало гемоглобинемию во все сроки наблюдения, в том числе в пик анемии, при интоксикации ЭГ поддерживало нормальный уровень гемоглобина, при стрессе предупреждало снижение гемоглобина в стадию резистентности (рис 11)

При введении АГ у всех подопытных животных значительно уменьшалось снижение ОРЭ (рис 12) Вероятно, в этом эффекте проявилось антиоксидантное и мембранопротекторное действие АГ Результатом этого явилось увеличение числа эритроцитов при ФГ-анемии При ЭГ-интоксикации количество эритроцитов незначительно снижалось в 1 и 5 сутки наблюдения, несмотря на повышение ОРЭ При стрессе повышение ОРЭ существенно увеличило число эритроцитов в крови в стадию тревоги, но не оказало влияния на этот показатель в начальный период стадии резистентности (4 суток)

В селезенке при ФГ-анемии объемная доля красной пульпы под действием АГ осталась высокой, но концентрация эритроцитов в ней нормализовалась (рис 13), что указывает на уменьшение гемолитической активности селезенки При ЭГ-интоксикации объем красной пульпы не менялся, оставаясь в пределах нормы, но концентрация эритроцитов в ней снижалась в меньшей мере При стрессе введение АГ предупреждало уменьшение объемной доли красной пульпы и в 3 раза увеличивало концентрацию эритроцитов в ней в стадию тревоги, которая оказалась на 16% выше, чем у интактных животных (рис 13), что указывает на активацию гемолитической функции селезенки Это частично объясняет эритропению, возникающую на 4 сутки под действием АГ у стрессированных животных

Изменение числа микроцитов в крови подтверждает это предположение Так, при ФГ-амсмии мшсроцитоз выявлялся только в пйк анемии и слабее коррелировал с концентрацией эритоцитов в селезенке (г=+0,46) (рис 14)

абс "КГ/л

180 160 1« 120 100 80 60 40 20 0

1

Ёооио

5

5 ЦЭ г-.

ФГ ЭГ Стресс

□ ГемоглобинбезАГ цГемоглэ&и сАГ

I 1 о ю л I

ФГ ЭГ стресс

ЗЭритра^яыбез АГ ятш Эритроциты с АГ

-ОРЭбезАГ

—«. -ОРЭсАГ

Рис 11 Количество гемоглобина в крови в Рис 12 Количество эритроцитов в крови и

динамике ФГ-анемии, интоксикации ЭГ и стресса при введении АГ

их осмотическая резистентность в динамике ФГ-анемии, интоксикации ЭГ и стресса при введении АГ

70 -60 50 40 30 20 10 о

Н ^ О о о

5 С <0 Ю ^

✓Г

Л'

5 (О ' ,

100 50

90 45

80

40

70

60 35

50 30

40 25

30 20

20 15

10 10

0 5

0

ЭГ

стресс

—I Концентрация эритроцитов без АГ Ш Концентрация эритроцитов с АГ ■ - Объем лульпы без АГ —■Объём пульпы с АГ

1111^

сг

О безЛ"

ЭГ Стресс

■ САГ

Рис 13 Объемная доля красной пульпы селезенки и эритроцитов в ней в динамике ФГ-анемии интоксикации ЭГ и стресса при введении АГ

Рис 14 Количество микроцитов в крови в динамике ФГ-анемии, интоксикации ЭГ и стресса при введении АГ

При ЭГ-интоксикации выраженность микроцитоза не изменилась, и по-прежнему отсутствовала корреляция с концентрацией эритоцитов в селезенке. При стрессе микроцитоз, наблюдаемый через 4 суток, при введении АГ не выявлялся

В красном костном мозге введение АГ значительно уменьшало нарушения эритропоэза При ФГ-анемии во все сроки наблюдения существенно увеличивался резерв зрелых эритроцитов (рис 15) за счет стимуляции их созревания (рис 16), при этом макроцитоз не развивался (рис 17), но возникал компенсаторный ретикулоцитоз (рис 18)

При ЭГ-интоксикации депо зрелых эритроцитов увеличилось в 2-3 раза (рис. 15) Пролиферативная активность и созревание клеток эритрона нормализовались (рис. 16), но, несмотря на это, в крови сохраняется анизоцитоз (рис 14, 17) Ретикулоцитоз не выявляется (рис 18) При иммобилизационном стрессе введение АГ нормализует пролиферацию и созревание клеток эритрона (рис 16) и резерв зрелых эритроцитов (рис 15) Вместе с тем, во все сроки наблюдения в крови животных появляется большое количество макроцитов (рис 17), а в стадию резистентности - и ретикулоцитов (рис 18)

Проведенное сравнение полученных данных позволило выделить ряд защитных эффектов АГ, направленных на протекцию клеток эритроцитарного звена при различных типах повреждения (схема на рис 19). В частности, введение АГ во всех сериях опытов приводило к повышению ОРЭ Причем, чем сильнее был снижен этот показатель, тем больше он повышался под действием АГ При обсуждении факторов, влияющих на ОРЭ в исследованных экспериментальных моделях, подчеркивалось важное значение активации ПОЛ, которая, по данным литературы, наиболее значительна при стрессе и интоксикации ФГ (В Goldberg, 1979, Н Itano, 1975, S К Jain, 1979, ЭМ Микаелян, 2988) Именно при этих патологических состояниях было максимальным снижение ОРЭ и ее повышение при введении АГ На основании этого можно предположить реализацию в данном случае антиоксидантного эффекта АГ, что подтверждается увеличением количества эритроцитов в крови, снижением их гемолиза в селезенке и уменьшением микроцитоза при ФГ-анемии, а также устранением эритопении в стадию тревоги и микроцитоза в стадию резистентности при стрессе

При ЭГ-интоксикации ОРЭ тоже повышалась под действием АГ, но на 5 сутки была снижена Кроме того, в этих условиях в 1 и 5 сутки выявлялась эритропения, а микроцитоз сохранялся во все сроки наблюдения По данным литературы (Е Ю Бонитенко, 2003, ЕМ. Caravati, 2005), 1 сутки характеризуются максимальным действием неизмененных молекул ЭГ, а на 5 сутки к нему присоединяется действие высокотоксичных метаболитов ЭГ, что приводит к наибольшему токсическому повреждению и, по-видимому, обусловливает снижение числа эритроцитов в эти сроки и ОРЭ на 5 сутки Таким образом, антиоксидантное действие АГ оказывается в данной ситуации малоэффективным Вероятно, АГ не способен ограничить осмотическое действие ЭГ и метаболический ацидоз, вызываемый продуктами трансформации ЭГ

ПИК 1с Зс 5С 15с АГ

КЗ 1000 кл , 700

есо

500

4эо зоо 200 1О0

инт пик 1с Зе 5 с 15с

Фсниягидпазин

ил 10ОО кл.г

Стресс

¡>ис.!5 Количественное соотношение кдетёр эритроидного ряда в красном костном мозгё н динамике Ф1 -анемии, интоксикации ЭГ и стресса при введении А1

Обозначения: НИШ проэритроб ластЩ, I-1 - базофильные .йвЬрмобдасты,

иод и хроматофил ьн ые и.орчобязс! ы. МН оксифнльные нормо&дасты. - зрелые эритроциты.

Введение АГ предупреждало снижение уровня гемоглобина в стадию резистентности стресса и повышало его при ФГ-анемии, что трудно объяснить только антиоксидантным эффектом АГ, не учитывая активность синтеза гемоглобина В условиях иммобилизационного стресса АГ, защищая эритроциты от разрушения, вероятно, способствует сохранению активности ферментов, участвующих в синтезе гемоглобина. При ФГ-анемии разрушение эритроцитов вторично и является следствием специфического связывания ФГ с оксигемоглобином и образованием метгемоглобина (Н Itano, 1975, В Goldberg, 1979, S.K Jain, 1979), поэтому уменьшение разрушения эритроцитов не может предотвратить снижение уровня гемоглобина Из этого логично следует, что АГ способен связывать ФГ, препятствуя, таким образом, его взаимодействию с гемоглобином В литературе есть достаточно много указаний на адсорбционные свойства АГ, в том числе по отношению к ФГ (С А Медведева, 2002)

>сл ед

120 100 80 60 40 20 0

Фенилгид разин

Рис 16 Индекс пролиферации (ИП) и индекс созревания (ИС) клеток эритроидного ростка в динамике ФГ-анемии, интоксикации ЭГ и стресса при введении АГ

Обозначения

-ИП -ИС

120

100

40

)сл ед

i

инг 1с Зс 5с 15

Зтленгликсуъ

инт 1с Зс 5с 15

АГ

I 30

инт 39ч 4с 5с 7с Стресс

□ без АГ

|с АГ

Рис. 17. Количество макроцитов е крови в дииамике ФГ-анемии, интоксикации '.Я' и стресса при введении АГ.

% 1 :

0.9 0.8 0,7 0,6 0,5 0.4 0.3 0,2 0,1 а

I

ш

1НГ п« 1с Зс 6с инт 39ч 4с 5с 7с

Стресс

Эс 5с Этилен Т^КОЛЬ

Рис. 18, Количество ретякулоцитов в периферической крови в динамике фенилгидразииовой гемолитической анемии, интоксикации ЭГ, пресса (| |) при введении АГ{ ).

Введение АГ во всех сериях экспериментов стимулирует эритропоэз, но в разной степени. Наибольшее патогенетическое значение активность эритропоэза имеет при ФГ-анемии, при которой через 2 недели происходит истощение клеток эритрона. Введение животным АГ приводило К стимуляции созревания и накопления в костном мозге эритроцитов, что обеспечивало частичную компенсацию анемии, хотя и вызывало ре гикулоцитоз. При этом лишь незначительно стимулировалась пролиферация нормобластон и не подключался ^тероб.п асти ч ее кий эритроиоэз (макроцитоз не выявлялся), что способствовало сохранению бластных форм клеток эритрона в костном мозге и предотвращало их

истощение При интоксикации ЭГ введение АГ нормализует темпы пролиферации и созревания клеток эритрона, а также резерв зрелых эритроцитов. При этом полностью устраняется ретикулоцитоз, но сохраняется макроцитоз, снижается количество базофильных и полихроматофильных нормобластов, что указывает на гетеробластический путь эритропоэза Аналогично действует АГ на эритропоэз при стрессе, но с преобладанием стимулирующего влияния на созревание эритроцитов, что отражается ретикулоцитозом в стадию резистентности.

Представленные данные демонстрируют закономерность чем активнее идет пролиферация клеток эритрона, тем больше в крови появляется макроцитов. Из этого следует, что АГ стимулирует пролиферацию всех бластных форм, сокращая число их делений, что и приводит к макроцитозу, но позволяет увеличить костномозговой резерв эритроцитов В совокупности результаты исследования позволяют констатировать способность АГ оказывать эритропоэтический эффект

В условиях введения АГ особого внимания заслуживает феномен эритропении, развивающейся на 4 сутки в стадию резистентности стресса и с 5 по 15 сутки интоксикации ЭГ, несмотря на высокие темпы пролиферации и дифференцировки клеток эритрона и большой костномозговой резерв эритроцитов Это может быть связано с задержкой выхода зрелых эритроцитов из костного мозга в кровь Известно, что этот процесс контролируется ретикулярными клетками стромы костного мозга, которые селективно выпускают в кровяное русло клетки крови с полностью сформированным главным комплексом гистосовместимости (МНС) (В Л Быков, 1997) По данным литературы, одним из механизмов мембранопротекторного действия АГ является способность этого полисахарида образовывать водородные связи с полярными группами углеводов гликокаликса, формируя на поверхности клеток трехмерный гидрофильно-гидрофобный сетчатый экран (О В Колбасеева, 2006), защищающий клетки от осмотически активных веществ и укрепляющий цитомембраны, что позволяет объяснить полученные нами факты Формируемый АГ экран может частично маскировать у некоторых зрелых эритроцитов отдельные белки МНС и таким образом влиять на селекцию клеток, выпускаемых из костного мозга в кровь

На основании полученных данных и данных литературы нами составлена гипотетическая схема патогенеза эритропении при стрессе и экзоинтоксикациях и корригирующего действия АГ (рис 19) Общими эффектами экзотоксикантов и стресса являются стимуляция ПОЛ, связанное с этим снижение ОРЭ, последующий гемолиз, а также угнетение эритропоэза Отличительные особенности патогенеза эритропении заключаются при ФГ-интоксикации в снижении гемоглобина, анизоцитозе и подключении гетеробластического пути эритропоэза на фоне торможения пролиферации и созревания клеток эритрона Специфической особенностью действия ЭГ является его осмотическая активность и возникновение метаболического ацидоза, что приводит к прогрессирующему угнетению созревания клеток эритрона, перестройке эритропоэза на гетеробластический путь и развитию в крови анизоцитоза и компенсаторного гиперретикулоцитоза При стрессе эритропения развивается на фоне умеренной депрессии пролиферации и созревания клеток эритрона и характеризуется нормоцитозом

Фенил гидразин

Стресс Этиленгликоль

Снижение

НЬ \

Стимуляция ПОЛ

Снижение осмотической резистентности эритроцитов

Осмотическая активность и метаболический ацидоз

Мембрано-протекторный эффект АГ

> / \

) Гемолиз

В селезенке и сосудах Постгеморрагический вне сосудов

ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АНЕМИЯ

Гемоглобинемия, анизоцитоз

Гетеробластический тип

Анти-оксидантный эффект АГ

ЭРИТРОПЕНИЯ

Анизоцитоз, ретикулоцитоз

ж-

Гетеробластический тип

Торможение ФГ пролиферации и созревания клеток

Угнетение эритропоэза

Умеренная депрессия

пролиферации и созревания при стрессе

Прогрессирующее

угнетение ЭГ созревания клеток

Стимуляция созревания

Стимуляция пролиферации, созревания и гетеробластического эритропоэза

Эритропоэтический эффект АГ

Рис 19 Гипотетическая схема патогенеза эритропении при иммобилизационном стрессе ( интоксикации фенилгидразином ( """^и этиленгликолем и

корригирующих эффектов арабиьогалактана ( ф)

При введении АГ проявляются его антиоксидантный, мембранопротекторный и эритропоэтический эффекты.

Антиоксидантное действие АГ установлено в работах А.О Лойта (1996), И.М. Красниковой (1999), ТД Четвериковой (2003) и других авторов По нашим данным, АГ существенно уменьшает снижение ОРЭ, что может быть связано с его антиоксидантным действием

Мембранопротекторный эффект АГ также способствует сохранению ОРЭ и значительно снижает гемолиз эритроцитов

Эритропоэтическое действие АГ заключается в ограничении или устранении нарушений эритропоэза и его стимуляции

Таким образом, АГ способен корригировать нарушения эритроидного звена системы крови, вызванные стрессом и интоксикации ЭГ и ФГ.

выводы

1. Фенилгидразиновая гемолитическая анемия характеризуется двукратным уменьшением гемоглобина и числа эритроцитов в крови, пятикратным снижением их осмотической резистентности, развитием анизоцитоза, увеличением интраспленального гемолиза, выраженным угнетением эритропоэза вследствие снижения в 2 раза активности пролиферации и созревания бластных форм эритрона, что завершается их истощением.

2 Отравление этиленгликолем вызывает эритропению, которая характеризуется уменьшением числа эритроцитов в 1,2 раза, трехкратным снижением их осмотической резистентности, устойчивым анизоцитозом и гиперретикулоцитозом (до 33±2,7%), выраженным угнетением эритропоэза на фоне прогрессирующего, с максимумом на 15 сутки, снижения индекса пролиферации (в 1,7 раза) и. особенно, индекса созревания клеток эритрона (в 3,5 раза), что приводит к истощению проэритробластов и накоплению полихроматофильных нормобластов

3. При иммобилизационном стрессе развивается кратковременная эритропения, характеризующаяся уменьшением числа эритроцитов в 1,5 раза, десятикратным снижением их осмотической резистентности, нормоцитозом, переходящим в микроцитоз, умеренной депрессией эритропоэза Через 5 суток эритропения сменяется компенсаторным эритроцитозом за счет активации эритропоэза с появлением на 7 сутки макроцитоза

4 Введение арабиногалактана при фенилгидразиновой анемии уменьшает гемоглобинемию и эритропению, устраняет анизоцитоз, повышает в 4 раза осмотическую устойчивость эритроцитов, снижает интраспленальный гемолиз, предупреждает истощение бластных форм эритрона и нормализует резерв зрелых эритроцитов за счет стимуляции их созревания, что сопровождается появлением компенсаторного ретикулоцитоза

5. При этиленгликолевой интоксикации введение арабиногалактана повышает в 2 раза осмотическую резистентность эритроцитов, предупреждает развитие ретикулоцитоза, нормализует пролиферативную активность и созревание клеток эритрона, способствуя сохранению резерва зрелых эритроцитов, но при этом не устраняет анизоцитоз и эритропению

6. В условиях иммобилизационного стресса введение арабиногалактана нормализует осмотическую резистентность эритроцитов, эритропоэз и резерв зрелых эритроцитов, препятствует развитию эритропении в стадию тревоги. В начальный период стадии резистентности арабиногалактан не устраняет эритропению, хотя она частично компенсируется макроцитозом и ретикулоцитозом

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Четверикова, ТД Влияние природного полисахарида арабиногалактана на динамику изменений эритропоэза и периферической красной крови при острой интоксикации этиленгликолем / Т.Д Четверикова, Л.С Васильева, Л.О Гуцол, С.А Медведева, О-В. Колбасеева, О В. Гаврилова, Е.Е Горелова // Актуальные проблемы медицины. Сб. науч. трудов. Томск, 2004, том 3. №2 - С. 290-292.

2 Четверикова, ТД Количественные и качественные изменения эритроцитов периферической крови при экспериментальной гемолитической анемии и их коррекция арабиногалактаном / Т Д Четверикова, Л.С. Васильева, Л О Гуцол, О.В Гаврилова, А А Медведников, А.Г Захаров // «Компенсаторно-присбособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» мат Всерос. научно-практич. конф Новосибирск,2004 -С 421-423

3. Гаврилова, О В Эритроцитопротекторный эффект арабиногалактана при экспериментальной гемолитической анемии / О.В Гаврилова, Т Д. Четверикова, Л.С. Васильева И Сибирский медицинский журнал - 2004 - №7 - С 39

4. Четверикова, Т.Д Сравнительный анализ эффективности коррекции гемолиза эритроцитов при различных схемах введения природного полисахарида арабиногалактана / Т.Д Четверикова, Л С Васильева, О.В Гаврилова, Ю.И Пивоваров, С.А Медведева, Л А Украинская // Ж Современные наукоемкие технологии Медицинские науки №6 -2004 -С 102

5. Четверикова, Т Д Эритропоэз и эритроциты крови при гемолитической анемии и введении арабиногалактана / ТД Четверикова, Л С Васильева, О.В Гаврилова, С А Медведева // Научно-практический журнал «Паллиативная медицина и реабилитация» // VII конгресс с междунар участием Красноярск -2005 - №2 -С.95

6 Макарова, О А Реакция красной крови на стресс и отравление фенилгидразином // О А Макарова, О В Гаврилова, Л С. Васильева // Сб науч трудов «Актуальные проблемы морфологии» - Красноярск, 2006, - С 106-109

7 Гаврилова, О В Количественные и качественные Изменения красной крови при остром отравлении этиленгликолем // О В. Гаврилова, Л С Васильева, Е Е Горелова // Сибирский медицинский журнал Иркутск, 2007, - №2 - С 33-35

8. Гаврилова, О-В Защитные эффекты арабиногалактана при экспериментальной гемолитической анемии // О.В Гаврилова, Л С. Васильева, Т Д Четверикова // Сибирский медицинский журнал - 2007 - №3 - С 47-49

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АГ - арабиногалактан

ИП - индекс пролиферации клеток эритропоэза

ИС - индекс созревания клеток эритропоэза

ККМ - красный костный мозг

ОРЭ - осмотическая резистентность эритроцитов

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПСК — полустволовые клетки красного костного мозга

ФГ - феьилгидразин

ЭГ - этиленгликоль

Отпечатано на Rizo ООО «Фирма Сантай» По адресу г. Иркутск, }л Красноармейская, 4Б Формат бумаги 60*84 1/16 Объем 1 п л Тираж 100 экз заказ № 108 Сдано в печать 5 октября 2007 г

Актуальность. Эритроидное звено системы крови играет важную роль в патогенезе практически всех заболеваний, снабжая кислородом, и соответственно, энергией клетки, осуществляющие защитные реакции. Хорошо известно, что недостаток кислорода приводит к гипоксии, ишемии, тканевому ацидозу, нарушению энергетического обмена, что ослабляет резистентность тканей и организма в целом к действию повреждающих факторов [56, 109, 113].

Установлено, что эритроидное звено чувствительно к действию эндо- и экзотоксинов [37]. Интоксикационный синдром, вызванный эндоинтоксика-цией, наблюдают в клинике при различных формах соматической патологии, а также при чрезмерном или длительном воздействии стрессорных факторов, когда обнаруживаются нарушения на уровне соматических функций и в сосудистом русле накапливаются токсичные продукты [54, 89, 125, 150, 164, 167]. Кроме того, в организм постоянно извне поступают вещества, обладающие избирательной токсичностью. Среди них по механизму действия можно выделить, по меньшей мере, две группы экзотоксикантов. К первой группе относятся токсины, действующие как в неизменном виде, так и после их биотрансформации (например, этиленгликоль) и вызывающие нарушение энергетических, метаболических, синтетических процессов в клетках [8, 17, 60, 90]. Другую группу составляют токсины, действующие опосредовано, образуя в результате взаимодействия с молекулой-мишенью высокоактивные реагенты. К ним можно отнести некоторые лекарства (фенацетин, нитроглицерин, викасол, некоторые сульфаниламиды, противомалярийные средства, анестетики) и химические вещества (фенилгидразин), образующие, в результате химических взаимодействий, сильные окислители, провоцирующие гиперактивацию процессов перекисного окисления липидов(ПОЛ) [10, 69, 129].

Эритроидное звено системы крови при различных интоксикациях наименее изучено (кроме интоксикаций, вызванных гемолитическими агентами) в связи с тем, что основное внимание уделяется адсорбционной и симптоматической терапии, а патогенетические принципы лечения разработаны значительно меньше. Вместе с тем, важное патогенетическое значение токсических нарушений эритроцитов и эритропоэза требует их детального изучения и поиска путей коррекции. В связи с этим, выяснение механизмов развития процессов повреждения и восстановления эритроидного звена системы крови при стрессе и экзогенных интоксикациях и поиск методов их коррекции представляет актуальную проблему современной медицины.

В настоящее время активно развивается новое направление, основанное на использовании природных полисахаридов с медицинскими целями. Существенный интерес представляет изучение биологических эффектов арабино- -галактана, полученного из лиственницы сибирской. Из единичных работ известно, что арабиногалактан стимулирует фагоцитарную систему, иммуногенез, ограничивает гемолиз эритроцитов и обладает гемопротекторным действием [19, 42, 43, 44, 45, 92, 151]. Это дает основание апробировать арабиногалактан для коррекции нарушений эритроцидного звена, развивающихся в условиях стресса и интоксикаций, вызванных агентами различной природы. Цель исследования.

Выявление нарушений эритроидного звена системы крови, вызванных иммобилизационным стрессом, интоксикацией фенилгидразином и этиленг-' ликолем, и патогенетическое обоснование их коррекции с помощью арабино-галактана. Задачи:

1) Исследование влияния иммобилизационного стресса на состояние эритроцитов периферической крови, эритропоэза и структуры красной пульпы селезенки.

2) Изучение реакции красной крови, эритроидного ростка и красной пульпы селезенки в динамике интоксикации этиленгликолем.

3) Исследование закономерных изменений показателей красной крови, эри-' трона и структуры красной пульпы селезенки в динамике фенилгидразино-вой гемолитической анемии.

4) Выявление корригирующйх эффектов арабиногалактана при нарушениях в эритроидном звене системы крови, вызванных иммобилизационным стрессом и интоксикацией фенилгидразином и этиленгликолем.

Научная новизна.

В эксперименте на крысах установлено, что общими закономерностями нарушений эритроидного звена системы крови, индуцированных иммобилизационным стрессом и интоксикацией фенилгидразином и этиленгликолем, являются развитие эритропении, снижение осмотической резистентости эритроцитов и нарушение эритропоэза.

Доказано, что при экзоинтоксикациях специфические особенности реакции эритроидного звена заключаются в перестройке эритропоэза на гетероб-ластический путь и истощении эритроидного ростка на фоне торможения пролиферации клеток эритрона при фенилгидразиновой анемии и прогрессирующего угнетения созревания эритроцитов при интоксикации этиленгликолем. Особенностью нарушений эритроидного звена при иммобилизационном стрессе является десятикратное снижение осмотической резистентности эритроцитов и кратковременная депрессия эритропоэза.

Приоритетными являются данные о эритропротекторном и эритропоэти-ческом действии арабиногалактана, который при стрессе и экзоинтоксикациях повышает осмотическую устойчивость эритроцитов, уменьшает гемолиз и нарушения эритропоэза, предупреждает истощение эритроидного ростка под действием фенилгидразина и этиленгликоля.

Теоретическая и практическая значимость;

Доказано что, ключевым звеном развития эритропении при иммобилизационном стрессе является снижение осмотической резистентости эритроцитов, а при интоксикациях фенилгидразином и этиленгликолем, наряду с этим, важное значение имеет угнетение эритропоэза с последующим истощением эритроидного ростка.

Установлено, что нарушения в эритроидном звене системы крови, вызванные этиленгликолем и его метаболитами, имеют прогрессирующий характер и могут составлять одно из звеньев патогенеза этиленгликолевой интоксикации. Выявленный при отравлении этиленгликолем гиперретикулоци-тоз может служить диагностическим и прогностическим критерием.

На основании полученных данных патогенетически обоснована коррекция нарушений в эритроидном звене системы крови, вызванных иммобилиза-ционным стрессом и экзотоксинами, с помощью арабиногалактана.

Положения, выносимые на защиту:

1. Снижение осмотической резистентности эритроцитов при иммобилизаци-онном стрессе является ключевым звеном патогенеза эритропении, при действии фенилгидразина эти сдвиги сочетаются с угнетением пролиферации клеток эритропоэза и истощением эритроидного ростка, а при интоксикации этиленгликолем происходит прогрессирующее истощение бласт-ных форм эритрона и нарушение созревания эритроцитов, что проявляется гиперретикулоцитозом.

2. Введение арабиногалактана повышает осмотическую устойчивость эритроцитов, уменьшает нарушения эритропоэза, нормализует костномозговой резерв эритроцитов, предупреждает истощение бластных форм под действием экзотоксинов, что обусловливает уменьшение выраженности эритропении.

Апробация полученных результатов.

Результаты исследований опубликованы в 8 работах, 3 из них в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, и доложены на: заочной электронной конференции «Современные проблемы науки и образования» (Москва, 2004); Всероссийском конгрессе «Человек и здоровье» (Иркутск, 2004); VII конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация» (Красноярск, 2005); на расширенном заседании кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ИГМУ; на заседании проблемной комиссии ИГМУ «Морфология, физиология и общая патология».

Структура и объём работы.

150 ВЫВОДЫ

1. Фенилгидразиновая гемолитическая анемия характеризуется двукратным уменьшением гемоглобина и числа эритроцитов в крови, пятикратным снижением их осмотической резистентности, развитием анизоцитоза, увеличением интраспленального гемолиза, выраженным угнетением эритропоэза вследствие снижения в 2 раза активности пролиферации и созревания бластных форм эритрона, что завершается их истощением.

2. Отравление этиленгликолем вызывает эритропению, которая характеризуется уменьшением числа эритроцитов в 1,2 раза, трехкратным снижением их осмотической резистентности, устойчивым анизоцитозом и гиперрети-кулоцитозом (до 33±2,7%), выраженным угнетением эритропоэза на фоне прогрессирующего, с максимумом на 15 сутки, снижения индекса пролиферации (в 1,7 раза) и, особенно, индекса созревания клеток эритрона (в 3,5 раза), что приводит к истощению проэритробластов и накоплению полихроматофильных нормобластов.

3. При иммобилизационном стрессе развивается кратковременная эритропе-ния, характеризующаяся уменьшением числа эритроцитов в 1,5 раза, десятикратным снижением их осмотической резистентности, нормоцитозом, переходящим в микроцитоз, умеренной депрессией эритропоэза. Через 5 суток эритропения сменяется компенсаторным" эритроцитозом за счет активации эритропоэза с появлением на 7 сутки макроцитоза.

4. Введение арабиногалактана при фенилгидразиновой анемии уменьшает ге-моглобинемию и эритропению, устраняет анизоцитоз, повышает в 4 раза осмотическую устойчивость эритроцитов, снижает интраспленальный гемолиз, предупреждает истощение бластных форм эритрона и нормализует' резерв зрелых эритроцитов за счёт стимуляции их созревания, что сопровождается появлением компенсаторного ретикулоцитоза.

5. При этиленгликолевой интоксикации введение арабиногалактана повышает в 2 раза осмотическую резистентность эритроцитов, предупреждает развитие ретикулоцитоза, нормализует пролиферативную активность и созревание клеток эритрона, способствуя сохранению резерва зрелых эритроцитов, но при этом не устраняет анизоцитоз и эритропению.

6. В условиях иммобилизационного стресса введение арабиногалактана нормализует осмотическую резистентность эритроцитов, эритропоэз и резерв зрелых эритроцитов, препятствует развитию эритропении в стадию тревоги. В начальный период стадии резистентности арабиногалактан не устраняет эритропению, хотя она частично компенсируется макроцитозом и ре-тикулоцитозом.