Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологическая коррекция препаратом плацетарных гликозаминогликанов ряда побочных эффектов циклофосфана и преднизолона

^ /X На правах рукописи

> ^

Пахоиов Дмитрий Валентинович

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ПРЕПАРАТОМ ПЛАЦЕНТАРНЫХ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ РЯДА ПОБОЧНЫХ ЭФФЕКТОВ ЦИКЛОФОСФАНА И ПРЕДНИЗОЛОНА

14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа - 1997

Работа выполнена в Башкирском государственном медицинском университете

Научный руководитель:

доктор биологических наук, с.н.с. С.А. Башкатов Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Медведев Официальные оппоненты:

Лауреат Государственной премии РФ, заслуженный деятель науки РФ и РБ, доктор медицинских наук, профессор Д.Н. Лазарева; доктор медицинских наук, профессор В.А. Стригин

Ведущее учреждение - Челябинская государственная медицинская академия

Защита достоится

1997г.

в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 084.35.01 при Башкирском государственном медицинском университете (450000, Уфа, ул. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета (450000, Уфа, ул. Ленина, 3)

Автореферат разослан

1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Э.Г.Давлетов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Цитостатическая и иммуносупрессивная терапия, )ажными средствами которой являются циклофосфан и преднизолон, широко применяется в клинике при лечении больных с онкопатологией, аутоиммунными и ал-гергическими заболеваниями, после трансплантационных вмешательств и т.п. Многочисленные осложнения этой терапии, в числе которых можно отметить на->ушения гемопоэза и функциональной активности разных видов клеток крови, по-юждают необходимость применения медикаментозных средств для их коррекции. Несмотря на разнообразие применяющихся с этой целью подходов и препаратов (анная проблема сохраняет свою актуальность.

В последние годы получены данные о значимой роли в регуляции и поддер-кании процессов гемопоэза гликозаминогликуронанов (ГАГ), являющихся одним [3 классов гетерополисахаридов и широко представленных в клетках и тканях ор-анизма (Гольдберг Е.Д. и др., 1995.). В ряде исследований (Вельский М.С., 993.) показана возможность использования экзогенных ГАГ (гепарин и др.) в ка-[естве корректоров нарушенных процессов гемопоэза. Однако практическое ис-юльзование этих препаратов затруднено вследствие недостаточной информации о :арактере изменений метаболизма ГАГ при действии повреждающих факторов на емопоэз.

Цель работы: обоснование возможности использования препарата гликоза-шногликуронанов плаценты человека в качестве корректора ряда побочных эффектов цитостатиков и иммуносупрессоров.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние препарата гликозаминогликуронанов плаценты че-ювека на уровень конечных продуктов ПОЛ, обмен ГАГ, гематологические, эн-окринные показатели в тканях кроветворных органов интактного организма.

2.Изучить влияние преднизолона и циклофосфана на содержание конеч-:ых продуктов ПОЛ, ГАГ, уроновых кислот в периферической крови и крове-ворных органах.

3. Оценить в эксперименте возможность применения препарата гликозами-огликуронанов плаценты человека в качестве корректора ряда побочных эффектов циклофосфана и преднизолона.

4. Обосновать перспективность использования препарата гликозаминоглн-

куронанов плаценты человека в клинике для устранения нарушений уровня ПОЛ, ГАГ, эндокринного статуса, вызванных преднизолоном и циклофосфаном.

Научная новизна. Проведенные исследования показали существенную роль дестабилизации обмена гликозаминогликанов в механизмах побочных эффектов циклофосфана и преднизолона на систему кроветворения. Впервые показана возможность коррекции ряда побочных эффектов этих соединений препаратами ГАГ.

Практическая значимость. Результаты исследований демонстрируют возможность прогнозирования клинического течения гематологических заболеваний по выявленной зависимости между снижением уровня ГАГ и депрессией гемопоэза, позволяют обосновать перспективность дальнейших исследований сочетанного применения цитостатиков и иммуносупрессоров с препаратом гликозаминогликуронанов, в результате которого может быть уменьшено побочное действие этих фармакологических средств.

Теоретические аспекты работы включены в преподавание курсов фармакологии, иммунологии и неврологии в Башкирском государственном медицинском университете.

Положения, выносимые на защиту:

1. В побочных эффектах терапевтических доз циклофосфана и преднизолона существенное значение имеют нарушения обмена ГАГ, интенсивности процессов перекисного окисления липидов и состояния биомембран в организме;

2. Препарат гликозаминогликуронанов плаценты человека следует рассматривать в качестве перспективного средства коррекции ряда побочных эффектов циклофосфана и преднизолона;

3. Уровень эндогенных ГАГ в органах и тканях гемопоэза косвенно характеризует функциональное состояние кроветворения в организме.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых БГМУ (Уфа, 1995, 1996), заседаниях общества фармакологов Башкортостана (Уфа, 1995, 1997), на международном Симпозиуме "Экология-95" (Уфа, 1995), на научной конференции БГМУ "Проблемы теоретической медицины" (Уфа, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы. Работа изложена на 171 страницах машинописи, содержит 21 таблицу и 30 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 234 источника, из которых 119 отечественных и 115 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 1300 белых неинбредных половозрелых крысах-самцах, 600 белых неинбредных мышах и 200 мышах линии СВА, полученных из питомника лабораторных животных РАМН "Рапполово".

В работе использовали препарат плацентарных гликозаминогликанов (ПГАГ) чистотой 95,5%, выделенный из плаценты человека.

Преднизолон (Пр) вводили в дозах 5 и 0,1 мг/кг подкожно 1 раз в сутки в течение 3 дней. При этом первая доза моделировала среднетерапевтическое, а вторая заместительное воздействие (Сергеев П.В и др., 1996). Циклофосфан (Цф) вводили в среднетерапевтической дозе 8 мг/кг по схеме аналогичной таковой для преднизолона. Животные подопытных групп через 30 минут после введения пред-низолона или циклофосфана получали внутрибрюшинно ПГАГ (по 10 мг/кг) или гепарин (по 50 ЕД/кг), который использовали в качестве препарата сравнения. Забор крови при изучении гематологических показателей, определении уровня конечных продуктов ПОЛ (малонового диальдегида (МДА)) (Стальная И.Д., Гари-швили, 1977), содержания ГАГ и уроновых кислот (УК) (Шараев П.Н. и др., 1989), кортизола, ТЗ и Т4 осуществляли на 1, 3, 6, 12, 24 час и на 3, 6, 10, 14, 17 и 21 сутки эксперимента. Для изучения гистологических показателей забор образцов осуществляли на 6 и 21 сутки опыта. Выделение ядерной, лизосомальной, микросомальной и цитозольной фракций проводилось с помощью стандартных методик (Финдлей Дж., 1990).

Морфо-функциональные показатели периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов; содержание гемоглобина, лейкоцитарная формула) изучали рутинными методами. При подсчете форменных элементов обращали внимание на наличие деструктивных форм клеток, изменение их размеров и качественные модификации микроокружения. ГАГ в костном мозге и селезенке

определяли по Hronowski S.J. et а]. (1986). Резистентность эритроцитов к гемолитическому действию соляной кислоты определяли методом кислотных эритрограмм (Терсков И.А. и др., 1957). Влияние ПГАГ на спонтанную и индуцированную ми-тогенами пролиферативную активность иммуноцитов оценивали в культурах клеток селезенки интактных и иммунизированных мышей линии СБА. О пролиферации культур судили по включению в ДНК клеток радиоактивной метки 3Н-тимидина (Фримель. Г., 1987). ГЗТ к ДНХБ изучалась на модели отека ушных раковин (Orzybilla В., etal., 1983.).

Математическую обработку результатов исследования проводили на ПЭВМ IBM 486 DX5 с применением программного обеспечения Microsoft Excel.

На рисунках звездочкой (*) обозначены статистически достоверные различия с контрольной группой.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Выполненные нами эксперименты показали, что парентеральное введение препарата плацентарных гликозаминогликуронанов значительно увеличивает содержание эндогенных ГАГ в гемопоэтических органах и тканях подопытных животных (рис. 1). Проведенные параллельно микроскопические исследования констатировали появление гликозаминогликанов в ядрах и цитоплазме стромальных клеточных элементов (клетки-предшественники, а также дифференцирующиеся фибро- и остеобласты) и только вслед за этим обогащение ими межклеточного мат-рикса, свидетельствующее об усилении синтеза именно эндогенных гликозаминогликанов (рис. 2).

Введение ПГАГ усиливало костномозговое кроветворение в целом, затрагивая все стадии дифференцировки клеток-предшественников кроветворения (особенно эритропоэза), и протекало на фоне усиленной пролиферации клеточных элементов стромы костного мозга при значительном возрастании объема микроциркуляции.

Препарат сравнения гепарин вызывал меньшую активацию кроветворения и не оказывал существенного влияния на стромальные элементы костного мозга. В селезенке при введении ПГАГ (но не гепарина) отмечалось некоторое уменьшение Т-зависимой зоны (Т-зоны) лимфоидных фолликулов при значительном увеличении Т-независимой зоны (В-зоны), свидетельствующее о стимуляции дифферен-

Селезенка Сыворотка Мембраны

Рис.1. Влияние ПАГ и гепарина на содержание гликозаминогликуронанов в гемопоэтических органах и тканях крыс

циации В-звена иммунной системы. Эти данные подтверждаются результатами РБТЛ (комитогенный эффект ПГАГ на пролиферацию, индуцированную В-митогеном) и ГЗТ к ДНХБ (угнетение ПГАГ интенсивности реакций контактной аллергии).

Таблица 1

Изменение распределения эндогенного ГАГ в костном мозге и костных балках в норме и под влиянием ПГАГ или гепарина (в 10 полях зрения _при увеличении хбОО)_

Группа Содержание ГАГ в мегакариоцитах костного мозга, % Отложение ГАГ в костных балках, %

нет ГАГ ГАГ в ядре ГАГ в цитоплазме в ядре и цитоплазме ГАГ снаружи и внутри диффузное окрашивание

Контроль (норма) 14,5 ±1,4 71,0 ±6,3 2,0 ±1,9 12,5 ±1,1 0,0 ±0,1 100,0 ±9,2

ПГАГ 10 мг/кг (6 сутки) 11,5 ±1,2 51,0 ±5,1 13,5 ±1,2 24,1 ±2,2 52,.2 ±5,1 48,3 ±4,0

ПГАГ 10 мг/кг (21 сутки) 5,0 ±0,5 72,1 ±7,3 3,0 ±0,4 20,2 ±2,3 12,5 ±1,4 87,5 ±8,6

Гепарин 50 ЕД/кг (6 сутки) 12,5 ±1Д 62,5 ±6,4 0,1 ±0,1 25 ±2,3. 12,5 ±1,4 87,5 ±9,9

Гепарин 50 ЕД/кг (21 сутки) 12,5 ±1,3 75,1 ±6,2 0,1 ±0,0. 12,5 ±1,4 0,1 ±0,0 100,0 ±10,3

Примечание:[""""рги - данные достоверно отличаются от контрольных значе-

ний.

Применение изучаемого полисахаридного препарата приводило к быстрому увеличению количества лейкоцитов, ретикулоцитов и гемоглобина в периферической крови подопытных крыс, которое сопровождалось постепенным нарастанием

содержания эритроцитов и тромбоцитов, молодых форм нейтрофилов при относительном уменьшении присутствия эозииофилов и базофилов. К окончанию эксперимента сдвиги в лейкоформуле исчезали. Фармакологические эффекты препарата сравнения (гепарин) совпадали по направленности с последними ПГАГ, но были менее выраженными.

Изучение системы периферического эритрона (рис. 3) при введении ПГАГ выявило появление чрезвычайно устойчивых к гемолизу форм эритроцитов, не присутствующих в эритрограммах интактных животных, пул которых в течение эксперимента продолжал нарастать. Использование гепарина вызывало только две волны выброса молодых форм на 6 и 17 сутки опыта, что подтверждает литературные данные о наличии у гепарина гемостимулирующих свойств (Вельский М.С., 1993.).

низко-стоикие средне-стоикие высоко-стоикие повышенно-стоикие

Рис. 2. Влияние ПГАГ и гепарина на резистентность эритроцитов крыс к гемолитическому действию соляной кислоты

стабильные

Эксперименты по изучению скорости включения 3Н-тимидина в клетки и органы гемопоэтической системы показали ее значительное увеличение под воздействием ПГАГ, указывающее на интенсификацию синтеза ДНК, что подтверждает результаты морфологических исследований о повышении интенсивности пролифе-ративных процессов в этих органах. В этой ситуации представлялось необходимым оценить ответ на введение ПГАГ со стороны эндокринной системы в ее звеньях, взаимосвязанных как с пластическим обменом, так и с гемопоэзом. Эти соображения обусловили выбор в качестве объектов такого исследования уровни кортизола, трийодтиронина и тироксина.

Инъекции ПГАГ увеличивали содержание кортизола в сыворотке крови, по-видимому, за счет увеличения его синтеза надпочечниками (Михайлов Ю.М., 1966.). Отмечено также стойкое повышение уровня ТЗ и снижение Т4, которые можно объяснить известным влиянием гормонов коры надпочечников на функцио-

нирование щитовидной железы, суть которого заключается в увеличении дейодиза-ции Т4 с образованием более активного ТЗ (Швец В.Н. и соавт., 1979.). При исследовании влияния гепарина на содержание этих гормонов выявлена однонаправленность его действия с ПГАГ, однако эффект гепарина был менее выражен по амплитуде и продолжительности. Влияние этого гликозаминогликана на содержание кортизола можно объяснить недавно открытой стимуляцией под его воздействием секреции АКТГ гипофизом (Ульянов A.M. и др., 1987; Шрейбер В., 1987.). Вполне вероятно, что и другие препараты, содержащие ГАГ, способны аналогичным образом изменять гормональный статус организма.

В экспериментах по изучению распределения по органам и тканям меченого 1251 кортизола у крыс максимальное содержание этого гормона выявлено в сыворотке, меньшее - в форменных элементах крови, тимусе, селезенке и минимальное - в костном мозге. Введение ПГАГ увеличивало долю кортизола, связанного с клетками крови и костного мозга, значительно уменьшало его уровень в тимусе и практически не влияло на этот показатель в сыворотке крови и селезенке. Полученные данные свидетельствуют о существенном влиянии ПГАГ на характер и направленность процессов обмена и распределения кортикостероидов в центральных и периферических органах системы кроветворения, приводящих к активации процессов гемопоэза.

Рассмотрев влияние ПГАГ на систему гемопоэза в целом, можно констатировать, что этот препарат оказывает значительное стимулирующее влияние на костномозговое кроветворение, инициируя созревание клеток-предшественников при эдновременной стимуляции стромы кроветворных органов. В пользу этого заключения свидетельствует вышеотмеченное нами улучшение состояния межклеточного матрикса. Усиление включения 3Н-тимидина в кроветворные органы указывает на активацию процессов синтеза в них нуклеиновых кислот. Гистологическое изучение селезенки крыс, получавших ПГАГ, показавшее увеличение ширины "светлых центров", в сочетании с результатами РБТЛ позволяет констатировать наличие у препарата ГАГ В-митогенного эффекта.

ПГАГ и входящие в него подклассы кислых гликозаминогликанов, в том числе и гепарин, в модельной системе гомогената печени крыс дозозависимо уменьшали интенсивность одного из интегральных показателей тканево-клеточного

гомеостаза - перекисного окисления липидов. При этом наибольший эффект в отношении этого показателя отмечался у ПГАГ в концентрации 10 мг/л, что подтверждает оптимальность выбранной дозы препарата (10 мг/кг) в экспериментах in vivo (рис. 3), показавших существенное снижение скорости ПОЛ в органах и тканях гемопоэза.

м кМ/гтк 60

В Контроль В ПГАГ □ Гепарин

Костный мозг Тимус Селезенка Сыворотка Мембраны

Рис.3. Вляние ПГАГ и гепарина на уровень МДА в гемопоэтических органах

крыс

Введение животным преднизолона и циклофосфана вызывало у них снижение содержания ГАГ и повышение уровня уро новых кислот в органах и тканях гемопоэза, нарушение распределения ГАГ в кроветворных, стромальных клетках и форменных элементах периферической крови. При применении циклофосфана отмечались более выраженные изменения содержания и обмена ГАГ, чем при введении преднизолона.

ПГАГ восстанавливал сниженный иммуносупрессорами уровень ГАГ в системе гемопоэза (рис.4), сглаживал изменения концентрации УК и увеличивал содержание ГАГ в стромальных, молодых гемопоэтических клетках и межклеточном матриксе. Эффекты гепарина были менее выражены по интенсивности и продолжительности.

Изучение состояния костного мозга при воздействии преднизолона и циклофосфана показало изменение активности ростков кроветворения. Так, преднизо-лон в дозе 5 мг/кг вызывал стимуляцию эритроцитарного ростка кроветворения. Однако эти процессы происходили на фоне обеднения клеточного состава костного мозга и появления клеток - представителей патологического (макроцитарного) кроветворения, а также уменьшения количества полнокровных сосудов в костном мозге. Преднизолон в малой дозе вызывал некоторое увеличение количества клеток стромы костного мозга без нарушения лейко-эритробластического индекса.

□ Контроль

МПреднизолон 5

□ Преднизолон 5+ПГАГ

□ Преднизолон 0,1

М Преднизолон 0,1+ПГАГ ■ Циклофосфан

□ Циклофосфан+ПГАГ

ГАГ

Рис.4. Влияние ПГАГ на содерание ГАГ и УК в костном мозге на фоне циклофосфана или преднизлона

Циклофосфан также значительно обеднял клеточное наполнение костного мозга, уменьшал количество полнокровных сосудов и содержание мегакариоцитов при снижении лейко-эритробластического индекса и появлении значительного количества гигантских клеток.

ПГАГ потенцировал усиление эритробластпческого кроветворения предки-золоном (5 мг/кг). Он стимулировал увеличение доли молодых (базофильных) форм нормобластов, стимулировал пролиферацию и стромальных механоцитов, уменьшал содержание гигантских клеток. При этом нами также отмечалось увеличение более чем в 2 раза количества полнокровных сосудов в костном мозге. К окончанию эксперимента отмечалось выравнивание соотношений основных популяций клеток костного мозга с одновременной стимуляцией всех ростков кроветворения и стромальных клеточных элементов. ПГАГ на фоне преднизолона в малой дозе вызывал аналогичные изменения.

В группе, получавшей ПГАГ на фоне циклофосфана, отмечалось восстановление содержания молодых форм клеток миелограммы, мегакариоцитов и клеток стромы костного мозга. ПГАГ увеличивал количество клеток, находящихся в стадии митоза, при этом усиливалась микроциркуляция в костном мозге. К завершению эксперимента ПГАГ восстанавливал нормальное соотношение эритроидного и грануломоноцитарного ростков костного мозга с одновременной нормализацией состава стромы и клеток костного мозга (увеличение доли их молодых форм и уменьшение содержания гигантских клеток). Препарат сравнения гепарин имел ту

же направленность действия на костный мозг, поврежденный иммуносупрессорами, однако менее выраженную.

Гистологическое исследование селезенки показало, что преднизолон в дозе 5 мг/кг вызывал длительно сохранявшееся уменьшение размеров В-зоны, и в меньшей степени Т-зоны лимфоидных фолликулов селезенки, при одновременном уменьшении количества митозов.

В малой дозе преднизолон проявлял реверсию своих эффектов, стимулируя количество митозов и увеличивая размеры "светлых" центров лимфоидных фолликулов. Однако этот эффект был кратковременным.

Циклофосфан уменьшал размеры лимфоидных фолликулов за счет уменьшения ширины Т-зоны. Одновременно происходило снижение количества митозов в селезенке в целом.

ПГАГ на фоне преднизолона (в дозе 5 мг/кг) восстанавливал количество митозов в селезенке, значительно увеличивал В-зону при уменьшении Т-зоны, что позволяет констатировать длительное В-митогенное действие ПГАГ.

При введении ПГАГ на фоне циклофосфана на все сроки опыта восстанавливалась ширина лимфоидных фолликулов, измененная цитостатиком. Количество митозов ПГАГ достоверно приводил к норме. Параллельно с этим, по сравнению с группой, получавшей цитостатик, увеличивалась ширина "светлых" центров и уменьшалась - Т-зоны, а также значительно увеличивалось количество клеток, находившихся на стадии митоза. Гепарин на фоне этих иммуносупрессоров несколько увеличивал количество митозов, не оказывая влияния на остальные показатели.

Изучение состояния периферической крови при воздействии ПГАГ на фоне иммуносупрессоров выявило, что при введении преднизолона в дозе 5 мг/кг достоверно увеличивался уровень ретикулоцитов, эритроцитов и гемоглобина с одновременным снижением содержания лейкоцитов. Изменялось и соотношение клеток лейкоформулы: к 6 суткам отмечено увеличение доли сегментоядерных нейтрофи-лов, эозинофилов с уменьшением палочкоядерных нейтрофилов, а к окончанию эксперимента происходили обратные изменения. Преднизолон в меньшей дозировке повышал уровень ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов (за счет палочкоядерных нейтрофилов с одновременным снижением эозинофилов), не изменял уровень гемоглобина в периферической крови. Циклофосфан, наоборот, вызывал стойкую ретикуло-, эритро-, лейко- и тромбоцитопению, а также в 2 раза снижал

уровень гемоглобина в периферической кропи. Одновременно с этим были отмечены изменения в лейкоформуле периферической крови (исчезновение молодых форм нейтрофилов с возрастанием старых). При сочетании ПГАГ с преднизолоном во всех дозах ПГАГ наблюдалось стойкое повышение количества ретикулоцитов, эритроцитов, нормализация уровня лейкоцитов и лейкоформулы периферической крови. Вместе с тем эффекты препарата ГАГ не затрагивали уровень гемоглобина в крови.

В комбинации с циклофосфаном ПГАГ проявлял антагонизм в отношении воздействия этого цитостатика на количество клеток в периферической крови: отмечалась нормализация уровня ретикулоцитов, эритроцитов, лейкоцитов. Положительное влияние ПГАГ на содержание тромбоцитов и гемоглобина, сниженное циклофосфаном, было менее выраженным. Гепарин на фоне введения иммуносупрес-соров не оказывал существенного воздействия на содержание ретикулоцитов и лейкоцитов в периферической крови. Он лишь несколько восстанавливал уровни тромбоцитов, эритроцитов и гемоглобина, сниженные циклофосфаном.

Анализ изменений в системе эритрона (рис. 5) под воздействием циклофос-фана показал, что в ней происходило длительное и значительное увеличение доли низко-стойких фракций эритроцитов с одновременным снижением более стабильных популяций эритроцитов. Эти сдвиги начинали уменьшаться лишь к окончанию эксперимента - 21 суткам опыта.

Кислотные эритрограммы животных, получавших преднизолон в высокой дозе, в сравнении с группой, которой вводили циклофосфан, меньше отклонялись от нормы. При применении преднизолона в дозировке 0,1 мг/кг нами отмечались две волны повышения доли низкостойких популяций к 6 и 17 суткам эксперимента. В остальные сроки опыта резистентность эритроцитов к гемолитическому действию соляной кислоты находилась в пределах контрольных значений. Характерная для преднизолона общая тенденция к увеличению количества неустойчивых форм эритроцитов на фоне повышенного содержания ретикулоцитов, гигантских клеток и обеднения клеточного состава стромы костного мозга свидетельствует о неполноценности костномозгового кроветворения, приводящей к выходу в периферическую кровь незрелых, функционально-неполноценных эритроцитов.

низко-стоикие

средне-стоикие

В Контроль

■ Преднизолон5

□ Преднизолон 5+ПГАГ

□ Преднизолон 0,1

■ Преднизолон 0,1+ПГАГ

□ Циклофосфан

■ Циклофосфан+ПГАГ

повышенно-стойкие

Рис.5. Влияние ПГАГна соотношение сублопуляций эритроцитов в норме и на фоне иммуносупрессии

По данным литературы (Гительзон И.И. и др., 1967) кислотная эритро-грамма при воздействии экзогенных и эндогенных факторов, к которым можно отнести иммуносупрессивные воздействия циклофосфана и преднизолона, отражает не только изменения физиологического состояния эритроцитов, но и потенциальные возможности костномозгового кроветворения. При этом ее показатели часто значительно расходятся с показателями осмотической и механической эритро-грамм, которые характеризуют только прочность эритроцитарной мембраны на разрыв (Гольдберг Д.И. и др., 1968). По-видимому, механизм снижения химической резистентности эритроцитов на фоне высоких доз преднизолона заключается в описанных ранее в литературе нарушениях им водно-электролитного баланса клеток крови, нарушением микровязкости эритроцитарной мембраны, ее проницаемости; изменением содержания в ней холестерина, уровня и конформации фосфоли-пидов и протеогликанов (Калинина Т.Т., 1979.; Ланкин В.З., 1986; Козинец Г.И. и др., 1997). Также известно, что такими мембранными эффектами обусловлены ти-молитическое и дегенеративное действие кортикостероидов на соединительную ткань, составляющую строму кроветворных органов (Сергеев П.В. и др., 1971; По-стриганева Т.Н. и др., 1980; Соловьев Г.М. и др., 1987).

ПГАГ на все сроки опыта проявлял антагонизм в отношении эффектов цик-юфосфана: нормализовал изменения в низкостойкой популяции эритроцитов, вы-1ывал увеличение числа среднестойких эритроцитов и восстанавливал высокостой-сую популяцию в эритроне.

Сочетание преднизолона (5 мг/кг) с ПГАГ приводило у крыс к достовер-юму повышению содержания на все сроки эксперимента среднестойких форм фитроцитов, что согласуется с вышеприведенными данными литературы. Несмотря 1а общее корригирующее действие ПГАГ на систему эритрона, измененного высо-сими дозами преднизолона, нами выявлено достоверное снижение высокостойкой юпуляции эритроцитов периферической крови крыс. ПГАГ, примененный на фоне юздействия малой дозы преднизолона, вызывал повышение низкостойкой фракции фитроцитов при одновременном сокращении популяции высокостойких клеток. Необходимо отметить, что на все сроки эксперимента ПГАГ потенцировал увеличе-ше стабильной фракции эритроцитов.

Препарат сравнения - гепарин, введенный в дозе 50 ЕД/кг на фоне цикло-[зосфана, несколько удлинял протяженность эритрограммы. Применение гепарина I комплексе с преднизолоном незначительно увеличивало долю стабильных эрит-

)0ЦИТ0В.

Изучение интенсивности включения меченого тимидина клетками гематологических органов показало, что преднизолон в малой дозе стимулировал включе-ше меченого тимидина в клетки гемопоэтических органов. ПГАГ (но не гепарин) осиливал это действие. Пр и Цф в иммуносупрессивных дозах снижали скорость (ключения изучаемой метки в органах и тканях, которая восстанавливалась при (ведении ПГАГ. Гепарин в аналогичном эксперименте был в два раза менее эффек-ивен.

Таким образом, применение изученных иммуносупрессоров приводит к на-»ушению содержания и обмена ГАГ в гемопоэтических органах и тканях, а также (беднению стромальных элементов костного мозга при умеренной стимуляции па-ологического кроветворения. Применение ПГАГ приводило к нормализации со-(ержапия и обмена этих гетерополисахаридов в гемопоэтических органах и тканях, I также к восстановлению стромальных элементов костного мозга и нормального ;роветворения в целом. Гепарин как препарат сравнения значительно уступал 1ГАГ по своей терапевтической эффективности.

Преднизолон резко снижал включение меченого кортизола в кроветворные органы, с одновременным перераспределением его содержания в сыворотке и форменных элементах крови. ПГАГ на фоне преднизолона проявлял противоположное действие на этот процесс в органах гемо- и иммунопоэза: в костном мозге - усиливал включение кортизола. Одновременно с этим, ПГАГ действовал однонаправ-ленно с преднизолоном - уменьшал включение меченого гормона в селезенке и тимусе.

При исследовании распределения меченого кортизола на субклеточном уровне было выявлено, что преднизолон уменьшал его включение в клеточную и субклеточные фракции. При введении ПГАГ на фоне преднизолона наблюдалось увеличение включения меченого кортизола в клеточные структуры вплоть до ядра клетки. Гепарин и гиалуроновая кислота действовали однонаправленно с ПГАГ однако отмечалась их меньшая эффективность влияния на эти процессы. Исследование включения меченого кортизола в клеточные структуры позволяет сделать вывод о том, что ПГАГ значительно улучшает доставку кортизола к поверхности клетки, облегчает перенос его в клеточные структуры и транспорт кортизола к точке приложения его действия - ядру клетки. Полученные данные позволяет частично раскрыть механизм взаимодействия ГАГ со стероидными гормонами, а также прояснить причины потенцирования ими многих эффектов глюкокортикостероида. В связи с этим можно сделать вывод о потенциальной целесообразности одновременного назначения малых доз преднизолона с ПГАГ для усиления фармакологического эффекта этого гормонального препарата, что, вероятно, позволит значительно снизить его побочные эффекты.

При введении циклофосфана ПГАГ более эффективно, чем гепарин, корригировал изменения содержания гормонов, вызванные им в сыворотке крови (рис. 6).

Эксперименты по оценке влияния ПГАГ на интенсивность включения 3Н-тимидина выявили его антагонизм по этому показателю с преднизолоном и циклофосфаном, что согласуется с наличием у препарата гематостимулирующих свойств. Таким образом, можно заключить, что ПГАГ является перспективным препаратом для коррекции и модуляции фармакологических эффектов цитостатиков и иммуно-супрессоров.

Рис.6. Влияние ПГАГ на уровень ряда гормонов на фоне преднизолона и циклофосфана

□ Контроль

■ Преднизолон 5

□ Преднизолон 5 +ПГАГ

Я Преднизолон 0,1

□ Преднизолон 0,1+ПГАГ

□ Циклофосфан

Циклофосфан +ПГАГ

В результате проведенных исследований в динамике подтверждено, что шклофосфан и преднизолон в терапевтических дозах вызывают существенное наущение гомеостаза, подтверждаемое значительным снижением уровня гликозами-гогликанов в органах и тканях гемопоэза. Выполненные исследования показали, [то параметры содержания и обмена ГАГ в тканях достаточно четко и своевременно сарактеризуют их патологические изменения. На этом основании можно заклю-шть, что показатели метаболизма ГАГ, определяемые в плазме крови и мембранах фитроцитов, вместе с другими дополнительными исследованиями могут использо-тться в практической деятельности клинических лабораторий в качестве важного щагностического показателя для выявления различных вариантов патологии сис-емы кроветворения. Не вызывает сомнений также перспективность дальнейшего иучения гликозаминогликанов в качестве средства профилактики и лечения нару-иений гемопоэза.

ВЫВОДЫ

[. ПГАГ оказывает активирующее влияние на процессы обмена ГАГ и нуклеиновых кислот в органах гемопоэза, обеспечивает гормональную регуляцию этих процессов и стимулирует кроветворение, не вызывая при этом появления патологических форм клеток крови.

В модельных субклеточных системах, популяциях клеток иммунной системы и в условиях'введения в интактный организм показано, что препарат кислых гликозаминогликанов плаценты человека снижает интенсивность процессов ПОЛ, обладает митогенным, комитогенным действием в отношении клеток В-звена иммунной системы и выраженным противовоспалительным действием.

3. Цитостатическое и иммуносупрессорное действие циклофосфана проявляется активацией процессов ПОЛ и макроцитарного гемопоэза, нарушением метаболизма гликозаминогликанов и нуклеиновых кислот, приводящим к изменению гормонального статуса, повреждению системы эритрона, стромальных элементов гемо-поэтических органов и кроветворения в целом.

4. Преднизолон повреждает строму кроветворных органов с угнетением в ней синтеза ДНК и гликозаминогликанов.

5. ПГАГ проявляет антагонизм в отношении повреждающего действиям циклофосфана на кроветворение за счет стабилизации скорости ПОЛ, нормализации обмена гликозаминогликанов и нуклеопротеидов.

6. ПГАГ нивелирует негативное действие преднизолона на строму гемопоэтических органов.

7. Экспериментально обоснована целесообразность разработки на основе гликозаминогликанов новых лекарственных препаратов - стимуляторов гемопоэза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Препарат гликозаминогликуронанов плаценты человека перспективен для дальнейшего исследования в качестве потенциального корректора побочных эффектов противоопухолевых средств.

2. Определение параметров уровня ГАГ, интенсивности процессов их обмена, скорости ПОЛ, кислотной резистентности эритроцитов могут быть использованы в клинике в качестве дополнительных прогностических тестов оценки состояния органов кроветворения в условиях воздействия неблагоприятных факторов.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Выявление иммунотропного действия у препарата плацентарных гликозаминогликанов/ /Материалы 60 научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ.-Уфа, 1995.-С.4-5. (Корженевский A.A.).

2. Препараты плацентарных гликозаминогликанов модулируют влияние циклофосфана и преднизолона на процессы лейкопоэза//Материалы 60 научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ.-Уфа, 1995.-С.5-6.

. Разработка лекарственных методов коррекции мембранотоксического действия экотоксикантов//Тез. докладов международного симпозиума "Экология-95".-1995.-С. А-35. (Мышкин В.А., Башкатов С.А., Волкова Е.С. и др.)

. Коррекция препаратом плацентарных гликозаминогликанов состояния мембран эритроцитов, измененных под воздействием циклофосфана и преднизолона //Материалы 61 научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ.-Уфа,1996.-с.18. (Валииурова Ю.Р.).

. Фармакологическая коррекция уровня гликозаминогликанов ряда органов и тканей системы гемопоэза, измененного воздействиями преднизолона/ /Материалы научной конференции "Проблемы теоретической медицины".-

Уфа, 1997.-С.67-70. (Башкатов С.А., Медведев Ю.