Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Изменение активности транскрипционного фактора HSF1 при экспрессии онкогенов RAS: механизмы и роль в канцерогенезе

la правах рукописи

ЗАМКОВА МАРИЯ АНАТОЛЬЕВНА

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА HSF1 ПРИ ЭКСПРЕССИИ ОНКОГЕНОВ RAS: МЕХАНИЗМЫ И РОЛЬ В

КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ

Специальность 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

У ОКТ 2014

Москва 2014

005553313

005553313

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук, Москва

Директор

академик РАН и РАМН Давыдов Михаил Иванович

Научный руководитель

доктор биологических наук,

профессор, Копнин Борис Павлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, заведующий лабораторией клеточной микробиологии ФГБУ "НИИЭМ

им.Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России Логунов Денис Юрьевич

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела математических методов в биологии НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского

МГУ им. М.В. Ломоносова Дугина Вера Борисовна

Ведущая организация: Государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего

профессионального образовапия

«Российский национальный

исследовательский медицинский

университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России.

Защита диссертации состоится 2014 г. в « на

заседании диссертационного совета Д 001.017.01 ''при ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) и на сайте www.ronc.ru.

Автореферат разослан «^У >>6:У^''^Д(2014г.

/7

Ученый секретарь диссертационного совета (// //

доктор медицинских наук профессор Мл, * Ю.В. Шишкин

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Злокачественные новообразования возникают в результате накопления в какой-либо из клеток организма мутаций в генах, продукты которых контролируют важнейшие аспекты ее жизнедеятельности - размножение, дифференцировку, метаболизм и др. В настоящее время известны сотни генов, так или иначе принимающих участие в процессах канцерогенеза. Однако многие детали молекулярных событий, ответственных за неопластическую трансформацию клеток при тех или иных первичных нарушениях генома и закономерности дальнейшей опухолевой прогрессии мутантных клонов с различным генетическим ландшафтом изучены недостаточно. Между тем их выяснение должно привести к более глубокому пониманию молекулярных механизмов канцерогенеза, идентификации новых перспективных мишеней для таргетной терапии новообразований, разработки новых способов ингибирования опухолевой прогрессии и, как результат, улучшению результатов лечения онкологических заболеваний.

Онкогены семейства RAS (Н-Л45, К-RAS, N-RAS) являются генами, мутации в которых наиболее часто встречаются в различных новообразованиях человека. Кодируемые этими генами белки Ras регулируют размножение, миграцию, жизнеспособность, метаболизм и дифференцировку клеток. При этом в зависимости от клеточного контекста, условий микроокружения и внутриклеточного уровня белков Ras, их влияние на судьбу клетки может сильно варьировать, и, в частности, либо способствовать неопластической трансформации, либо вызывать необратимую остановку клеточного цикла, старение и смерть клеток. В настоящее время, несмотря на многочисленные попытки, эффективных методов ингибирования действия онкогенного Ras в клинической практике не существует. Поэтому пополнение фундаментальных знаний о регуляции и функционировании онкобелков Ras имеет большое значение для поиска эффективных путей подавления вызываемой ими опухолевой прогрессии.

Ранее в лаборатории цитогенетики НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН было обнаружено, что экспрессия мутантных онкобелков Ras приводит к уменьшению экспрессии генов сестринов, контролирующих антиоксидантную активность пероксиредоксинов, и, как следствие, к увеличению внутриклеточного содержания активных форм кислорода (АФК), воздействующих на многие аспекты жизнедеятельности клеток. Кроме того, с помощью биоинформатического анализа, было установлено, что промоторы генов сестринов содержат потенциальные HSFl-респонсивные элементы. HSF1 - транскрипционный фактор, регулирующий синтез белков теплового шока, - в настоящее время рассматривается некоторыми исследователями в качестве новой перспективной мишени противоопухолевой таргетной терапии. Однако имеющиеся в литературе данные о роли HSF1 в процессах канцерогенеза весьма противоречивы. Выяснение закономерностей функционирования HSF1 в клетках, трансформированных онкобелками Ras, и изучение влияния на

опухолевый рост различных модификаций функции HSF1, может внести существенный вклад в поиск новых эффективных способов ингибирования опухолевой прогрессии.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение влияния экспрессии онкогенов RAS на активность транскрипционного фактора HSF1 и оценка биологических последствий различных изменений активности HSF1 в нормальных, иммортализованных и опухолевых клетках человека.

Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:

1. Изучить влияние экспрессии мутантных форм онкобелка Ras на активность транскрипционного фактора HSF1 в нормальных фибробластах человека (ФЧ) и иммортализованных кератиноцитах (НаСаТ).

2. Исследовать влияние экспрессии мутантных форм онкобелка Ras на внутриклеточное содержание активных форм кислорода (АФК) и экспрессию генов сестринов в ФЧ и НаСаТ; изучить связь изменений уровня АФК и экспрессии генов сестринов с изменениями транскрипционной функции HSF1.

3. Создать лентивирусные векторы, экспрессирующие различные мутантные формы HSF1 (конститутивно-активную, доминантно-негативную); с помощью трансдукции созданных векторов изучить влияние разных модификаций функции HSF1 на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в различных типах клеток (ФЧ, НаСаТ, рак ободочной кишки НСТ116, фибросаркома НТ1080).

4. Изучить влияние различных модификаций функции HSF1 на скорость роста клеток разных типов в культурах in vitro.

5. Изучить влияние различных модификаций функции HSF1 на кинетику роста и васкуляризацию ксенографтов опухолевых клеток человека в бестимусных мышах.

Научная новизна и практическая значимость исследования

Выполненные исследования позволили получить ряд приоритетных результатов.

Впервые установлено, что экспрессия активных форм онкобелка Ras повышает внутриклеточное содержание АФК, репрессируя ген SESN3 счет изменения активности регулирующего его транскрипционного фактора HSF1. Выявлено противоположное действие онкобелка Ras на транскрипционную активность HSF1 в различных клеточных контекстах, в частности в нормальных фибробластах и иммортализованных кератиноцитах человека. Обнаружено, что противоположные изменения активности HSF1 - увеличение активности в кератиноцитах и понижение активности в фибробластах - ведут в данных клеточных контекстах к сходным последствиям: репрессии гена SESN3, повышению внутриклеточного уровня АФК, активации ингибитора циклинзависимых киназ p21c,pl/w,n и замедлению скорости роста клеток in vitro.

Продемонстрировано ингибирующее влияние избирательного подавления экспрессии гена SESN3 на скорость роста культивируемых клеток.

При изучении влияния различных модификаций функции HSF1 на кинетику роста ксенографтов рака ободочной кишки человека НСТ116 в бестимусных мышах показано, что ингибирование транскрипционной активности HSF1 увеличивает скорость опухолевого роста, а активация функции HSF1 приводит к противоположному эффекту. Эти эффекты, по крайней мере, частично, связаны с изменениями активности ключевых регуляторов клеточного цикла и ангиогенеза - белков Erkl/2 и HIF-la. Таким образом, предлагаемое в качестве нового терапевтического подхода ингибирование функции HSF1 приводит в исследованной модели не к замедлению, а к ускорению опухолевого роста, тогда как активация функции HSF1, наоборот, замедляет опухолевую прогрессию. Противоположные эффекты ингибирования активности HSF1 на скорость роста опухолевых клеток, полученные на разных моделях/клеточных линиях в условиях in vitro и in vivo, указывают на необходимость проведения более углубленных исследований для оценки возможности и путей использования транскрипционного фактора HSF1 в качестве терапевтической мишени.

Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 5 июня 2013 года на совместной научной конференции лабораторий цитогенетики, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, механизмов химического канцерогенеза, регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 — «онкология», конкретно пунктам 1, 2, 3.

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в получении и анализе полученных результатов работы. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от обзора современной литературы по изучаемой проблеме до экспериментальной реализации поставленных целей и задач, а также обсуждении результатов на семинарах, в научных публикациях и на конференциях.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков, 3 таблицы. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы», «Список литературы». Библиографический материал включает ссылки на 243 источника литературы.

Основное содержание работы

Материалы и методы

В работе использованы следующие методы исследования: молекулярное клонирование, трансдукция ленти- и ретровирусных векторов, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), анализ экспрессии белков с помощью вестерн-блот гибридизации, иммунофлюоресцентный анализ белков, измерение уровня активных форм кислорода, анализ люциферазной активности, анализ динамики роста клеточных культур и ксенографтов в бестимусных мышах, иммуногистохимический анализ срезов опухолевых тканей, статистическая обработка данных.

Результаты исследования и обсуждение

Влияние активных форм белка Ras на уровень АФК и экспрессию генов сестринов

Задачи диссертационной работы включали: а) изучение влияния экспрессии активных белков Ras на содержание АФК и уровень мРНК генов сестринов; б) выяснение вопроса являются ли эти эффекты HSFl-зависимыми; и, в) оценку биологических последствий данных эффектов. Для решения поставленных задач был создан набор сублиний НаСаТ и культур ФЧ, экспрессирующих экзогенные активные мутантные белки H-Ras, с заменами аминокислот в кодонах: 12 (RasV12), 12 и 40 (RasV12C40), 12 и 37 (RasV12G37) и 12 и 35 (RasV12S35). Данные мутанты являются доминантно-активными формами белка Ras; двойные мутанты способны активировать лишь определенный сигнальный путь (Табл. 1), что позволяло не только анализировать возможное влияние гиперэкспрессии активированного Ras на интересующие нас мишени, но и предполагать, через какие эффекторы белка Ras может осуществляться это воздействие.

Таблица 1. Сублинии НаСаТ и ФЧ, экспрессирующие различные мутантные варианты белка Ras.

Мутантные формы Ras Культуры клеток НаСаТ и ФЧ

«Пустой» вектор pLXSN (контроль - К) экспрессия эндогенного белка H-Ras

Мутант RasV12(V12) одновременная экспрессия эндогенного белка и конститутивно-активного белка Н^ав

Двойной мутант RasV12C40 (С40) одновременная экспрессия эндогенного белка и белка Н-Яаз, активирующего Р13К-сигнальный путь

Двойной мутант RasV12G37 (G37) одновременная экспрессия эндогенного белка и белка Н-КаБ, активирующего RalGDS-cигнaльный путь

Двойной мутант RasV12S35 (S35) одновременная экспрессия эндогенного белка и белка Н-Каэ, активирующего Raf-cигнaльный путь

Для создания конструкций был использован ретровирусный вектор pLXSN. Их трансдукция в клеточные линии приводила к экспрессии мутантных вариантов белка Ras (Рис. 1).

Фибробласты НаСаТ

Ras Ras

Рис. 1. Вестерн-блот анализ экспрессии мутантных вариантов белка Ras.

Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Белок р-актин использовали в качестве контроля количества нанесенных образцов.

Используя полученные культуры клеток, был проведен анализ влияния экспрессии активного белка Ras на уровень внутриклеточных АФК. Измерения проводили на 11-15 день после инфекции. Было показано, что трансдукция Ras приводит к 1,5-кратному увеличению содержания АФК в НаСаТ и к 1,4-1,8-кратному повышению уровня АФК в фибробластах человека. При этом вклад двойных мутантов, то есть разных Ras-активируемых сигнальных путей, был примерно равным (рис. 2А, Б, вверху). Вследствие того, что повышение уровня АФК может быть связано с Ras-регулируемой экспрессией генов сестринов, как показали ранее на некоторых клеточных линиях [Kopnin et al., 2007], была проведена оценка уровня мРНК сестринов в исследуемых клеточных сублиниях. Как видно из рисунка 2А {внизу), экспрессия RasV12 в НаСаТ приводит к значительному снижению экспрессии SESN3 на 11-15 день после инфекции, и к небольшому уменьшению уровня мРНК SESNJ на 11 день после инфекции. Эксперименты показали, что подавление экспрессии SESN3 и SESN1 в большей степени связано с активацией Ras-Raf сигнального пути (RasV12S35) (рис. 2А, внизу). В случае с ФЧ также было показано Ras-индуцируемое снижение экспрессии SESN3 на 11-15 день после инфекции. Так же, как и в НаСаТ, наибольший вклад вносит Ras-Raf сигнальный путь (рис. 2Б, внизу). Однако в фибробластах не было обнаружено влияния экспрессии активного Ras на уровень мРНК SESN1 на момент измерений.

А)

Фибробласты

НаСаТ

35

30

pLXSN V12 С40 G37 S35 pLXSN V12 С40 G37 S35

SESN2

тубулин SESN3 SESN1

Рис. 2. Влияние экспрессии активных мутантов белка Ras на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в НаСаТ (А) и фибробластах человека (Б).А), Б) Вверху, средние значения суммарной флюоресценции DCF в 5 х 104 клеток в трех экспериментах. Среднее значение ± стандартное отклонение, р < 0.05. Внизу, результаты ОТ-ПЦР анализа уровня мРНК SESN1, SESN2, SESN3. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. мРНК а-тубулина использовали как контроль количества нанесенных образцов.

Как было показано ранее на некоторых клеточных линиях [ Kopnin et al., 2007], Ras-индуцируемое повышение содержания АФК и снижение экспрессии генов сестринов носит временный характер и с некоторого момента возвращается к контрольному уровню. Поэтому, продолжая проводить измерения изменений уровня АФК и экспрессии генов сестринов в клетках, экспрессирующих активные мутантные варианты Ras, до 24 дня после инфекции, было обнаружено, что в случае НаСаТ содержание АФК в клетках, экспрессирующих активный Ras, возвращалось к базовому контрольному уровню после 18 дня после инфекции. При этом уровень экспрессии SESN1 оказывался на уровне контроля после 12 дня; a SESN3 - после 16 дня после инфекции (рис. ЗА). В случае ФЧ наблюдалась сходная картина (рис. ЗБ). На рисунке 3 представлены результаты влияния трансдукции RasV12 и RasV12S35 на уровень АФК и экспрессию гена SESN3, так как, исходя из данных предыдущего эксперимента (рис. 2), их эффект является наиболее значимым. Необходимо отметить, что вплоть до 24 дня после введения активных мутантов белка Ras, их экспрессия сохранялась.

А)

Фиброёлзсты

I pLXSN D V12 В S35

НаСаТ

m PLXSN о vi2 в s3s

Il II III

13я 1вд

Дни после инфекции

Рис. 3. Влияние экспрессии активных мутантов белка Ras (RasV12 и RasV12S35) на уровень АФК и экспрессию гена SESN3 в НаСаТ и ФЧ с 11 по 24 дни после инфекции.

А) графики средних значений суммарной флюоресценции DCF в 5 х 104 клеток в трех экспериментах в различные дни после инфекции. Б) относительная интенсивность полос SESN3, SESN1 и SESN2 представлена как отношение интенсивности полос SESN3, SESN1 и SESN2 к интенсивности полос а-тубулина. Среднее значение ± стандартное отклонение, *р <0.05.

Полученные данные о Ras-индуцированном временном снижении экспрессии преимущественно гена SESN3, регулирующего регенерацию пероксиредоксинов, указывают на существование неизвестного ранее механизма Ras-индуцированного повышения уровня АФК посредством ослабления антиоксидантной защиты клетки.

Влияние экспрессии Ras на активность транскрипционного фактора

HSF1

Полученные результаты демонстрировали наличие эффекта гиперэкспрессии онкогенного белка Ras на экспрессию генов сестринов, однако механизмы влияния оставались неизвестны. Используя базу данных TRANSFAC, содержащую информацию о сайтах связывания эукариотических факторов транскрипции в геномах, было обнаружено, что в промоторах генов сестринов есть HSFl-респонсивные элементы. Исходя из этих данных, было решено проанализировать, не является ли Ras-индуцируемое снижение экспрессии генов сестринов HSF1-зависимым. Для этого сначала было проведено исследование влияния экспрессии мутантов белка Ras на

транскрипционную активность фактора HSF1. Для решения данной задачи была создана репортерная конструкция pLentiA-mCMV-HSE-Luc-puro, содержащая HSFl-респонсивные элементы, активация которых приводит к экспрессии люциферазы. Эта конструкция, а также все мутантные варианты белка Ras и «пустой» вектор (в качестве контроля), были трансдуцированы в культуры клеток НаСаТ и ФЧ.

Анализ люциферазной активности, проводимый с 11 по 24 дни после инфекции белков Ras, показал, что экспрессия активного Ras приводит к 1,5-2-кратному увеличению транскрипционной активности HSF1 в НаСаТ и к 1,5-2,5-кратному снижению активности HSF1 в фибробластах. При этом вклад двойных мутантов Ras, активирующих лишь отдельные эффекторы Ras (Raf или PI3K или RalGDS) оказался примерно одинаковым (рис. 4).

Фибробласты

pLXSN V12 С40 G3? 335

pLXSN V12 С40 G3?

Рис. 4. Влияние экспрессии активных мутантов белка Ras на активность люциферазного репортера, содержащего HSFl-респонсивные элементы, в НаСаТ и фибробластах. Среднее значение ± стандартное отклонение, *р < 0.005.

Так как ранее [Stanhill el al., 2006] было показано, что активация HSE может быть HSF1-независимой был проведен анализ возможной взаимосвязи влияния экспрессии белков Ras на активность люциферазного репортера с изменением содержания или внутриклеточной локализации HSF1. Как известно [Vujanac et al., 2005], неактивный HSF1 циркулирует в клетке между цитоплазмой и ядром; активация фактора приводит к его транслокации и накоплению в ядре.

Проведенный Вестерн-блот анализ показал, что экспрессия активированных мутантных форм белка Ras не изменяет тотального содержания белка HSF1, но приводит к изменениям его ядерной фракции: снижению количества ядерного HSF1 в фибробластах и накоплению HSF1 в ядрах клеток НаСаТ. При этом воздействие двойных мутантов соответствует таковому при экспрессии люциферазазного репортера (Рис. 5).

Фибробласты pLXSN V12 С40 G37 S35

гистон 3

НаСаТ pLXSN V12 С40 G37 S35

------- »»

HSF1 цитоплазм.

р-актин

HSF1 тотальный

Рис. 5. Влияние экспрессии активных мутантов белка Ras на количество тотального, ядерного и цитоплазматического белка HSF1 в фибробластах и НаСаТ.

Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Белок гистон 3 использовали в качестве контроля количества нанесенных образцов для ядерной фракции, а белок актин - для цитоплазматической и тотальной.

Фибробласты

НаСаТ

pLXSN

pLXSN

RasV12

Рис. 6. Иммуногистохимическое окрашивание ядер клеток, экспрессирующих RasV12, и контрольных культур клеток НаСаТ и ФЧ. Представлены типичные поля зрения для каждой экспериментальной группы.

Для подтверждения результатов Вестерн-блот анализа было также, с использованием антител к HSF1, проведено иммунофлюоресцентное окрашивание ядер клеток, экспрессирующих активный мутант RasV12, и контрольных культур клеток НаСаТ и ФЧ. Как видно из рисунка 6 результаты иммунофлюоресценции согласуются с результатами Вестерн-блот анализа.

Результаты экспериментов показали, что в двух исследуемых типах Ras-экспрессирующих клеток наблюдаемые изменения функционирования HSF1 являются противоположными. Литературные данные говорят о том, что последствия активации онкогенного белка Ras зависят от типа клеток, в которых он экспрессируется, а также от условий проведения эксперимента [Ewen et al.,2000; Shields et al., 2000]. В одних случаях гиперэкспрессия Ras приводит к преждевременному старению и снижению пролиферации [Deng et al., 2004; Zhu et al., 19984 Lin et al., 2001; Roper et al., 2001]; в других - к стимуляции пролиферации и снижению дифференцировки клеток [Mainiero et ai, 1997; Zhu et al., 1999]. Используемые в работе клетки отличаются по

происхождения, а также по «нормальности», поэтому не удивительно, что программы, запускаемые активным белком Ras, в одних случаях могут приводить к снижению активности той или иной мишени, а в других - к ее повышению.

Влияние модификаций активности HSF1 на уровень АФК и экспрессию генов сестринов

Итак, выше было показано, что экспрессия доминантно-активных мутантов белка Ras влияет на транскрипционную активность HSF1, причем это влияние противоположно в двух исследуемых типах клеток. Следующим шагом для подтверждения гипотезы, что влияние трансдукции активного Ras на уровень внутриклеточных АФК и экспрессию генов сестринов является HSF1-зависимым, было создание конструкций, экспрессирующих модифицированный HSF1, и проведение оценки их воздействия на содержание АФК и экспрессию сестринов. В качестве модифицированных форм HSF1 были использованы конститутивно-активная форма HSF1 (HSFl-Act (Act); делеция аминокислотных остатков с 203 по 315) и доминантно-негативная форма HSF1 (HSFl-dN (dN); делеция аминокислотных остатков с 454 по 522), функциональность которых ранее была подтверждена [Voellmy et al.,2005] (рис.

7).

J

ДНК-свяэывающий домен

регуляторный домен_,

гидрофобные повторы

202

трансактивационный домен

453 523 529

нш ■

HSF1 дикий тип

конститутивно-активный HSF1

доминантно-негативный HSF1

Рис. 7. Модификации транскрипционного фактора Н8Р1.

Путем трансдукции полученных плазмид, несущих конститутивно-активную и доминантно-негативную формы Н8Р1, в НаСаТ и ФЧ, были получены клеточные культуры, стабильно экспрессирующие трансгены. Присутствие введенных последовательностей ШР1 в полученных сублиниях через 11-24 дня после инфекции было подтверждено с помощью ОТ-ПЦР (рис. 8А). Функционирование данных конструкций было проверено путем анализа изменений уровня транскрипционной активности НЭР1 при их совместном введении с репортерной конструкцией рЬепиА-тСМУ-Н8Е-Ьис-риго, содержащей НвП-респонсивные элементы и показали, что активный 118Р1 повышает уровень экспрессии люциферазы, тогда как Н8Р1-ёЫ понижает (рис. 8Б).

Рис. 8. Подтверждение наличия (А) и функциональности (Б) конструкций HSFl-Act и HSFl-dN в НаСаТ и фибробластах.

А) Присутствие мРНК введенных конструкций HSFl-Act и HSFl-dN в НаСаТ и ФЧ. Б) Анализ влияния экспрессии HSFl-Act и HSFl-dN в НаСаТ и ФЧ на активность лтоциферазного репортера. Представлены средние значения суммарной люминесценции в пяти экспериментах.

Получив вышеперечисленные сублинии, была проведена оценка влияния экспрессии HSFl-Act и HSFl-dN на уровень АФК и экспрессию генов сестринов. Результаты экспериментов показали, что трансдукция HSFl-Act в НаСаТ приводит к 1,3-кратному увеличению уровня АФК (рис. 9А) и уменьшению экспрессии SESN3 (рис. 9Б, В), тогда как результатом экспрессии активного HSF1 в фибробластах является 1,5-кратное снижение содержания АФК (рис. 9А) и повышение уровня мРНК SESN3 (рис. 9Б, В). Трансдукция HSFl-dN не оказывает значимого влияния на уровень АФК и экспрессию сестринов ни в НаСаТ, ни в фибробластах. Кроме того, отметим, что активный HSF1 влияет только на экспрессию SESN3, тогда как уровни мРНК SESN1 и SESN2 не изменяются (рис. 9А, Б, В). Это говорит о том, что эффект активных форм белка Ras только на экспрессию гена SESN3, по-видимому, является HSFl-зависимым.

фибробласты

НаСаТ

I

В)

Б)

PL6 Act dN

тубулим SESN3 SESN1 SESN2

o,s

PL6 Act dN

PL6 Act dN

o

Рис. 9. Влияние экспрессии HSFl-Act и HSFl-dN на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в фибробластах человека (слева) и НаСаТ (справа).

А) Средние значения суммарной флюоресценции DCF в 5x104 клеток в трех экспериментах. Б) Результаты ОТ-ПЦР анализа уровня мРНК SESN1, SESN2, SESN3. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. мРНК а-тубулина использовали как контроль количества нанесенных образцов. В) Относительная интенсивность полос SESN3, SESN1 и SESN2 представлена как отношение интенсивности полос SESN3, SESNJ и SESN2 к интенсивности полос а-тубулина. Среднее значение ± стандартное отклонение, *р < 0.05.

Так как результаты экспериментов показали, что экспрессия конститутивно-активной формы HSF1 оказывает противоположные эффекты на уровень АФК и содержание мРНК SESN3 в НаСаТ и нормальных фибробластах, возникал вопрос, какие возможные отличия между этими двумя исследуемыми типами клеток могут определять, характер воздействия HSF1 на экспрессию гена SESN37 Фибробласты человека и НаСаТ различаются по гистогенетическому происхождению и степени «нормальности». Для оценки возможной роли этих факторов были выбраны две опухолевые клеточные линии, одна из которых имеет эпителиальное происхождение (НСТ116, клетки рака ободочной кишки человека), а другая соединительнотканное (НТ1080, фибросаркома). То есть эти две клеточные линии являются «не нормальными» и имеют происхождение сходное с НаСаТ и фибробластами, соответственно. Путем трансдукции HSFl-Act и HSFl-dN в данные клеточные линии и оценки влияния их экспрессии на содержание АФК и уровень мРНК генов сестринов, было показано, что и в НСТ116, и в НТ1080 экспрессия активного HSF1 приводит к увеличению содержания АФК (1,7-кратному в НСТ116 и 1,2-кратному в НТ1080) и снижению уровня мРНК SESN3 (рис. 10А, Б, В). То есть

эффект трансдукции ПЭР 1-Ас1 в этих клеточных линиях схож с таковым в НаСаТ. Кроме того в случае НСТ116 было также обнаружено, что экспрессия доминантно-негативной формы Н8Р1 приводит к 1,3-кратному снижению уровня АФК и повышению экспрессии БЕБАГ3 (рис. 10А, Б, В, слева).

А)

I

Б)

В)

ы

НСТ116

НТ1080

pLÍ Act

тубулии SESN3 SESN1 SESN2

|

pL6 Act dN

i

II

PLS Act dN

pL6 Act dN

Рис. 10. Влияние экспрессии HSFl-Act и HSFl-dN на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в НСТ116 (А) и НТ1080 (Б).

А) Средние значения суммарной флюоресценции DCF в 5 х 104 клеток в трех экспериментах. Б) Результаты ОТ-ПЦР анализа уровня мРНК SESN1, SESN2, SESN3. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. мРНК а-тубулина использовали как контроль количества нанесенных образцов. В) Относительная интенсивность полос SESN3, SESN1 и SESN2 представлена как отношение интенсивности полос SESN3, SESN1 и SESN2 к интенсивности полос а-тубулина. Среднее значение ± стандартное отклонение, *р < 0.05.

Результаты этих экспериментов указывают, что не происхождение, а скорее выраженность признаков неопластически трансформированного фенотипа определяет характер влияния модификаций фактора HSF1 на экспрессию гена SESN3 и, как следствие, уровень АФК.

Таким образом было обнаружено, что экспрессия активированного белка Ras приводит к повышению содержания АФК и снижению мРНК SESN3 в обоих типах исследуемых клеток (НаСаТ и ФЧ); увеличению транскрипционной активности HSF1 в НаСаТ и ее уменьшению в фибробластах. Кроме того, трансдукция активного HSF1 повышает уровень АФК и подавляет экспрессию SESN3 в НаСаТ и приводит к противоположным

эффектам в фибробластах. Согласно предположению об Н8Р1-зависимом Яаз-индуцируемом повышении содержания АФК и снижении экспрессии сестринов, подавление активности НвР1 в фибробластах должно было бы приводить к тем же эффектам, что и ее повышение в НаСаТ (увеличению уровня АФК и подавлению экспрессии SESNЗ). Однако трансдукция доминантно-негативной формы ШР1 не приводила к подобным эффектам (рис. 9А, Б, В, справа). Возможной причиной этого могло являться то, что доминантно-негативный мутант Н8Р1 в недостаточной степени подавляет активность Р18Р1. Поэтому была создана конструкция, содержащая эЬРНК Я57*7 (бЬНЗР!). Для ее трансдукции в фибробласты использовали вектор рЬЭЬ-риго (в качестве контроля использовались клетки с введенным вектором рР8Ь-риго-зЬОРР). Экспрессия эЫРЧР 1 приводила к понижению активности люциферазного репортера при их совместном введении и уменьшению уровня тотального белка Н8Р1 (рис. 11 А, Б). Эти эффекты сопровождались снижением уровня мРНК БЕБЫЗ и 1,5-кратным увеличением содержания АФК (рис. 12).

вИСГР вЬНБР!

Рис. 11. Влияние трансдукции зЬН8Р1 на активность люциферазного репортера (А) и на количество тотального белка НЗР1 (Б) в фибробластах.

А) Представлены средние значения суммарной люминесценции в пяти экспериментах. Среднее значение ± стандартное отклонение, *р < 0.05. Б) Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Белок актин использовали в качестве контроля количества нанесенных образцов.

Рис. 12. Влияние трансдукции shHSFl и на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в фибробластах. А) Средние значения суммарной флюоресценции DCF в 5 х 104 клеток в трех экспериментах. Б) Результаты ОТ-ПЦР анализа уровня мРНК SESN1, SESN2, SESN3. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. мРНК а-тубулина использовали как контроль количества нанесенных образцов. В) Относительная интенсивность полос SESN3, SESN1 и SESN2 представлена как отношение интенсивности полос SESN3, SESN1 и SESN2 к интенсивности полос а-тубулина. Среднее значение ± стандартное отклонение, *р < 0.05.

Для дальнейшей проверки предположения о HSF1-зависимом характере Ras-индуцируемого снижения экспрессии SESN3 и повышения уровня АФК была проведена совместная трансдукция в клетки НаСаТ shHSFl и RasV12 (RasV12 был выбран вследствие того, что он оказывал наибольшее влияние на экспрессию SESN3 и уровень АФК). В качестве контролей использовались клеточные сублинии, экспрессирующие shHSFl и «пустой» вектор pLXSN, вектор pLSL-puro-shGFP, а также RasV12. Сублинии, экспрессирующие shHSFl, демонстрировали снижение уровня тотального белка HSF1, а сублинии, экспрессирующие RasV12, - повышенное содержание белка Ras (рис. 13).

Рис. 13. Влияние трансдукции shHSFl и RasV12 на уровень тотального белка HSF1 и Ras в НаСаТ.

Представлены типичные

результаты одного из трех экспериментов. Белок актин использовали в качестве контроля количества нанесенных образцов.

В сублиниях НаСаТ наблюдалось небольшое (1,2-кратное) снижение уровня АФК и повышение экспрессии SESN3 при инактивации HSF1 с помощью shPHK. Результаты показали, что в сублиниях, экспрессирующих shHSFl, влияние экспрессии активного Ras на уровень АФК и содержание мРНК SESN3 отсутствует (рис. 14).

гЬ

shGFP shHSFl

тубулин SESN3 SESN1 SESN2

ShGFP BhHSFI

Рис. 14. Влияние трансдукции 5ЬНЗР1 и КазУ12 на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в НаСаТ.

А) Средние значения суммарной флюоресценции ПСР в 5 х 104 клеток в трех экспериментах. Б) Результаты ОТ-ПЦР анализа уровня мРНК ЖШ, 8ЕЬЪ'2, ЗЕЗЫЗ. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. мРНК а-тубулина использовали как контроль количества нанесенных образцов. В) Относительная интенсивность полос Ж5ВД, ЖЯУ/ и 5ЁЯ42 представлена как отношение интенсивности полос SESNЗ, Ъ'ЕЯМ! и к интенсивности полос а-

тубулина. Среднее значение ± стандартное отклонение,р < 0.05.

Результаты данной работы показывают, что, в дополнение к ранее описанным механизмам регуляции экспрессии генов сестринов -транскрипционным фактором р53 [Budanov et al., 2004] и белками семейства FoxO [Chen et al., 2010] - существует еще один путь, опосредованный транскрипционным фактором HSF1. р53 вовлечен в регуляцию экспрессии генов SESN1 и SESN2, тогда как белки FoxO - гена SESN3, поэтому можно предположить участие и HSF1, и белков FoxO в Ras-индуцированном снижении уровня мРНК гена SESN3. Однако данные об отмене влияния активного белка Ras на экспрессию гена SESN3 и уровень АФК в клетках с подавленной активностью HSF1 указывают на первичную роль HSF1 в осуществлении этих эффектов по крайне мере в иммортализованных кератиноцитах человека линии НаСаТ.

Влияние изменений активности HSF1 на размножение клеток in vitro

Известно, что изменение уровня внутриклеточных АФК может влиять на многие клеточные процессы, включая скорость пролиферации, метаболизм и апоптоз. Причем эффект зависит от концентрации АФК. Например, если в клетке слегка повысить содержание АФК, то это может привести к стимуляции клеточного роста, однако, если концентрация будет выше, то результатом может являться ингибирование роста, а при очень больших концентрациях -клеточная смерть [Day et al., 2005]. Транскрипционный фактор HSF1, в свою очередь, рассматривается в качестве мишени для терапии опухолей, поэтому исследование его связи, в частности, с процессами клеточной пролиферации является актуальным на настоящий момент. Вследствие того, что результатом трансдукции активной формы HSF1 в клетки НаСаТ, НСТ116, НТ1080 является

подавление экспрессии SESN3 и, как следствие, повышение уровня АФК, а в случае фибробластов к таким эффектам приводит инактивация HSF1, была проведена оценка влияния экспрессии модифицированных форм HSF1 на скорость роста клеток in vitro. Было показано, что трансдукция HSFl-Act приводит к снижению скорости роста НаСаТ и НСТ116; к подобному эффекту также приводит инактивация фактора HSF1 в фибробластах (рис. 15А). Однако, повышение уровня мРНК SESN3 и, как следствие, снижение содержания АФК за счет экспрессии доминантно-негативной формы HSF1 в клетках НСТ116, shHSFl в НаСаТ и активного мутанта HSF1 в фибробластах не влияет на скорость роста клеточных культур (рис. 15Б).

д^ . Фибробласты

- ,hGFP (

-»(iHSfl '

/J

Дни инкубации ■ SESN3

I I

НаСаТ

.. plS

J

»tiGfP athMSFI

Hi SESN3 i О ROS P

ll

НСТ11Б

pte

v

Л.

Ш afiSNJ

□ ROS

I

I

2 - I ■ -=••• *

X

/

. ShGFP »KHSF1 >

.У

Дни инкубации

■В SESN3 □ R08 ?

I I

•hGFP shHSFl

■ISESN3. О ROS

■ I

Рис. 15. Влияние различных модификаций функции ГОР1 на кинетику размножения и уровни АФК и мРНК 8Е8ИЗ в культурах клеток НР, НаСаТ и НСТ116.

А) Влияние введения конструкций 1Ш1, уменьшающих экспрессию гена 5'Е&ЫЗ и повышающих содержание АФК. Б) Влияние введения конструкций НЯР1, увеличивающих экспрессию гена БЕБЫЗ и понижающих содержание АФК.

Каждая точка - средняя величина для 3-х лунок; представлены типичные данные одного из трех экспериментов. Внизу представлены результаты влияния трансдукции модифицированных форм Н8Р1 и 5ЬН8Р1 на уровни АФК и мРНК БЕЗЫЗ. Среднее значение ± стандартное отклонение, *р < 0.05.

Так как влияние трансдукции активной формы Н8Р1 (НаСаТ, НСТ116) и зЬН8Р1 (фибробласты) на рост клеток могло быть связано с повышением уровня АФК вследствие ингибирования экспрессии гена было

исследовано влияние подавления экспрессии этого гена за счет введения эЬРНК к ЗЕЯМ3 (использовали вектор рЬ^Ь-риго-зИЗЕЗЮ) на скорость пролиферации данных клеточных культур (НаСаТ, НСТ116, фибробласты). Как видно из рисунка 16 введение эЬЗЕХЫЗ приводит к ожидаемому уменьшению количества мРНК Ж5Ю и увеличению уровня АФК, а также к снижению скорости роста клеточных культур. В качестве контроля были использованы клетки, трансдуцированные вектором рЬЯР-ршо-зЬСРР.

ь

Е 35

* 30 О

t~ га о

5 *>

О 15

Фибробласты

BhGFP shSESN3

Л-

Л

Дни инкубации

НаСаТ

Дни инкубации

НСТ116

- stlGFP

- shSESNS

Дни инкубации

If У

I I ROS

shGFP SHSESN3

■ SESN3 □ ROS

shGFP shSESN3

МШ SESN3 □ ROS

ShGFP ^ shSESN3

Рис. 16. Влияние подавления экспрессии SESN3 в фибробластах, НаСаТ и НСТ116 на скорость роста клеточных культур in vitro.

Каждая точка - средняя величина для 3-х лунок; представлены типичные данные одного из трех экспериментов.

Внизу представлены результаты влияния трансдукции shSESN3 на уровни АФК и мРНК SESN3.

Среднее значение ± стандартное отклонение, *р < 0.05.

Эти данные указывают на то, что Н8Р1-индуцированное ЗЕ^ЫЗ-зависимое снижение скорости роста клеток связано скорее с функциями гена БЕБЫЗ, включающими регуляцию содержания внутриклеточных АФК, чем с какой-либо другой, независимой от процессов окисления-восстановления, его активностью. Об этом свидетельствует тот факт, что независимое от окислительно-восстановительных процессов антипролиферативное влияние гена SESNЗ наблюдали при его повышенной экспрессии, тогда как результаты данной работы указывают на редокс-зависимое снижение скорости роста клеточных культур при пониженном уровне мРНК гена SESN3.

Как уже было показано ранее [Коршп ег а/., 2007] возрастание уровня АФК может приводить к увеличению количества активного р53, белка, участвующего во многих ключевых процессах клеточной жизнедеятельности, в частности, в процессе пролиферации [Ье\те е! а/., 1997]. Для проверки

предположения, что р53, а также его мишень белок р21

Cip/WAFl

являющийся

ингибитором циклин-зависимых киназ, могут играть роль в S ESN3 -зависимом снижении скорости роста клеточных культур, было оценено содержание белков р53 и р21 в клетках с подавленной экспрессией гена SESN3 (фибробласты, НаСаТ, НСТ116) (рис. 17). Результаты вестерн-блот анализа показали, что уровень белка p21cip/WAF1 значительно повышался во всех клеточных культурах, экспрессирующих shSESN3. В случае р53, его количество заметно увеличивалось в фибробластах с подавленной экспрессией SESN3, однако, в кератиноцитах и НСТ116 повышение уровня р53 было не столь очевидно. Это указывает на возможное наличие р53-независимых механизмов увеличения содержания белка p2icipl/WAF1 по крайне мере в НаСаТ и НСТ116.

Фибробласты НаСаТ НСТ116

Рис. 17. Влияние транедукции shSESN3 на уровень белков р53 и p2iCjP/WAF1 в нормальных фибробластах, НаСаТ и НСТ116.

Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Белок актин использовали в качестве контроля количества нанесенных образцов.

Влияние изменений активности HSF1 на рост клеток in vivo

В последнее время ингибирование активности транскрипционного фактора HSF1 все чаще рассматривают в качестве мишени для таргетной терапии опухолей [Solimini et al., 2007; Whitesell et al., 2009]. Однако данные об участии HSF1 в процессах канцерогенеза противоречивы. Многие работы демонстрируют, что подавление активности HSF1 негативно влияет на развитие опухолей. Однако следует отметить, что в большинстве таких работ использовались опухолевые клеточные культуры, которые дополнительно подвергали либо воздействию онкогенов [Khaleque et al., 2005], либо ингибировали в них функции опухолевых супрессоров, в частности гена р53 [Dai et al., 2007]. Результаты других работ показывают, что, наоборот, повышение активности HSF1 может препятствовать развитию процессов канцерогенеза в определенных условиях. Все эти противоречия могут объясняться условиями проведения экспериментов, различиями в наборе факторов, которыми воздействовали на клеточные культуры, а также типом исследуемых клеток. Данные недавней работы с использованием ChIP-Seq анализа как раз указывают на то, что мишени транскрипционного фактора

HSF1 (а, следовательно, и последствия воздействия на них) могут сильно варьировать в зависимости от клеточного контекста [Mendillo et al., 2012].

Выше было показано, что в зависимости от типа клеток различные модификации HSF1 приводят к снижению скорости роста клеточных культур. В частности, впервые было продемонстрировано, что экспрессия активного HSF1 в кератиноцитах и НСТ116 уменьшает скорость роста клеток in vitro (рис. 15). На следующем этапе данной работы была проведена оценка влияния конститутивно-активной формы HSF1 также и на рост подкожных ксенографтов у бестимусных мышей. В качестве контроля были инъецированы клетки НСТ116, содержащие «пустой» вектор pL6modl. Было обнаружено, что скорость роста опухолевых ксенографтов, экспрессирующих активный HSF1, замедляется (рис. 18), что согласуется с кинетикой роста клеток НСТ116, содержащих HSFl-Act, in vitro (рис. 15А).

НСТ116

Рис. 18. Влияние экспрессии активной формы Н8Р1 на скорость роста подкожных опухолей. Приведены средние значения, полученные при анализе 8-12 опухолей в каждом из трех экспериментов.

Известно, что скорость роста опухолей может зависеть не только от пролиферативной, но и от ангиогенной активности неопластических клеток, которая определяет степень васкуляризации опухолей. Чтобы оценить имеет ли место влияние экспрессии активного ШР1 на ангиогенную активность клеток был проведен иммуногистохимический анализ срезов опухолевых тканей, окрашенных антителами к С034, узнающих эндотелиальные клетки кровеносных сосудов. Анализ показал, что результатом экспрессии конститутивно-активной формы ПЭР 1 является уменьшение числа сосудов с просветами (р < 0.02) (рис. 19), то есть питание опухолевых клеток, содержащих Н8Н1 -А с!, осуществляется менее интенсивно по сравнению с контрольными линиями.

НСТ116 pL6 Act

CD34

8 § мл

S

I:»" I 5»"

О я

* г t,*

I сосуды с просветами 3 сосуды 6« просветов

Рис. 19. Влияние трансдукции активной формы 118Р1 на ангиогенез. Вверху, иммуногистохимическое

окрашивание срезов опухолей НСТ116 антителами на С034. Для каждой экспериментальной группы

представлены типичные поля зрения. Внизу, приведены результаты подсчета С034 положительных структур. Среднее значение ± стандартное отклонение, *р < 0.02.

Act pL6

А) Б)

Act pL6

HIF1a

P-Erk1/2 Erk1/2

р-актин

+ ++

Рис. 20. Влияние трансдукции активной формы HSF1 на экспрессию белков Erkl/2 and HIF-la.

А) Вестерн-блот анализ клеточных культур. Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Б) Иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолей антителами на HIF-la. Для каждой экспериментальной группы представлены типичные поля зрения. Для количественной оценки уровня экспрессии HIF-la ввели следующие обозначения: (+) — низкий, (++) — средний.

В основе воздействия изменений функции транскрипционного фактора HSF1 на пролиферативную и ангиогенную активность клеток могут лежать несколько механизмов, включая HSP-опосредованное изменение стабильности/активности MAPKs, Akt, mTOR и HIF-la [Solimini el a/., 2007]. Так как ключевыми регуляторами клеточной пролиферации и ангиогенеза считаются, соответственно, МАР-киназы Erkl/2 и HIF-la [Diaz-Gonzalez et al., 2005; Meloche et al., 2007], был проведен анализ содержания фосфорилированных (активных) форм Erk и белка HIF-la в клетках НСТ116, экспрессирующих конститутивно-активную форму HSF1. Вестерн-блот анализ показал снижение содержания фосфорилированных форм Erk (р42 и р44) и уровня белка HIF-la (рис. 20А). Результаты иммуногистохимического анализа опухолевых срезов, окрашенных антителами к HIF-la, полностью согласовывались с данными вестерн-блот анализа (рис. 20Б).

Выводы

1) Установлено, что гиперэкспрессия различных мутантных белков Ras в клетках человека приводит к временному увеличению уровня внутриклеточных АФК и снижению экспрессии гена SESN3.

2) Впервые продемонстрировано влияние экспрессии мутантных форм онкобелка Ras на активность транскрипционного фактора HSF1. При этом обнаружено, что данный эффект зависит от типа клеток: в нормальных фибробластах экспрессия Ras снижает активность HSF1, тогда как в иммортализованных кератиноцитах линии НаСаТ транскрипционная функция HSF1 повышается.

3) Впервые продемонстрировано влияние изменений активности HSF1 на экспрессию гена SESN3 и уровень внутриклеточных АФК. Установлено, что результатом подавления активности HSF1 в нормальных фибробластах человека является снижение уровня мРНК SESN3 и, как следствие, увеличение содержания АФК. В клетках НаСаТ, НСТ116 и НТ1080 к репрессии гена SESN3 и повышению уровня АФК приводит не уменьшение, а увеличение транскрипционной активности HSF1.

4) Обнаружено, что модификации активности HSF1, модулируя экспрессию гена SESN3, изменяют скорость пролиферации культур клеток разных типов.

5) Обнаружено, что в основе SESN3-зависимого снижения скорости роста клеток in vitro лежит повышение внутриклеточного содержания белка-ингибитора циклинзависимых киназ p21c'pl/Wafl. Анализ связи повышения содержания p2lCipl/Wafl с активацией р53 в клетках разных типов указывает на существование как р53-завивимого, так и р53-независимых механизмов активации p2lc,pl/Wafl в ответ на репрессию SESN3 и/или повышение уровня АФК.

6) Впервые продемонстрировано снижение скорости роста подкожных ксенографтов рака ободочной кишки человека НСТ116, экспрессирующих конститутивно-активную форму HSF1. Ингибирование транскрипционной активности HSF1, наоборот, увеличивает скорость роста ксенографтов НСТ116. Эти изменения скорости опухолевого роста связаны с соответствующими изменениями в уровне фосфорилирования МАР-киназы ERK, экспрессии HIF-la и ангиогенной активности опухолевых клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. М. А. Замкова, П. Б. Копнин, Н. В. Хромова, Б. П. Копнин. Влияние изменений активности HSF1 на рост клеток рака ободочной кишки человека in vitro и in vivo.// Российский биотерапевтический журнал. -2012-Т.11,№.1 - с. 59-65.

2. Zamkova М, Khromova N, Kopnin BP, Kopnin P. Ras-induced ROS upregulation affecting cell proliferation is connected with cell type-specific alterations of HSFl/SESN3/p21 (Cipl/WAFl) pathways.// Cell Cycle. - 2013 -12(5)-p. 826-36.

Тезисы конференций:

1. Zamkova M., Kopnin B. HSF1 participation in realization of RAS effects in tumor cells.// The Ukrainian Biochemical Journal. - 2009 - T. 81, No.4 (специальный выпуск). — P. 140.

2. Замкова M.A., Копнин П.Б., Хромова Н.В., Копнин Б.П. Изменения активности транскрипционного фактора HSF1 влияют на скорость роста клеток рака ободочной кишки человека in vitro и in vivo.// Сборник тезисов 14 международной пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века». - 2010 - Т. 2 - С. 137.

3. М. Zamkova, P. Kopnin, В. Kopnin. Heat shock transcriptional factor 1 effect on the level of reactive oxygen species via regulation of sestrins' expression depends on cell type.// The EMBO Meeting 2010 (Abstracts) - P.196.

4. M. Zamkova, P. Kopnin, N. Khromova, B. Kopnin. The influence of modifications of HSF1 activity on human carcinoma cells growth.// Journal of Medical Genetics. - September 2010. - Vol 47 Supplement 1.

Подписано в печать:

08.07.2014

Заказ № 10106 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru