Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Изменение активности пролинспецифических пептидаз мозга при экспериментальном моделировании амнезии

На правах рукописи

□03448924

НАЗАРОВА ГАЛИНА АЛЕКСЕЕВНА

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОЛИНСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЕПТИДАЗ МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ АМНЕЗИИ

14.00.16 - патологическая физиология

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 онт2т

Москва - 2008

003448924

Работа выполнена в лаборатории общей патофизиологии нервной системы Государственного учреждения Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской АМН и лаборатории психофармакологии Государственного Учреждения Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В.Закусова Российской АМН

Научные руководители: доктор биологических наук

Н.А.Крупина доктор биологических наук Н.Н.Золотов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Г.А. Романова

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, Р.У.Островская

Ведущее учреждение:

Московский государственный университет им. М.ВЛомоносова, факультет фундаментальной медицины

Автореферат разослан <Е\ >

2008 года

Защита диссертации состоится » ¿¡¿¿"Э Л^ —У 2008 года в

заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 пр^аучно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315, Москва, Балтийская улица, дом 8.

' / часов

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.Н.Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Амнезия встречается как самостоятельное заболевание и как симптом целого ряда тяжелейших нервно-психических и соматических расстройств (деменции различного типа, нейродегенеративные заболевания, сосудистые нарушения, травмы, адциктивные расстройства и др) (МКБ-10, 1995; Kopelraan M.D., 1987, 2002; Milner В., 2005). По данным международных организаций и специальных исследований неуклонное старение населения планеты (Пресс-бюллетень Информ. Центра ООН в Москве, 2007; Ritchie R-, Lovestone S., 2002) сопровождается ростом числа деменций от 5 до 30 и более процентов в зависимости от региона и этнической принадлежности обследованных популяций (Stevens T. et al., 2002; Demirovic J. et al., 2003; Sikström S., 2007). Наиболее частой причиной деменции в пожилом возрасте является болезнь Альцгеймера, относящаяся к первично-дегенеративным заболеваниям и характеризующаяся прогрессирующим снижением когнитивных функций (Дамулин И.В. 1995; Яхно H.H., Преображенская И.С., 2002; Demirovic J. et al., 2003; Stevens T. et al., 2002). По данным Центра психического здоровья РАМН до 4,5-5,0% населения Москвы в возрасте 60-65 лет страдают деменцией альцгеймеровского типа (Гаврилова С.И., 2002). Затраты на терапию болезни Альцгеймера сопоставимы с затратами на онкологические и кардиологические заболевания. Нарушения когнитивной деятельности, включающие амнезии, приводят к выраженной социальной дезадаптации больных, резкому снижению качества жизни не только самих больных, но и их родственников. Изучение механизмов развития мнестических расстройств и поиск новых подходов к их патогенетической терапии представляет собой важную медико-биологическую и социально-экономической проблему, поскольку по мере роста числа больных с нарушениями памяти, вызванными целым рядом причин, обществу требуется все больше сил и средств для ведения таких больных.

По существующим в настоящее время представлениям, к развитию мнестических расстройств могут приводить нарушения функционирования различных механизмов, вовлеченных в процесс следообразования, - нейрофизиологических, нейромедиаторных, молекулярных (Крутиков Р.И., 1989; Гомазков O.A., 2004; Ещенко Н.Д., 2004; Муравьева Е.В. Анохин К.В., 2006; Cammarota M. et al., 2000; Compte A. et al., 2000, 2003; Harkany T., Penke В., Luiten P.O., 2000; Malleret G. et al, 2001; Morris R.G., 2006), в целом свидетельствующие о дизрегуляции одной из интегративных систем организма - нервной системы - как основы нарушений памяти (Крыжановский Г.Н., 2002).

В последние годы внимание исследователей привлекает изучение роли нейропептидов в опосредовании процессов памяти и ее нарушений (Ашмарин И.П. и др., 1990-2006; Гомазков, O.A., 2004; Романова Г.А. и др., 2002, 2006; Вао Х.М. et al., 2002; Gölpinar М.А., Yegen B.C., 2004; McEwen B.B. 2004; Jahn О. et al., 2005; Aguilar-Valles A. et al., 2007). Согласно современным представлениям, одним из механизмов изменения уровня биологически активных пептидов в организме является интенсивность их метаболизма - скорость процессинга и деградации. В проявлении физиологических

свойств пептидов одну из главных ролей играют протеолитические ферменты -пептадазы, определяющие количественный и качественный состав регуляторных пептидов. Даже незначительная дизрегуляция функции этих ферментов может вести к возникновению ряда патологических состояний ЦНС, к которым относятся, в том числе, и заболевания, связанные с нарушением памяти. Известно, что многие пептиды, опосредующие процессы памяти, являются субстратами пролинспецифических пептидаз, в частности, пролилэндопептидазы (ПЭП) и дипептидилпептидазы IV (ДП-IV). Показано, что у крыс с возрастом наблюдается увеличение активности ПЭП в различных структурах мозга (Agirregoitia N. et al., 2003, 2007). Увеличение активности ПЭП обнаружено в клинике в структурах мозга пациентов с болезнью Альцгеймера (post mortem) (Park Y.S. et al., 2006). В эксперименте выявлено изменение активности и экспрессии ПЭП при нарушениях памяти на моделях деменции альцгеймеровского типа (Rossner S., et al., 2005). Однако в целом данные о характере изменения активности ПЭП при расстройствах, сопровождаемых развитием амнезий, противоречивы. Прямых данных об изменении активности ДП-IV при нарушениях памяти в клинике и в эксперименте нет. Тем не менее, наличие у фермента субстратов, участвующих в модуляции когнитивных процессов (Minthon L., et al.,1996; Mentlein R., 1999; Redrobe J.P. et al., 2004), позволяет предполагать участии ДП-IV в механизмах обучения и памяти, а также в механизмах старения. Накапливаются данные о том, что ПЭП и ДП-IV могут влиять на функции ЦНС и модулировать мнестическую деятельность путем воздействия на механизм трансдукции (Gerwins Р., Fredholm В.В., 1992; Lynch М.А., et al., 1994; Schultz et al., 2002; Aertgeerts et al., 2003).

Имеется достаточно большое количество данных об антиамнестической эффективности ингибиторов ПЭП (Золотов H.H. и др., 1992; Yoshomoto et al., 1987; Toide К, et al., 1995;Mari ghetto et al., 2000; Bellemdre G., et a!., 2005; Garcia-Horsman J.A. et al., 2007; Männistö, P.T. et al., 2007;) при недостаточности сведений об изменении активности фермента в ЦНС при мнестических расстройствах. В последнее время появляются все новые ингибиторы ПЭП, антиамнестическая эффективность которых еще не изучена.

Все вышеизложенное указывает на актуальность исследования роли пептидаз в патогенезе амнезии и в поиске подходов к созданию новых ноотропных средств на основе ингибиторов пептидаз мозга.

Цель исследования заключалась в проведении сравнительного анализа активности протеолитических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV в структурах мозга крыс при разных способах моделирования амнезий и изучении возможности коррекции экспериментальных нарушений мнесгической деятельности новыми ингибиторами пролилэндопептидазы.

Задачи исследования:

1) Исследовать изменение активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-IV в гиппокампе и фронтальной коре мозга крыс в тесте условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) на моделях ретроградной амнезии, вызванной

максимальным электрическим шоком и острым введением антагониста М-холинорецептора скополамина.

2) Исследовать изменение активности ПЭП и ДП-1У в гиппокампе и во фронтальной коре мозга крыс при моделировании хронической амнезии путем субхронического системного введения скополамина,

3) Исследовать изменение активности ПЭП и ДП-1У в гиппокампе, фронтальной коре мозга крыс и гипоталамусе при моделировании деменции альцгеймеровского типа путем разрушения ядер Мейнерта холинотоксином АР-64 А.

4) Исследовать изменение активности ПЭП и ДП-1У в структурах мозга крыс в процессе естественного старения в сочетании с оценкой мнестических функций в тесте УРПИ.

5) Исследовать активность пептидаз у старых животных в зависимости от их способности к обучению.

6) Провести изучение антиамнестических свойств новых ингибиторов ПЭП на моделях ретроградной амнезии и при нарушениях памяти, вызванных естественным старением крыс, и изучить их влияние на активность ПЭП в структурах мозга.

7) Сравнить эффекты новых ингибиторов ПЭП и пирацетама на моделях ретроградной амнезии.

Научная новизна. Впервые выявлен схожий характер изменений активности пролинспецифических ферментов ПЭП и ДП-1У в структурах мозга крыс на моделях острой ретроградной амнезии, а также у крыс с амнезией, вызванной хроническим введением скополамина. Обнаружено повышение активности ПЭП во фронтальной коре мозга и гиппокампе, а также снижение активности ДП-ГУ во фронтальной коре. Показано, что антиамнестическое действие новых ингибиторов ПЭП - бензилоксикарбонильных и трет-бутилоксикарбонильных производных ' аминоацилцианопирролидина -сопровождается нормализацией активности ПЭП в структурах мозга. Выявлена корреляционная взаимосвязь между эффективностью антиамнестического действия ингибиторов ПЭП на моделях ретроградной амнезии в тесте условного рефлекса пассивного избегания и снижением повышенной активности ПЭП в коре и гиппокампе. На модели деменции альцгеймеровского типа, вызванной разрушением ядер Мейнерта холинотоксином АР-64А, в отличие от модели хронической амнезии, вызванной многократным введением скополамина, показано снижение активности ПЭП и ДП-1У в структурах мозга крыс. Впервые показано изменение активности ПЭП и ДП-ГУ у крыс в динамике старения. Установлено, что у плохо обучаемых старых крыс по сравнению с хорошо обучаемыми повышена активность ПЭП, но не ДП-П/ в коре и подкорковых структурах мозга. На модели естественного старения продемонстрирована высокая антиамнестическая эффективность неконкурентного ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-глутаминил-цианопирролидина.

Теоретическая и практическая значимость. Получены прямые свидетельства участия пролинспецифических ферментов ПЭП и ДП-IV в механизмах нарушения памяти, что расширяет существующие в настоящее время представления о дизрегуляционных механизмах развития амнезий различной этиологии, в том числе, мнестических нарушений при нейродегенеративных заболеваниях. Полученные данные об актиамнестической эффективности ряда ингибиторов ПЭП дипептидной природы на разных экспериментальных моделях амнезий подтверждают наличие общих механизмов в' развитии мнестических расстройств различной природы. Проведенный скрининг восьми новых дипептидных ингибиторов ПЭП позволил выявить наиболее эффективные соединения с антиамнестическим действием - бензилоксикарбонил-глутаминил-цианопирролидин (Z-GIn-Prd-N) и бензилоксикарбонил-метионил-цианопирролидин (Z-Met-Prd-N). Полученные результаты являются основой для поиска и разработки препаратов, которые могут составить новую группу ноотропов, перспективных для включения в комплексную патогенетическую терапию амнезий.

Положения, выносимые на защиту.

1. Нарушения мнестической деятельности различной этиологии сопровождаются изменением активности пролинспецифических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы-IV в структурах мозга крыс.

2. Улучшение мнестической деятельности под влиянием дипептидных ингибиторов пролилэндопептидазы сопровождается нормализацией активности пролилэндопептидазы в мозге крыс с ретроградной амнезией.

3. При естественном старении у плохо обучаемых крыс активность пролилэндопептидазы в структурах мозга выше, чем у хорошо обучаемых. Ингибитор пролилэндопептидазы Z-GIn-Prd-N улучшает мнестическую деятельность у старых крыс и нормализует активность фермента.

Апробация. Основные положения и результаты исследования были доложены на Второй международной конференции "Biological Basis of Individual Sensitivity to Psychotropic Drugs" (Москва, 1993), на Ш Российском конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), XVI Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2007), Международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные соединения» (Белоруссия, Гродно, 2007).

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проведены на беспородных белых крысах-самцах я животных линии Внстар. Было использовано 1011 крыс. Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде.

Новые дипептидные ингибиторы ПЭП были разработаны с использованием фармакологического дизайна H.H. Золотовым и синтезированы В.Ф.Поздневым. Изучены следующие соединения - неконкурентные ингибиторы ПЭП: Boc-Ala-Prd-N; Вос-Trp-Prd-N; Z-Trp-Prd-N; Z-Gln-Prd-N; MeOZ-Ala-Prd-N; Z-Met-Prd-N; Boc-nVal-Prd-N; Z-Prd (где MeOZ- 4-метоксибензилоксикарбонил - защитная группа по N-концу; Z - бензилоксикарбонил - защитная группа по N-концу; Prd-N - цианопирролидин; Prd -пирролидин; Вое - трет-бутилоксикарбонил - защитная группа N-конца), обладающие различной степенью выраженности ингибирования ПЭП; Ala, Trp, Gin, Met, nVal -остатки аминокислот аланина, триптофана, глугамина, метионина и норвалина соответственно. В качестве препарата сравнения использовали ноотроп пирацетам в дозах 300 мг/кг [модель ретроградной амнезии, вызванной максимальным электрошоком (МЭИ!)] и 800 мг/кг (модель ретроградной амнезии, вызванной однократным введением скополамина) (Крайнева В А., 1997; Ахапкина Т.И., Воронина Т.А., 2005). Ингибиторы вводили за 20 мин (Золотов H.H., 1997), а препарат сравнения пирацетам вводили за 50 мин до обучения (Антонова М.И. и др., 2003). Для моделирования острой ретроградной и хронической амнезии был использован скополамин (Sigma, США). Выработку условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) осуществляли по стандартной методике (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств, 2005).

Ретроградную амнезию моделировали путем однократного введения скополамина в дозе 2,5 мг/кг, а также с применением МЭШ (сила тока 44 мА, частота тока 50 Гц, продолжительность 0,3 с) непосредственно после обучения. Для моделирования хронической амнезии применяли введение скополамина в дозе 1,0 мг/кг, внутрибрюшинно, в течение двух недель. Через 24 часа после последнего введения скополамина у крыс вырабатывали УРПИ. Моделирование деменции альцгенмеровского типа проводили путем билатерального введения холинотоксина AF-64А в дозе 57,5 мкг/сторону (Hanin I., 1992). Выработку УРПИ проводили через 2 недели после оперативного вмешательства. В качестве контроля использовали две группы крыс: ложно оперированных с введением физиологического раствора и интактных животных, которые не различались по латентному времени УРПИ. Экспериментальные исследования по выявлению мнестического дефицита у старых животных проводили на крысах 18-26 месячного возраста, которых разделяли на плохо и хорошо обучаемых. Если длительность латентного периода захода в темную камеру у крыс не превышала 60 с, то крыса считалась плохо обучаемой.

Тест на воспроизведение УРПИ проводили через 24 ч после обучения на всех моделях, а на модели естественного старения - также через 7 суток после обучения.

Сразу после тестирования крыс декапитировали и выделяли структуры мозга для определения активности ПЭП и ДП-IV.

Активность проликспецифических пептидаз измеряли флуорометрическим методом. Метод основан на определении освобождающегося в процессе ферментативной реакции 7-амино-4-метилкумарина с пептидом Z-AIa-Pro-MCA (для ПЭП) или с пептидом Gly-Pro-MCA (для ДП-IV), имеющего отличный от пептидов спектр флуоресценции. Гидролиз субстрата регистрировали после 30 минут инкубации при 37°С на спектрофлуорометре LS-5B (Peikin-Elmer, США). Количество освободившегося 4-метил-7-аминокумарина определяли из величины флуоресценции.

Белок определяли спектрофотометрически с красителем Кумасси голубьм G-250 по методу Брэдфорда (Bradford M, 1976), используя в качестве стандарта сывороточный альбумин человека (Sigma, США). Оптическую плотность проб измеряли на фотоколориметре КФК-2-УХЛ 4.2 (Россия) со светофильтром 590 нм или спектрофотометре UltroSpec III (Pharmacia-LKB, Швеция) при 595 нм.

Активность холинацетилтрансферазы (ХАТ) определяли по методу Fonnum (Fonnum, 1969), используя в качестве субстрата [1-|4С]-ацетилкоэнзим А. Ацетилхолин, образующийся в результате ферментативного переноса меченого по углероду ацетата на холин, определяли после его экстракции в органическую фазу радиометрически.

Статистическую обработку результатов проводили по алгоритмам программы "Statistica 6.0" и "Primer" с проверкой соответствия распределения эмпирических данных нормальному закону по критерию Колмогорова-Смирнова и проверкой равенства генеральных дисперсий в двух сравниваемых выборках. В случае выполнения условий применимости для сравнения средних значений двух независимых выборок использовали непарный параметрический t-критерий Стьюдента, при невыполнении - непарный непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Данные представлены в виде М±ш. В случае сравнения нескольких независимых выборок, в которых распределение эмпирических данных соответствовало нормальному закону, применяли однофакторный дисперсионный анализ ONE WAY ANOVA с последующим сравнением средних значений в рядах дисперсионного комплекса по тесту Стьюдента-Ньюмана-Кеулса (Student-Neuman-Keuls test). Корреляционную взаимосвязь выявляли путем расчета непараметрического коэффициента корреляции рангов Спирмэна (Rs). Принятый уровень значимости составлял 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изменения активности пептидаз в мозге крыс при моделировании ретроградной амнезии.

Воздействие МЭЩ на крыс опытной группы сразу после обучения УРПИ приводило к уменьшению латентного периода захода в темную камеру через 24 часа после обучения от 109,б±12,7 с (контрольная группа) до 36,2±15,0 с (опытная группа), то есть вызывало амнезию навыка (р < 0,05)

Активность ПЭП и ДП-1У во фронтальной коре и гиппокампе крыс при электрошоковой амнезии представлена в табл. 1.

Как видно из таблицы, активность ПЭП была повышена по сравнению с контролем как в коре (Р(2,27)=7,91; р=0,002; результаты постднсперсионного анализа приведены в таблице 1], так н в гиппокампе [Р(2,27)=8,16; р=0,002), а активность ДП-1У была снижена в коре [Р(2,27)=85,02; р=0,000] и оставалась без изменений в гиппокампе [Р(2,27)=0,49; р>0,05]. Пирацетам в дозе 300 мг/кг снижал активность ПЭП во фронтальной коре мозга и гиппокампе, и не оказывал влияния на активность ДП-1У.

Таблица 1.

Активность ПЭП и ДП-ГУ в структурах головного мозга крыс в контроле, после воздействия максимального электрошока и коррекции пирацетамом.

Фермент Активность (нмоль*мин"'*мг! белка)

Фронтальная кора Гиппокамп

Контроль МЭШ Пирацетам + МЭШ Контроль МЭШ Пирацетам + МЭШ

ПЭП 0 442±0 025 0.5б5±0.022* 0 468±0.022# 0.430±0 020 0.572=10.029* 0 478±0.026#

ДП-1У 0.099±0 005 0 068±0.003* 0 079±0.007* 0,ЮЗ±0,010 0,097±0,00б 0,092±0,007

По тесту Стьюдента-Ньюмана-Кеулса после однофакторного дисперсионного анализа' *р<0,05 - по сравнению с контролем в соответствующей структуре мозга (п=10); # р<0,05 - по сравнению со значением в группе с применением МЭШ (п=10).

При моделировании ретроградной амнезии однократным введением скополамина у крыс контрольной группы латентное время захода в темную камеру составляло 155,0±24,б сек через 24 часа после обучения УРПИ. У опытных крыс введение скополамина вызывало уменьшение латентного периода захода в темную камеру в 7 раз (22,5±9,7 с; р < 0,05).

Результаты по измерению активности ферментов представлены в табл. 2. Введение скополамина сопровождалось увеличением активности ПЭП во фронтальной коре и в гиппокампе и снижением активность ДП-1У во фронтальной коре (р<0,01) практически Активность фермента в гиппокампе не изменялась.

Пирацетам в дозе 800 мг/кг оказывал антиамнестическое действие и понижал активность ПЭП во всех исследованных структурах мозга; при этом пирацетам повышал сниженную активность ДП-Р/ во фронтальной коре и не влиял на активность фермента в гиппокампе.

Таблица 2.

Активность ПЭП и ДП-1У в структурах головного мозга крыс в контроле, после введения скополамина и коррекции пирацетамом.

Фермент Активность (нмоль*мин'|*мг"1 белка)

Фронтальная кора Гиппокамп

Контроль Скополамин Пирацетам+ скополамин Контроль Скополамин Пнрацетаи+ скополамин

ПЭП 0,429±0,025 0,535±0,020* 0,449±0,021# 0,395±0.026 0,517*0.024* 0,405±0.026#

ДП-1У 0,110±0,010 0.075±0.003* 0,100±0,009# 0.107±0.006 0.095*0.004 0.115*0.008

По тесту Стьюдента-Ньюмана-Кеулса после однофакторного дисперсионного анализа: *р<0,05 - по сравнению с контролем в соответствующей структуре мозга (п=10); #р<0,05 - по сравнению со значением в группе с введением скополамина (п=10).

Изучение возможности патогенетической коррекции экспериментальной амнезии новыми синтетическими ингибиторами пролилэндопептидазы.

Установлено, что проведение МЭШ у крыс сразу после обучения УРПИ вызывает у

животных амнезию навыка, что проявляется значительным, почти в 3 раза уменьшением

латентного времени рефлекса при его воспроизведении через 24 часа после обучения

(рис.1).

МЭШ+2-01п-Ргп МЭШ+г-МеЬРгсЬМ

Рис. 1. Влияние ингибиторов ПЭП на воспроизведение УРПИ у крыс с ретроградной амнезией, вызванной МЭШ.

*р<0,05; **р<0,01 - по сравнению с действием МЭШ (п= 10); #р<0,05 - по сравнению с контролем (п=10).

и

Соединение Вос-А1а-Ргс1-Ы в дозах 0,1; 0,5 мг/кг и 4,0 мг/кг не обладало алтиамнестическими свойствами. В дозах 1,0 мг/кг и особенно 2,0 мг/кг это соединение значительно увеличивало латентное время рефлекса при его воспроизведении. Это свидетельствует о наличии антиамнестической активности у данного вещества. Соединение 2-Тгр-Рп1-Ы антиамнестическими свойствами обладало в дозе 2,0 мг/кг, а при использовании этого вещества в дозах 0,1; 0,5; 1,0 и 4,0 мг/кг эти свойства не выявлялись. У соединения 2-С1п-Ргс!-М антиамнестическая активность была выявлена в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг, а у соединения г-МеЯ^-Ы - в дозах 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 и 4,0 мг/кг (рис. 1).

Соединения Вос-Тгр-Ргс1-Ы и 2гМ в исследованных дозах на данной модели антиамнестических свойств не проявляли. Пирацетам устранял нарушения памяти, вызванные МЭШ, в дозе 300 мг/кг.

Таким образом, среди новых соединений - ингибиторов ПЭП выявляются вещества (Вос-А1а-Ргё-М, г-Тгр-РгЛ-И, г-бЬ-РгсШ, 2-Ме1-Ргс1-ЬГ), обладающие антиамнестической активностью при моделировании ретроградной амнезии, вызванной МЭШ.

После тестирования на сохранение УРПИ через 24 часа после его выработки у крыс контрольной и опытных груш была измерена активность ПЭП в головном мозге. Данные представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Изменение активности пролилэндопептидазы в структурах мозга крыс при воздействии максимального электрошока и влияние различных ингибиторов на активность данного фермента.

Вещество Доза ингибитора, мг/кг Активность ПЭП (нмоль*мин"'*мг1 белка)

кора гиппокамп

Контроль 0.442*0.025 0.430±0.020

МЭШ 0.565*0.022 № 0.572*0.02Ш

Вос-А1а-Рг(Ш + МЭШ 0,5 1,0 2,0 4,0 0.528*0.024 0.473*0.030* 0.446*0.019** 0.492*0.034 0.554*0.042 0,478*0.031* 0.458*0.023** 0.491*0.027

г-Тгр-РгсШ + МЭШ 0,5 1,0 2,0 4,0 0.544*0.029 0.513*0.017 0.498*0.022* 0.548*0.026 0.536*0.030 0.505*0.024 0.484*0.028* 0.560*0.038

г-Оп-ггсШ+мэш 0,1 0,5 1,0 2,0 4,0 0.469*0.037* 0.55940.021 0.439*0.030** 0.521±0.023 0.529*0.04 0.478*0.031* 0.537*0 019 0.442*0.021** 0.509*0.025 0.541*0 026

г-Ме1-Рг£Ш + МЭШ 0,1 1,0 2,0 0.471*0.027* 0.452*0.024** 0.485*0.018* 0.477*0.016* 0.450*0.029** 0.493*0.024*

Вос-Тгр-РгсШ + МЭШ 1,0 4,0 0.518*0.033 0.539±0.042 0.545*0.039 0.522*0.035

г-Ргс!+мэш 1,0 4,0 0.493*0.026 0.539*0.022 0.498*0.027 0.528*0.041

*р< 0,05; **р <0,01 - по сравнению с действием МЭШ; #р<0,05 - по сравнению с контролем (п=10).

По приведенным данным следует, что те ингибиторы ПЭП, которые снижали повышенную активность фермента, в тех же дозах нормализовали поведенческую активность исследуемых животных.

Выявлена корреляционная взаимосвязь между увеличением латентного времени захода в темный отсек камеры и глубиной торможения повышенной активности ПЭП в коре и гиппокампе под влиянием ингибиторов в дозе 1,0 мг/кг (в обоих случаях = - 0,943; р= 0,004805) (рис.2, рис.3).

0-

50 100 150 200 250 300 3 0

с Л с С -5 г Вос-Тф-Рг^-Ы

1,0 • г-тгр-рш-ы »

£ я к «с • г-рм • Вос-Ай-Ргё-Ы

и .20 * •

-25

% увеличения латентного времени захода в темный отсек

Рис.2. Взаимозависимость изменения (в %) латентного времени захода в темный отсек камеры в тесте УРПИ и активности ПЭП в коре мозга крыс под влиянием ингибиторов ПЭП в дозе 1,0 мг/кг на модели ретроградной амнезии, вызванной максимальным электрошоком.

&

1 по

: -15

» -20

-25

50 100 150 200 250 300 3

Вос-Тгр-Ргй-М

• г-тг^Рга-ы • г-Ргб Во*-А1а-Рг<)-Ы

'Лувеличения латетного времени захода в темный отсах

Рис.З. Взаимозависимость изменения (в %) латентного времени захода в темный отсек камеры в тесте УРПИ и активности ПЭП в гиппокампе крыс под влиянием ингибиторов ПЭП в дозе 1,0 мг/кг на модели ретроградной амнезии, вызванной максимальным электрошоком.

Исследование эффектов ингибиторов ПЭП на модели ретроградной амнезии, вызванной однократным введением скополамина

Соединение Вос-А1а-Рг<3-Ы в дозе 1,0 мг/кг обладало антиамнестическим эффектом в условиях амнезии, вызванной скополамином, на модели УРПИ, увеличивая латентное время рефлекса при его воспроизведении через 24 часа после обучения. Соединение МеСЙ-А1а-Ргб-Ы в дозе 0,5 мг/кг способствовало ослаблению амнезии УРПИ, а в дозах 1,0 и 2,0 мг/кг не обладало такими свойствами.

Наиболее выраженные антиамнестические свойства отмечались у соединения 2-01п-Рй-М В дозах 0,5; 1,0 и особенно 2,0 мг/кг это вещество существенно увеличивало латентное время рефлекса при его воспроизведении через сутки после обучения (рис.4), практически до контрольного значения. Соединение Z-^íet-Prd-N также обладало выраженным антиамнестическим действием в дозе 1,0 мг/кг (рис. 5). Соединения Вос-Тгр-

Z-Trp-Prd-N, г-Рй, Вос-пУа1-РМ-М в диапазоне доз от 0,5 до 2,0 мг/кг не обладали способностью предупреждать вызванную однократным введением скополамина амнезию у крыс.

Рис.4. Влияние ингибитора ПЭП Z-Gln-Prd-N на воспроизведение УРПИ у крыс с ретроградной амнезией, вызванной однократным введением скополамина. *р<0,05; **р<0,01 - по сравнению с действием МЭШ (п=10); #р<0,05 - по сравнению с контролем (п=Ю).

Рис.5. Влияние ингибитора ПЭП г-Ме(-Ргс1-Ы на воспроизведение УРПИ у крыс с ретроградной амнезией, вызванной однократным введением скополамина. *р<0,05; **р<0,01 - по сравнению с действием МЭШ (п=10); #р<0,05 - по сравнению с контролем (п=10).

Эталонный препарат пирацетам в дозе 800 мг/кг ослаблял нарушения памяти, вызванные однократным введением скополамина.

Таким образом, среди новых соединений - ингибиторов ПЭП выявлены вещества (Boc-AIa-Prd-N, Z-GIn-Prd-N, Z-Met-Prd-N), обладающие отчетливыми антиамнестическими свойствами на модели ретроградкой амнезии, вызванной однократным введением М-холинолитика скополамина. Каждый из этих ингибиторов также проявлял антиамнестическую активность на модели ретроградной амнезии, вызванной МЭШ.

Данные по изменению активности ПЭП во фронтальной коре и гиппокампе при действии ингибиторов ПЭП приведены в табл. 4.

Таблица 4.

Изменение активности пролилэндопептидазы в структурах мозга под влиянием ингибиторов ПЭП на модели ретроградной амнезии у крыс, вызванной однократным введением скополамина.

Вещества Доза в мг/кг Активность (нмоль*мин-1*мг-1 белка)

Фронтальная кора Гиппокамп

Контроль - 0,429±0,025 0,39540.026

Скополамин 2,5 0,535*0,020## 0,517±0.024##

Boc-Ala-Prd-N+ скополамин 1,0 0.46540.019* 0.43540.030*

Boc-Ala-Prd-N+скополамин 0,5 0.48340.024 0.46340.028

2,0 0.47940.022 0.440±0.034

Boc-Tm-Prd-N +скополамин 0,5 0.50840.027 0 49040.015

1,0 0.518*0015 0.49740.020

2,0 0.50040.029 0.48540 032

Z-Trp-Prd-N+скополамин 0,5 0.5 И ±0.019 0.47240.022

1,0 0.52540.035 0.46840.024

2,0 0.50440.020 0.479±0.032

Z-Gln-Prd-N +скополамин 0,5 0.46740.022* 0.43040.030*

1,0 0.44940.031* 0.432±0.019*

2,0 0.42040.029** 0.40240.021"

Z-Prd + скополамин 0,5 0,52040,040 0.50140032

1,0 0.54840.035 0.52140.029

2,0 0.51940.028 0.49840.034

Контроль - 0.46140.022 0.46540.024

Скополамин 0.574±0.028## 0.55940.023#

MeOZ-AIa-Prd-N + 0,5 0.48940.030* 0.49140.020*

скополамин 1,0 0.50840.025 0.50640.018

2,0 0.50240.026 0.48440.032

Z-Met-Prd-N + 0,5 0.548±0.030 0.52840.027

1,0 0.47640.022** 0.47340.0.024**

скополамин 2,0 0.51040.016 0.48140.0.36

Boc-nVal-Prd-N + 0,5 0.52240.023 0.53140.022

1,0 0.51640.036 052240.030

скополамин 2,0 0.53740.029 0.50940.024

*р <0,05; **р<0,01 - по сравнению с действием скополамина (п= 10);

#р<0,05; ##р<0,01 - по сравнению с контролем (п=10).

Жирной чертой отделены результаты, полученные в разных сериях.

На данной модели ретроградной амнезии, как и на модели амнезии, вызванной действием МЭШ, те ингибиторы ПЭП, которые снижали повышенную активность фермента, в тех же дозах проявляли антиамнестическое действие.

На данной модели ретроградной амнезии также выявлена корреляционная взаимосвязь между увеличением латентного времени захода в темный отсек камеры и глубиной торможения активности ПЭП в коре и гиппокампе под влиянием ингибиторов в дозе 1,0 мг/кг (для изменений в коре = -0,976; р=0,000; дня изменений в гиппокампе = -0,905; р=0,002) (рис. 6, рис.7).

100 ПО 200 250 3 0

♦

воо-тгр-рга-н

Хум

■»такого врамаии захода ■ темный отсак

Рис. 6. Взаимозависимость изменения (в %) латентного времени захода в темный отсек камеры в тесте УРПИ и активности ПЭП в коре мозга крыс под влиянием ингибиторов ПЭП в дозе 1,0 мг/кг на модели ретроградной амнезии, вызванной однократным введением скополамина.

♦ г-ря •

Ю -50 50 100 150 200 250 3

-2

Вос-Тп>Рп«

■4 ♦

.6

♦

-8 г-тгрл>лн)

-10 ♦ ♦ МаОгАГ*РпН<

-12

-14 Вос-АДОЩ-Ы

-16 * гмл-Рпш

2-01п-РпШ

%у. аиия латантаого врамаии захода ■ тайный отсак

Рис.7. Взаимозависимость изменения (в %) латентаого времени захода в темный отсек камеры в тесте УРПИ и активности ПЭП в гиппокампе крыс под влиянием ингибиторов ПЭП в дозе 1,0 мг/кг на модели ретроградной амнезии, вызванной однократным введением скополамина.

Таким образом, более выраженному торможению активности фермента соответствует более сильное антиамнестическое действие ингибитора. На модели ретроградной амнезии, вызванной однократным введением скополамина, наиболее эффективными в дозе 1,0 мг/кг оказались Boc-Ala-Prd-N, Z-Gln-Prd-N и Z-Met-Prd-N.

Влияние хронического введения скополамина на обучение крыс в тесте УРПИ

Многократное введение скополамина приводило к снижению латентного времени захода в темную камеру у крыс при воспроизведении УРПИ через 24 ч после обучения по сравнению с контролем (р<0,01), что свидетельствовало о развитии амнезии у крыс в этих условиях.

Выявлено уменьшение активности ХАТ у подопытных животных во фронтальной коре мозга (табл. 5), что подтверждает возникновение у крыс состояния, которое можно рассматривать как адекватную экспериментальную модель деменции, в том числе деменции альцгеймеровского типа, характеризующейся снижением активности холинергической системы (Cummings J.L., Back С., 1998).

Как следует из данных, приведенных в таблице 5, активность ПЭП в группе подопытных крыс была выше по сравнению с контролем, как в коре, так и гиппокампе. Активность ДП-IV в коре снижалась, а в гиппокампе достоверных изменений не наблюдалось.

Таблица 5.

Активность холинацетилтрансферазы, пролилэндопептидазы и дилептидилпептидазы IV в различных областях головного мозга контрольных крыс и крыс после 2-недельного введения скополамина.

Фермент Активность ферментов (нмоль * мин'1 * мг"1 белка)

Фронтальная кора Гиппокамп

Контроль Скополамин Контроль Скополамин

ХАТ 1.291±0.055 1.079±0.029* 1.514±0.037 1.519±0.020

ПЭП 0.485±0.010 0.512±0.005** 0.360±0.010 0.39940.005**

ДП-IV 0.093±0.005 0.075±0.00з" 0.065±0.002 0.066*0.001

Примечание: контроль - п = 15; группа с хроническим введением скополамина - п = 9. р<0,05; р<0,01 - в сравнении с соответствующим контролем.

Изучение активности пептидаз п холинацетилтрансферазы в различных структурах мозга крыс после повреждения базальных ядер Мейнерта ацетнлходнновым

токсином АК-64А.

Введение холинотоксина АР-64А в ядра Мейнерта приводило к снижению латентного времени захода в темную камеру (р<0,01), что указывало на наличие амнезии при данном виде моделирования деменции альцгеймеровского типа.

Как видно из данных, приведенных в таблице 6, активность ХАТ после билатерального повреждения ядер Мейнерта ацетилхолиновым токсином АР-64А была

снижена во фронтальной коре, что подтверждает адекватность модели. В пшпокампе наблюдалось увеличение активности фермента по сравнению с контролем.

Таблица 6.

Изучение активности пептидаз и холинацетшггрансферазы в различных структурах мозга крыс после повреждения базальных ядер Мейнерта ацетилхолнновым токсином АР-64А.

Фермент Активность ферментов (нмоль * мин"' * мг"' белка)

Фронтальная кора Гиппокамп

Контроль (п=24) АР-64А (п=59) Кошроль (п=24) АР-64А (п=59)

ХАТ 1.302±0.093 1.010*0.057** 1.707*0.047 1.848*0.029**

ПЭП 0.472*0.022 0.378*0.013** 0.506*0.017 0.426*0.015**

ДП-1У 0.069*0.003 0.056*0.003* 0.059*0.003 0.051*0.004

*р<0,05; **р<0,01 - по сравнению с соответствующими контролями.

Активность ПЭП была снижена во фронтальной коре и гиппокампе. Активность ДП-[V была снижена во фронтальной коре и не изменялась в гиппокампе.

Изменения активности пептицаз мозга при старении крыс.

Динамика возрастных изменений активности ПЭП и ДП-ГУ в мозге крыс приведена на рис. 8.

1

0.9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4

0,3 0,2 0,1 О

Рис. 8. Изменения активности ПЭП и ДП-ГУ в гомогенатах целого мозга крыс различного возраста.

Сплошная линия - изменение активности ПЭП; пунктирная линия - изменение активности ДП-ГУ. По вертикали - активность фермента, нмоль*мин'*мг' белка, по горизонтали - возраст животных. По результатам постдисперсионного анализа по тесту Стьюдента-Ньюмана-Кеупса: р<0,05 - по сравнению с 3-мес животными (п=8); *р<0,05 - по сравнению с 12-мес животными (п=8); 'р<0,05 по сравнению с 18-мес животными (п=8).

Показано, что к возрасту 12 мес активность ПЭП значимо снижается, наблюдается тенденция к снижению активности ДП-IV. К возрасту 18 мес. активность обоих ферментов повышается и продолжает нарастать к 26 мес.

Повышение активности пептидаз в позднем возрасте может быть связано с развитием различных патологических процессов, которые могут не выявляться на клиническом (поведенческом) уровне. Возрастание при старении активности ПЭП и ДП-IV, вероятно может быть связано с изменением уровня их эндогенных субстратов (Kitagawa J. et al., 2005). Есть прямые свидетельства увеличения экспрессии гена ПЭП в структурах мозга у мышей при старении, что авторы связывают с процессами возрастного ухудшения памяти (Jiang С.Н. et al., 2001).

Изменения активности пептидаз в мозге старых крыс в зависимости от способности

к обучению.

Результаты измерения активности пептидаз в мозге хорошо и плохо обучаемых крыс приведены в таблице 7.

Таблица 7.

Изменения активности пептидаз в коре и комплексе подкорковых структур мозга крыс 26-месячного возраста в зависимости от способности к обучению.

Фермент Активность ферментов (нмоль * мин'1 * мг'1 белка)

Кора Подкорковые структуры

Хорошо обучаемые (п=10) Плохо обучаемые (п=12) Хорошо обучаемые (п=10) Плохо обучаемые ("-12)

ПЭП 1,137±0,066 1,657±0,!42* 0,910±0,059 1,888±0,17з"

ДП-IV 0,618±0,029 0,639±0,032 0,815±0,08б 0,640±0,112

- по сравнению с хорошо обучаемыми крысами.

Как видно из таблицы, активность ПЭП в коре и комплексе подкорковых структур в группе плохо обучаемых 26-месячных крыс была значительно выше, чем у хорошо обучаемых животных. Изменения активности ДП-IV не были статистически значимы.

Изучение ингибитора пролилэндопептидазы Z-GIn-Prd-N в качестве корректора нарушений памяти при старении крыс.

У контрольных молодых крыс через 24 часа и через 7 суток после обучения латентный период захода в темную камеру при воспроизведении УРПИ составлял в среднем 140 -150 с (табл.13). Старые животные при воспроизведении рефлекса вели себя как необученные: латентный период захода в темную камеру в среднем составлял 15-25 с как через 24 часа, так и на 7 сутки после обучения. Данные свидетельствовали о нарушении процессов обучения и памяти у крыс в возрасте 26 месяцев. Старые животные в группе, получавшей Z-GIn-Prd-N (одно из наиболее активных, по нашим данным,

антиамнестических соединений) при воспроизведении рефлекса через 24 часа и даже 7 суток после обучения вели себя, подобно молодым крысам (см. табл. 8), что свидетельствовало о способности соединения г-01п-Ргс!-К устранять дефицит памяти у старых животных.

Таблица 8.

Влияние 2-01п-Ргс1-К (2,0 мг/кг) на воспроизведении УРПИ у крыс различного возраста.

Группа животных Латентное время захода в темную камеру, с

До обучения Через 24 час после обучения Через 7 суток после обучения

3 месяца 22,1±3,2 147,6±9,8 143,8±11,6

3 мес + г-оь-Рга-ы 21,2±2,7 166,0±7,7 171,0±4,9 U

26 месяцев 16,0±1,2 18,0±1,7 22,5±4,7

26 мес + г-^п-Рга-Ы 25,3±3,8' 141,3±21,2" 155,8±15,7"

'р<0,05 - отличия латентного времени у необученных крыс 26 мес без препарата и с введением

г-ап-Ркт

**р<0,01 - отличия между крысами в возрасте 3 и 26 мес (без препарата); "*р<0,01 - отличия между крысами соответствующего возраста без препарата и с введением г-С1п-Ргс!-Ы (п=15).

Изменения активности ПЭП у этих животных приведены в таблице 9.

Таблица 9.

Влияние г-С1п-Ргс1-Ы (2,0 мг/кг) на активность ПЭП в мозге крыс различного возраста.

Группа животных Активность ПЭП (нмоль * мин"' * мг"1 белка)

Крысы, 26 месяцев Крысы, 3 месяца

Фронтальная кора Гиппокамп Фронтальная кора Гиппокамп

Контроль 0,810*0,051+ 0,866±0,044+ 0,472±0,019 0,415±0,027

г-вы-м-к 0,637±0,039' 0,722±0,032' 0,45140,021*" 0,398*0,025"'

*р<0,05 - отличия активности ПЭП в мозге крыс 26-мес возраста без препарата и с введением г-01п-Рг<ш.

"р<0,01 - отличия активности ПЭП в мозге крыс 26- и 3-мес возраста после введения препарата. +р<0,01 - отличия активности ПЭП в мозге крыс 26-мес и 3-мес возраста. Во всех группах п=15.

Как видно из таблицы, повышенная активность ПЭП как в коре, так и в пшпокампе старых крыс в группе с введением ингибитора ПЭП 2-01п-Ргс)-К была ниже, чем в контроле, но не достигала значений активности фермента у молодых животных.

В целом, по итогам работы на разных экспериментальных моделях амнезии можно прийти к заключению о том, что обе изученные пролинспецифические пептидазы - ПЭП и ДП-ГУ вовлечены в патофизиологические механизмы развития нарушений памяти. Полученные данные подтверждают важную роль ПЭП в мнестической деятельности и являются первым прямым экспериментальным свидетельством вовлечения ДП-1У в эти процессы.

Представляет интерес тот факт, что выявленное в наших исследованиях изменение активности ферментов носило одинаковый характер на обеих моделях ретроградной амнезии, независимо от способа моделирования. Можно полагать, что паттерн изменения активности пептидаз, выявленный в настоящей работе, отражает специфическую нейрохимическую картину дизрегуляции в системе пролинспецифических пептидаз в мозге при ретроградной амнезии.

Наиболее выраженные антиамнестические свойства выявлены у соединений 2-01п-РтсШ и г-Ме1-Рг<1-М, которые, также как и пирацетам, при однократном введении нормализовали активность ПЭП в изученных структурах мозга. Низкие эффективные дозы селективных ингибиторов ПЭП могут указывать на то, что фермент и метаболизируемые им нейролентиды являются непосредственными участниками мнестических процессов.

По нашим данным, глубина торможения повышенной активности ПЭП под влиянием ингибитора фермента во фронтальной коре и гиппокампе мозга крыс прямо связана с эффективностью антиамнестического действия ингибитора на обеих моделях ретроградной амнезии: чем более выражено снижение повышенной активности ПЭП в мозге, тем лучше воспроизведение УРПИ у крыс (см. рис. 2, 3, б, 7).

Обращает на себя внимание схожий паттерн изменения активности ПЭП и ДП-1У в исследованных структурах мозга у крыс с ретроградной амнезией и у крыс с амнезией, вызванной хроническим введением скополамина. Эта данные, в совокупности, позволяют предполагать, что пролинспецифическяе пептидазы ПЭП и ДП-ГУ вовлечены в развитие нарушений памяти разной этиологии, и могут рассматриваться как мишени для поиска новых антиамнестических препаратов.

В наших исследованиях на модели деменции альгеймеровского типа, вызванной разрушением ядер Мейнерта, в отличие от других изученных моделей амнезии, активность обеих пептидаз была снижена во фронтальной коре, в гиппокампе выявлены отличия в характере изменения активности ферментов: активность ПЭП была снижена, а активность ДП-ГУ не изменялась. Наши наблюдения не противоречат данным Ямамото и соавторов о снижении активности ПЭП в структурах стриатума у крыс на модели амнезии альцгеймеровского типа, вызванной введением иботеновой кислоты в ядра Мейнерта (УатапЖо М. а!., 2003). Авторы объясняют полученный факт развитием протективного ответа в нейронах стриатума. Предположение основывается на данных о защитных эффектах ингибиторов ПЭП в отношении нейронов ишемизированных структур мозга (БЫэЫбо У, е1. а!., 1999) и о повышенной чувствительности Т-лимфоцитов с высокой активностью ПЭП к клеточной смерти, индуцированной активацией (СМака С, е1. а1., 2002). Таким образом, снижение активности ПЭП на модели деменции, вызванной разрушением ядер Мейнерта, можно связать с развитием экспериментального нейродегенеративного процесса, однако причины изменения активности ДП-1У в структурах мозга в данных условиях требуют специального изучения.

В наших исследованиях активность ХАТ на модели деменции альгеймеровского типа, вызванной разрушением ядер Мейнерта, была снижена только во фронтальной коре. Разрушали ядра Мейнерта, нейроны которых проецируются в неокортекс (Кеэпег Я.Р. е1 а1., 1986), не затрагивая другие источники холинергической иннервации, поэтому снижение активности ХАТ в неокортексе было ожидаемым и соответствовало снижению активности

ХАТ во фронтальной и височной коре у больных с деменцией разного типа, в том числе, альцгеймеровского (М^ег БЬ, е1 а]., 2000). В работе Шинода и соавторов (8Ьтос1а М, ей а!., 1999) показано, что при разрушении ядра Мейнерта с помощью иботеновой кислоты снижалась активность ХАТ в коре мозга, что согласуется с нашими данными. При этом в рассмотренной выше работе активность фермента в гиппокампе не изменялась. Такой паттерн активности ХАТ - снижение активности фермента в коре и неизменность активности в гиппокампе - выявлен нами на модели амнезии, вызванной хроническим введением скополамина. Обнаруженное в наших исследованиях повышение активности ХАТ в гиппокампе крыс с разрушением ядер Мейнерта может отражать развитие адаптивного ответа в ЦНС на снижение активности холинергической системы в коре мозга.

Интересно, что обе изученные нами модели хронического нарушения памяти многие исследователи относят к моделям деменции альцгеймеровского типа. По нашим данным, паттерн изменения активности пролинспецифических пептидаз мозга на этих моделях различен. Характер изменения ХАТ во фронтальной коре был схож, а в гиппокампе различался.

В целом, на основании сопоставления полученных нами данных и данных литературы можно полагать, что обе модели могут быть рассмотрены, как модели деменции альцгеймеровского типа, однако при этом каждая из них отражает несколько разные аспекты заболевания и/или разные стадии развития нейродегенеративного процесса.

Показано, что у старых крыс повышается активность ПЭП и ДП-П/ в мозге. Однако у плохо обучаемых старых крыс по сравнению с хорошо обучаемыми животными повышена активность ПЭП, но не ДП-ГУ в коре и подкорковых структурах мозга. Под влиянием ингибитора ПЭП Z-Gln-Prd-N мнемонические функции у старых животных нормализуются одновременно со снижением активности ПЭП в структурах мозга. В совокупности, наши данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что изменение активности ПЭП вносит больший вклад в процессы памяти, чем ДП-ГУ. Однако в пользу участия ДП-1У в мнемонической деятельности свидетельствуют наши экспериментальные данные о снижении активности фермента в коре мозга на моделях ретроградной амнезии у молодых крыс. Кроме того, выявленное нами у старых животных повышение активности ДП-ГУ также может вносить вклад в развитие нарушений памяти.

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что пролинспецифические пептидазы ПЭП и ДП-1У вовлечены в развитие нарушений памяти разной этнологии, и могут рассматриваться как мишени для поиска новых антиамнестических препаратов. Перспективной является разработка комплексной патогенетической терапии амнезий на основе поиска и изучения новых ингибиторов ПЭП.

ВЫВОДЫ

1. Изменения активности пролинспецифических пептидаз - пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы-1У в головном мозге крыс на моделях ретроградной амнезии, вызванной максимальным электрошоком и однократным введением М-холиноблокатора скополамина, имели однонаправленный характер:

- во фронтальной коре активность пролилэндопептидазы была повышена, а дипептидилпептидазы IV - снижена,

- в гиппокампе активность пролилэндопептидазы была повышена, а дипептидилпептидазы IV - не изменялась.

2. Ингибиторы пролилэндопептидазы Вос-А!а-Рг<1-Н (1,0 и 2,0 мг/кг), г-Тгр-Рй-И (2,0 мг/кг), г-01п-Рг(3-Ы (0,1 и 1,0 мг/кг), г-Мм-РгсШ (0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 мг/кг) при системном введении на модели ретроградной амнезии, вызванной максимальным электрошоком, улучшали воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания, а также снижали активность пролилэндопептидазы в коре и гиппокампе. Ингибиторы Вос-Тф-РгсШ и Z-Pгd в дозах 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 и 4,0 мг/кг антиамнестического действия не проявляли. Ноотропный препарат пирацетам проявлял антиамнестическое действие и нормализовал активность пролилэндопептидазы в дозе 300 мг/кг.

3. Ингибиторы пролилэндопептидазы Вос-А1а-РгсШ (1,0 мг/кг), Х-СТп-Ргб-Ы (0,5; 1,0 и 2,0 мг/кг), г-Ме1-Ргс1-К (1,0 мг/кг), МеОг-А1а-Рп1-Н (0,5 мг/кг) при системном введении на модели ретроградной амнезии, вызванной однократным введением скополамина, улучшали воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания, а также снижали активность пролилэндопептидазы в коре и гиппокампе. Ингибиторы Вос-Тгр-РгсЩ г-Тгр-РгсШ, г-Ргс! и Вос-пУа1-Ргс!-Ы в дозах 0,5; 1,0; 2,0 мг/кг были неэффективны. Ноотропный препарат пирацетам проявлял антиамнестическое действие и нормализовал активность пролилэндопептидазы в дозе 800 мг/кг.

4. На модели хронической амнезии, вызванной многократным системным введением скополамина, активность пролилэндопептидазы во фронтальной коре и гиппокампе была повышена. Активность дипептидилпептидазы IV была снижена в коре и не изменялась в гиппокампе.

5. На модели деменции альцгеймеровского типа, вызванной введением холинотоксина АР-64А в ядра Мейнерта, активность пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV во фронтальной коре мозга крыс была снижена. В гиппокампе наблюдали снижение активности только пролилэндопептидазы.

6. При естественном старении крыс от 3 до 26 месяцев активность пролилэндопептидазы в целом мозге была снижена к 12-месячному возрасту и значительно повышена к 2б-месяцам. Активность дипептидилпептидазы IV у крыс в возрасте 26 месяцев была повышена. У старых плохо обучаемых крыс активность пролилэндопептидазы была выше, чем у хорошо обучаемых. Ингибитор

пролилэндопептидазы г-01п-Ргс1-К (2,0 мг/кг) при субхроническом

введении улучшал воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания и снижал активность фермента во фронтальной коре и гиппокампе старых крыс. 7. Полученные данные свидетельствуют о том, что пролинспецифические пептидазы в головном мозге крыс вовлечены в развитие амнезий. Ингибиторы пролилэндопептидазы могут быть эффективны в комплексной патогенетической терапии нарушений памяти различной этиологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Garibova T.L., Zolotov N.N., Nazarova G.A., Gromov I.A., Voronina Т.A Correlation between brain peptidase activities and benzodiazepine withdrawal syndrome //Biological Basis of Individual Sensitivity to Psychotropic Drugs: Abstr. 2-nd Int. Conf. - Moscow, 22-26 May, 1993,- P. 15.

2. Наркевич В.Б., Назарова Г.А., Золотов H.H., Позднев В.Ф., Раевский К.С. Нейролептическая каталепсия у крыс сопровождается активацией пролилэндопептидазы мозга и устраняется ингибиторами этого фермента // Доклады АН СССР . - 1994. - Т. 339. - №5. - С. 691-693.

3. Золотов Н.Р., Назарова Г.А., Богданова Н.Г., Куксин Д.А. Физиологически активные пептиды и протеолитические ферменты мозга. Взаимодействие нейромедиаторных систем // Дизрегуляционная патология органов и систем: Тез. докл. III Российского конгресса по патофизиологии. 9-12 ноя 2004 г. - Москва, 2004. - С. 139.

4. Золотов H.H., Крупина H.A., Кушнарева Е.Ю., Лебедева М.А., Саноцкая Н.В., Мациевский ДД., Назарова Г.А., Крайнева В.А., Богданова Н.Г., Лосев A.C., Кудрин B.C., Клодт П.М., Воронина Т.А., Гарибова Т.Л. Ингибиторы пролинспецифических пептидаз в патогенетической коррекции при моделировании экспериментальных патологических состояний // Фармакология - практическому здравоохранению: Тез.докл. III съезда фармакологов России. 23-27 сент. 2007 г. -Санкт-Петербург, 2007 - Ч. 1. - С. 1706.

5. Золотов Н Н., Крупина H.A., Кушнарева Е.Ю., Лебедева М.А, Саноцкая Н.В., Мациевский Д.Д., Назарова Г.А., Богданова Н.Г., Крайнева В.А., Воронина Т.А., Гарибова Т.Л. Ингибиторы пролинспецифических пептидаз в моделировании патологических состояний и их патогенетической коррекции //Химия протеолитических ферментов: Тез. докл. VI симпозиума 23-25 алр. 2007 г. -Москва, 2007,- С. 51.

6. Золотов H.H., Крупина H.A., Богданова Н.Г., Кушнарева Е.Ю., Назарова Г.А., Лебедева М.А., Кудрин B.C., Клодт П.М., Воронина Т.А. Изменения активности дипептидилпептидазы IV (CD26) при различных аутоиммунных и неврологических состояниях в эксперименте // «Нейроиммунология»: Тез.докл. XVI Всероссийской конференции 23-26 мая 2007 г. - Санкт-Петербург, 2007. - С.49-50.

7. Назарова Г.А., Золотое Н.Н., Крупина Н.А, Крайнева В.А., Гарибова T.JI, Воронина ТА. Изменение активности пролинспецифических пептидаз при экспериментальном моделировании ретроградной амнезии // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2007. - №6. - С. 232-235.

8. Золотов Н.Н., Назарова Г.А., Крайнева В.А., Гарибова Т.Л., Воронина Т.А. Изменения активности пролинспецифических пептидаз мозга при развитии экспериментальной толерантности к психотропным препаратам // Лекарственные средства и биологически активные соединения: Тез. докл. Международной научной конф. 11-12 окт. 2007 г. - Гродно, Беларусь, 2007 - С. 55-57.

Nazarova Galina Alexeevna Changes in the activity of brain proline specific peptidases using the experimental models of amnesia

Changes in the activity of proline specific peptidases prolyl endopeptidase (PEP) and dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) in frontal cortex and hippocampus were investigated in experimental models of amnesia. Retrograde amnesia was produced in rats by a single injection of M-cholinergic antagonist scopolamine or by the maximal electroconvulsive stimulation. The amnesic effect was evaluated in passive avoidance test. Retrograde amnesia was accompanied by the increase in PEP activity in both frontal cortex and hippocampus. The activity of DPP-IV significantly decreased in cortex while remained unchanged in hippocampus. The same changes in the activity of PEP and DPP-IV in the brain were observed in rats subjected to chronic scopolamine administration. During normal ageing activities of PEP and DPP-IV significantly increased. In the experimental rat model of dementia of Alzheimer' type induced by bilateral infusion of cholinergic toxin AF64A into the basal magnocellular nuclei activities of both peptidases were significantly decreased in frontal cortex and hippocampus. The new synthetic inhibitors of PEP as well as piracetam revealed antiamnesic effects and normalized PEP activity in brain structures. The results provide evidence for the involvement of PEP and DPP-IV in the mechanisms of memory. These findings afford ground for the treatment strategy of memory impairment based on the correction of PEP activity with the specific peptidase inhibitors.

OincMiTniio в ООО "Фирме Блок" Подписано в печать 2008 г.

Тираж 100 экземпляров

Актуальность темы. Амнезия встречается как самостоятельное заболевание и как симптом целого ряда тяжелейших нервно-психических и соматических расстройств (деменции различного типа, нейродегенеративные заболевания, сосудистые нарушения, травмы, аддиктивные расстройства и др.) (МКБ-10, 1995; Kopelman, M.D., 1987, 2002; Milner В., 2005). По данным международных организаций и специальных исследований неуклонное старение населения планеты (Пресс-бюллетень Информ. Центра ООН в Москве, 2007; Ritchie R., Lovestone S., 2002) сопровождается ростом числа деменций от 5 до 30 и более процентов в зависимости от региона и этнической принадлежности обследованных популяций (Stevens Т. et al., 2002, Demirovic J. et al., 2003; Sikstrom S., 2007). Наиболее частой причиной деменции в пожилом возрасте является болезнь Альцгеймера, относящаяся к первично-дегенеративным заболеваниям и характеризующаяся прогрессирующим снижением когнитивных функций (Дамулин И.В. 1995; Яхно Н.Н., Преображенская И.С., 2002; Stevens Т. et al., 2002, Demirovic J. et al., 2003). По данным Центра психического здоровья РАМН до 4,5-5% населения Москвы в возрасте 60-65 лет страдают деменцией альцгеймеровского типа (Гаврилова С.И., 2002). Затраты на терапию болезни Альцгеймера сопоставимы с затратами на онкологические и кардиологические заболевания. Нарушения когнитивной деятельности, включающие амнезии, приводят к выраженной социальной дезадаптации больных, резкому снижению качества жизни не только самих больных, но и их родственников. Изучение механизмов развития мнестических расстройств и поиск новых подходов к их патогенетической терапии представляет собой важную медико-биологическую и социально-экономической проблему, поскольку по мере роста числа больных с нарушениями памяти, вызванными целым рядом причин, обществу требуется все больше сил и средств для ведения таких больных.

По существующим в настоящее время представлениям, к развитию мнестических расстройств могут приводить нарушения функционирования различных механизмов, вовлеченных в процесс следообразования, - нейрофизиологических, нейромедиаторных, молекулярных (Кругликов Р.И., 1989; Гомазков О.А., 2004; Ещенко Н.Д., 2004; Муравьева Е.В. Анохин К.В., 2006; Cammarota M.et al., 2000; Compte A. et al., 2000, 2003; Harkany Т., Penke В., Luiten P.G., 2000; Malleret G. et al, 2001; Morris RG, 2006).

В последние годы внимание исследователей привлекает изучение роли нейропептидов в опосредовании процессов памяти и ее нарушений (Ашмарин И.П. и др., 1990-2006; Bao Х.М, et al., 2002; Gulpinar М.А., McEwen B.B. 2004; Yegen, B.C., 2004; Jahn O. et al., 2005; Aguilar-Valles A., et al., 2007;). Согласно современным представлениям, одним из механизмов изменения уровня биологически активных пептидов в организме является интенсивность их метаболизма - скорость процессинга и деградации. В проявлении физиологических свойств пептидов одну из главных ролей играют протеолитические ферменты - пептидазы, определяющие количественный и качественный состав регуляторных пептидов. Даже незначительные нарушения функции этих ферментов могут лежать в основе ряда патологических состояний ЦНС, к которым относятся, в том числе и заболевания, связанные с нарушением памяти. Известно, что многие пептиды, опосредующие процессы памяти, являются субстратами пролинспецифических пептидаз, в частности, пролилэндопептидазы (ПЭП) и дипептидилпептидазы (ДП-TV). Показано, что у крыс с возрастом наблюдается увеличение активности ПЭП в различных структурах мозга (Agirregoitia N. et al., 2003, 2007). Увеличение активности ПЭП обнаружено в клинике в структурах мозга пациентов с болезнью Альцгеймера (post mortem) (Park Y.S. et al., 2006). В эксперименте выявлено изменение активности и экспрессии ПЭП при нарушениях памяти на моделях деменции альцгеймеровского типа (Rossner S., et al., 2005). Однако в целом данные о характере изменения активности ПЭП при расстройствах, сопровождаемых развитием амнезий, противоречивы. Прямых данных об изменении активности ДП-IV при нарушениях памяти в клинике или в эксперименте нет. О возможном участии ДП-IV в механизмах обучения и памятп, а также в механизмах старения может свидетельствовать наличие у фермента субстратов, участвующих в модуляции когнитивных процессов (Minthon L. et al., 1996; Mentlein, R., 1999; Redrobe J.P. et al.,2004). Накапливаются данные о том, что ПЭП и ДП-IV могут влиять на функции ЦНС и модулировать мнестическую деятельность путем воздействия на механизм трансдукции (Gerwins Р., Fredholm В.В., 1992; Lynch М.А., Voss K.L., Gower A.J., 1994; Schultz I. et al., 2002; Aertgeerts, K. et al., 2003).

Имеется достаточно большое количество данных об антиамнестической эффективности ингибиторов ПЭП (Yoshimoto, Т., et al., 1987; Золотов Н.Н. и др., 1992; Toide К, et al., 1995;Bellemere G, et al., Marighetto et al., 2000; 2005; Garcia-Horsman J.A., Mannisto P.Т., Venalainen J.I., 2007; Mannisto P.T. et al., 2007) при недостаточности сведений об изменении активности фермента в ЦНС при мнестических расстройствах. В последнее время появляются все новые ингибиторы ПЭП, антиамнестическая эффективность которых еще не изучена.

Все вышеизложенное указывает на актуальность исследования роли пептидаз в патогенезе амнезии и в поиске подходов к созданию новых ноотропных средств на основе ингибиторов пептидаз мозга.

Цель исследования заключалась в проведении сравнительного анализа активности протеолитических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы в структурах мозга крыс при разных способах моделирования амнезий и изучении возможности коррекции экспериментальных нарушений мнестической деятельности новыми ингибиторами пролилэндопептидазы.

Задачи исследования:

1) Исследовать изменение активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-IV в гиппокампе и фронтальной коре мозга крыс в тесте условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) на моделях ретроградной амнезии, вызванной максимальным электрическим шоком, и острым введением антагониста М-холинорецептора скополамина.

2) Исследовать изменение активности ПЭП и ДП-IV в гиппокампе и во фронтальной коре мозга при моделировании хронической амнезии путем субхронического системного введения скополамина.

3) Исследовать изменение активности ПЭП и ДП-IV в гиппокампе, фронтальной коре мозга и гипоталамусе при моделировании деменции альцгеймеровского типа путем разрушения ядер Мейнерта холинотоксином AF64A.

4) Исследовать изменение активности ПЭП и ДП-IV в структурах мозга крыс в процессе естественного старения в сочетании с оценкой мнестических функций в тесте УРПИ.

5) Исследовать активность пептидаз у старых животных в зависимости от их способности к обучению.

6) Провести изучение антиамнестических свойств новых ингибиторов ПЭП на моделях ретроградной амнезии и при нарушениях памяти, вызванных естественным старением крыс, и изучить их влияние на активность ПЭП в структурах мозга. 7) Сравнить эффекты новых ингибиторов ПЭП и пирацетама на моделях ретроградной амнезии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Нарушения мнестической деятельности различной этиологии сопровождаются изменением активности пролинспецифических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы-IV в структурах мозга крыс.

2. Улучшение мнестической деятельности под влиянием дипептидных ингибиторов пролилэндопептидазы сопровождается нормализацией активности пролилэндопептидазы в мозге крыс с ретроградной амнезией.

3.При естественном старении у плохо обучаемых крыс активность пролилэндопептидазы в структурах мозга более высокая, чем у хорошо обучаемых. Ингибитор пролилэндопептидазы Z-Gln-Prd-N улучшает мнестическую деятельность у старых крыс и нормализует активность фермента.

Научная новизна

Впервые выявлен схожий характер изменений активности пролинспецифических ферментов ПЭП и ДП-IV в структурах мозга крыс на моделях острой ретроградной амнезии, а также у крыс с амнезией, вызванной хроническим введением скополамина. Обнаружено повышение активности ПЭП во фронтальной коре мозга и гиппокампе, а также снижение активности ДП-IV во фронтальной коре. Показано, что антиамнестическое действие новых ингибиторов ПЭП бензилоксикарбонильных и третбутилоксикарбонильных производных аминоацилцианопирролидина - сопровождается нормализацией активности ПЭП в структурах мозга. Выявлена корреляционная взаимосвязь между эффективностью антиамнестического действия ингибиторов ПЭП на моделях ретроградной амнезии в тесте условного рефлекса пассивного избегания и снижением повышенной активности ПЭП в коре и гиппокампе. На модели деменции альцгеймеровского типа, вызванной разрушением ядер Мейнерта холинотоксином AF-64A, в отличие от модели хронической амнезии, вызванной многократным введением скополамина, показано снижение активности ПЭП и ДП-IV в структурах мозга крыс. Впервые показано изменение активности ПЭП и ДП-IV у крыс в динамике старения. Установлено, что у плохо обучаемых старых крыс по сравнению с хорошо обучаемыми повышена активность ПЭП, но не ДП-IV в коре и подкорковых структурах мозга. На модели естественного старения продемонстрирована высокая антиамнестическая эффективность неконкурентного ингибитора ПЭП Z-Gln-Prd-N.

Теоретическая и практическая значимость

Получены прямые свидетельства участия пролинспецифических ферментов ПЭП и ДП-IV в механизмах нарушения памяти, что расширяет существующие в настоящее время представления о механизмах развития амнезий различной этиологии, в том числе, мнестических нарушений при нейродегенеративных заболеваниях. Полученные данные об антиамнестической эффективности ряда ингибиторов ПЭП дипептидной природы на разных экспериментальных моделях амнезий подтверждают наличие общих механизмов в развитии мнестических расстройств различной природы. Проведенный скрининг восьми новых дипептидных препаратов с антиамнестическим действием позволил выявить наиболее эффективные соединения - Z-Gln-Prd-N и Z-Met-Prd-N. Полученные результаты являются основой для поиска и разработки препаратов, которые могут составить новую группу ноотропов, перспективных для включения в комплексную патогенетическую терапию амнезий. Апробация. Основные положения и результаты исследования были доложены на III Российском конгрессе по патофизиологии

Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), Второй международной конференции: "Biological Basis of Individual Sensitivity to Psychotropic Drugs"(MocKBa, 1993), 4-Международной конференции: "Biological Basics of Individual Sensitivity to Psyschotropic Drugs" (Москва,

2006), III Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), VI симпозиуме "Химия протеолитических ферментов (Москва. 2007), XVI Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург,

2007), Международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные соединения» (Белоруссия, Гродно, 2007).

выводы

1. Изменения активности пролинспецифических пептидаз -пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы-IV в головном мозге крыс на моделях ретроградной амнезии, вызванной максимальным электрошоком и однократным введением М-холино'блокатора скополамина, имели однонаправленный характер:

- во фронтальной коре активность пролилэндопептидазы была повышена, а дипептидилпептидазы IV - снижена,

- в гиппокампе активность пролилэндопептидазы была повышена, а дипептидилпептидазы IV - не изменялась.

2. Ингибиторы пролилэндопептидазы Boc-Ala-Prd-N (1,0 и 2,0 мг/кг), Z-Trp-Prd-N (2,0 мг/кг), Z-Gln-Prd-N (0,1 и 1,0 мг/кг), Z-Met-Prd-N (0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 мг/кг) при системном введении на модели ретроградной амнезии, вызванной максимальным электрошоком, улучшали воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания, а также снижали активность пролилэндопептидазы в коре и гиппокампе. Ингибиторы Boc-Trp-Prd-N и Z-Prd в дозах 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 п 4,0 мг/кг антиамнестического действия не проявляли. Ноотропный препарат пирацетам проявлял антиамнестическое действие и нормализовал активность пролилэндопептидазы в дозе 300 мг/кг.

3. Ингибиторы пролилэндопептидазы Boc-Ala-Prd-N (1,0 мг/кг), Z-Gln-Prd-N (0,5; 1,0 и 2,0 мг/кг), Z-Met-Prd-N (1,0 мг/кг), MeOZ-AIa-Prd-N (0,5 мг/кг) при системном введении на модели ретроградной амнезии, вызванной однократным введением скополамина, улучшали воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания, а также снижали активность пролилэндопептидазы в коре и гиппокампе. Ингибиторы Boc-Trp-Prd-N, Z-Trp-Prd-N, Z-Prd и Boc-nVal-Prd-N в дозах 05; 1,0; 2,0 мг/кг были неэффективны. Ноотропный препарат пирацетам проявлял антиамнестическое действие и нормализовал активность пролилэндопептидазы в дозе 800 мг/кг.

4. На модели хронической амнезии, вызванной многократным системным введением скополамина, активность пролилэндопептидазы во фронтальной коре и гиппокампе была повышена. Активность дипептидилпептидазы IV была снижена в коре и не изменялась в гиппокампе.

5. На модели деменции альцгеймеровского типа, вызванной введением холинотоксина AF-64A в ядра Мейнерта, активность пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV во фронтальной коре мозга крыс была снижена. В гиппокампе наблюдали только снижение активности пролилэндопептидазы.

6. При естественном старении крыс от 3-х до 26-месяцев активность пролилэндопептидазы в целом мозге была снижена к 12-месячному возрасту и значительно повышена к 26-месяцам. Активность дипептидилпептидазы IV у крыс в возрасте 26 месяцев была повышена. У старых плохо обучаемых крыс активность пролилэндопептидазы была выше, чем у хорошо обучаемых. Ингибитор пролилэндопептидазы Z-Gln-Prd-N (2,0 мг/кг) при субхроническом введении улучшал воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания и снижал активность фермента во фронтальной коре и гиппокампе старых крыс.

7. Полученные результаты свидетельствуют о том, что пролинспецифические пептидазы в головном мозге крыс вовлечены в развитие амнезий. Ингибиторы пролилэндопептидазы могут быть эффективны в комплексной патогенетической терапии нарушений памяти различной этиологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании проведено изучение роли пролинспецифических пептидаз мозга - пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV - в механизмах нарушений памяти. У животных с ретроградной амнезией, вызванной максимальным электрошоком, а также однократным системным введением скополамина, проявлявшейся в уменьшении латентного времени захода в темную камеру в тесте условного рефлекса пассивного избегания, была определена активность ПЭП и ДП-IV в структурах мозга, опосредующих процессы запоминания и воспроизведения информации - фронтальной коре и гиппокампе. Было обнаружено повышение активности ПЭП в обеих структурах мозга и снижение активности ДП-IV во фронтальной коре. На модели естественного старения у крыс обнаружено повышение активности обоих ферментов в структурах мозга, более выраженное для ПЭП.

На модели ретроградной амнезии, вызванной максимальным электрошоком, системное введение ингибиторов ПЭП Boc-Ala-Prd-N, Z-Trp-Prd-N, Z-Gln-Prd-N, Z-Met-Prd-N улучшало воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания, а также снижало повышенную активность ПЭП в коре и гиппокампе. При использовании наиболее эффективных доз дипептидных ингибиторов Boc-Ala-Prd-N, Z-Gln-Prd-N, Z-Met-Prd-N (1,0 и 2,0 мг/кг) латентное время захода животных в темную камеру в 1,5-2 раза превышало величину этого показателя при применении эталонного ноотропного препарата пирацетама (в дозе 300 мг/кг).

На модели ретроградной амнезии, вызванной однократным системным введением скополамина, ингибитор Z-Trp-Prd-N не проявлял антиамнестической активности. Напротив, дополнительно исследованный на этой модели новый ингибитор ПЭП MeOZ-Ala-Prd-N был эффективен. При использовании наиболее эффективных доз дипептидных ингибиторов Z-Gln-Prd-N, Z-Met-Prd-N (1,0 и 2,0 мг/кг) латентное время захода животных в темную камеру, также как и на модели амнезии, вызванной МЭШ, в 1,5-2 раза превышало величину данного показателя при применении пирацетама (800 мг/кг).

Наиболее эффективными на обеих моделях были соединения Z-Gln-Prd-N и Z-Met-Prd-N, которые, также как и пирацетам, при однократном введении нормализовали активность ПЭП в изученных структурах мозга. Важно подчеркнуть, что Z-Gln-Prd-N при многократном введении проявлял антиамнестическую активность на модели естественного старения у крыс и нормализовал повышенную активность ПЭП в мозге. Низкие эффективные дозы селективных ингибиторов ПЭП могут указывать на то, что фермент и метаболизируемые им нейропептиды являются непосредственными участниками мнестических процессов.

На основании полученных результатов можно заключить, что пролилэндопептидаза активно вовлечена в патофизиологические механизмы развития ретроградной амнезии, а ее наиболее эффективные ингибиторы Z-Gln-Prd-N и Z-Met-Prd-N перспективны для внедрения в качестве средств патогенетической терапии ряда мнестических расстройств.

Применение пирацетама нормализовало сниженную активность ДП-IV во фронтальной коре мозга только на модели ретроградной амнезии, вызванной однократным введением скополамина, что косвенно подтверждает вовлеченность данного фермента в механизмы развития определенных типов амнезий. Для выяснения тонких механизмов участия ДП-IV в развитии нарушений памяти необходимы дополнительные исследования не только самого фермента, но и модуляторов его активности.

Ингибиторы ПЭП можно отнести к препаратам с ноотропным действием. Побочными эффектами многих препаратов группы ноотропов являются повышенная раздражительность, беспокойство и бессонница, слабость, сонливость, головокружение, тремор, тошнота, рвота, диарея, боли в животе. В отношении известных ингибиторов ПЭП показано, что при их применении в клинике могут возникать лишь незначительные побочные эффекты, проявляющиеся в виде головокружения, головной боли, сонливости, усталости, раздражения, психомоторного возбуждения и легких кожных раздражений (Morain P. et al., 2000; Umemura К. et al., 1997, 1999). При продвижении новых ингибиторов ПЭП как лекарственных препаратов необходимы дополнительные исследования токсичности, побочных эффектов и взаимодействия с другими препаратами.

Интересно, что в спектре действия ноотропов выявляются анксиолитические свойства (Воронина Т.А, Середенин С.Б., 2007). Ранее было показано (цит. по Ворониной Т.А., Середенину С.Б., 2002), что один из изученных нами ингибиторов ПЭП - Z-Met-Prd-N обладает выраженным анксиолитическим действием на экспериментальных моделях тревоги. В наших исследованиях также обнаружены косвенные свидетельства наличия анксиолитического действия у другого ингибитора ПЭП Z-Gln-Prd-N с ноотропной активностью. Дальнейшие исследования расширят существующие на сегодняшний день представления о спектре действия новых ингибиторов ПЭП, обладающих ноотропным эффектом, которые могут составить новую группу ноотропов, перспективных для включения в комплексную патогенетическую терапию амнезий.

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что пролинспецифические пептидазы ПЭП и ДП-IV вовлечены в развитие нарушений памяти разной этиологии, и могут рассматриваться как мишени для поиска новых антиамнестических препаратов. Перспективной является разработка комплексной патогенетической терапии амнезий на основе поиска и изучения новых ингибиторов ПЭП.