Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Тревожно-депрессивные состояния, вызванные ингибитором дипептидилпептидазы IV (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

0034Б4080

КУШНАРЕВА ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА

ТРЕВОЖНО-ДЕПРЕССИВНЫЕ СОСТОЯНИЯ, ВЫЗВАННЫЕ ИНГИБИТОРОМ ДИПЕПТИДИЛПЕПТИДАЗЫ IV (экспериментальное исследование)

14.00.16 - патологическая физиология

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 ПАР

Москва-2009

003464080

Работа выполнена в лаборатории общей патофизиологии нервной системы Государственного учреждения Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской АМН.

Научные руководители: доктор биологических наук

Н.А.Крупина

доктор биологических наук Н.Н.Золотов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор, член-корреспондент РАМН В.К.Решетняк

доктор биологических наук Г.М .Мо лодавкин

Ведущее учреждение: Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

[«

Автореферат разослан «_£_!_» ШС^Р/у/Уу^ 2009 года

Защита диссертации состоится « Ж»ма/)гту 2009 года часс

на заседании Диссертационного совета Д 001.$03.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315, Москва, Балтийская улица, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.Н.Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Депрессия и тревожность, встречаются как самостоятельные нозологические формы, так и совместно (Бурчинский С.Г., 2005; Мосолов С.Н., 2005; Marks I.E., 2001). Более чем у 50% больных депрессией определяются симптомы тревожного расстройства (Haddad P.M., 1995; Ravindran A.V. et al., 1997; Fava M. et al., 2000; Roy-Byme P.P. et al., 2000). Среди больных с диагнозом тревожного расстройства почти половина удовлетворяет также критериям большой или малой депрессии (Priest R.G., Baldwin D., 1994). Для тревожно-депрессивных расстройств характерны более тяжелые клинические проявления и психосоциальные нарушения, наличие коморбндного состояния ухудшает прогноз заболевания. Большие затраты на лечение смешанного типа тревожно-депресивных нарушений при низкой терапевтической эффективности, длительная нетрудоспособность больных, а также высокий процент попыток суицида при осложненных формах заболевания приводят к резкому снижению качества жизни таких больных и подчеркивают социально-экономическую значимость этой проблемы, занимающей одно из первых мест в рейтинге интегративной оценки социального бремени различных заболеваний в мире через индекс DALY (Desjarlais R. et al., 1995). Клинико-эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что изучение патогенетических механизмов тревожно-депрессивных нарушений, а также поиск новых подходов к их патогенетической терапии представляют собой важную медико-биологическую проблему.

По общепринятым представлениям тревожно-депрессивные расстройства связывают с недостаточностью моноаминергических систем мозга и нарушением взаимодействия ненротрансмиттерных и центральных нейрорегуляторных систем (van Praag H.M. et al., 1990; Anand A., Charney D.S., 2000; Ressler K.J., Nemeroff C.B., 2000; Nemeroff С. В., 2002; Phillips M.L. et al., 2003; Maletic V. et al., 2007). В настоящее время большую роль в генезе аффективных расстройств отводят участию пептидергических систем мозга, в частности, нейропептидам (Gray T.S., Bingaman E.W., 1996; van Megen H.J. et al., 1996; Kramer M.S. et al., 1998; Koob G.F., 1999; Anand A., Charney D.S., 2000; Ressler K.J., Nemeroff C.B., 2000; Karl T. et al., 2003). Уровень регуляторных пептидов в организме определяется эффективностью их процессинга с участием, в том числе протеолитических ферментов -пептидаз (Mentlein R. et al., 1993, 1999; Buhling F. et al., 1995; Scharpé S. et al., 2001; Polgar L., 2002). Известно, что многие нейропептиды, опосредующие эффекты тревоги и депрессии, являются субстратами пролинспецифических пептидаз - дипептидил-пептидазы-IV (ДП-IV) и пролилэндопептидазы (ПЭП) (Mentlein R. et al., 1993, 1999; Kanai К. et al., 1999; Scharpé S. et al., 2001). В клинике показано, что изменение активности ПЭП и ДП-IV в сыворотке и плазме крови у больных с аффективными расстройствами связано с состоянием депрессии и тревоги, однако данные о направленности изменения активности этих ферментов противоречивы (Maes M. et al., 1991-2004). В экспериментах на грызунах с недостаточностью ДП-IV, вызванной мутацией гена фермента, выявлено снижение стресс-реактивности (Karl T. et al., 2003) и уменьшение депрессивно-подобного поведения в стресс-ситуациях (El Yacoubi M. et al., 2006). В недавних исследованиях показано, что развитие экспериментального МФТП-индуцированного состояния у крыс сопровождается

повышением активности ПЭП и ДП-IV в структурах мозга (Крупина H.A. и др., 2006). Приведенные данные позволяют предположить, что дизрегуляция в системе пролинспецифических пептидаз является одним из механизмов развития тревожно-депрессивных расстройств.

В этой связи особый интерес представляют данные об антидепрессантной активности ряда синтетических ингибиторов ПЭП, полученные на экспериментальной модели депрессии в тесте принудительного плавания Порсолта (Золотов H.H. и др., 1992) и на модели экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома (Хлебникова H.H. и др., 2009). Запатентовано средство для лечения стресса и тревожности, а также депрессивных нарушений, на основе комбинации ингибитора ДП-IV и его субстрата нейропептида Y (Фон Херстен Шт. и др., 2001).

Изложенные факты указывают на актуальность исследования роли пептидаз в патогенезе тревожно-депрессивных нарушений и поиска современных подходов к созданию новых анксиолитиков и антидепрессантов на основе ингибиторов пролинспецифических пептидаз.

Целью исследования явилось изучение эмоционально-поведенческих нарушений у крыс, вызванных необратимым синтетическим ингибитором дипептидилпептидазы IV метионил-2(5)-цианопирролидином в условиях его введения в раннем постнатальном периоде, а также определение активности протеолитических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV, уровня моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс.

Задачи исследования:

1) Изучить изменения поведения крыс обоего пола в подростковом возрасте и у взрослых животных, подвергнутых субхроническому введению ингибитора ДП-IV метионил-2(8)-цианопирролидина (Met-Prd-N) в раннем постнатальном периоде, в тестах на определение уровня тревожности (приподнятый крестообразный лабиринт, тест «открытого поля», специализированная шкала для оценки тревожно-фобического состояния у крыс).

2) Изучить изменения поведения крыс обоего пола в подростковом возрасте и у взрослых животных, после субхронического введения ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде, в тестах на наличие депрессивно-подобного состояния (тест принудительного плавания, оценка суточного потребления жидкости и потребления/предпочтения раствора сахарозы).

3) Изучить изменения двигательной активности в тестах «открытого поля», сенсомоторной реактивности в акустическом стартл-рефлексе и болевой чувствительности в тесте «Горячая пластина» у крыс обоего пола в подростковом возрасте и у взрослых животных после введения ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде.

4) Исследовать эффекты однократного введения диазепама на уровень тревожности у крыс с эмоционально-поведенческими нарушениями, вызванными ингибитором ДП-IV Met-Prd-N в условиях его введения в раннем постнатальном периоде.

5) Исследовать эффекты субхронического введения ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролиднна (г-Ме^РгсМ^) на проявления депрессивно-подобного поведения у крыс с эмоционально-поведенческими нарушениями, вызванными ингибитором ДП-1У МеЬРгё-И в условиях его введения в раннем постнатальном периоде, в сравнении с эффектами трициклического антидепрессанта имипрамина.

6) Изучить изменение активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-1У флуорометрическим методом во фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме, прилежащем ядре и гиппокампе в динамике развития эмоционально-поведенческих нарушений у крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-1У Ме^РгсШ в раннем постнатальном периоде.

7) Изучить уровень моноаминов и их метаболитов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией во фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме, прилежащем ядре и гиппокампе в динамике развития эмоционально-поведенческих нарушений у крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-1У Ме^Ргс!^ в раннем постнатальном периоде.

Научная новизна. Впервые получены данные о том, что модуляция активности фермента дипептидилпептидазы IV путем введения в раннем постнатальном периоде его синтетического ингибитора метионил-2(8)-цианопирролидина вызывает у крыс обоего пола длительные нарушения поведения, проявляющиеся в развитии тревоги и депрессии. Показано, что динамика развития тревожно-депрессивного состояния у самцов и самок различна. Фармакологический анализ тревожно-депрессивного состояния у крыс, подвергнутых субхроническому введению ингибитора ДП-1У в постнатальном периоде, в совокупности с характером эмоционально-поведенческих нарушений позволяет рассматривать такие изменения поведения в качестве новой модели тревожно-депрессивных состояний у крыс. На данной модели обнаружены антидепрессивные свойства нового синтетического ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)~ цианопирролидина.

Установлено, что развитие экспериментального тревожно-депрессивного состояния, вызванного введением ингибитора ДП-1У Ме^РпЗ-Ы в раннем постнатальном периоде, сопровождается повышением активности пролинспецифических пептидаз - ПЭП и ДП-1У в структурах мозга, опосредующих развитие эмоционально-поведенческих расстройств, -фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме, прилежащем ядре и гиппокампе. На всех этапах развития тревожно-депрессивного состояния у крыс в этих структурах выявлены изменения в состоянии серотонинергической, норадренергической и дофаминергической систем мозга, различные у самцов и самок. У самцов в динамике обследования наблюдается снижение функциональной активности нигростриатной и мезолимбической дофаминергических систем и повышение активности норадренергической системы в гипоталамусе на поздних сроках. У самок в динамике обследования наблюдается снижение функциональной активности мезолимбической и нигростриатной дофаминергических систем и повышение активности серотонинергической системы в гиппокампе и коре мозга.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют представления о патофизиологических механизмах развития аффективных расстройств по типу тревоги и депрессии, подчеркивая важную роль дизрегуляции активности пролинспецифических пептидаз. Результаты исследования открывают новые подходы к разработке комплексной патогенетической терапии тревожно-депрессивных состояний на основе использования ингибиторов пролилэндопептидазы и являются основой для поиска новых препаратов - ингибиторов ПЭП, обладающих антидепрессантной активностью.

Новая модель тревожно-депрессивного состояния у крыс, вызванная ингибитором ДП-1У метионил-2(8)-цианопирролидином в условиях его введения в ранний постнаталъный период, может быть использована для дальнейшего изучения патофизиологических механизмов тревоги и депрессии и скрининга новых фармакологических соединений с антидепрессантными и анксиолитическими свойствами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибитор дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидин в условиях его субхронического постнатапьного введения крысам вызывает эмоционально-поведенческие расстройства типа тревожно-депрессивного состояния в подростковом возрасте и у взрослых животных.

2. Тревожно-депрессивное состояние у крыс сопровождается повышением активности пролинспецифических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV, а также изменением функционального состояния серотонинергической, норадренергической и дофаминергической систем в структурах мозга.

3. Ингибитор пролилэндопептидазы бензилоксикарбонил-метионил-2(5)-циано-пирролидин подавляет признаки депрессивно-подобного поведения у крыс, подвергнутых постнатальному введению ингибитора дипептидилпептидазы IV.

Апробация. Основные положения и результаты исследования были доложены на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), на XVI Всероссийской конференции «Нейроиммунология» «Нейроимидж» и научно-практической конференции неврологов (Санкт-Петербург, 2007), на XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), на III Съезде фармакологов России «Фармакология -практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), на XIV Всемирном конгрессе по психиатрии (Чешская республика, Прага, 2008).

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 10 работ, из них 8 тезисов, 2 статьи в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа включает 8 рисунков и 19 таблиц. Список литературы содержит 300 источников, из них 49 работ отечественных и 251 работа зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 146 белых крысах обоего пола популяции Вистар. Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде, за исключением периодов тестирования на потребление жидкости и предпочтение/потребление сахарозы.

В исследовании использовали синтетический ингибитор ДП-IV неконкурентного типа метионил-2(8)-цианопирролидин (ИНГ, синтезирован в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН, константа ингибирования по субстрату Gly-Pro-7-aMnno-4-кумариламиду составляет 2,7 нмоль/л) и новый синтетический неконкурентный ингибитор ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин (Z-Met-Prd-N) (синтезирован в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН, константа ингибирования по субстрату 2-А1а-Рго-7-амино-4-кумариламиду составляет 2,0 нмоль/л). Также в работе применяли классический трициклический антидепрессант имипрамин (торговое название препарата «мелипрамин», «EGIS», Венгрия) и транквилизатор бензодиазепинового ряда диазепам («РУСАН ФАРМА ЛТД», Индия). Все препараты вводили внутрибрюшинно.

Схема эксперимента. Для выявления и проверки воспроизведения нарушений в поведении крыс, подвергнутых постнатальному введению ИНГ, проведено 3 экспериментальных серии (I, II и III серии). В каждой серии половине животных (опытные группы) в период с 5-го по 18 постнатальный день включительно вводили ингибитор ДП-IV в дозе 1,0 мг/кг в объеме 0,1 мл на 10 г массы тела, второй половине крысят (контрольные группы) - физиологический раствор. В возрасте около 1 мес. формировали опытные и контрольные группы животных из крысят одного пола с примерно равным числом особей: I серия я=35, II серия я=59, III серия (только самцы) «=52. В каждой серии поведение животных исследовали в динамике взросления.

Оценка поведения животных

Оценка уровня тревожности у крыс

Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) представляет собой металлический лабиринт, расположенный на высоте 80 см от пола и состоящий из 2 открытых (не имеющих стенок) рукавов (ОР) и 2 закрытых (имеющих стенки, но не закрытых с торцов) (Moser P.C., 1989) рукавов (ЗР), перпендикулярных друг другу, с площадкой в центре (Ц) ПКЛ. Освещенность в центре лабиринта составляла 39 лк. В течение 5 мин фиксировали: число заходов, стоек и время, проведенное в ОР и ЗР лабиринта, число свешиваний из ОР и ЗР лабиринта, время нахождения в Ц и число свешиваний из Ц, число оценок риска (выглядывание из открытых торцевых отделов ЗР ПКЛ не менее чем до линии ушей с немедленным возвратом), предпочтение ОР (по отношению числа заходов в ОР к суммарному числу заходов в ОР и ЗР). Сроки обследования: I серия - 1, 2, 3,4 и 7 мес.; II серия - 1, 2 и 3 мес.

Комплексный многопараметровый метод оценки тревожно-фобических состояний у крыс (в баллах) основан на количественной оценке изменения видоспецифических поведенческих ответов у крыс в серии этологически адекватных тест-стимулов, моделирующих мягкое стрессогенное воздействие, провоцирующее проявление

состояний тревожности и страха у животных (Родина В.И. и др., 1993). В состав шкалы для оценки тревожно-фобических состояний у крыс входят 9 тестов, в основе которых лежат две основные ситуации: 1 - столкновение с незнакомым неживым объектом или незнакомой ситуацией (I-V тесты); 2 - действие руки экспериментатора (приближение и поглаживание; VI-IX тесты). Тревожно-фобический уровень крыс оценивается по сумме баллов, присваиваемых животному по результатам полного обследования по ранжированной шкале. Общее время тестирования составляет 300 с. Сроки обследования:

I серия - 2, 3, 4 и 7 мес.; II серия - 1, 2 и 3 мес. В качестве дополнительной оценки тревожности использовали показатель величины латентного периода выхода из центра «открытого поля» (Ramos A. et al., 1997). Сроки обследования: I серия - 2, 3, 4 и 7 мес.;

II и III серии - 1, 2 и 3 мес.

Оценка депрессивно-подобного поведения

Тест принудительного плавания [методика Порсолта (Porsolt R.D. et al., 1978) в модификации Щетинина Е.В. с соавт. (Щетинин Е.В. и др., 1989)] проводили в цилиндрическом баке, заполненном водой на высоту 35 см, температура воды составляла 25-26°С. В течение 10 мин фиксировали длительность периодов активного плавания, пассивного плавания и иммобилизации (полное отсутствие плавательных движений). Вычисляли ритмологический индекс депрессивности (ИД), определяемый отношением числа самых коротких периодов иммобилизации (до 6 с) к общему числу периодов активного плавания. Увеличение длительности иммобилизации свидетельствует о наличии «поведенческого отчаяния» у животных, а увеличение ИД - о наличии биоритмологических нарушений, характерных для депрессивных состояний. Сроки обследования: I серия -1,2, 3 и 7 мес.; II. серия - 1,2 и 3 мес.; III серия-2 и 3 мес.

Определение суточного потребления жидкости и предпочтения/потребления сахарозы у крыс. Тест альтернативного выбора сахароза/вода принят для оценки поведения переживания удовольствия у крыс (Vogel G. et al., 1990). Ежедневно для каждого животного рассчитывали суточное суммарное потребление жидкости (г), предпочтение сахарозы воде (в процентах от общего количества выпитой жидкости) и относительное потребление сахарозы, рассчитываемое по формуле: (выпитая сахароза, г)/(масса тела, г) х 100% (Frenois F. et al., 2007). Снижение потребления/предпочтения сахарозы свидетельствует о появлении признаков агедонии, а снижение потребления жидкости - о снижении уровня одной из жизненно важных мотиваций. Сроки обследования: I серия -7 мес.; II серия - 1, 2 и 3 мес.

Оценку сенсомоторной реактивности (эмоциональности) проводили по изменению характеристик акустического стартл-ответа (ACO) - реакции вздрагивания животного в ответ на неожиданный сильный звуковой раздражитель (120 дБ) - в модульной установке "Coulboum Instruments Inc." (США). Измеряли амплитуду ACO и ее снижение в условиях модуляции ответа предшествующим раздражителем (80 дБ), подпороговым для вызова реакции вздрагивания (предстимульное торможение, ПСТ). Считается, что увеличение амплитуды ACO характерно для состояния страха и тревожности (Davis М., 1988), а снижение/срыв ПСТ - для психотических состояний у животных (Swerdlow N.R. et al., 1990). Сроки обследования: I серия - 1, 2, 3,4 и 7 мес.; II серия - 1,2 и 3 мес.

Оценка ориентировочно-исследовательской деятельности

Тест «открытого поля» (с визуальной оценкой поведения). Оценку двигательной (горизонтальной) и исследовательской (вертикальной) активности у животных проводили в стандартных условиях «открытого поля» по числу пересеченных квадратов (кв.) и числу стоек (ст.) в течение 3 мин. Сроки обследования: I серия - 2, 3, 4 и 7 мес.; II серия - I, 2 и 3 мес.

Автоматизированный тест «открытого поля» проводили в установке «Opto-Varimex» («Columbus Instruments», США) по программе «Auto Track». В течение 3 мин тестирования фиксировали длину пройденного пути (горизонтальная активность, см) и число стоек (вертикальная активность, ст.). Сроки обследования: I серия - 1, 2, 3 и 4 мес.; II серия - 1, 2 и 3 мес.; III серия - 1 и 2 мес.

Оценку болевой чувствительности проводили в тесте «Горячая пластина» по величине порогов болевых реакций (ПБР), о которых судили по латентному периоду реакции избавления у животного (вылизывание задней лапки), помещенного на пластину, нагретую до t°=55°C. Сроки обследования: I серия - 7 мес.; II серия - 1, 2 и 3 мес.

Определение нейрохимических показателей

У части животных (II серия, 1 и 3 мес.; I серия, 7 мес.) определяли активность ПЭП и ДП-IV, уровень моноаминов и их метаболитов во фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме, прилежащем ядре, гиппокампе. Исследования проводили на базе лабораторий нейрохимической фармакологии и психофармакологии ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН.

Активность пролинспецифических пептидаз измеряли флуорометрическим методом. Метод основан на определении освобождающегося в процессе ферментативной реакции 7-амино-4-метилкумарина с пептидом Z-Ala-Pro-MCA (для ПЭП) или с пептидом Gly-Pro-MCA (для ДП-IV), имеющего отличный от пептидов спектр флуоресценции. Гидролиз субстрата регистрировали после 30 минут инкубации при 37°С на спектрофлуорометре LS-5B (Perkin-Elmer, США). Количество освободившегося 4-метил-7-аминокумарина определяли из величины флуоресценции. Активность пептидаз выражали в нмоль*мин"'*мг"1 белка. Белок определяли спектрофотометрически с красителем Кумасси голубым G-250 по методу Брэдфорда (Bradford М., 1976), используя в качестве стандарта сывороточный альбумин человека (Sigma, США). Оптическую плотность проб измеряли на фотоколориметре КФК-2-УХЛ 4.2 (Россия) со светофильтром 590 нм.

Уровень моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ионпарная хроматография) с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette, США) (Кудрин B.C. и соавт., 1988). Для определения количества моноаминов в структурах мозга крыс использовали раствор, содержащий в качестве внутреннего стандарта диоксибензиламин (ДОБА), норадреналин (НА), Ь-3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА), 3,4-дигидроксифенилуксусную кислоту (ДОФУК), дофамин (ДА), гомованилиновую кислоту (ГВК), 5-гидрокситриптофан (5-ОТФ), 5-гидрокситриптамин (5-ОТ), 5-оксииндолуксусную кислоту (5-ОИУК) в концентрации 500 пкмоль/мл. Величины

концентрации моноаминов в опытных образцах рассчитывали методом «внутреннего стандарта», исходя из отношений площадей пиков в стандартной смеси и в образце, и выражали в нмоль/мл.

Статистическую обработку результатов проводили по алгоритмам программы "Statistica 6.0" с проверкой соответствия распределения эмпирических данных нормальному закону по критерию Колмогорова-Смирнова: в случае соответствия применяли однофакторный дисперсионный анализ one-way ANOVA с последующим сравнением средних значений дисперсионного комплекса по тесту Ньюмана-Кеулса (Н-К) или по LSD-тесту; при несоответствии - непараметрический однофакторный дисперсионный анализ Kruskall-Wallis ANOVA, в этом случае post hoc анализ проводили по непарному непараметрическому U-критерию Манна-Уитни (М-У). Для сравнения двух зависимых выборок использовали критерий Вилкоксона. Для выявления корреляционной взаимосвязи рассчитывали непараметрический коэффициент корреляции рангов Спирмена (rs). Частоту встречаемости признака оценивали с помощью точного метода Фишера (ТМФ). Данные представлены в виде М±т. Принятый уровень значимости составлял 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Определение уровня тревожности в ПКЛ. У самцов опытной группы в возрасте 1 мес. по сравнению с контролем выявлено увеличение уровня тревожности во всех 3-х сериях (рис.1), о чем свидетельствовало уменьшение числа заходов в OP (II, III серии), уменьшение времени пребывания в OP (II, III серии), уменьшение числа свешиваний из ОР (II серия), увеличение числа оценок риска (I и II серии), увеличение числа свешиваний из ЗР (II серия), увеличение времени пребывания в ЗР (II и III серии). Частота выходов в ОР у самцов опытных групп в возрасте 1 мес. ниже, чем у самцов контрольных групп (объединено по 3 сериям: 57,4% и 80,4% соответственно, р<0,05; ТМФ). В возрасте 2 мес. у подопытных самцов сохранялись признаки повышенной тревожности, о которых судили по увеличению числа оценок риска (II серия: контроль - 1,0±0,3, опыт - 4,4±0,8; III серия: контроль - 0,9±0,2, опыт - 2,9±0,4, во всех случаях по критерию М-У р<0,01) и уменьшению числа свешиваний из ЗР (III серия: контроль - 2,4±0,5, опыт - 0,8±0,3, по критерию М-У р<0,05). В возрасте 3 и 7 мес. изменение уровня тревожности в ПКЛ не выявлено (во всех случаях р>0,05).

У подопытных самок признаки тревожности были выявлены в обеих сериях, однако изменения тревожности в ПКЛ носили менее стабильный характер, чем у самцов: в возрасте 1 и 3 мес. у самок опытных групп по сравнению с контролем выявлено уменьшение числа заходов в ОР (рис.1) (I серия, 1 и 3 мес.), уменьшение времени нахождения в OP (I серия, 1 и 3 мес.), уменьшение числа свешиваний из OP (I серия, 1 мес.), уменьшение числа свешиваний из ЗР (I серия, 1 мес.). В возрасте 2 мес. во II серии у подопытных самок обнаружено увеличение числа оценок риска. В возрасте 7 мес. в I серии изменения уровня тревожности у подопытных самок в ПКЛ не выявлено (р>0,05).

Рис.1. Показатели поведенческой активности крыс, подвергнутых введению ингибитора дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидина в раннем постнатальном периоде, и контрольных крыс в ПКЛ.

Обозначения: «Вр.(х10),Ц» - время, проведенное в центре лабиринта, с; «Заходы, ОР» - число заходов в ОР; «Вр.(хЮ),ОР» - время в ОР, с; «Св., ОР» - число свешиваний из ОР; «Риски» - число оценок риска; «Св., ЗР» - число свешиваний из ЗР; «Вр. (х100),ЗР» -время, проведенное в ЗР, с; «Заходы, ЗР» - число заходов в ЗР. Многоугольник светлосерого цвета - контроль; темно-серого цвета - опыт. *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 - по сравнению со значением показателя в соответствующей контрольной группе (роэ1 1юс анализ по критерию Манна-Уитни).

Во II серии части подопытных и контрольных крыс-самцов после первого тестирования в ПКЛ в возрасте 1 мес. спустя 21 день вводили диазепам в дозе 0,5 мг/кг, однократно, за 30 мин до повторного тестирования в ПКЛ (рис.2).

До введения диазепама у животных опытной группы по сравнению с контролем отмечено уменьшение числа заходов в ОР и времени пребывания в них, уменьшение числа свешиваний из центра ПКЛ и из ЗР, свидетельствующие о повышенном уровне тревожности в опытной группе. Анксиолитик диазепам нивелировал различия в группах по всем показателям. Кроме того, диазепам вызывал уменьшение числа оценок риска у подопытных крыс по сравнению с исходным уровнем. У подопытных крыс выявлена тенденция к увеличению времени пребывания в ОР и увеличению числа свешиваний из ОР, ЗР и из центра ПКЛ (р<0,14). В группе контроля диазепам снижал число заходов в ОР (при неизменности времени пребывания в них и отсутствии изменений в предпочтении ОР) и увеличивал число свешиваний из ЗР, что может отражать изменение характера исследовательской активности у животных на фоне действия препарата. Полученные

данные являются фармакологическим подтверждением наличия повышенной тревожности у подопытных крыс.

Повышенную тревожность также выявлена у взрослых подопытных самцов с помощью комплексного многопараметрового метода оценки тревожно-фобических состояний у крыс в возрасте 2 мес. (I и II серии) и 7 мес. (I серия) (рис.3). На других сроках обследования у подопытных самцов и на всех сроках обследования у подопытных самок изменения уровня тревожности не обнаружено (во всех случаях р>0,05).

Контрольная группа

12 10 8 6 4 2 # ■ -X Гш рХ. 1 пЙ х^ #

Заходы, ОР Вр.(хЮ),ОР Св.,ОР Риски Св.,Центр Заходы,ЗР Вр.(х100),ЗР Св-.зр Пред.,ОР

Опытная группа (введение ингибитора ДП-1\/ в раннем постанатльном периоде)

12 10 8 6 4 2 * 1 1 п £ * П рХ. н пй * 1 .

Заходы, ОР Вр.(хЮ),ОР Св.,ОР Риски Св.,Центр Заходы,ЗР Вр.(х100),ЗР Св.,ЗР Пред.,ОР

Рис. 2. Влияние диазепама (острое введение, 0,5 мг/кг) на поведение крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-ГУ метионил-2(8)-цианопирролидина в раннем постнатальном периоде, и контрольных крыс в ПКЛ.

Обозначения как на рис.1; кроме того, «Св., Центр» - число свешиваний из центра ПКЛ, «Пред., ОР» - предпочтение ОР, %. Белые столбики - контроль до введения препаратов; черные столбики - контроль после введения; светло-серые столбики - опыт до введения; темно-серые столбики - опыт после введения. *р<0,05 - по сравнению со значением показателя в соответствующей по сроку обследования контрольной группе (непарный критерий Манна-Уитни); #р<0,05 - по сравнению со значением показателя в данной группе при обследовании до введения диазепама (парный критерий Вилкоксона).

Кроме того, признаки тревожности у подопытных самцов обнаружены в подростковом возрасте и во взрослом состоянии в стрессогенных условиях открытого пространства по показателю увеличения латентного периода выхода из центра «открытого поля»: в возрасте 1 мес. (II серия: контроль - 27,2±4,6 с; опыт - 51,1±12,9 с, по ЬЗО-тесту р<0,05; III серия: контроль - 12,5±1,6 с; опыт - 22,1±3,6 с, по тесту Н-К р<0,05) и 2 мес. (II серия: контроль - 15,4±2,4 с; опыт- 32,2±6,5 с, по тесту Н-К р<0,05). На других сроках обследования у подопытных самцов и на всех сроках обследования у подопытных самок увеличения латентного периода не выявлено (во всех случаях р>0,05).

Таким образом, у крыс опытных групп выявлены признаки увеличения тревожности, о чем свидетельствует изменение поведения животных в тесте ПКЛ, увеличение латентного периода выхода из центра «открытого поля», а также увеличение балла тревожности по специализированной шкале тревожно-фобических состояний у крыс. У самцов увеличение тревожности в подростковом возрасте воспроизводилось от серии к серии, тогда как у самок изменения в уровне тревожности были менее стабильны.

Рис.3. Уровень тревожности у крыс, подвергнутых введению ингибитора дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидина в раннем постнатальном периоде, и контрольных животных в разные возрастные периоды (по результатам применения комплексного метода оценки тревожно-фобических состояний у крыс).

Обозначения: белые столбики - контроль, самцы; черные столбики - опыт, самцы; серые столбики - контроль, самки; заштрихованные столбики - опыт, самки. *р<0,05 - по сравнению со значением показателя в соответствующей контрольной группе (post 1юс-анализ по тесту Ньюмана-Кеулса).

Оценка депрессивного компонента в поведении крыс в тесте принудительного плавания. У подопытных самцов в возрасте 1 мес. ни в одной из серий не выявлено признаков «поведенческого отчаяния» и биоритмологических нарушений. В возрасте 2 мес. во всех сериях отмечено повышение ИД и увеличение длительности иммобилизации по сравнению с контролем (табл.1). В возрасте 3 мес. повышение ИД обнаружено в I серии, а увеличение длительности иммобилизации в I и III сериях. В возрасте 7 мес. в I серии у подопытных самцов ИД и длительность иммобилизации превышали значения показателей в контрольной группе, однако величина этих показелей в обеих группах находилась в пределах нормальных значений для крыс [ИД - 1,0±10%; длительность иммобилизации -до 20 с (Крупина H.A. и др., 1999)].

Также как и у самцов, у подопытных самок в подростковом возрасте не выявлено увеличения длительности иммобилизации и ИД (р>0,05). В возрасте 2 мес. в I серии у подопытных самок отмечено увеличение ИД (табл. 1). В 7 мес. в I серии выявлено только увеличение длительности иммобилизации.

В III серии для оценки эффектов антидепрессанта имипрамина и ингибитора ПЭП Z-Met-Prd-N по результатам обследования в возрасте 2 мес. были сформированы 3 пары групп крыс таким образом, чтобы в каждой паре длительность иммобилизации и ИД

Длительность иммобилизации и ритмологический индекс депрессивности у крыс опытных и кон

принудительного плавания (I, II и III серии).

Группы Иммобилизация (с) Индекс депр

I се рия 11 серия 111 серия 1 серия 11 серия

самцы самки самцы самки самцы j самки самцы самки самцы са

Контроль, 1 мес. 14,3 ±6,9 (п=9) 12,0±4,8 (п=7) 13,1±6,0 (п=13) 21,6± 5,7 (п=16) Исследований не проводили 0,6±0,2 (п=9) 1,1 ±0,5 (п=7) 0,5± 0,1 (п=13) 0,8 <п

Опыт, 1 мес. 14,5±4,5 (л=12) 19,4± 7,1 (п=7) 19,4± 5,8 (п=17) 12,3± 4,0 (п=13) 1,1 ±0,3 (ч=12) 1,0+ 0,4 (п=7) 1,5± 0,3 (п=17) 0.S (п

Контроль, 2 мес. 6,8 ±1,3 (п=8) 16,1±6,3 (п=7) 2,6+ 1,2 (п=7) 12,8+6,6 (п=8) 19,8±8,2 (п=26) Исследований не проводили 0,4±0,1 (п=8) 0,5± 0,1 (п=7) 0,1±0,0 (п=7) 0,6 ("

Опыт, 2 мес. 47,8±7,8 *** (п=12) 48,1± 14,6 (п=7) 34,9±11,8 (п=9) 15,3+8,4 (п=6) 34,8±7,0 ** (п=26) 2,2±0,4 *** (п=12) 3,6±1,9 * (п=7) 1,8 ±0,5 ** (п=9) 0,5 (л

Контроль, 3 мес. 3,0±2,2 (п=8) П,3±6,0 (п=7) 4,1+1,6 (п=7) 4,0± 1,9 (п=7) 3,4±1,3 (п=8) Исследований не проводили 0,2+ 0,1 (п=8) 0,4± 0,2 (п=7) 0,2± 0,1 (п=7) 0,2 (ч

Опыт, 3 мес. 31,5 ±63 *** (п=12) 22,0± 8,5 (п=7) 5,2± 2,2 (п=9) 2,3± 1,2 (п=6) 33,7±14,7 * (п=7) 1,4±0,3 ** (п=12) 1,7+ 1,1 (п=7) 0,5± 0,2 (п=9) 0,4 (ч

Контроль, 7 мес. 0,6± 0,4 (п=8) 5,0±3,3 (п=7) Исследований не проводили Исследований не проводили 0,1±0,1 (п=8) 0,3± 0,2 (п=7) Исследован! не проводил

Опыт, 7 мес. 10,9±3,8 * (п=12) 22,0± 6,3 * (п=6) 1,1± 0,5 * (п=12) 4,0±2,8 (п=6)

Примечание к табл.1: *р<0,05 , **р<0,01, ***р<0,001 - по сравнению со значением показателя в соответе (post hoc анализ по критерию Манна-Уитни). п - число животных в группе.

у крыс подопытных подгрупп статистически значимо превышали величину указанных показателей у крыс контрольных подгрупп. В течение 10 дней ежедневно животным одной пары вводили имипрамин в дозе 10 мг/кг (контроль: п=7; опыт: п=6), второй пары - Z-Met-Ргс1-Ы в дозе 2 мг/кг (контроль: п=8; опыт: п=7), третьей пары - физиологический раствор (контроль: п=8; опыт: п=7). Повторное тестирование плавательного поведения проводили через сутки после прекращения инъекций препаратов. Показано, что имипрамин подавляет признаки «поведенческого отчаяния» и нормализует биоритмологические показатели (рис.4), что является фармакологическим доказательством наличия депрессивно-

Длительность иммобилизации

с 70 Ингибитор ПЭП

60 |

50

40

30 20 #

10 ^ * I

контроль опыт

Имипрамин

контроль

Физиологический раствор

I

Ритмологический индекс депрессивности

Ингибитор ПЭП

Имипрамин

I

I

Физиологический раствор

I

¿1.

Рис.4. Влияние имипрамина (10 мг/кг) и ингибитора ПЭП 2-Ме1-РгсШ (2 мг/кг) на длительность иммобилизации и ИД у крыс, подвергнутых постнатальному введению ингибитора ДП-1У, и контрольных крыс в тесте принудительного плавания.

Обозначения: белые столбики - контроль до введения препаратов; черные столбики - контроль после введения; светло-серые столбики - опыт до введения; темно-серые столбики - опыт после введения. *р<0,05; **р<0,01 - по сравнению со значением показателя в соответствующей по сроку обследования контрольной группе (непарный критерий Манна-Уитни); #р<0,05 - по сравнению со значением показателя в данной группе при обследовании до введения препарата (парный критерий Вилкоксона).

подобного поведения у крыс опытных групп. Эффекты ингибитора ПЭП 2-Ме1-РпМ\1 по подавлению признаков депрессии в поведении крыс сравнимы с эффектами имипрамина, однако доза 2-Ме(-Рг<1-М была в 5 раз меньше.

Определение суточного потребления жидкости и предпочтения/потребления сахарозы у крыс позволило выявить у подопытных крыс обоего пола в подростковом возрасте снижение потребления сахарозы, у молодых взрослых самцов - снижение предпочтения сахарозы, а у зрелых подопытных самок - снижение потребления сахарозы, т.е. у крыс обоего пола выявлены признаки гедонических расстройств. Кроме того, у подопытных самцов выявлено также снижение потребления жидкости в подростковом и взрослом возрасте, а у подопытных самок нарушения питьевой мотивации не наблюдали: (рис.5). У подопытных самцов в возрасте 3 и 7 мес. и у подопытных самок в возрасте 2 и

% Относительное потребление сахарозы, 1 мес, II серия

Предпочтение сахарозы, 2 мес, II серия

% Относительное потребление сахарозы, 7 мес, I серия

X I Г L *

Й1 Ifil 4

1 день

Потребление жидкости, 1 мес, II серия

Ж

3 день

Потребление жидкости, 1 мес, III серия

JL

I I

I

Рис.5. Суммарное суточное потребление жидкости, относительное потребление и предпочтение сахарозы в группах крыс, подвергнутых действию ингибитора ДП-IV в раннем постнатальном периоде, и контрольных крыс.

Обозначения: белые столбики - контроль, самцы; черные столбики - опыт, самцы; светло-серые столбики - контроль, самки; темно-серые столбики - опыт, самки. *р<0,05 -по сравнению со значением показателя в соответствующей контрольной группе (post hoc анализ по тесту Ньюмана-Кеулса).

3 мес. признаков гедонических нарушений и питьевой мотивации не выявлено.

Таким образом, о наличии депрессивного компонента в поведении крыс свидетельствует развитие состояния «поведенческого отчаяния» и нарушение ритмологической структуры плавательного поведения в тесте принудительного плавания, а также появление у животных признаков агедонии и снижения питьевой мотивации.

При обследовании подопытных самцов в тесте «открытого поля» (с визуальной оценкой поведения) не выявлено статистически значимых отличий от показателей контрольной группы в ориентировочно-исследовательской деятельности (двигательная и исследовательская активность) животных. У подопытных самок в возрасте 2 мес. отмечено снижение исследовательской активности (I серия: контроль - 10,1±1,8 ст., опыт -4,7±0,8 ст., по тесту Н-К р=0,037), в 3 мес. - увеличение двигательной активности (II серия: контроль - 28,6±5,1 кв., опыт - 45,8±7,4 кв., по LSD-тесту р=0,03), в 7 мес. - увеличение исследовательской активности (I серия: контроль - 1,6±0,5 ст., опыт - 4,5±1,4 ст., по тесту Н-К р=0,003).

При тестировании животных в автоматизированном тесте «открытого поля» в

возрасте 1 мес. у самцов опытной группы отмечено увеличение горизонтальной активности (III серия: контроль - 722,0±52,2 см, опыт - 885,1±58,1 см, по тесту Н-К р=0,041); в возрасте 2 мес. - снижение горизонтальной (I серия: контроль - 666,4±46,0 см, опыт -457,1±26,2 см, по тесту Н-К р=0,014) и исследовательской активности (I серия: контроль -22,3±1,2 ст., опыт - 17,9±1,6 ст., по LSD-тесту р=0,030); в возрасте 3 и 4 мес. - изменений в ориентировочно-исследовательской деятельности не выявлено. В группе подопытных самок отмечено увеличение исследовательской активности в 2 мес. (I серия: контроль -

17,9±],6 ст., опыт - 25,3±1,6 ст., по тесту Н-К р=0,010) и в 3 мес. (II серия: контроль -14,7±1,8 ст., опыт - 22,8±1,9 ст., по тесту Н-К р=0,045).

Таким образом, в подростковом периоде у подопытных саш/ов наличие признаков выраженной тревожности в ПКЛ не сопровождалось снижением двигательной активности в тестах «открытого поля», а в возрасте 2 мес. снижение двигательной активности в автоматизированном тесте не сопровождалось увеличением тревожности (по тесту ПКЛ и латентности выхода из центра «открытого поля»), у подопытных самок также признаки тревожности в ПКЛ не сопровождались снижением ориентировочно-исследовательской деятельности в тестах «открытого поля». Можно заключить, что повышение уровня тревожности в ПКЛ и «открытом поле» не является отражением снижения двигательной и исследовательской активности.

Изменение болевой чувствительности в динамике взросления выявлено только у подопытных самцов на фоне повышения уровня тревожности: в возрасте 1 мес. латентный период реакции избавления был увеличен (И серия: контроль - 10,2±1,1 с, опыт - 13,9± 1,2 с, по тесту Н-К р=0,040), а в возрасте 7 мес. - снижен (I серия: контроль - 18,8±1,7, опыт - 15,1±0,9 с, по LSD-тесту р=0,037). По данным психофизиологических и клинических исследований характер взаимосвязи тревожности и болевой чувствительности противоречив: выявлено как снижение ПБР (Rhudy J.L., Meagher M.W., 2000), так и отсутствие изменений болевой чувствительности при повышенной тревожности (Lautenbacher S. et al., 1999; Jones A. et al., 2002).

Статистически значимых различий по показателям сенсомоториой реактивности у подопытных крыс обоего пола по сравнению с контролем ни на одном из сроков обследования не выявлено, что свидетельствует об отсутствии психотического компонента в поведении подопытных животных.

В целом, полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что синтетический ингибитор ДП-IV неконкурентного типа метионил-2(5)-цианопирролидин в условиях его внутрибрюшинного введения в раннем постнатальном периоде вызывает у крыс стойкие нарушения поведения по типу усиления тревоги и депрессии.

Активность пролинспецифических пептидаз в структурах мозга крыс. У самцов опытной группы по сравнению с контролем в возрасте 1 мес. выявлено увеличение активности ПЭП и ДП-IV во фронтальной коре и гипоталамусе (рис.6); в 7 мес. -увеличение активности ПЭП во фронтальной коре и стриатуме, также увеличение активности ДП-IV во всех изученных структурах мозга. У подопытных самок в возрасте 1 мес. по сравнению с контролем отмечено увеличение активности ПЭП в гиппокампе и активности ДП-IV во всех изученных структурах мозга; в 7 мес. - увеличение активности обоих ферментов в стриатуме. В 3 мес. у подопытных крыс обоего пола статистически значимых изменений в активности обоих ферментов не выявлено.

Уровень моноаминов и их метаболитов в стуктурах мозга крыс. У самцов опытной группы (табл.2) на всех сроках обследования выявлено снижение отношения ГВК/ДА в стриатуме. Кроме того у самцов 3-месячного возраста в стриатуме отмечено снижение уровня ГВК, а у 7-месячных крыс - увеличение отношения ДОФУК/ДА. В возрасте 7 мес. обнаружено также уменьшение уровня ГВК в прилежащем ядре и увеличение уровня НА в гипоталамусе.

Активность ПЭП, 1 мес.

Стриатум

нмоль*мин' *мг белка 0,040

Активность ДП-IV, I мес.

0,030 0,020 0,010 0,000

I*

гШ_о!

П1пП

*

П«г-Л

ШпП

Фронтальная кора

Гипоталамус

Прилежащее ядро

Стриатум

нмоль 0,060 0,040 0,030 0,020 0,010 0,000 *мин' *мг"'белка Активность ПЭП, 7 мес.

* п! X п nififi iiifl * * ninfi 1 X п

>ронтальная кора Гипоталамус Прилежащее ядро Стриатум Гиппокамп

нмоль 0,016 0,012 0,009 0,006 0,003 0,000 0 *мин''*мг"'белка Активность ДП-IV, 7 мес.

* ftifin * pJnfl * £ ЛпП Jni

фронтальная кора Гипоталамус Прилежащее ядро Стриатум Гиппокамп

Рис.б. Активность пролинспецифических пептидаз в структурах мозга подопытных и контрольных крыс.

*р<0,05 - по сравнению со значением показателя в соответствующей контрольной группе (post hoc анализ по критерию Манна-Уитни).

В группе подопытных самок (табл. 3) в возрасте I и 3 мес. выявлено снижение уровня ДА и ДОФУК в прилежащем ядре, в 1 мес. в этой структуре также выявлено снижение уровня ГВК. У 3-месячных самок выявлено снижение уровня ДА в гиппокампе, уровня ДОФУК в гипоталамусе и повышение отношения ДОФУК/ДА на фоне тенденции к снижению уровня ДА во фронтальной коре; у 7-месячных крыс - снижение уровня ДА в стриатуме. В возрасте 1 мес. в гиппокампе выявлено увеличение уровня 5-ОИУК и отношения 5-ОИУК/5-ОТ, в возрасте 3 мес. - увеличение 5-ОИУК/5-ОТ, а в возрасте 7 мес. - увеличение 5-ОИУК. В возрасте 3 мес. во фронтальной коре отмечено снижение отношения 5-ОИУК/5-ОТ на фоне тенденции к повышению уровня 5-ОТ, а в 7 мес. -увеличение уровня 5-ОТ.

Уровень моноаминов и их метаболитов (нмоль/г ткани) в структурах мозга кр!

Стриатум, 1 мес.

Группы НА ДА ДОФУК гвк ДОФУК/ДА ГВК/ДА 5-ОТ

Контроль 0,90±0,14 137,14±11,99 13,84±1,41 4,92±0,65 0,10±0,00 0,04±0,00 2,22±0,2

Опыт 1,07±0,13 137,41±5,44 15,69±1,65 3,55±0,14 0,11 ±0,01 0,03±0,00** 2,53±0,1

Стриатум, 3 мес.

Контроль 0,75±0,16 99,80±8,27 11,73±0,94 5,93±0,34 0,12±0,02 0,06±0,01 2,64±0,1

Опыт 0,82±0,14 99,49±4,86 12,44±1,39 3,97±0,40** 0,13±0,01 0,04±0,00** 2,47±0,1

Стриатум, 7 мес.

Контроль 0,76±0,11 119,91 ±7,96 11,64±0,92 5,11±0,45 0,10±0,00 0,04±0,00 2,28±0,1

Опыт 10,74±0,07 122,15±3,64 13,40±0,69 4,10±0,23 0,11±0,00* 0,03±0,00** 2,3 8±0,С

Гипоталамус, 7 мес.

Контроль 5,22±0,56 1,29±0,20 0,16±0,03 0,20±0,04 0,13±0,02 0,17±0,04 2,88±0,2

Опыт 6,34±0,32* 1,31±0,Ю 0,13±0,02 0,10±0,03 0,10±0,01 0,09±0,02 2,70±0,1

Прилежащее ядро,7 мес.

Контроль 2,14±0,61 26,18±4,11 4,15±0,57 4,67±0,65 0,16±0,01 0,19±0,02 4,82±0,S

Опыт 2,95±0,64 20,41±3,07 3,62±0,42 2,55±0,33 * 0,19±0,01 0,14±0,01 4,52±0,5

Примечание к табл.2: post hoc анализ по критерию Манна-Уитни - *р<0,05; **р<0,01- по сравне! контрольной группе; число животных: 1 мес., контроль п=6, опыт п=8; 3 мес., контроль п=7, опыт п=9; 7 л

Уровень моноаминов и их метаболитов (нмоль/г ткани) в структурах мозга кры

Прилежащее ядро, 1 мес.

Группы НА ДА ДОФУК гвк ДОФУК/ДА ГВК/ДА I 5-ОТ

Контроль 2,04±0,26 28,86±2,90 8,08±0,78 4,64±0,58 0,29±0,02 0,16±0,01 4,93±0,92

Опыт 2,25±0,74 15,77±2,40** 4,34±0,53** 2,41±0^4** 0,29±0,02 0,16±0,02 4,13±0,23

Гиппокамп, 1 мес

Контроль 1,48±0,08 0,65±0,21 0,11 ±0,02 0,31±0,07 0,21±0,05 0,75±0,24 2,16±0,13

Опыт 1,64±0,04 0,27±0,03 0,14±0,03 0,28±0,07 0,63±0,18 1,09±0,27 2,37±0,14

Фронтальная кора, 3 мес.

Контроль 1,01±0,07 0,34±0,03 0,08±0,01 0,14±0,03 0,23±0,03 0,41 ±0,08 1,00±0,15

Опыт 0,90±0,06 0,23±0,04 0,09±0,01 0,17±0,04 0,42±0,06* 0,81±0,16 1,48±0,07

Гипоталамус, 3 мес.

Контроль 4,64±0,32 1,15±0,17 0,21 ±0,04 0,14±0,04 0,21 ±0,05 0,13±0,03 3,11±0,21

Опыт 5,40±0,54 1,08±0,11 0,10±0,01 * 0,13±0,04 0,10±0,01 0,13±0,04 2,65±0,19

Прилежащее ядро, 3 мес.

Контроль 1,80±0,34 28,44±2,63 5,42±0,56 4,58±0,43 0,16±0,03 0,13±0,02 4,90±1,09

Опыт 2,68±0,77 13,74±2,34** 2,88±0,37** 4,44±2,16 0,22±0,03 0,40±0,23 3,64±0,17

Гиппокамп, 3 мес.

Контроль 1,62±0,12 0,19±0,09 0,14±0,04 0,21 ±0,05 1,21±0,38 1,91 ±0,62 2,04±0,16

Опыт 1,56±0,09 0,06±0,01** 0,08±0,02 0,23±0,04 1,28±0,37 3,71 ±0,58 1,68±0,12

Фронтальная кора, 7 мес.

Контроль 0,99±0,06 1 0,29±0,03 0,13±0,06 0,10±0,03 0,43±0,18 0,33±0,10 1,06±0,12

Опыт 1,07±0,05 1 0,23±0,03 0,04±0,01 0,08±0,01 0,20±0,06 0,37±0,04 1,48±0,04 *

Стриатум, 7 мес.

Контроль 0,77±0,13 119,94±4,57 11,02±0,71 4,20±0,32 0,009±0,00 0,03±0,00 2,45±0,16

Опыт 1,45±0,60 82,89±16,71** 8,53±1,62 3,29±0,35 0,75±0,65 2,12±2,08 3,48±0,84

Гиппокамп, 7 мес.

Контроль 1,36±0,03 0,27±0,04 0,05±0,01 0,21 ±0,06 0,23±0,04 0,82±0,26 1,92±0,10

Опыт 1,47±0,07 0,54±0,26 0,15±0,05 0,09±0,02 0,89±0,57 0,45±0,15 2,55±0,30

Примечание к табл.3: post hoc анализ по критерию Манна-Уитни - *р<0,05; **р<0,01- по сравнени контрольной группе; число животных: 1 мес., контроль п=8, опыт п=7; 3 мес., контроль п=7, опыт п=6; 7 Mei

Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что синтетический ингибитор ДП-IV неконкурентного типа метионил-2(8)-цнанопирролиднн в условиях его внутрибрюшинного введения в раннем постнатальном периоде вызывает у крыс стойкие нарушения поведения по типу усиления тревоги и депрессии, более четко проявляющиеся у самцов. В целом, полученные данные позволяют рассматривать экспериментальное тревожно-депрессивное состояние у крыс, вызываемое ингибитором ДП-IV метионил-2(8)-цианопирролидпном в условиях его постнаталыюго введения, как новую модель тревожно-депрессивного состояния, по-разному развивающегося у самок и самцов.

В настоящем исследовании ИНГ ДП-IV вводили крысам в период с 1-й по 3-ю неделю развития, что соответствует срокам созревания данной ферментной системы (Kato Т. et al., 1979; Imai К., Kato Т., 1984). Показанная в работе индукция тревожно-депрессивного состояния в эксперименте путем воздействия на систему становления активности ДП-IV в раннем онтогенезе свидетельствует об участии ДП-IV в развитии тревожно-депрессивных состояний, однако механизмы такого участия остаются предметом специальных исследований. Повышение активности ДП-IV в структурах мозга крыс у взрослых животных с признаками тревожно-депрессивного состояния может быть адаптивным ответом на длительное подавление активности фермента у новорожденных крыс. Такое повышение активности ДП-IV само по себе может быть одним из патогенетических механизмов развития аффективных нарушений. Результаты исследования подтверждают представления о том, что многие формы патологии взрослого организма закладываются в раннем онтогенезе.

Анализ изменения активности ПЭП и ДП-IV и состояния моноаминергических систем в структурах мозга крыс, повергнутых постнатальному введению ингибитора ДП-IV, с позиции теории генераторных и системных механизмов нервных расстройств (Крыжановский Г.Н., 1980-1997) позволяет высказать предположение о том, что в основе развивающегося у животных тревожно-депрессивного состояния лежит формирование сложной патологической системы, в состав которой входит ряд структур мозга, вовлеченных в реализацию мотивационного и эмоционального поведения - фронтальная кора, стриатум, прилежащее ядро, гиппокамп и гипоталамус. Такая сложная патологическая система на разных этапах своего существования может проявляться разной клинической симптоматикой, включая, в том числе, и периоды латентного течения расстройства. Однако в настоящее время не ясно, какая структура может играть роль патологической детерминанты (детерминант) тревожно-депрессивного состояния. В целом, можно заключить, что дизрегуляция активности пролинспецифических пептидаз, уровня моноаминов и взаимодействия этих систем в ЦНС вносит вклад в генез эмоционально-поведенческих расстройств типа тревожно-депрессивных состояний.

В свете сказанного особый интерес представляют выявленные в настоящем исследовании антидепрессивиые эффекты ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианоиирролидина, что согласуется с данными о наличии у этого ингибитора свойств антидепрессанта и анксиолитика, полученными на модели экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома у крыс (Хлебникова H.H. и др., 2009).

В целом, на основании полученных данных можно полагать, что поиск новых

фармакологических средств, обладающих свойствами антидепрессантов и анкиолитиков,

среди ингибиторов пролинспецифических пептидаз может быть перспективным.

Включение таких соединений в комплексную терапию депрессивных состояний может

повысить эффективность такой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Синтетический ингибитор дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидин при введении в дозе 1,0 мг/кг в раннем постнатальном периоде (5-18 дни) вызывал появление признаков тревожности и депрессивно-подобного поведения у крыс обоего пола в подростковом возрасте и у взрослых животных.

2. Развитие тревожно-депрессивного состояния у крыс обоего пола, подвергнутых постнатальному введению ингибитора ДП-ГУ, сопровождалось повышением активности пролинспецифических пептидаз пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV в структурах мозга - во фронтальной коре, стриатуме, прилежащем ядре, гиппокампе и гипоталамусе.

3. Развитие тревожно-депрессивного состояния у крыс обоего пола, подвергнутых постнатальному введению ингибитора ДП-1У, сопровождалось изменением состояния моноаминергических систем мозга - дофаминергической, серотонинергической и норадренергической систем - во фронтальной коре, стриатуме, прилежащем ядре, гиппокампе и гипоталамусе.

4. Бензодиазепиновый транквилизатор диазепам при остром внутрибрюшинном введении в дозе 0,5 мг/кг уменьшал проявление признаков тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте у самцов крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-1У в раннем постнатальном периоде.

5. Трициклический антидепрессант имипрамин при субхроническом внутрибрюшинном введении в дозе 10,0 мг/кг подавлял проявление признаков депрессивности в тесте принудительного плавания у самцов крыс, подвергнутых постнатальному введению ингибитора ДП-1У.

6. Синтетический ингибитор пролилэндопептидазы бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин при субхроническом внутрибрюшинном введении в дозе 2,0 мг/кг подавлял проявление признаков депрессивности в тесте принудительного плавания у самцов крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-1У в раннем постнатальном периоде. Результаты свидетельствуют о наличии антидепрессантых свойств у ингибитора ПЭП.

7. Результаты исследования позволяют рассматривать длительные эмоционально-поведенческие нарушения у крыс, вызванные инигибитором ДП-1У в условиях его постнатального введения, как новую экспериментальную модель тревожно-депрессивного состояния. Полученные данные свидетельствуют о том, что дизрегуляционное повышение активности пролинспецифических пептидаз в ЦНС может быть патогенетическим механизмом развития тревоги и депрессии, а ингибиторы пролилэндопептидазы могут быть эффективны в комплексной патогенетической терапии тревожно-депрессивных расстройств.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Золотов H.H., Крупина H.A., Кушнарсва Е.Ю., Лебедева М.А., Саноцкая Н.В., Мациевский Д.Д., Назарова Г.А., Крайнева В.А., Богданова Н.Г., Воронина Т.А., Гарибова Т.Л. Ингибиторы пролинепецифических пептидаз в моделировании патологических состояний и их патогенетической коррекции // Тезисы докладов и стендовых сообщений VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов». 23-25 апреля, 2007. - М. - 2007. - С. 51.

2. Золотов H.H., Крупина H.A., Богданова Н.Г., Кушнарева Е.Ю., Назарова Г.А., Лебедева М.А., Кудрин B.C., Клодт П.М., Воронина Т.А. Изменения активности дипептидилпептидазы IV (CD26) при различных иммунных и неврологических состояниях в эксперименте // Материалы XVI Всероссийской конференции «Нейроиммунология» «Нейроимидж» и научно-практической конференции неврологов. 23-26 мая, 2007. - СП6.-2007,- Нейроиммунология. - 2007. - T.V. - № 2. - С. 49-50.

3. Кушнарева Е.Ю., Крупина H.A., Золотов H.H.,. Хлебникова H.H. Эмоционально-поведенческие нарушения у крыс, вызванные введением ингибитора дипептидилпептидазы IV в раннем постнатальном периоде // Тезисы докладов XX Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. 4-8 июня, 2007. - М. - 2007.

- С. 298.

4. Золотов H.H., Крупина H.A., Кушнарева Е.Ю., Лебедева М.А., Саноцкая Н.В., Мациевский Д.Д., Назарова Г.А., Крайнева В.А., Богданова Н.Г., Лосев A.C., Кудрин B.C., Клодт П.М., Воронина Т.А., Гарибова Т.Л. Ингибиторы пролинспецифических пептидаз в патогенетической коррекции при моделировании экспериментальных патологических состояний // Материалы III Съезда фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению». 23-27 сентября, 2007. - СПб. -Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т.7. - Спец. выпуск. - 4.1.

- С. 1706.

5. Крупина H.A., Орлова И.Н., Хлебникова H.H., Панкова Н.Б., Богданова Н.Г., Кушнарева Е.Ю., Родина В.И. Дизрегуляционные механизмы в развитии экспериментальных эмоционально-поведенческих расстройств //В кн.: «Дизрегуляционная патология». Материалы Объединенного пленума Российского и Московского научных обществ патофизиологов, Научного совета по общей патологии и патофизиологии РАМН и Минздравсоцразвития РФ, посвященного 85-летию академика РАМН Г.Н.Крыжановского 13 -14 ноября, 2007. - Патогенез. - Приложение 1. - 2007. -С. 13-14.

6. Кушнарева ЕЛО. Экспериментальная модель тревожно-депрессивного состояния у крыс, вызванного введением ингибитора дипептидилпептидазы IV в раннем постнатальном периоде, и изменение активности пролинспецифических пептидаз в структурах мозга // Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». 19-22 мая, 2008. - М. - 2008. - С. 236-237.

7. Krupina N., Kushnareva Е., Khlebnikova N., Zolotov N. Behavioral alterations in rats postnatally exposed to inhibitor of dipeptidyl peptidase iv: animal model of anxiety-depression state // New Research Abstract Book. XIV World Congress of Psychiatry. September 20-25, 2008. Prague. Czech Republic. Ceskâ a slovenskâ psychiatrie. J. of Czech, and Slovak, psychiatry. - Prague. - V.104. - Suppl.l. - P.29.

8. Kushnareva E., Krupina N., Khlebnikova N., Zolotov N. Activities of prolyl endopeptidase and dipeptidyl peptidase iv in brain structures of rats with anxiety-depression state induced by postnatal administration of dipeptidyl peptidase iv inhibitor // New Research Abstract Book. XIV World Congress of Psychiatry. September 20-25, 2008. Prague. Czech. Republic. Ceska a slovenska psychiatrie. J. of Czech, and Slovak, psychiatry. - Prague. - V.104. - Suppl.l. -P.30.

9. Крупина H.A., Кушнарева Е.Ю., Хлебникова H.H., Золотов Н.Н., Крыжановский Г.Н. Поведенческие изменения у крыс, вызванные ингибитором дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидином: экспериментальная модель тревожно-депрессивного состояния // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2009. - Т. 147. - № 3. - С. 256260.

10. Крупина Н.А., Кушнарева Е.Ю., Хлебникова Н.Н., Золотов Н.Н., Крыжановский Г.Н. Экспериментальная модель тревожно-депрессивного состояния у крыс, вызванная введением ингибитора дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидина в раннем постнатальном периоде // Жури. высш. нервн. деят. - 2009. - Т. 58. - №3. - С. 358-367.

Kushnareva Ekaterina Yurievna Anxiety-depression-like state induced by inhibitor of dipeptidyl peptidase IV (experimental study)

The effects of postnatal administration (5-18 postnatal days) of irreversible synthetic inhibitor of dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) methionyl-2(S)-cyano-pyrrolidine (1 mg/kg, i.p) in rats of both genders were studied. Increased anxiety was revealed in adolescent and adult experimental males and females in the elevated plus-maze, open field and in a battery of tests for evaluating anxiety-phobic states. Depression-related immobility behavior and rhythmological index of depression in forced swimming test were higher in adult rats of both genders as compared with control. Adolescent and adult rats postnatally exposed to inhibitor of DPPIV presented anhedonia in sucrose preference test. Diazepam (0,5 mg/kg, acute exposure) suppressed anxiety, imipramine (10,0 mg/kg, subchronic exposure) suppressed depression-related behavior in DPPIV-treated rats. Anxiety-depression state in males and females was associated with the increase of DPPIV and prolyl endopeptidase (PEP) activity and with the changes in dopaminergic, serotonergic and noradrenergic systems in frontal cortex, striatum, nucleus accumbens, hippocamp and hypothalamus in rat brain. Synthetic inhibitor of PEP benzyloxycarbonyl-methionyl-2(S)-cyano-pyrrolidine (2,0 mg/kg, subchronic exposure) suppressed depression-relative behavior in forced swimming test similar to imipramine. Data confirm the hypothesis that modulation of DPPIV activity in early ontogenesis may cause persistent disturbances in behavior such as anxiety-depression state together with alterations in DPPIV and PEP activity and changes in monoaminergic systems in various brain structures. Long-term behavioral alterations in adolescent and adult rats postnatally exposed to DPPIV inhibitor may be considered as a new rat model of anxiety-depression-like state. Our finding suggests a role for DPPIV and PEP enzymes in the pathophysiology of depression and anxiety and give much promise for the development of new approaches to complex pathogenetic therapy of depressive disorders with PEP-modulating drugs.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ВЭЖХ/ЭД — метод высокоэффективной жидкостной

хроматографии с электрохимической детекцией

ГВК — гомованилиновая кислота

ДА — дофамин

ДОБА — диоксибензиламин

ДОФУК — диоксифенилуксусная кислота

ДП-1У — дипептилпептидаза-1У

ИД — индекс депрессивности

МФТП — 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин

НА — норадреналин

5-ОИУК — 5-оксииндолуксусная кислота

5-ОТ — 5-гидрокситриптамин

5-ОТФ — 5-гидрокситрнптофан

ПКЛ — приподнятый крестообразный лабиринт

ПЭП — пролилэндопептидаза

Для заметок

Актуальность исследования. Депрессия и тревожность, встречаются как самостоятельные нозологические формы, так и совместно (Бурчинский

C.Г., 2005; Мосолов С.Н., 2005; Marks I.E., 2001). Более чем у 50% больных депрессией определяются симптомы тревожного расстройства (Haddad P.M., 1995; Ravindran A.V. et al., 1997; Fava M. et al., 2000; Roy-Byrne P.P. et al., 2000). Среди больных с диагнозом тревожного расстройства почти половина удовлетворяет также критериям большой или малой депрессии (Priest R.G., Baldwin D., 1994). Для тревожно-депрессивных расстройств характерны более тяжелые клинические проявления и психосоциальные нарушения, наличие коморбидного состояния ухудшает прогноз заболевания. Большие затраты на лечение смешанного типа тревожно-депресивных нарушений при низкой терапевтической эффективности, длительная нетрудоспособность больных, а также высокий процент попыток суицида при осложненных формах заболевания приводят к резкому снижению качества жизни таких больных и подчеркивают социально-экономическую значимость этой проблемы, занимающей одно из первых мест в рейтинге интегративной оценки социального бремени различных заболеваний в мире через индекс DALY (Desjarlais R. et al., 1995). Клинико-эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что изучение патогенетических механизмов тревожно-депрессивных нарушений, а также поиск новых подходов к их патогенетической терапии представляют собой важную медико-биологическую проблему.

По общепринятым представлениям тревожно-депрессивные расстройства связывают с недостаточностью моноаминергических систем мозга и нарушением взаимодействия нейротрансмиттерных и центральных нейрорегуляторных систем (van Praag Н.М. et al., 1990; Anand A., Charney

D.S., 2000; Ressler K.J., Nemeroff C.B., 2000; Nemeroff C.B., 2002; Phillips M.L. et al., 2003; Maletic V., Robinson M. et al., 2007). В настоящее время большую роль в генезе аффективных расстройств отводят участию пептидергических систем мозга, в частности, нейропептидам (Bingaman E.W., 1996; van Megen H.J. et al., 1996; Kramer M.S. et al., 1998; Koob G.F., 1999; Anand A., Charney D.S., 2000; Ressler K.J., Nemeroff C.B., 2000; Gray T.S., Karl T. et al., 2003). Уровень регуляторных пептидов в организме определяется эффективностью их процессинга с участием, в том числе протеолитических ферментов - пептидаз (Mentlein R. et al., 1993, 1999; Biihling F. et al., 1995; Scharpe S. et al., 2001; Polgar L., 2002). Известно, что многие нейропептиды, опосредующие эффекты тревоги и депрессии, являются субстратами пролинспецифических пептидаз -дипептидилпептидазы-IV (ДП-IV) и пролилэндопептидазы (ПЭП) (Mentlein R. et al., 1993, 1999; Kanai К. et al., 1999; Scharpe S. et al., 2001).

В клинике показано, что изменение активности ПЭП и ДП-IV в сыворотке и плазме крови у больных с аффективными расстройствами связано с состоянием депрессии и тревоги, однако данные о направленности изменения активности этих ферментов противоречивы (Maes М. et al., 19912004). В экспериментах на грызунах с недостаточностью ДП-IV, вызванной мутацией гена фермента, выявлено снижение стресс-реактивности (Karl Т. et al., 2003) и уменьшение депрессивно-подобного поведения в стресс-ситуациях (El Yacoubi М. et al., 2006). В недавних исследованиях показано, что развитие экспериментального МФТП-индуцированного состояния у крыс сопровождается повышением активности ПЭП и ДП-IV в структурах мозга (Крупина Н.А. и др., 2006). Приведенные данные позволяют предположить, что дизрегуляция в системе пролинспецифических пептидаз является одним из механизмов развития тревожно-депрессивных расстройств.

В этой связи особый интерес представляют данные об антидепрессантной активности ряда синтетических ингибиторов ПЭП, полученные на экспериментальной модели депрессии в тесте принудительного плавания Порсолта (Золотов Н.Н. и др., 1992а, 19926) и на модели экспериментального МФТП-индуцированного депрессивного синдрома (Хлебникова Н.Н. и др., 2009). Запатентовано средство для лечения стресса и тревожности, а также депрессивных нарушений, на основе комбинации ингибитора ДП-IV и его субстрата нейропептида Y (Фон Херстен Шт. и др., 2001).

Изложенные факты указывают на актуальность исследования роли пептидаз в патогенезе тревожно-депрессивных нарушений и поиска современных подходов к созданию новых анксиолитиков и антидепрессантов на основе ингибиторов пролинспецифических пептидаз.

Целью исследования явилось изучение эмоционально-поведенческих нарушений у крыс, вызванных необратимым синтетическим ингибитором дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидином в условиях его введения в раннем постнатальном периоде, а также определение активности протеолитических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV, уровня моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс.

Задачи исследования:

1) Изучить изменения поведения крыс обоего пола в подростковом возрасте и у взрослых животных, подвергнутых субхроническому введению ингибитора ДП-IV метионил-2(8)-цианопирролидина (Met-Prd-N) в раннем постнатальном периоде, в тестах на определение уровня тревожности (приподнятый крестообразный лабиринт, тест «открытого поля», специализированная шкала для оценки тревожно-фобического состояния у крыс).

2) Изучить изменения поведения крыс обоего пола в подростковом возрасте и у взрослых животных, после субхронического введения ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде, в тестах на наличие депрессивно-подобного состояния (тест принудительного плавания, оценка суточного потребления жидкости и потребления/предпочтения раствора сахарозы).

3) Изучить изменения двигательной активности в тестах «открытого поля», сенсомоторной реактивности в акустическом стартлрефлексе и болевой чувствительности в тесте «Горячая пластина» у крыс обоего пола в подростковом возрасте и у взрослых животных после введения ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде.

4) Исследовать эффекты однократного введения диазепама на уровень тревожности у крыс с эмоционально-поведенческими нарушениями, вызванными ингибитором ДП-IV Met-Prd-N в условиях его введения в раннем постнатальном периоде.

5) Исследовать эффекты субхронического введения ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина (Z-Met-Prd-N) на проявления депрессивно-подобного поведения у крыс с эмоционально-поведенческими нарушениями, вызванными ингибитором ДП-IV Met-Prd-N в условиях его введения в раннем постнатальном периоде, в сравнении с эффектами трициьслического антидепрессанта имипрамина.

6) Изучить изменение активности пролинспецифических пептидаз ПЭП и ДП-IV флуорометрическим методом во фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме, прилежащем ядре и гиппокампе в динамике развития эмоционально-поведенческих нарушений у крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде.

7) Изучить уровень моноаминов и их метаболитов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией во фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме, прилежащем ядре и гиппокампе в динамике развития эмоционально-поведенческих нарушений у крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде.

Научная новизна. Впервые получены данные о том, что модуляция активности фермента дипептидилпептидазы IV путем введения в раннем постнатальном периоде его синтетического ингибитора метионил-2(8)-цианопирролидина вызывает у крыс обоего пола длительные нарушения поведения, проявляющиеся в развитии тревоги и депрессии. Показано, что динамика развития тревожно-депрессивного состояния у самцов и самок различна. Фармакологический анализ тревожно-депрессивного состояния у крыс, подвергнутых субхроническому введению ингибитора ДП-IV в постнатальном периоде, в совокупности с характером эмоционально-поведенческих нарушений позволяет рассматривать такие изменения поведения в качестве новой модели тревожно-депрессивных состояний у крыс. На данной модели обнаружены антидепрессивные свойства нового синтетического ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина.

Установлено, что развитие экспериментального тревожно-депрессивного состояния, вызванного введением ингибитора ДП-IV Met-Prd-N в раннем постнатальном периоде, сопровождается повышением активности пролинспецифических пептидаз - ПЭП и ДП-IV в структурах мозга, опосредующих развитие эмоционально-поведенческих расстройств, -фронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме, прилежащем ядре и гиппокампе. На всех этапах развития тревожно-депрессивного состояния у крыс в этих структурах выявлены изменения в состоянии серотонинергической, норадренергической и дофаминергической систем мозга, различные у самцов и самок. У самцов в динамике обследования наблюдается снижение функциональной активности нигростриатной и мезолимбической дофаминергических систем и повышение активности норадренергической системы в гипоталамусе на поздних сроках. У самок в динамике обследования наблюдается снижение функциональной активности мезолимбической и нигростриатной дофаминергических систем и повышение активности серотонинергической системы в гиппокампе и коре мозга.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют представления о патофизиологических механизмах развития аффективных расстройств по типу тревоги и депрессии, подчеркивая важную роль дизрегуляции активности пролинспецифических пептидаз. Результаты исследования открывают новые подходы к разработке комплексной патогенетической терапии тревожно-депрессивных состояний на основе использования ингибиторов пролилэндопептидазы и являются основой для поиска новых препаратов — ингибиторов ПЭП, обладающих антидепрессантной активностью.

Новая модель тревожно-депрессивного состояния у крыс, вызванная ингибитором ДП-IV метионил-2(8)-цианопирролидином в условиях его введения в ранний постнатальный период, может быть использована для дальнейшего изучения патофизиологических механизмов тревоги и депрессии и скрининга новых фармакологических соединений с антидепрессантными и анксиолитическими свойствами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибитор дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидин в условиях его субхронического постнатального введения крысам вызывает эмоционально-поведенческие расстройства типа тревожно-депрессивного состояния в подростковом возрасте и у взрослых животных.

2. Тревожно-депрессивное состояние у крыс сопровождается повышением активности пролинспецифических ферментов пролилэндопептидазы и дипептидилпептидазы IV, а также изменением функционального состояния серотонинергической, норадренергической и дофаминергической систем в структурах мозга.

3. Ингибитор пролилэндопептидазы бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидин подавляет признаки депрессивно-подобного поведения у крыс, подвергнутых постнатальному введению ингибитора дипептидилпептидазы IV.

Апробация. Основные положения и результаты исследования были доложены на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), на XVI Всероссийской конференции «Нейроиммунология» «Нейроимидж» и научно-практической конференции неврологов (Санкт-Петербург, 2007), на XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), на III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), на XIV Всемирном конгрессе по психиатрии (Чешская республика, Прага, 2008).

7. Результаты исследования позволяют рассматривать длительные эмоционально-поведенческие нарушения у крыс, вызванные ингибитором ДП-IV в условиях его постнатального введения, как новую экспериментальную модель тревожно-депрессивного состояния. Полученные данные свидетельствуют о том, что дизрегуляционное повышение активности пролинспецифических пептидаз в ЦНС может быть патогенетическим механизмом развития тревоги и депрессии, а ингибиторы пролилэндопептидазы могут быть эффективны в комплексной патогенетической терапии тревожно-депрессивных расстройств.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании показано, что необратимый синтетический ингибитор дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидин, в условиях его введения в раннем постнатальном периоде, вызывал стойкие эмоционально-поведенческие расстройства у крыс, проявлявшиеся в усилении тревожности и депрессивно-подобного поведения. Динамика эмоционально-мотивационных нарушений у самцов и самок была различна, что, по-видимому, обусловлено влиянием половых гормонов. Изменения в поведении сопровождались повышением активности протеолитических ферментов ПЭП и ДП-IV в структурах мозга, опосредующих эмоциональное поведение, а ингибитор ПЭП купировал проявление депрессивного поведения. Взаимосвязь в изменении активности пептидаз и поведенческих проявлений свидетельствует о вовлеченности ПЭП и ДП-IV в генез тревожно-депрессивных нарушений.

Изменения уровня моноаминов и функциональной активности основных моноаминергических систем мозга прослеживались, начиная с подросткового периода, вплоть до зрелого возраста. В раннем подростковом периоде у самцов изменения активности пептидаз и ДА-ергической системы наблюдались в разных структурах мозга, тогда как изменения состояния других моноаминергических систем не были выявлены. В этот же период у самок изменения активности обеих пептидаз в гиппокампе сопровождались увеличением оборота 5-ОТ, а повышение активности ДП-IV в прилежащем ядре выявлялось одновременно с недостаточностью ДА-системы. У молодых половозрелых крыс на фоне отсутствия статистически значимых изменений в активности пептидаз у самцов сохранялась недостаточность ДА-системы в стриатуме, а у самок при сохранении недостаточности ДА-системы в прилежащем ядре было выявлено снижение активности этой системы также в гиппокампе и гипоталамусе. У зрелых крыс-самцов повышение активности ДП-IV в прилежащем ядре сопровождалось снижением метаболизма ДА (также как и у самок в подростковый период), повышение ДП-IV в гипоталамусе выявлялось одновременно с повышением уровня НА, однако увеличение активности пептидаз во фронтальной коре и гиппокампе не сопровождались изменениями состояния изученных моноаминергических систем. В том же возрасте у самок сохранялся повышенный оборот 5-ОТ при отсутствии, в отличие от подросткового возраста, изменений в активности обеих пептидаз, увеличение уровня 5-ОТ во фронтальной коре не сопровождалось изменениями в активности пептидаз. По нашему мнению, представляется важным тот факт, что в позднем возрасте наличие эмоционально-поведенческих расстройств у самцов и самок происходит на фоне одновременного увеличения активности обоих ферментов и выраженной недостаточности ДА-системы в стриатуме. В научной литературе существуют редкие свидетельства того, что изменения концентрации катехоламинов в ЦНС могут оказывать регулирующее влияние на активность дипептидилпептидаз в мозге крыс (Imai К. et al., 1984). В наших исследованиях не получено прямого хронологического подтверждения изменений в активности пептидаз и состояния моноаминергических систем мозга, однако наши данные не позволяют исключить такого взаимодействия. В пользу возможной взаимосвязи между этими системами свидетельствует факт увеличения активности пептидаз и снижения активности ДА-системы в стриатуме у крыс в зрелом возрасте. В целом, можно предположить, что дизрегуляция в системе пролинспецифических пептидаз, в системе моноаминов и их взаимодействия вносит вклад в генез эмоционально-поведенческих расстройств типа тревожно-депрессивных состояний.

На основании полученных данных о повышении активности пептидаз в структурах мозга крыс с усилением признаков тревоги и депрессии в поведении и эффективности ингибитора ПЭП бензилоксикарбонил-метионил-2(8)-цианопирролидина в предотвращении развития депрессивного состояния у животных можно полагать, что поиск новых фармакологических средств, обладающих свойствами антидепрессантов и анкиолитиков, среди ингибиторов пролинспецифических пептидаз может быть перспективным.