Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Ивабрадин как субстрат-маркер активности изофермента CYP3A4

На правах рукописи

ТОЛКАЧЕВ БОРИС ЕВГЕНЬЕВИЧ

ИВАБРАДИН КАК СУБСТРАТ-МАРКЁР АКТИВНОСТИ ИЗОФЕРМЕНТА СУРЗА4

14.03.06 Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград-2013

з окт т

005534040

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Петров Владимир Иванович

Научный консультант:

доктор медицинских наук Магницкая Ольга Валерьевна

Официальные оппоненты:

Тюренков Иван Николаевич

чл.-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ, заведующий кафедрой

Ведущая организация:

Сычев Дмитрий Алексеевич доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России, кафедра клинической фармакологии и терапии, заведующий кафедрой

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится "_" октября 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного

совета Д 208.008.02 при ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Автореферат разослан "_" сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Бугаева Любовь Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности

Одним' из наиболее перспективных направлений современной клинической фармакологии является разработка и внедрение научно-обоснованных подходов к индивидуализации лекарственной терапии. Данные методы призваны стать мощными инструментами так называемой персонифицированной медицины, главная задача которой со-, стоит в повышении эффективности и безопасности фармакотерапии с учётом факторов, способных оказывать влияние на меж- и внутрииндивидуальную вариабельность фармакологического ответа. Особое место среди них занимают различия в скорости биотрансформации лекарственных веществ, которая в большинстве случаев определяется активностью ферментов метаболизма (Кукес В.Г., Сычев Д.А., 2008). Изменение последней, в свою очередь, может быть обусловлено такими причинами, как гепетический полиморфизм, пол, возраст, лекарственные взаимодействия, сопутствующие заболевания и др. (Cropp C.D., 2008).

Установлено, что изофермент CYP3A4 участвует в метаболизме более 50% лекарственных препаратов, многие из которых являются её ингибиторами, либо индукторами (Elens L, van Gelder Т. et al, 2013). Межлекарственные взаимодействия на уровне этой системы метаболизма часто становятся причиной изменения плазменных концентраций препаратов. Следствием этого может являться как снижение эффективности фармакотерапии, так и повышение риска нежелательных лекарственных реакций. Это приводит к необходимости коррекции режима дозирования (Temesvari М. et al., 2011).

Существуют два принципиальных подхода к определению активности ферментов метаболизма лекарственных веществ: гено- и фенотипирование. Фенотипирования ферментов метаболизма лекарственных веществ заключается в оценке их ахтивности in vivo с использованием различных маркёрных субстратов (Tong-Liu Y. et al., 2007).

На сегодняшний день в научно-исследовательской практике используются большое количество маркёрных субстратов CYP3A4, среди которых распространение получили мидазолам, эритромицин, а также лидокаин (MEGX-тест). Кроме того, было предложено оценивать активпость CYP3A4 путём определения эндогенных соединений -кортизола и холестерина, а также их метаболитов в моче. Однако ни один из перечисленных методов фенотипирования этого изофермента не может считаться универсальным в силу объективных недостатков, таких как низкая специфичность, инвазивность

взятия проб для анализа, высокая вариабельность получаемых результатов. (Fuhr U., Jetter A., Kirchheiner J., 2007). Кроме того, результаты опубликованных к настоящему времени исследования свидетельствуют о том, что для изоформы ЗА4 цитохрома Р450 нехарактерен клинически значимый генетический полиморфизм, что не позволяет решать задачи индивидуализации терапии метаболизируемыми ею лекарственными препаратами с помощью фармакогенетического тестирования (Mathijssen R.H.J. et al., 2010).

По этой причине, проблема поиска новых маркерных субстратов и стратегий оценки активности CYP3A4 сохраняет свою актуальность.

Все вышесказанное определило цели и задачи данного исследования.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка и внедрение метода фено-типирования CYP3A4 с использованием ивабрадипа в качестве маркерного субстрата для оценки активности данного изофермента на фоне приёма индукторов и ингибиторов. Для реализации поставленной цели были обозначены следующие задачи:

1. Разработать и валидизировать методику количественного определения ива-брадина и его N-деметилированного метаболита в биологических пробах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Оценить возможность использования ивабрадина для изучения активности изофермента СУРЗА4 в группе условно здоровых добровольцев исходно и после курсового приёма грейпфрутового сока.

3. Оценить возможность использования ивабрадина для изучения активности CYP3A4 в группе условно здоровых добровольцев исходно и после курсового приёма экстракта зверобоя продырявленного.

4. Оценить возможность изучения активности CYP3A4 с использованием разработанной методики фенотипирования у пациентов на фоне плановой терапии, включающей индукторы/ингибиторы данного изофермента в условиях клинической практики.

Научная новизна

1. Впервые была разработана и внедрена методика количественного ВЭЖХ определения ивабрадина и его N-деметилированного метаболита в плазме крови и моче человека с использованием домперидона в качестве внутреннего стандарта.

2. Впервые была изучена возможность использования ивабрадина в качестве маркерного субстрата для оценки изменения активности CYP3A4 в группе условно здоро-

вых добровольцев на фоне приёма ингибитора и индуктора данного изофермента (грейпфрутового сока и экстракта зверобоя, соответственно).

3. Впервые была изучена возможность применения ивабрадина для фенотипиро-вания активности изофермента СУРЗА4 у пациентов, принимающих в составе фармакотерапии ингибиторы и индукторы этой системы метаболизма.

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведённое исследование позволило обосновать возможность применения оригинального неинвазивного метода оценки активности СУРЗА4, одного из ключевых ферментов метаболизма лекарственных веществ, с использованием ивабрадина в качестве безопасного маркерного субстрата данного изофермента.

Результаты исследования и перспективы внедрения предложенного метода фенотипирования СУРЗЛ4 включены в материал лекций и практических занятий для студентов, слушателей факультета постдипломного образования и факультета усовершенствоания врачей ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России.

Методология исследования

Планирование научной работы основывалось на общих гносеологических принципах, подразумевающих проведение двух ключевых этапов исследования - теоретического и эмпирического. Теоретический этап исследования состоял в поиске и анализе литературных данных, подтверждающих гипотезу относительно возможности использования ивабрадина в качестве маркерного субстрата СУРЗА4. Целью эмпирического этапа исследования было экспериментальное подтверждение вышеобозначенной гипотезы. Планирование и проведение экспериментальной части исследования было основано на принципах биоэтики, ОЬР и вСР. Выводы сделаны на основании результатов, полученных в ходе наблюдений и экспериментов и статистически обработанных методами непараметрической статистики.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана и валидизирована ВЭЖХ методика количественного определения ивабрадина и К-десметиливабрадина в плазме крови и моче человека с использованием домперидона в качестве «внутреннего стандарта».

2. Определение метаболического отношения №десметиливабрадин/ивабрадин в плазме крови или моче после однократного перорального приёма ивабрадина в дозе 10

мг позволило выявить ингибирование и индукцию СУРЗА4 у добровольцев, вызванную грейпфрутовым соком и экстрактом зверобоя продырявленного, соответственно.

3. Определение метаболического отношения М-десметиливабрадин/ивабрадин в моче после однократного перорального приёма ивабрадина в дозе 10 мг позволяет оценить изменение активности СУРЗА4 у пациентов, получающих в составе плановой терапии кларитромицин или карбамазепин.

4. Ивабрадин может быть использован как безопасный субстрат-маркёр для оценки активности изофермента СУРЗА4 на фоне приёма индукторов и ингибиторов.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных в данной работе результатов обусловлена однородностью выборки участников исследования, использованием валвдизированной методики количественного анализа биологических проб, применением адекватных непараметрических методов медико-биологической статистики, согласованностью с результатами опубликованных ранее исследований, теоретическим обоснованием полученных экспериментальных данных.

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Основные результаты работы доложены и обсуждены на 70-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», (Волгоград, апрель 2012 г.), 1У-ом съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, сентябрь 2012 г.), ГУ-ом Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств», (Волгоград, октябрь 2012 г.).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследование выполнялось на базе кафедры клинической фармакологии и интенсивной терапии (НУЗ ОКБ на ст. Волгоград 1 ОАО «РЖД») ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России и лаборатории фармакологической кинетики НИИ фармакологии ВолгМУ в соответствии с перспективным планом научно-исследовательских работ.

Проведение исследования одобрено на заседатш Комиссии по экспертизе диссертационных исследований Регионального Независимого Этического Комитета (про-

токол №147-2011 от 09.12.2011г.)- Утверждённый протокол исследования не содержал замечаний, изменений и дополнений.

Материалы и методы исследования

Настоящее исследование включало 3 этапа:

• 1 этап (аналитический) - разработка метода количественного определения ивабрадина и его N-деметилированного метаболита в плазме крови и моче человека;

• 2 этап (фармакокинетическое исследование) - мониторинг концентраций ивабрадина и N-деметиливабрадина в плазме крови и моче добровольцев для изучения активности изофермента CYP3A4;

• 3 этап - оценка активности CYP3A4 у пациентов, принимающих индукторы и ингибиторы данной нзоформы в составе плановой фармакотерапии.

Основные реактивы и оборудование:

• калибровка метода: стандарт ивабрадина (Servier, Франция); стандарт N-десметиливабрадина (Toronto Research Chemical Inc., Канада); стандарт домперидона (Toronto Research Chemical Inc., Канада); аналитические весы АХ120 (Shimadzu, Япония); холостая моча; замороженная плазма доноров (ТУЗ «Волгоградский областной центр крови»);

• подготовка биологических проб к исследованию: натрия цитрат пятиводный Na3C6H507'5H20, «ОСЧ» (Россия); центрифуга 5702 R (Eppendorf, США); автоматические пипетки-дозаторы объёмом 10, 100,1000 и 5000 мкл (Eppendorf, США); метанол для ВЭЖХ (Fisher Scientific, Великобритания); манифолд для твердофазной экстракции ISOLUTE VacMaster-10 (Biotage, Швеция); концентрирующие патроны для твердофазной экстракции ISOLUTE CN, 100 мг сорбента / 1 мл объем патрона (Biotage, Швеция); натрия гидрооксид NaOH, «ОСЧ» (Россия); рН-метр рН213 (Наппа Instruments, Германия);

• приготовление мобильной фазы: ацетонитрил для ВЭЖХ, УФ 210 нм, «ОСЧ» (Россия); дигидрофосфат калия КН2РО4, «ОСЧ» (Россия); магнитная мешалка Yellow Line (IKA, Германия); ультразвуковая ванна УЗВ-5,7 («ПКФ «Сапфир», Россия);

• хромато графический анализ: хроматографическая система LC-20AD с флюоресцентным детектором RF-10A XL (Shimadzu, Япония); обращенно-фазная хроматографическая колонка Kromasil С18, зернение 5 мкм, размеры 150 мм*4,6 мм (AkzoNobel, Швеция); шприц для ВЭЖХ 7I0NR, объем 100 мкл (Hamilton, США).

Целью первого этапа работы явилась разработка метода хроматографического количественного определения ивабрадина и его М-деметилированного метаболита в плазме крови и моче человека с использованием домперидона в качестве «внутреннего стандарта».

Расчёт площади хроматографического пика проводился по формуле:

где S - площадь пика, Н - высота хроматографического пика, ts - время начала пика, t2 -время окончания пика.

Валидация разработанного метода проводилась в соответствии с рекомендациями Европейского Медицинского Агентства (Guideline on bioanalytical method validation, EMEA, 2011).

Второй этап состоял в проведении открытого перекрёстного фармакокинетиче-ского исследования, в котором изучалась возможность использования ивабрадина в качестве маркерного субстрата для оценки активности изофермента CYP3A4 у добровольцев.

В исследование были включены 12 добровольцев, соответствующих следующим критериям: мужчины от 18 до 45 лет; верифицированный диагноз «здоров» по данным стандартных клинических, лабораторных и инструментальных методов обследования; ИМТ в пределах 18,5-25; подписание информированного согласия на участие в исследовании.

Критерии невключения добровольцев в исследование: отягощенный аллергологи-ческий анамнез; лекарственная непереносимость; хронические заболевания сердечнососудистой, бронхолегочной, нейроэндокринной системы, а также заболевания желудочно-кишечного тракта, печени, почек, крови; хирургические вмешательства на желудочно-кишечном тракте (за исключением аппепдэктомии); острые инфекционные заболевания менее чем за 4 недели до начала исследования; прием лекарственных препаратов, биологически активных добавок и нутриентов, оказывающих влияние на активность CYP3A4 менее, чем за 30 дней до начала исследования; курение более 10 сигарет в день; необходимость приёма домперидона в момент проведения исследования.

После подписания информированного согласия проводилось скрининговое клиническое обследование добровольцев, включающее врачебный осмотр, а также лабора-

торные тесты: клинический анализ крови, клинический анализ мочи, биохимический анализ крови (общий белок, билирубин, креатинин, аспартатаминотрансфераза, алани-наминотрансфераза, щелочная фосфатаза, глюкоза, холестерин), ЭКГ, тест на гепатит С, ВИЧ.

Скрининговые лабораторные исследования осуществляли на базе общеклинической и биохимической лабораторий НУЗ «ОКБ на ст. Волгоград-1 ОАО «РЖД». Тестирование добровольцев на гепатит С и ВИЧ проводилось на базе ГУЗ "Волгоградский областной Центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями".

Включённые в исследование участники совершили 4 плановых визита (рис. 1). В начале каждого визита добровольцам производилось взятие 5 мл венозной крови из локтевой вены. После этого каждый участник исследования перорально однократно принимал натощак 10 мг ивабрадина (Кораксан®, Servier, Франция), который запивался 250 мл воды (1,3 и 4 визиты) или 250 мл грейпфрутового сока (визит 2).

Рис. 1. Дизайн открытого перекрёстного фармакокинетического исследования у добровольцев.

В течение последующих 6-ти часов производилось пятикратное взятие 5 мл венозной крови в следующие временные точки от приёма препарата: 0,5 ч (= 0,5 ТСтах); 1,2 Ч (= Тстм); 2,5 ч; 3,75 ч; 5,5 ч (= 0,5 Т„2).

Образцы крови собирали в пластиковые пробирки, содержащие 0,5 мл 5%-го раствор натрия цитрата в качестве антикоагулянта.

На протяжении 12-ти часов после однократного приёма ивабрадина, что соответствует периоду полувыведения препарата, у добровольцев собиралась моча с целью оценки кумулятивной почечной экскреции ивабрадина и его метаболита. Общий объём собранной мочи измерялся с помощью градуированной мерного цилиндра.

На всех визитах для подтверждения отсутствия риска развития выраженной бра-дикардии на фоне приёма ивабрадина как диагностического средства у добровольцев измерялась ЧСС после 1-го (до приема препарата) и 3-его (время достижения максимальной концентрации) взятия крови.

В течение 3-х дней до второго визита добровольцы пили 100% восстановленный грейпфрутовый сок (Я®, ОАО "ЭКЗ "Лебедянский", Россия) в количестве 1 л/сутки.

Временной промежуток между вторым и третьим визитами («отмывочный период») составлял 7 дней, что было необходимо для восстановления активности CYP3A4 после прекращения приёма грейпфрутового сока (Seden К. et al., 2010).

В период между третьим и четвёртым визитами участникам второго этапа исследования в качестве индуктора изофермента CYP3A4 был назначен препарат растительного происхождения, обладающий антидепрессивным и психостимулирующим действием - зверобоя продырявленного травы экстракт сухой (Негрустин®, 425 мг капсулы, Гек-сал АГ, Салютас Фарма ГмбХ, Германия) по 1 капсуле 2 раза в сутки на протяжении 14 дней.

Во время 2-го и последующих визитов с помощью опроса участников исследования проводилась оценка комплаентности (фиксация случаев пропуска приёма индуктора/ингибитора), а также мониторинг нежелательных эффектов.

Критерии исключения добровольца из исследования: отказ продолжать участие в исследовании; аллергические реакции и другие побочные эффекты приёма ивабрадина (ЧСС<55 уд/мин), грейпфрутового сока и/или экстракта зверобоя продырявленного; невозможность соблюдения, либо нарушение запланированной схемы исследования.

По результатам мониторинга концентраций ивабрадина и N-десметиливабрадина в плазме крови строили фармакокинетические кривые зависимости концентраций указанных веществ от времени с использованием двухкамерной модели для однократного перорального приёма препарата (Каркшценко Н.Н., 2001). Для расчёта модельных параметров (ka, kg, к]2, к2Ь Со) методом наименьших квадратов применяли надстройку «поиск решения» с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel 2010.

Площадь под фармакокинетической кривой «концентрация - время» (AUCo-пч) рассчитывали методом статистических моментов (методом «наименьших трапеций»).

Метаболическое отношение (МЯ) в плазме определяли как отношение «площади под фармакокинетической кривой» метаболита (АиСо-12ч>ыУв) к «площади под фарма-кокинетической кривой» ивабрадина (АиСо-п, пш):

_ АиСо-12чМ-ГУВ

Л^^шгазма д. - ■

Метаболическое отношение в моче, собранной за 12ч после однократного приёма ивабрадина, рассчитывалось по отношению кумулятивной экскреции (СЕ) Ы-десметиливабрадина к ивабрадину, равной произведению концентрации вещества (С) на объём мочи (V):

цго _ СЕ0-12ЧШУВ _ CN.IVBXVO.124 МКмоча РБ г Г7Т7 '

<-Ло-г2ч1Ув мув^Уо-пч

На третьем этапе исследования для апробирования разработанной методики в условиях реальной клинической практики было сформировано две группы пациентов (рис. 2), находящихся на стационарном лечении в НУЗ «Отделенческая клиническая больница на ст. Волгоград-1 ОАО «РЖД»:

• 1-ая группа: пациенты терапевтического отделения с показанием к назначению ингибитора изофермента СУРЗА4 - кларитромицина в дозе 1000 мг/сутки на срок не менее 7 суток;

• 2-ая группа: пациенты неврологического отделения с показаниями к фармакотерапии индуктором изофермента СУРЗА4 - карбамазепяном в дозе 400 мг/сутки не менее 14 суток.

Рис. 2. Оценка активности СУРЗА4 у пациентов, принимающих индукторы/ингибиторы этой изоформы в составе плановой фармакотерапии.

Фармакотерапия кларитромицином и карбамазепииом назначалась пациентам лечащим врачом в плановом порядке. Для оценки активности изофермента CYP3A4, включённым в исследование пациентам однократно назначался ивабрадин (Кораксан®, Servier, Франция) в дозе 10 мг в 20:00. После этого в моче, собранной за 12 ч, определяли содержание ивабрадина и его N-деметилированного метаболита. Метаболическое отношение в моче рассчитывали аналогично второму этапу. Пробы мочи анализировали в обеих группах исходно и через 7 суток в группе 1 или 14 суток в группе 2.

Критериями исключения из исследования являлись: плановый приём ивабрадина, приём домперидона за 48 часов до участия в исследовании, выраженная брадикардия (ЧСС<55 уд/мин), сахарный диабет, ожирение (ИМТ>30 кг/м2), тяжёлые заболевания печени, декомпенсированная хроническая сердечная недостаточность, терминальная стадия хронической почечной недостаточности, синдром слабости синусового узла, си-ноатриальная блокада, искусственный водитель ритма сердца, атриовентрикулярная блокада П1 степени, индивидуальная непереносимость ивабрадина.

Результаты и их обсуждение

Разработка метода количественного анализа ивабрадина и его N-деметилированного метаболита состояла из несколько этапов, первый из которых заключался в подборе условий хроматографирования изучаемых веществ, включающем определение оптимальных параметров мобильной фазы (значение pH, соотношение компонентов мобильной фазы), а также самой хроматографической системы (температура анализа, скорость потока). С этой целью из маточных растворов стандартов ивабрадина и N-десметилвабрадина готовились рабочие водные растворы в диапазоне от 25 до 1000 нг/мл. Количественное определение проводилось на жидкостном хроматографе Shimadzu с флуоресцентным детектором при длине волны экстинкции 283 нм и длине волны эмиссии 328 нм, что соответствовало спектру собственной флюоресценции изучаемых веществ. В качестве мобильной фазы была выбрана смесь ацетонитрила и 0,05М раствора однозамещённой калиевой соли орто-фосфорной кислоты. Экспериментально было установлено, что оптимальным соотношением компонентов мобильной фазы является 0,24/0,76. При этом pH буферного раствора составлял 4,8. Хроматографирование проводили при скорости потока 1 мл/мин. Среднее время удерживания для ивабрадина составило 8,0±0,21 мин; для N-десметиливабрадина - 8,9±0,28 мин, для домперидона (внутреннего стандарта) —

11,2±0,14 мин. Таким образом, подобранные условия хроматографирования обеспечивали необходимую степень разделение пиков изучаемых при времени удерживания, приемлемом в условиях рутинного анализа (рис. 3).

ивабрадина (250 нг/мл), Ы-десметиливабрадина (250 нг/мл) и домперидона (1000 нг/мл). По оси абсцисс - минуты, по оси ординат - единицы интенсивности эмиссии.

Второй этап разработки метода заключался в подборе условий пробоподготовки, позволяющей проводит концентрирование исходных образцов. Экспериментально было установлено, что оптимальной является следующая схема подготовки к проведению анализа: 1) кондиционирование патрона с привитой С]М-фазой с помощью дистиллированной воды 2) нанесение биопробы (плазмы или мочи); 3) промывание патрона дистиллированной водой; 4) элюирование искомых веществ с помощью метанола; 5) упаривание образца до получения сухого остатка; б) его последующее растворение в 100 мкл метанола перед хроматографированием.

Третий этап разработки метода количественного анализа состоял в калибровке системы по целевым биологическим матрицам (плазме крови и моче) и определении основных валидационных характеристик (табл. 1).

Для построения калибровочных кривых (рис. 4 и 5) готовились разведения изучаемых веществ в концентрациях, соответствующих терапевтическому диапазону ивабрадина и его метаболита в плазме крови и моче.

0,6 0,5 с 0,4 Ч, 0,3

I 0,2 М" 0.1 О

у-0.0022Х-0,0162

К1 = 0,99846

I, нг/мл

100 200 Cji.lV» иг'мл

(а) (б)

Рис. 4. Калибровочная зависимость концентрации ивабрадина (а) и Ы-десметил-ивабрадина (б) в плазме крови.

400 600 800 Сга, нг/мл

400 600 800 Cn.iv» т1*л

1000 1200

(а) (б)

Рис. 5. Калибровочная зависимость концентрации ивабрадина (а) и К-десметил-ивабрадина (б) в моче.

Таблица 1. Основные валидационные параметры биоаналитической методики количественного определения ивабрадина и его Ы-деметилированного метаболита.

Биопроба С, нг/мл Точность, %СУ Правильность, %ИОМ Предел количественного определения, нг/мл

Внутридневная Междневная Внутридневная Междневная Нижний Верхний

Ивабрадин

Плазма 5 41,33 46,66 129,74 54,29 10 250

10 4,58 19,13 118,61 94,11

25 13,02 10,9 113,84 102,44

50 14,08 7,18 106,29 97,84

100 1,43 10,7 90,73 102,73

200 1,42 1,54 98,19 99,49

250 6,02 1,27 99,15 99,13

Моча 25 10,75 11,04 119,74 113,56 25 1000

50 4,05 7,65 115,49 110,83

75 6,28 11,56 112,19 105,9

250 3,9 3,29 93,28 92,69

375 7,2 4,28 96,62 100,46

500 5,27 5,16 98 99,28

1000 2,12 3,22 100,38 100,02

Продолжение табл. 1

Биопроба Сдам, нг/мл Точность, %СУ Правильность, %ЫОМ Предел количественного определения, нг/мл

Внутридневная Междневная Внутридневная Междневная Нижний Верхний

1Ч-десметиливабрадин

Плазма 5 67,56 11,46 5,64 -24,01 10 250

10 10,95 3,86 80,31 82,39

25 18,77 7,52 85,5 94,64

50 14,61 6,54 108,55 101,78

100 5,31 6,59 107,26 108,35

200 2,78 1,51 101,52 100,57

250 4,47 2,98 100,46 100,71

Моча 25 13,24 10,88 110,62 108,75 25 1000

50 12,72 10,69 99,37 96,37

75 7,74 8,22 101,08 98,33

250 2,48 5,17 98,17 97,31

375 7,55 4,92 101,77 101,62

500 9,23 6,64 99,55 97

1000 5,7 3,64 100,43 98,99

Примечание: Сном - номинальная концентрация; %СУ - коэффициент вариации;

%]ЧОМ - процент от номинальной концентрации, который составляет концентрация, расчитаниая по уравнению регрессии; Э - площадь хроматографического пика; С - концентрация.

Расчёт валидационных параметров показал, что при концентрации искомых веществ в плазме равной 5 нг/мл значения точности и правильности не достигают установленных пределов, что позволяет рассматривать концентрацию 10 иг/мл как нижний предел количественного определения ивабрадина и его метаболита в плазме крови.

На основании результатов определения концентраций ивабрадина и Ы-десметиливабрадина в плазме крови и моче добровольцев исходно и после 3-х дневного приёма ингибитора СУРЗА4 (грейпфрутового сока) были рассчитаны «площади под фармакокинетической кривой» ивабрадина и его метаболита (табл. 2), а также кумулятивная экскреция данных веществ (табл. 3).

Таблица 2. «Площадь под фармакокинетической кривой» ивабрадина и его метаболита у добровольцев до и после курсового приёма грейпфрутового сока, (Ме (ЬС>;

и<»).

Показатель Визит 1 (исходно) Визит 2 (ингибитор СУРЗ А4)

АиС 1УВ ( 0-12ч)> нгч/мл 66,72(53,31; 101,52) 144,22 (94,88; 188,55)

АиС шуВ (о-12,),. нг-ч/мл 98,92 (88,17; 151,24) 105,78(75,74; 117,42)

На фоне приема сока у добровольцев в плазме крови было выявлено повышение AUC ивабрадина на 53,7% и AUC метаболита на 6,48%, что свидетельствовало об уменьшении конверсии ивабрадина в N-десметиливабрадин, повышении плазменной концентрации неизменённого препарата и, в незначительной степени, его основного метаболита, биотрансформация которого также является СУРЗА4-зависимой.

Полученные данные согласуются с результатами исследования влияния грейпфрутового сока на фармакокинетику ивабрадина, проводившимся разработчиком препарата, компанией Servier (Ivabradine: scientific discussion, EMEA, 2005).

Грейпфрутовый сок является прямым ингибитором фермента CYP3A4 за счёт содержащихся в нём активных компонентов - бергамоттина и 6,7-дигидроксибергамоггина, которые относятся к ингибиторам средней силы (Girennavar В. et al., 2007). Так как активные компоненты грейпфрутового сока оказывают влияние преимущественно на фермент CYP3A4 в кишечнике, наблюдаемое повышение плазменной концентрации ивабрадина было обусловлено, в первую очередь, увеличением абсолютной биодоступности препарата вследствие снижения интенсивности его биотрансформации в энтероцитах (Dahan A., Amidon G.L., 2009).

Сходные изменения были зафиксированы при параллельном изучении кумулятивной почечной экскреции (СЕ) данных веществ, оцениваемой по их абсолютному количеству в моче, собранной за 12 часов после однократного приёма 10 мг ивабрадина (табл. 3).

Таблица 3. Кумулятивная экскреция ивабрадина и К-десметиливабрадина с мочой у добровольцев исходно и на фоне приёма ингибитора СУРЗА4 (Ме (И2; и(2)).

Показатель Визит 1 (исходно) Визит 2 (ингибитор CYP3A4)

ceivb, мкг 121,9 (57,2; 360,8) 282,2 (161,9; 471,3)

CEn.ivb, мкг 48,3 (23,9; 86,8) 58,4 (30,5; 73,9)

Экскреция неизменённого препарата с мочой спустя 3 дня приема сока грейпфрута увеличилась на 56,8% по сравнению с исходной, Ы-десметиливабрадина— на 17,3%.

На основании полученных данных производился расчёт метаболических отношений в плазме крови и моче добровольцев исходно, а также спустя 3 дня употребления сока (табл. 4). В результате было обнаружено достоверное снижение МП на 52,3% в плазме и на 42,1% в моче, что однозначно указывало на ингибирование изофермента СУРЗА4.

Таблица 4. Метаболические отношения, рассчитанные по плазме и моче добровольцев исходно и на фоне приёма ингибитора СУРЗ А4 (Ме (Ь<3; иО})).

Метаболическое Визит 1 Визит 2

отношение (исходно) (ингибитор CYP3A4) Р

MRnnajjHa 1,49 (1,34; 1,66) 0,71 (0,41; 1) 0,002

MRM04a 0,38 (0,35; 0,47) 0,22(0,15; 0,24) 0,002

Примечание: *р - критерий Вилкоксона

Результаты количественного определения ивабрадина и его метаболита, полученные при анализе плазмы крови и мочи добровольцев исходно, а также на фоне приёма индуктора метаболизма СУРЗА4 (экстракта зверобоя продырявленного) представлены в табл. 5 и 6.

Таблица 5. AUC ивабрадина и N-десметиливабрадина в плазме крови добровольцев исходно и на фоне приёма индуктора CYP3A4 (Me (LQ; UQ)).

Показатель Визит 3 (исходно) Визит 4 (индуктор CYP3A4)

AUCivb. нг»ч/мл 93,14(66,39; 140,65) 79,84 (65,23; 115,68)

AUCn_ivb, нг'ч/мл 92,78 (50,34; 143,10) 117,84 (96,4; 134,32)

Полученные в ходе второго этапа исследования результаты выявили снижение AUC ивабрадина на 14,2% и повышение AUC метаболита на 21,2% на фоне приёма экстракта Hypericum perforatum, что согласуется с опубликованными ранее данными о влиянии экстракта зверобоя продырявленного на фармакокинетику ивабрадина (Portoles А. et al„ 2006).

Кроме того, было выявлено снижение кумулятивной почечной экскреции неизменённого препарата на 12,3% и повышение выведения с мочой N-деметилированного метаболита в среднем па 33,1% спустя 14 дней приёма добровольцами экстракта Hypericum perforatum в дозе 850 мг/сутки.

Таблица 6. Кумулятивная экскреция ивабрадина и Ы-десметиливабрадина с мочой добровольцев исходно и на фоне приёма индуктора СУРЗА4 Ме (1.(3; иС})).

Показатель Визит 3 (исходно) Визит 4 (индуктор CYP3A4)

CE1VB, мкг 319,2(209,4; 435,0) 279,8 (213,9; 324,0)

CEn.ivb, мкг 106,9 (63,5; 143,7) 158,4 (102,6; 209,5)

При этом метаболическое отношение, рассчитанное и по плазме, и по моче добровольцев, достоверно увеличился по сравнению с исходом, что отражает индукцию фермента (табл. 7).

Таблица 7. Метаболическое отношение, рассчитанное по плазме и моче добровольцев исходно и на фоне приёма индуктора СУРЗА4 (Ме (Ь(2; и<3)).

Метаболическое отношение Визит 1 Визит 2 (ингибитор СУРЗА4) Р*

МКинви 1,06 (0,51; 1,45) 1,5 (1; 1,8) 0,004

мк.М0ча 0,32 (0,29; 0,35) 0,54 (0,52; 0,65) 0,002

Примечание: *р - критерий Вилкоксона

Множественные сравнения между результатами, полученными по моче добровольцев (рис. 6), также установили достоверные различия между величинами метаболического отношения на фоне ингибирования и индукции СУРЗ А4.

0,7 1-

I 0,6--

I 0,5---- -

I 0,4 -цвт-——.. ■ -

I «-й—^—П I 0,2' 1 ш 1

е о.1 — I—ми—— —

Й о -I—I—^—,—ьма—,—ш—,—вам—,

визит 1 иишбитор визит 3 индуктор СУРЗА4 СУР ЗА4

Рис. 6. Метаболические отношения, определённые в моче добровольцев исходно и на фоне приёма ингибитора/индуктора СУРЗА4 (*р<0,05; критерии Фридмана и Ныо-мена-Кейлса).

С использованием метода Блэнда-Алтмана, было установлено, что различия между результатами определения метаболического коэффициента в плазме и моче добровольцев находятся в пределах ±28Б разности определений, что свидетельствует о согласованности обоих изучаемых методов. Таким образом, однонаправленные изменения метаболического отношения Ы-деметиливабрадин/ивабрадин как в плазме, так и моче добровольцев, наблюдаемые нами на фоне приёма индуктора/ингибитора, позволяют использовать оба варианта биопроб для фенотипирования СУРЗА4. Однако, поскольку одним из требований к методам фенотипирования ферментов метаболизма является минимальная иквазивность, наиболее приемлемым является использование для оценки ак-

ра

тивности СУРЗА4 метаболического отношения в моче, не требующее взятия проб крови и более простое с организационной точки зрения.

Для подтверждения безопасности использования ивабрадина в настоящем исследовании, в ходе каждого из 4-х визитов у добровольцев контролировалось ЧСС до взятия холостой плазмы крови и спустя 1,5 часа после однократного приёма ивабрадина, что соответствовало Тсию, В среднем снижение ЧСС составило 5-8 уд/мин. Ни у одного из добровольцев не было зафиксировано брадикардии (ЧСС<60 уд/мин). Кроме того, на протяжении всего периода исследования не было выявлено статистически значимых различий в уровне ЧСС, как на фоне приема грейпфрутового сока, так и экстракта зверобоя.

В связи с отличиями выборки условно здоровых добровольцев от лиц, имеющих сопутствующие заболевания, и необходимостью изучения риска аналитической интерференции ивабрадина с наиболее часто назначаемыми индукторами и ингибиторами, предложенная методика фенотипирования была апробирована в клинической практике на двух группах пациентов, одна из которых в составе плановой терапии получала кла-ритромицин, относящийся к ингибиторам СУРЗА4, вторая группа - карбамазепип, индуктор систем биотрансформации.

Результаты определения кумулятивной экскреция ивабрадина и его метаболита с мочой, собранной в течение 12-ти часов после однократного приёма 10 мг препарата Кораксан®, пациентами исходно и спустя 7 дней приёма кларитромицина в дозе 1000 мг/сутки, представлены в табл. 8.

Таблица 8. Кумулятивная экскреция с мочой и метаболическое отношение ивабрадина и №десметиливабрадина пациентов исходно и на фоне приема ингибитора СУРЗА4 (Ме (1X2; и<2)).

Показатель Визит 1 (исходно) Визит 2 (ингибитор CYP3 А4)

CEjvb, мкг 163,21 (116,53; 211,89) 177,19 (156,88; 222,47)

CEN.IVn, мкг 59,15 (39,66; 70,29) 36,52(30,84; 53,51)

MRH04a 0,35 (0,32; 0,36) 0,25 (0,1905; 0,26)

В результате было установлено, что кумулятивная экскреция ивабрадина в группе пациентов, получающих кларитромицин, повысилась на 8,5%, в то время как экскреция Ы-десметиливабрадина снизилась на 38,2%. Достоверное уменьшение метаболического

отношения в моче на 26,9% подтвердило ожидаемое ингибирование СУРЗА4 на фоне приёма кларитромицина.

В группе пациентов, получающих карбамазепин, были зафиксированы обратные изменения изучаемого показателя. 12-ти часовая экскреция с мочой ивабрадина увеличилась на 17%, а метаболита - повысилась на 87,1%, вследствие чего рассчитанное метаболическое отношение выросло на 54,2%, указывая на развитие индукции изофермен-та СУРЗА4 (табл. 9).

Таблица 9. Кумулятивная экскреция с мочой и метаболическое отношение ивабрадина и Ы-лесметиливабрадина у пациентов исходно и на фоне приёма индуктора СУРЗА4 (Ме (ЬС>; и<5)).

Визит 1 Визит 2

Показатель (исходно) (индуктор СУРЗА4)

СЕ,ув. мкг 198,54 (131,77; 312,45) 232,41 (180,01; 274,15)

СЕн-1ув, мкг 65,6 (48,61; 90,34) 122,75 (93,16; 136,83)

МЯмоча 0,33 (0,29; 0,37) 0,51 (0,45; 0,55)

Таким образом, были подтверждены достоверные различия между величинами метаболического отношения у пациентов на фоне ингибирования и индукции СУРЗА4 (рис. 7).

0,6 0.5

л

Щш

Ш

ингибитор СУР ЗА4

(а)

индуктор СУР ЗА4

(б)

Рис. 7. Метаболические отношения, определённые в моче пациентов исходно и после курсового приёма ингибитора (а) и индуктора (б) СУРЗА4 (*р<0,05; критерий Вилкоксона).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выводы

1. Разработанная методика количественного определения ивабрадина и его N-деметилированного метаболита обладает аналитическими характеристиками, приемлемыми для проведения анализа их концентраций в плазме крови и моче у человека.

2. На фоне курсового приёма (3 дня) грейпфрутового сока (1 л/сут) было выявлено достоверное уменьшение метаболического отношения N-десметиливабраяин/ивабрадин в плазме крови (52,3%) и моче (42,1%) условно здоровых добровольцев.

3. На фоне курсового приёма (14 дней) сухого экстракта Hypericum perforatum (850 мг/сут) отмечается статистически значимое увеличение метаболического отношения N-десметиливабрадин/ивабрадин в плазме крови (41,5%) и моче (68,8%) условно здоровых добровольцев.

4. Метаболическое отношение в плазме крови или моче является объективным показателем, позволяющим оценивать изменения активности CYP3A4 на фоне приёма индукторов, либо ингибиторов данной изоформы. Результаты оценки активности CYP3A4, получаемые на основании анализа этих типов биопроб, согласуются между собой.

5. Фенотипирование CYP3A4 с использованием «ивабрадинового теста» позволяет проводить мониторинг изменения активности данного изофермента у пациентов) получающих его индуктор, либо ингибитор (карбамазепин и кларитромицин, соответственно) в составе плановой фармакотерапии.

6. Однократный приём 10 мг ивабрадина не приводил к развитию брадикардии (ЧСС<60 уд/мин) в группах условно здоровых добровольцев и пациентов, как исходно, так и в случае ингибирования/индукции CYP3A4, что подтверждает безопасность предлагаемого метода фенотипирования.

Практические рекомендации

1. Рекомендовать применение ивабрадина в качестве маркерного субстрата для проведения фенопитировапия CYP3A4 в исследованиях по изучению межлскарствен-ных взаимодействий.

2. Рекомендовать использование разработанного нами хроматографического метода для количественного определения ивабрадина и его N-деметилированного ивабра-

дина в плазме крови или моче.

3. Рекомендовать рассматривать метаболическое отношение >1-десметиливабра-дин/ивабрадин в моче как адекватный показатель для оценки активности СУРЗА4.

Перспективы дальнейшей разработки темы

Предложенный метод фенотипирования изофермента СУРЗА4 может в дальнейшем использоваться для изучения изменения активности данной системы метаболизма у пациентов с заболеваниями печени, анализа взаимосвязи активности фермента с фарма-кокинетикой его субстратов, прогнозирования нежелательных межлекарственных взаимодействий у пациентов в условиях полипрагмазии, а также при разработке алгоритмов коррекции режимов дозирования препаратов, в метаболизме которых принимает участие СУРЗА4.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Толкачев Б.Е. К-каналы: подлинные «водители» сердечного ритма II Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2008. - №1 (25). -С. 14-20.

2. Кузнецов К.А., Рябуха А.Ф., Магннцкая О.В., Смирнова Л.А., Сучков Е.А., Ефпмова А.А., Толкачев Б.Е.. Количественное определение ивабрадина у больных ишемической болезнью сердца II Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2011. -№2 (38). - С. 48-50.

3. Петров В.И., Магницкая О.В., Толкачёв Б.Е., Смирнова Л.А., Рябуха А.Ф., Кузнецов К.А., Сучков Е.А.. Сравнительная оценка методов определения метаболического коэффициента 1Ч-десметиливабраднн/нвабрадин в плазме и моче. II Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2013. -№3(47).-С. 45-47.

4. Петров В.И., Магннцкая О.В., Толкачёв Б.Е., Смирнова Л.А., Рябуха А.Ф., Кузнецов К.А., Сучков Е.А.. Определение метаболического отношения ¡4-деметнливабрадин/ивабрадии для оценки активности СУРЗА4 // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2013. - №3 (47). -С. 51-54.

б

7

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕ1ШЙ

AUC - area under curve, площадь под фармакокинетической кривой

СЕ - cumulative excretion, кумулятивная экскреция

DP - domperidone, домперидон

IVB - ivabradine, ивабрадин

MR - metabolic ratio, метаболическое отношение

N-IVB - N-desmethylivabradine, N-десметиливабрадин

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ИМТ - индекс массы тела

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭКГ - электрокардиограмма

Другие публикации по теме диссертации Толкачев Б.Е. Оптимизация количественного определения ивабрадина в плазме крови И Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Материалы юбилейной 70-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2012. - С. 375. Толкачев Б.Е., Смирнова JI.A., Магницкая О.В., Сучков Е.А. Методологические основы терапевтического лекарственного мониторинга ивабрадина. // Инновации в современной фармакологии: Материалы IV-ro съезда фармакологов России. - Москва: Изд-во Фолиум, 2012. - С. 179.

Толкачев Б.Е., Сучков Е.А. Определение ивабрадина и его N-деметилированного метаболита для оценки активности изофермента CYP3A4. // Материалы IV Всероссийского научно-практического семинара для молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств», Волгоград: Изд-во ВолгГМУ, 2012. - С. 212.

ТОЛКАЧЕВ БОРИС ЕВГЕНЬЕВИЧ

ИВАБРАДИН КАК СУБСТРАТ-МАРКЁР АКТИВНОСТИ ИЗОФЕРМЕНТА СУРЗА4

14.03.06 Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 09.09. 2013 г. Формат 60 х 84/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Усл. печ. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ 300/1. Отпечатано с готового оригинал-макета заказчика в типографии издательства «Перемена» 400066, г. Волгоград, пр. им. В. И. Ленина, 27