Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Высокоэффективная жидкостная хроматография в оценке биотрансформации лекарственных средств (фармакогенетика и фармакокинетика)

Актуальность проблемы. Метаболизм или биотрансформация лекарственных средств (JIC) - понятие, отражающее химические изменения, которым подвергаются лекарственные вещества в организме. Чаще всего, результатом метаболизма J1C является, с одной стороны, повышение растворимости в воде (повышение гидрофильности), что способствует их выведению из организма с мочой, а с другой - изменение фармакологической активности ЛС. Изменение фармакологической активности может приводить к образованию из фармакологически активного вещества фармакологически неактивного вещества, фармакологически активное вещество на первом этапе может превращаться в другое фармакологически активное вещество, а неактивные фармакологические ЛС (пролекарства) превращаться в организме в активные соединения [29,228,356].

Интенсивность метаболизма конкретного ЛС зависит как от свойств самого вещества, так и от индивидуальных особенностей организма (скорость печеночного кровотока, активность ферментов и другие) и является основным фактором, определяющим уровень концентрации ЛС в плазме крови и длительность его пребывания в нем [8,12,29]. Таким образом, индивидуализация фармакотерапии, заключающаяся в поддержании концентрации ЛС в пределах терапевтического диапазона, должна включать определение интенсивности процессов биотрансформации данного ЛС у конкретного пациента.

В системе биотрансформации (метаболизма) ксенобиотиков большое значение имеет микросомальная окислительная система цитохрома Р-450, которая насчитывает более 100 различных изоферментов. Чрезмерная активность определенного изофермента будет определять отсутствие эффективности от приема соответствующего ЛС в связи с его быстрым разрушением, а сниженная активность будет вызывать развитие побочных эффектов. Активность ферментов генетически детерминирована и может быть оценена непрямым способом на основе анализа структуры ДНК. Однако, не всегда отсутствие или наличие полиморфизма ген, кодирующих выработку фермента, коррелирует с клинической эффективностью JIC, метабо-лизирующегося данным ферментом. В этом случае определение концентрации ЛС в крови пациента лучше информирует о возможном побочном эффекте или недостаточной эффективности, хотя при этом может и не объяснять причину этого явления [66,72,90].

Таким образом, при индивидуализации фармакотерапии важно проведение как генотипирования, так и фенотипирования. Проведение гено-типирования осуществляется с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и, с одной стороны, имеет ряд плюсов (возможность получения информации путем анализа всего одной пробы, не требует введения фармакологически активного вещества), но, с другой стороны, данный метод позволяет оценивать лишь наследственные изменения функциональной активности фермента без учета влияния эндогенных факторов. Фено-типирование связано с определением концентрации JIC и его основного метаболита в плазме крови, поэтому для его проведения необходимо иметь высокочувствительный метод их совместного определения в биологических жидкостях. С учетом всех плюсов и минусов различных методов анализа J1C в биологических жидкостях наибольшее распространение получил метод ВЭЖХ. Все вышесказанное определяет необходимость комплексного подхода к оценке активности системы биотрансформации J1C и разработке методов ее оценки.

Цель исследования: теоретическое и экспериментальное обоснование принципов методологического подхода к оценке системы биотрансформации лекарственных средств с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для рационального применения лекарственных средств.

Задачи исследования:

• установить закономерности хроматографического поведения нифеди-пина, верапамила, ловастатина, метопролола, амитриптилина, налтрек-сона, лидокаина и их метаболитов и разработать оптимизированные по хроматографическим параметрам методики их количественного определения в плазме крови методом ВЭЖХ;

• изучить фармакокинетику указанных лекарственных средств и их метаболитов в плазме крови у различных групп пациентов;

• изучить хроматографическое поведение метаболита лидокаина - MEGX, предложить условия его определения в плазме крови методом ВЭЖХ для проведения MEGX-теста;

• оценить с помощью MEGX-теста влияние различных факторов (времени суток, совместного приема нескольких лекарственных средств, патологических состояний) на активность CYP3A4; подобрать лекарственные средства-маркеры для оценки активности CYP3A4 и CYP2D6 и провести фенотипирование указанных изоферментов;

• провести генотипирование CYP3A4 и CYP2D6 методом ПЦР у пациентов московской популяции;

• провести сопоставление результатов фено- и генотипирования CYP3A4 и CYP2D6 с клинической эффективностью лекарственных средств, ме-таболизирующихся данными изоферментами;

• изучить фармакокинетику налтрексона и его метаболита после введения новой лекарственной формы.

Научная новизна: Определены оптимальные хроматографические условия эффективного разделения нифедипина, верапамила, ловастатина, метопролола, амитриптилина, налтрексона и их основных метаболитов методом ВЭЖХ. Подобраны оптимальные условия выделения исследуемых соединений из плазмы крови. Разработаны методики их количественного определения в плазме крови, отличающиеся высокой чувствительностью и воспроизводимостью.

Показано, что определение динамики концентрации лекарственного средства и его метаболита характеризует индивидуальные особенности их фармакокинетики у конкретного пациента на всех этапах пребывания JIC в организме.

С помощью MEGX-теста показано влияние времени суток, лекарственных веществ и патологических состояний на активность CYP3A4, что отражается на динамике концентрации лекарственных средств и их метаболитов, метаболизирующихся данным изоферментом.

Изучено распределение полиморфных аллелей ген, кодирующих выработку изоферментов CYP3A4 и CYP2D6 в выборке лиц московской популяции.

Подобраны маркерные препараты для определения активности CYP3A4 и CYP2D6. Проведено сопоставление фенотипирования и генотипирования указанных изоферментов с клинической эффективностью J1C, метаболизирующихся данными изоферментами.

Впервые изучены временные параметры проявления ингибирующего и индуцирующего влияния флуконазола и карбамазепина на CYP3A4.

На примере изучения налтрексона в новой пролонгированной форме показана возможность использования динамики концентрации метаболита J1C для контроля за его эффективностью. концентрацией их метаболитов, достоверно информирует о снижении или увеличении активности указанных изоферментов.

На основании использования комплексного подхода к оценке биотрансформации лекарственных средств внесен ряд рекомендаций по проведению исследований по биоэквивалентности лекарственных средств.

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре фармацевтической химии и кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних заболеваний ММА имени И.М.Сеченова, а также на кафедрах фармацевтической химии, экспериментальной и клинической фармакологии медицинских и фармацевтических высших учебных заведений (Дальневосточного государственного медицинского университета, Рязанского государственного медицинского университета, Сибирского государственного медицинского университета и других).

Материалы диссертационного исследования использованы при подготовке: ФСП на «Продетоксон, таблетки для имплантации»; «Методических рекомендаций по проведению качественных клинических исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов» МЗ РФ; методических рекомендаций «Изучение метаболизма лидокаина для оценки функции печени в клинике внутренних болезней (MEGX-тест)»; методических рекомендаций «Изучение метаболизма ЛС»; учебных пособий для студентов медицинских вузов «Клиническая фармакология блокаторов медленных кальциевых каналов» и «Клиническая фармакология бета-адреноблокаторов».

Личный вклад соискателя: основная часть исследований выполнена автором лично. Автором лично подобраны условия хроматографическо-го определения концентрации лекарственных средств и их метаболитов в плазме крови, проведено определение концентрации лекарственных средств и их метаболитов в плазме крови у различных групп испытуемых, проведен MEGX-тест, а также фенотипирование CYP3A4 и CYP2D6. Автором самостоятельно проведены статистическая обработка и анализ полученных результатов.

Обследование испытуемых, назначение препаратов и отбор проб крови проводили на базе ГКБ № 23 им."Медсантруд" сотрудники и аспиранты кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних заболеваний ММА имени И.М.Сеченова (завкафедрой проф. Кукес В.Г.): к.м.н. Игонин А.А., к.м.н. Смолярчук Е.А., к.м.н. Кашаева О.В., к.м.н. Андреев Д.А., к.м.н. Сычев Д.А., Бердникова Н.Г., Савченко А.Ю. Работа с пациентами для изучения фармакокинетики новой лекарственной формы налтрексона проводилась к.м.н. Сулимовым Г.Ю. (Федеральный научно-методический центр терапии психических заболеваний МЗ РФ). Генотипи-рование осуществлялось совместно с лабораторией молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ФГУП "ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (зав.лабораторией, проф. Носиков В.В.; научный сотрудник лаборатории Игнатьев И.В.).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000г., 2001г., 2003г.); совместной научно-практической конференции ПЛ ЛС РАМН, ИКФ НЦ ЭГКЛС МЗ РФ, ГКБ №23 и кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних заболеваний ММА имени И.М.Сеченова (Москва 2000г., 2001г., 2002г.); Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2000г.); VII world Conference on clinical Pharmacology and Therapeutics (Italy, Florence, 2000г.); II Российской конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 2001г.); 5th Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics (Denmark, Odense, 2001 г.); 2-ом Съезде Российского Научного Общества фармакологов (Москва, 2003г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной темой кафедры фармацевтической химии ММА имени И.М.Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (номер гос. регистрации - 01.200.110545.), а также плановой темой НИР ПЛ J1C РАМН «Оптимизация фармакотерапии заболеваний внутренних органов посредством разработки рациональных методов контроля клинически значимых параметров фармакокинетики лекарственных средств» (номер гос. регистрации - 01.206.110468).

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 327 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследования, их обсуждение, выводы и практические рекомендации. В работе содержится 48 таблиц и 66 рисунков и диаграмм. Список литературы включает 368 источников, из них 312 зарубежной литературы.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны высокочувствительные ВЭЖХ - методики анализа ни-федипина, верапамила, ловастатина, амитриптилина, метопролола, налтрексона с основными метаболитами, позволяющие проводить их количественное определение в плазме крови.

2. Разработана методика количественного определения метаболита ли-докаина (MEGX) в плазме крови с помощью ВЭЖХ для проведения MEGX-теста. Показана возможность использования данной методики как альтернативной поляризационному флюоро-иммуноанализу.

3. Показано, что флуконазол является мощным ингибитором CYP3A4, с эффектом развивающимся на 3 день курсового приема флуконазола, и полностью исчезающим через 6 дней после его отмены. Ингибиро-вание обуславливает увеличение в плазме крови концентрации лекарственных средств, метаболизирующихся CYP3A4 (в частности, бло-каторов медленных кальциевых каналов) и снижение концентрации их метаболитов.

4. Установлено, что карбамазепин обладает индуцирующим действием на CYP3A4, что приводит к увеличению концентрации метаболитов лекарственных средств - субстратов данного изофермента в плазме крови на 5 день его курсового приема. После отмены карбамазепина активность фермента восстанавливается через 4 дня.

5. С помощью MEGX-теста показано, что активность CYP3A4 может меняться в течение суток. При проведении теста в утренние часы концентрация MEGX статистически достоверно выше, чем в вечернее время.

6. Установлено, что проведение MEGX-теста позволяет оценить тяжесть состояния пациентов при тяжелой сердечной недостаточности и тяжелой бронхиальной астме. Концентрация MEGX в плазме крови до и на фоне лечения данных заболеваний может служить критерием эффективности проводимой терапии.

7. Методом ПЦР мутация CYP2D6*4 в выборке лиц московской популяции обнаружена у 28 % испытуемых. При этом 21 % являлись гете-розиготами (CYP2D6*1/ CYP2D6*4) и 7 % - гомозиготами (CYP2D6*4/ CYP2D6*4). Мутация CYP2D6*3 в исследуемой выборке обнаружена у 7 %, которые являлись гетерозиготами (CYP2D6*1/ CYP2D6*3). Полиморфные аллели CYP3A4*1 и CYP3A4*2 в исследуемой выборке не обнаружены.

8. Предложены лекарственные средства в качестве маркеров для определения активности CYP2D6 (метопролол) и CYP3A4 (нифеди-пин, лидокаин).

9. Для метопролола получена корреляция между наличием полиморфной аллели CYP2D6*4, снижением активности изофермента 2D6 и возникновением побочных эффектов при его приеме. Установлена корреляция между наличием полиморфной аллели CYP2D6*4 и снижением активности изофермента 2D6, при использовании в качестве маркера - амитриптилина.

10. На примере налтрексона показано, что определение концентрации метаболита JIC в плазме крови может служить критерием его эффективности.

11. Продемонстрировано, что одновременное определение концентрации J1C и его метаболита более полно характеризует интенсивность процессов метаболизма, а также информирует об их изменениях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ФАРМ АКОКИНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. При проведении фармакокинетических исследований нового лекарственного средства необходимо изучать его влияние на активность системы биотрансформации и, в частности, цитохром Р-450.

2. Включение добровольцев в фармакохинетические исследования лекарственных средств, с целью их рандомизации и избежания побочных эффектов, рекомендуется проводить после оценки индивидуальной активности системы биотрансформации (генотипирования или фенотипирования ферментов метаболизма исследуемого лекарственного средства).

3. В случаях, когда необходимо оценить активность системы цитохрома Р-450 использовать в качестве маркера активности CYP3A4 нифедипин и лидокаин (MEGX-тест), а для оценки активности CYP2D6 - метопролол и амитриптилин.

4. Учитывая, что активность CYP3A4 подвержена влиянию различных факторов, при курсовом назначении ЛС, метаболизирующихся данным изоферментом, следует проводить MEGX-тест с целью коррекции режима дозирования.

5. До начала лечения лекарственными средствами, метаболизирующи-мися CYP2D6 (бета-блокаторы, психотропные средства) целесообразно проводить генотипирование - для выбора первоначальной дозы, а в процессе лечения проводить фенотипирование для коррекции режима дозирования.

6. При совместном курсовом назначении лекарственных средств одно из которых является индуктором или ингибитором метаболизма другого лекарственного средства, необходимо осуществлять контроль за концентрацией лекарственного средства и его метаболита в плазме крови с целью предупреждения развития побочных эффектов или отсутствия эффективности.