Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследования по разработке и стандартизации новых фармацевтических композиций с природным кальция карбонатом

005050880

На правах рукописи

о//

БОЛЬШАКОВА АНАСТАСИЯ ЕВГЕНЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ И СТАНДАРТИЗАЦИИ НОВЫХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЙ С ПРИРОДНЫМ КАЛЬЦИЯ КАРБОНАТОМ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

21 МАР 2013

Самара - 2013

005050880

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Мельникова Нина Борисовна

Официальные оппоненты:

Шаталаев Иван Федорович - доктор биологических наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра химии фармацевтического факультета, заведующий кафедрой

Шорманов Владимир Камбулатович - доктор фармацевтических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармацевтической, токсикологической и аналитической химии, профессор кафедры.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 5 апреля 2013 г. в 40'00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (443001, г. Самара, ул. Ар-цыбушевская, 171).

Автореферат разослан «»

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат фармацевтических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современная экологическая обстановка и образ жизни обусловливают мировую тенденцию к увеличению поражений костной ткани - осте-опении, остеопороз и частота переломов (ВОЗ, 2008). Причинами заболеваний костной ткани являются нарушение баланса микро- и макроэлементов в воде и пище, изменение гомеостаза кальция (Heaney R.P., 1965) и метаболизма витамина D (Дам-бахер М.А., 1996), стрессы (Paradopulos I.S., 1997), гиподинамия (Красных И.Г., 1969), ацидоз (Lindsay D.W., Dempster R., 1993), а также возрастные изменения костной ткани (Суслов Е.И., 1975), эстрогенная недостаточность (Notario А., 1987) и глю-кокоргикостероидная терапия (Ринге И.Д., 1991). Для лечения этих заболеваний традиционно используют препараты кальция, витамины группы D, бисфосфонаты, селективные модуляторы эстрогеновых гормонов, кальцитонины и соли стронция с органическими кислотами, причем препараты кальция обязательны при любых комбинациях (Heaney, 2011). В свою очередь, эффективность лечения заболеваний костной ткани возрастает при комплексном введении гетерополисахаридов (хондроитинсуль-фаты, гиалуронаты) и соединений фосфора. Роль полисахаридов заключается в связывании катионов кальция и фосфат-анионов в комплекс с коллагеном (Fleisch, Neuman, 1961; Wahl, Czernuszka, 2006), контролирующим формирование костной ткани в остеобластах (Gleeson, 1992; Garnero, 2006). В результате многочисленных исследований установлено повышение биоусвояемости кальция при его нахождении в лекарственной форме (ЛФ) в ионизованном состоянии (Nordin, 2011). Для коррекции метаболизма фосфора при остеопорозе и остеопениях препаратами выбора являются лекарственные средства из класса бисфосфонатов, которые независимо от механизма действия регулируют метаболизм в костной ткани на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях (Rodan, 1996, Graham, 2007). Недостатками бисфосфонатов являются побочные эффекты (Diel, 2010) и их несовместимость с ионами кальция в ЛФ. На фармацевтическом рынке чрезвычайно мало комбинированных препаратов кальция и фосфора («Остеогенон», «Алфлутоп», «Остеомед» и др.), и, соответственно, отсутствует практический опыт анализа основных компонентов и стандартизации лекарственных средств.

Таким образом, разработка комбинированного препарата для профилактики и лечения заболеваний костной ткани, исследование его свойств и стандартизация методов анализа компонентов в сложной ЛФ являются актуальной задачей медицины и фармации.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка и стандартизация новых комбинированных фармацевтических композиций кальция и фосфора на основе водной суспензии природного кальция карбоната для профилактики и лечения заболеваний костной ткани.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) исследование коллоидно-химических свойств Мицеллат на основе природного кальция карбоната;

2) разработка методов анализа и контроля качества природного кальция карбоната в суспензии Мицеллат;

3) исследование специфического ремоделирующего действия суспензии кальция карбоната в ветеринарии;

4) обоснование использования эндогенного полисахарида в качестве стабилизатора Мицеллата и разработка методов качественного и количественного анализа полисахарида, их стандартизация в комбинированных суспензиях;

5) разработка новой комбинированной фармацевтической композиции для профилактики заболеваний и репарации костной ткани, апробация состава на модели искусственного травматического дефекта;

6) разработка новой комбинированной фармацевтической композиции для профилактики заболеваний и ремоделирования костной ткани, апробация состава на модели глюкокортикостероидного остеопороза;

7) установление нормативов качества всех компонентов для спецификации новых лекарственных средств.

Научная новизна

• Впервые предложен комплекс методов оценки коллоидно-химических свойств природного кальция карбоната в суспензии: методы просвечивающей электронной микроскопии, дифракции электронов и спектроскопии характеристических потерь энергии электронов для элементного анализа, седиментационного анализа и адсорбционного титрования катионным индикатором, которые могут быть использованы для контроля качества в суспензионных лекарственных препаратах кальция.

• Установлена возможность получения устойчивых водных суспензий природного кальция карбоната стабилизацией натрия гиалуронатом. Основными критериями качества суспензии является присутствие наноразмерных кластеров (1-100 нм) на поверхности частиц кальция и условная плотность отрицательного заряда (не менее 0,11±0,05 мкмоль/г).

• Впервые разработана фармацевтическая композиция в виде стабилизированной натрия гиалуронатом суспензии природного кальция карбоната, которая дополнительно содержит фосфорсодержащий метаболический препарат широкого спектра действия - диметиловый эфир 1,1-Диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты (диме-фосфон). В эксперименте на животных продемонстрирована эффективность специфического ремоделирующего костную ткань действия.

• ИК- и УФ-спектральными исследованиями показано хемосорбционное взаимодействие димефосфона с ионами кальция на поверхности частиц мицелл с образованием кальциевьгх солей диметилового эфира 1,1 -диметил-3-оксобутилфосфоновой кислоты.

• Выявлены условия унифицированной пробоподготовки образцов фармацевтических суспензий для ВЭЖХ, фотоколориметрического, гравиметрического и трило-нометрического анализа метилпарабена, соединений фосфора, натрия гиалуроната, фруктозы, кальция и магния.

Практическая значимость. В результате проведения научных исследований созданы предпосылки для расширения ассортимента комбинированных лекарственных средств на основе природного кальция карбоната и фосфора для профилактики и лечения заболеваний костной ткани. Разработаны и запатентованы составы фармацевтических композиций, стимулирующих регенерацию костной ткани, в виде суспензий - «Мицеостин» (патент РФ № 2444365) и «Мицефосфон» (патент РФ № 2442592); оформлены международные заявки на изобретение (№ РСТ/ЛШО11/000913 и № РСТ/Яи2011/000914 соответственно), на которые получены положительные решения. Оптимальные составы суспензий «Мицеостин» и «Мицефосфон» могут быть использованы для профилактики остеопений, в частности остеопороза.

Разработанные методики определения подлинности (элементный анализ, седи-ментационные характеристики, оценка заряда суспензии) и доброкачественности (примеси железа, меди, марганца) суспензии природного кальция карбоната, предложенные стандартизованные методики количественного определения натрия гиалуроната и фруктозы (спектроскопия), кальция (гравиметрия), унифицируемая ВЭЖХ-методика метилпарабена по принципу «введено-найдено» могут быть использованы в специализированной контрольно-аналитической лаборатории.

Результаты исследований использованы при подготовке проектов нормативной документации - ФСП «Мицеостин, суспензия для внутреннего применения» и ФСП «Мицефосфон, суспензия для внутреннего применения» (ООО «Славянская аптека»).

Практическая значимость результатов проведенных исследований подтверждена актами о внедрении (приложение): ООО «Славянская аптека» (от 20.11.2012 г.), на кафедре «Фармацевтической химии и фармакогнозии» ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России (от 17.01.2013 г.) и на отделении «Фармация» ГБОУ СПО НО «Нижегородский медицинский колледж» (от 15.01.2013 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России (№ государственной регистрации 01201063248) по научной проблеме «Разработка и исследование новых лекарственных средств на основе природных и синтетических веществ».

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследований коллоидно-химических свойств Мицеллата на основе природног о кальция карбоната и разработки методов контроля суспензии.

2. Результаты исследований по стабилизации натрия гиалуронатом Мицеллата и разработки методов качественного и количественного анализа полисахарида.

3. Исследования по разработке новых комбинированных фармацевтических композиций для профилактики заболеваний и репарации костной ткани, апробация составов в экспериментах на животных.

4. Результаты по установлению нормативов качества всех компонентов и стандартизация новых лекарственных средств.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на VI международном симпозиуме «Экология человека и медико-биологическая безопасность населения» (Греция, Салоники, 2010), X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Н.Новгород, 2011), 16-й Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучные дисциплины) («Красный плес», 2011), III съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» (Санкт-Петербург, 2011), VII международном симпозиуме «Экология человека и медико-биологическая безопасность населения» (Испания, Мурсия, 2011), Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и нано-биоматериалы: актуальные проблемы и вопросы безопасности» (Казань, 2012).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 10 научных работах, из них: 4 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК РФ; 2 патента РФ на изобретение; 2 международные заявки, на которые имеются положительные решения.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 23 рисунка. Список цитируемой литературы включает 145 ссылок, в том числе 83 иностранных, 12 интернет ресурсов. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и приложений.

Первая глава посвящена обзору литературы по современному состоянию исследований фармакотерапии остеопороза и научному обоснованию целесообразности создания комбинированных лекарственных средств кальция и фосфора. В главе 2 дана характеристика объектов и методов исследования. В 3-ей главе представлены экспериментальные данные и обсуждены результаты собственных исследований. В приложение вынесены проекты фармакопейных статей на разработанные композиции, отчёты доклинических испытаний и акты внедрения результатов работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика объектов и методов исследования Материалы и реактивы: Мицеллат марка «О» (ТУ 5743-001-43646913-2006, ООО «Славянская аптека», пос. Вольгинский Владимирской обл.; ООО «Мицеллат», г. Сочи); димефосфон (диметилоксобутилфосфонилдиметилат, не менее 99%, ФСП 42-8488-07, ООО «ТЕХНОФОС», г. Казань, республика Татарстан); кальция карбонат (кальций углекислый, СаСОэ, квалификация «ЧДА», ГОСТ 4530-76); натрия гиалуро-нат (порошок из стекловидного тела быка, 99,8%, 1,63 MDa, CPN Spol.s.r.o, The Czech Republic; «Sigma», Product Number: H7630); натрий фосфорнокислый двузаме-щенный 2-водный (натрий гидрофосфат дигидрат, Na2HP04-2H20, ТУ 2148-00254364632-2004, ООО «Альфахим», г. Санкт-Петербург); калий фосфорнокислый од-нозамещённый (калий дигидрофосфат, КН2Р04, ТУ 2186-001-57904307-02, ООО «Альфахим», г. Санкт-Петербург); фруктоза кристаллическая (ТУ 911-011-3598767702, ЗАО «Диетпродукт», г. Одинцово, Московская обл.); метилпарабен (метил-4-гидроксибензоат, >99.0% (GC), Ueno Fine Chemicals Industry, Индия; «Sigma-Aldrich», Product Number: 54750); спирт этиловый (медицинский, 95%, ООО «Гиппократ», г. Самара); карбазол (дибензопиррол, >95% (GC), «Sigma», Product Number: С5132); то-луидин голубой-0 («Sigma-Aldrich», Product Number Т3260); вода очищенная (ФС 420324-09), полученная на установке системы очистки воды Elix 3 с картриджем Progard (Millipore, Франция), удельное сопротивление менее 0,2 цСм.

В работе изучены фармацевтические композиции, в которых количество кальция карбоната в суспензии Мицеллат составляло 50%, а магния карбоната не превышало 1%. Состав «Мицефосфона», используемый в экспериментах на крысах, масс.

%: Мицеллата (4,2), димефосфона (10,0), натрия гиалуроната (0,8), фруктозы (15,0), этанола (2,0), метилпарабена (0,2), воды очищенной (до 100,0).

Состав «Мицеостина», масс. %: Мицеллата (4,2), натрия гиалуроната (0,8), натрия гидрофосфата (1,0), калия дигидрофосфата (0,05), фруктозы (10,0), этанола (2,0), метилпарабена (0,2), воды очищенной (до 100,0).

Методы исследования и приборы: Электронные спектры поглощения были получены на приборе «Bio line Specord S-100» (Analytik Jena, Germany) в области 190600 нм и спектрофотометре «Unico® 1200 Series» (Unico Inc., США) в видимой области спектра (325-1000 нм), толщина кварцевой кюветы - 10 мм. ИК-спектры были сняты на ИК-спектрофотометре с преобразователем Фурье «IR Prestige-21» (Shimadzu, Japan) в области 4000-500 см"1 в виде смесей с калия бромидом при концентрации изучаемых веществ в смеси 0,1-0,3%, а также в тонкой пленке вазелинового масла. ВЭЖ-хроматограммы были получены с использованием хроматографиче-ской системы: ВЭЖ-хроматограф «LC-lOAvp» (Shimadzu, Japan) в обращено-фазовом режиме с дегазатором подвижной фазы, термостатом колонки и UV-Vis-детектированием. Колонка Phenomenex® Luna 5u Cl8 100 A, 250x4,6 мм, 5 мкм. Объем вводимой пробы - 20 мкл. Атомно-абсорбционные спектры были сняты на атом-но-абсорбционном спектрофотометре AA-7000F (Shimadzu, Japan) с двух-лучевой оптической схемой и автоматическим дозатором проб в пламенном режиме лампой с полым катодом для определения соответствующих элементов. Измерения pH растворов проводили на электронном стационарном рН-метре «Portlab 102» (Jenway U.K. by Bibby Scientific Ltd., Staffordshire, UK).

Исследование дисперсности суспензии Мицеллата проведено на просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) LEO 912 AB OMEGA (Zeiss, Germany) при ускоряющем напряжении 60-120 kB1. 2,5 мкл разведенной суспензии (1:10 000) высушивали на медной сетке. Структура частиц кальция карбоната была исследована методом дифракции электронов и подтверждена элементным анализом методом спектроскопии характеристических потерь энергии электронов (СХПЭЭ).

Определение условного отрицательного заряда водной суспензии Мицеллата проводили адсорбционным титрованием раствором катионного индикатора толуиди-нового голубого с использованием высокочастотного лабораторного титратора ТВ-6J11 (Россия) при максимальной чувствительности и постоянном перемешивании.

1 МГУ им. М.В. Ломоносова проф. К.В. Шайтаном

Точка эквивалентности определялась методом касательных по кривым зависимости показаний прибора (мкА) от объема титранта (мл).

Определение кальция в суспензии Мицеллата проводили гравиметрически после его перевода в кальция хлорид и дальнейшего осаждения раствором аммония оксала-та. Содержание магния в суспензии определяли в надосадочной жидкости (раствор А) по ГФ XI. Анализ натрия гиалуроната проводили по карбазольному методу Б^всЬе при последовательном растворении СаСОз в концентрированной НС1, осаждении гиа-луроновой кислоты ацетонитрилом и фотометрировании карбазольного комплекса при 530±2 нм. Фильтрат (раствор Б) использовали для анализа димефосфона, фруктозы и метилпарабена. Количественное определение димефосфона по содержанию общего фосфора после минерализации окислительной смесью азотной и хлорной кислот (в соотношении 1:1) аликвоты раствора Б проводили фотоколориметрически 425±2 нм в соответствии с методикой (ГФ XII). Анализ фруктозы выполняли фотометрически 480±2 нм, используя аликвоту раствора Б после образования комплексов фруктозы с резорцином (Олейников Д.Н., 2008). Содержание метилпарабена определяли в аликвоте раствора Б после осаждения ионов кальция аммония оксалатом методом ВЭЖХ с УФ-детектором (205±2 нм и 254±2) нм (КашЫе Я.М., 2011).

Медико-биологические исследования эффективности суспензий «Мицефосфон» и «Мицеостин» (ноябрь 2010 г., апрель 2011 г., соответственно) в экспериментах на животных (крысы, кролики) проводили в ЦНИИЛ ГБОУ ВПО Нижегородской государственной медицинской академии под руководством проф., д.б.н. И.В. Мухиной. Активность фосфатаз в биологических жидкостях определяли «по конечной точке» методом Веззеу-Ьооту-Вгоск, основанном на ферментативном гидролизе л-нитрофенилфосфата, измеряя оптическую плотность растворов при 405±2 и 420±2 нм. Репаративное действие доказывали в экспериментах на кроликах на модели искусственного травматического дефекта шаровидной фрезой нижней челюсти в ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Минздрава России под руководством зав. кафедрой хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, проф., д.м.н. Е.И. Дерябина. Эффективность ремоделирующего действия суспензии Мицеллат («Алексанат-Зоо») на костную ткань была продемонстрирована в экспериментах на бройлерах, курах-несушках и молочных поросятах (Сергиев Посад,

2008-2009; Дубровицы, 2009-2011), телятах (Екатеринбург, 2011) и собаках (Курган,

2009-2010).

Статистическую обработку проводили по программе 81аН5Йса 7,0.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Свойства суспензии природного кальция карбоната - Мицеллата и комбинированного препарата «Мицеостин» на его основе

Суспензии Мицеллат являются агрегативно неустойчивыми системами: время расслаивания суспензий варьируется от 3 до 5 часов. Стабилизация суспензии осуществлялась натрия гиалуронатом с концентрацией 0,5-1,2%, причем наиболее стабильны суспензии с массовой концентрацией кальция карбоната 5-7% и при постоянной концентрации остальных компонентов, используемых в качестве консервантов (метилпарабен), подсластителей (фруктоза). ЭМ-анализ Мицеллата показал неоднородность суспензии по размерам (рис. 1). Основное содержание (около 80%) составляют частицы со средним размером 0,75 мкм (0,3-1,2 мкм).

60-

Рис. 1. Распределение по размерам крупных кристаллических частиц кальция карбоната в Мицеллате, предварительно разбавленного в 10 000 раз

1,0 1,5 2,0 2,5 Размер частиц, мкм

На крупных частицах размером более 0,5 мкм на поверхности содержатся отдельные наноразмерные частицы (1-100 нм), не отделяющиеся от более крупных при механическом перемешивании (рис. 2, а-г). Наноразмерные частицы способны образовывать мицеллярные структуры. Крупные частицы формируются за счет агрегации частиц при разбавлении суспензии водой.

а)

б)

Рис. 2. ПЭМ-фото наночастиц в Мицеллате

Дифракция электронов подтверждает, что все частицы являются кристаллическими (рис. 3) и по данным спектра ХПЭЭ представляют собой преимущественно кальция карбона! (рис. 4). Область нормированных спектров образца Мицеллата с наночастицами и литературных данных для кальция карбоната совпадает: два пика в области 347 и 350 эВ соответствуют 350 и 353 эВ для Ь2,3-линий кальция.

8 |

ё § 0.8-||

II "

|Й Я

(2 0.4 -

340 360 380

Потери энерпщ электронов. эВ

Рис. 3. Дифракционная картина Рис. 4. СХПЭЭ-анализ образка Мицеллата: ианочастиц Мицеллата 1 - спектр образца Мицеллата, 2 - спектр

кальция карбоната из базы данных

Адсорбционное титрование суспензии катионным индикатором толуидиновым голубым показал существование отрицательного заряда (переход окраски осадка с адсорбированным индикатором от синей до сиреневой) частиц мицеллы предположительного состава:

КСаСОО,, пСО/~ (п-х) • Са2+}хСа2* {(СаС03)„ пНСО/ (п-х) ■ Са2+}хСа2+ Условная плотность отрицательного заряда (р, мкмоль индикатора, приходящегося на 1 г частиц суспензии) на поверхности частицы мицеллы, определяемая по кривым прямого титрования (рис. 5) по формуле 1:

I. п«:А

¿0 -

!

\гШ

жН]

Рис. 5. Кривая прямого титрования суспензии Мицеллата

р_С„\«нд.уУ(шд.)

где: Сэкв(инд.), моль/л - молярная концентрация эквивалента раствора индикатора; У(инд.), л - объем раствора индикатора в точке эквивалентности; ш, г - навеска.

достаточно велика и равна 0,11 ±0,03 мкмоль/г, что способствует оптимальной проницаемости частиц кальция карбоната.

Ремоделирующее действие суспензии Мицеллат («Алексанат-Зоо») на костную ткань продемонстрировало повышение живой массы опытного молодняка бройлеров при снижении затрат кормов на 1 кг живой массы (Сергиев Посад, 2008); положительное влияние на состояние перьевого покрова кур-несушек, повышение интенсивности яйценоскости с увеличенной яичной массой (Сергиев Посад, 2009); ускорение костеобразования, восстановление прочности и нормальной структуры костей при выращивании молочных поросят (Дубровицы, 2009-2011); более раннее восстановление объема мягких тканей и сокращение сроков сращивания переломов у собак (Курган, 2009-2010); повышение естественной резистентности, нормализации минерального обмена и повышению продуктивности телят (Екатеринбург, 2011).

Предложена фармацевтическая композиция «Мицеостин» (патент №2444365) на основе суспензии Мицеллат, стабилизированная натрия гиалуронатом (0,8 масс. %) и включающая дополнительно (масс. %) натрия гидрофосфат (1,0), калия дигидрофос-фат (0,05), фруктозу (10,0), этанол (2,0), метилпарабен (0,2).

Репаративное действие на костную систему «Мицеостина» (динамика восстановления костных дефектов и гистограмма состава регенерата) подтверждено на модели искусственного травматического дефекта шаровидной фрезой нижней челюсти у кроликов (4 группы животных по 21 самцу породы шиншилла, 3 месяца) при пероральном (с питьевой водой) введении. Показана эффективность «Мицеостина»: ускорение динамики построения новообразованной кости, сосудистой и соединительной ткани (таблица 1, рис. 6, а-в).

Таблица 1

Динамика восстановления костных дефектов (М±т), мм

Исследуемые группы Через 30 суток Через 60 суток Через 90 суток

Диаметр Глубина Диаметр Глубина Диаметр Глубина

1 (контроль, заживление в естественных условиях репарации) 3,5±0,5 2,7±0,4 2,5±0,5 2,0±0,2 1,8±0,5 1,6±0,4

2 (лечение перо-ральным введением «Мицеостин») 2,7±0,3 2,3±0,3 1,6±0,2 0,8±0,2 1,0±0,5 (р<0,001) 0,4±0,1 (р<0,001)

Рис. 6. Гистограмма динамики роста костной (а), сосудистой (б) и соединительной (в) ткани; И - группа 1, □ - группа 2

Острая токсичность (LDS0) оценивалась на тест-системе белых крыс линии Wistar и беспородных белых мышей (по 228 особи) методом Беренса и Кербера. Средние смертельные дозы для мышей-самцов составляют 12,5±1,7 г/кг, для мышей-самок — 14,2±1,9 г/кг, для крыс-самцов - 16,1±1,8, для крыс-самок - 16,9±1,6 г/кг. По данным патоморфологического исследования органов следует, что суспензия является малотоксичной ЛФ VI класса относительно безвредных веществ (LD50 > 15 мг/кг) или малоопасных веществ (LD50 > 5 г/кг), не оказывающая местного раздражающего действия.

На основании проведенных исследований «Мицеостина» в эксперименте на животных подтверждено его репаративное действие на дефекты костной ткани.

2. Разработка и исследование комбинированного препарата кальция и фосфора для профилактики и лечения остеопороза

В качестве источника фосфора была выбрана фармацевтическая субстанция ди-мефосфон (ДМФ) - диметиловый эфир 1,1 -диметил-3-оксобутилфосфоновой кислоты (LDS0 2000-4000 мг/кг для лекарственной формы в виде 15% раствора) - метаболик преимущественно антиацидотического действия.

Прогнозирование по компьютерной программе PASS показало высокую фармакологическую активность ДМФ для заболеваний костной ткани (стимулятор формирования костной ткани, Ра = 0,767; антиостеопорозная активность Ра = 0,672; регулятор кальция Ра = 0,660; ингибитор кислой фосфатазы Ра = 0,604; антагонист остеокластов Ра= 0,474).

Димефосфон способен легко растворяться в воде с образованием ионизованных форм, сопровождающимся изменением рН среды от 6,0-6,5 до 2,7-4,0 в 15% водном растворе:

н,с—с—с — о

ДМФ

СНз ОСНз СНз ОСНз

1 1 НОН Н2 1 1 +

с— 1 -Р—п « * н3с- -с— II -с —с— 1 -Р=ОН 1

1 СН3 1 ОСНз II о 1 сн3 ОСНз

_ нон он . »

нон

сн3 осн3 I I ^он нон

нэс—с—с —с-PC

II I I он о сн3 осн3

СН3 ОСН3 н2 I I .ОН + н3с—с—с —с—рС _ +н3о

II I

О сн3 ОСНз

Б В

Ионизация ДМФ в присутствии воды важна для взаимодействия с ионами кальция, присутствующими в суспензии. Взаимодействие ДМФ с водой подтверждают УФ-спектры чистого ДМФ в безводном ацетонитриле, 95% этаноле и в воде: резко изменяется интенсивность и форма полосы, характеризующей переход с переносом заряда при участии растворителя (190-210 нм), в данном случае воды, и полос п-»л* и п~*к*- переходов Р=0 и С=0.

ИК-спектры ДМФ в присутствии 1% воды характеризуют включение воды в молекулу ДМФ, при этом взаимодействие происходит по фосфорильной группе (таблица 2). Из данных ИК-спектров смеси ДМФ с кальция карбонатом в присутствии 1 % воды (модельная смесь ДМФ + СаСОз + вода) видно, что наблюдаемые спектры близки комплексам, образованным гидратированной фосфорильной группой ДМФ и кальцием (Шагидуллин, 2004).

Интенсивность связывания ДМФ с кальция карбонатом в водной суспензии была изучена по адсорбции ДМФ на поверхности кальция карбоната.

Таблица 2

ИК-спектры димефосфона (ДМФ) и его смеси с водой и солями кальция

Образец Волновое число г>, см"1

4000-2500 (ОН, Н20) 1750(С=0)-1600 (бОН2) 1250-1200 (Р-О)

ДМФ 3522 (ср. шир.) 3470 (ср. шир.) 1719 (инт. узк.) 1244 (инт. узк.)

ДМФ+ 1 % воды 3443 (инт. шир.) 1713 (инт. узк.) 1647 (инт. сред.) 1224 (инт. узк.) 1207 (инт. узк.)

ДМФ + 1% воды + СаС12 3460 (инт. шир.) 1705 (инт. узк.) 1635 (инт. узк.) 1223 (инт. узк.)

ДМФ + 1% воды + СаСОз 3474 (инт. шир.) 1719 (инт. узк.) 1647 (инт. сред.) 1238 (инт. сред.) 1205 (инт. сред.)

На рисунке 7 приведена типичная изотерма адсорбции ДМФ и его продуктов взаимодействия с водой на поверхности кальция карбоната. $1от-------- ---------------

Рис. 7. Изотерма сорбции ДМФ из

водных растворов А = Р(С) на поверхность кальция карбоната

' МО.Ж.Л

Анализ изотермы адсорбции ДМФ (А, ммоль/г) на поверхности кальция карбоната в линейных координатах с/А от с показал, что процесс формально соответ-

А _ Дгах ' • С

ствует уравнению Ленгмюра А ~ ^ + Ь ^с)' где Ьэф ~ эмпирический коэффициент,

характеризующий эффективность адсорбции, а Атах - предельная адсорбция, равная 29,4±1,8 ммоль/г, свидетельствует о хемосорбционном связывании ДМФ.

На основании проведенных исследований была разработана фармацевтическая композиция «Мицефосфон» состава (масс. %): Мицеллата (5), димефосфона (10), натрия гиалуроиата (0,8), фруктозы (15,0), этанола (2,0), метилпарабена (0,2).

Фармацевтическая композиция «Мицефосфон» проявляет низкую токсичность (1ЛЭ50 2,0-4,0 г/кг). Ремоделирующее действие доказывали на модели глюкокортико-стероидного остеопороза у крыс линии Wistar, вызванного введением внутрибрю-шинно гидрокортизона ацетата. Лечение проводили суспензией «Мицефосфон» в эк-витерапевтической дозе (3,5 мл/кг/сут), а контрольные группы и интактные животные получали суспензию крахмала. Эффективность лечения оценивали по основным маркерам заболевания - активности общей щелочной фосфатазы, кислой фосфатазы, тартратрезистентной кислой фосфатазы, неспецифически катализирующих гидролиз фосфорных эфиров с образованием неорганических фосфатов. Кроме того, контролировали содержание кальция и фосфора в сыворотке крови и моче (таблица 3).

Таблица 3

Динамика биохимических показателей сыворотки крови при применении суспензии «Мицефосфон» (М±ш)

Показатели Группа, лечение После моделирования остеопороза После лечения

Щелочная фосфатаза, Ед/л I контрольная (интактные), суспензия крахмала 42,06±3,43 45,39±5,39

И контрольная, суспензия крахмала 46,40±5,66 56,34±7,60

111 экспериментальная, суспензия «Мицефосфон» 41,82±9,52 50,29± 7,75

Кислая фосфатаза, Ед/л I контрольная (интактные), суспензия крахмала 10,91±0,71 10,17±0,21

II контрольная, суспензия крахмала 14,48± 0,95* 15,27±1,15*

1П экспериментальная, суспензия «Мицефосфон» 14,95±0,92* 12,76±0,61**

Тартратста-бильная кислая фосфатаза, Ед/л I контрольная (интактные), суспензия крахмала 4,34±1,15 4,93±1,67

II контрольная, суспензия крахмала 7,49±2,86* 7,47±0,39*

IU экспериментальная, суспензия «Мицефосфон» 7,33±1,66* 5,45±0,29**

Кальций, ммоль/л I контрольная (интактные), суспензия крахмала 1,59±0,14 1,93±0,60

II контрольная, суспензня крахмала 2,01±0,29 3,34±0,60*

III экспериментальная, суспензия «Мицефосфон» 1,88±0,10 2,73±0,36*

Фосфор, ммоль/л I контрольная (интактные), суспензия крахмала 2,44±0,15 1,93±0,19

И контрольная,суспензия крахмала 3,88±0,59* 2,59±0,29*

III экспериментальная, суспензия «Мицефосфон» 3,52±0,21* 2,16±0,06**

*- достоверные различия с интактной группой, ** - достоверные различия с П контрольной группой (р <0,05).

Лечение суспензией «Мицефосфон» корригировало изменения в костной системе крыс, вызванные введением гидрокортизона ацетата, нормализовало массу животных и улучшало общее функциональное состояние. В сыворотке крови снижалась активность тартратустойчивой кислой фосфатазы и активность кислой фосфатазы, уменьшалось количество фосфора и кальция в сыворотке крови по сравнению с группой, принимающей плацебо.

Применение «Мицефосфона» с лечебной целью нормализовало содержание ионов в моче. Так, содержание фосфора достоверно не отличалось от исходного состояния, а содержание кальция было достоверно меньше, чем в контроле.

Таким образом, в эксперименте на крысах выявлен ремоделирующий эффект, важный при профилактике и лечении заболеваний костной ткани, в частности осте-опороза, для разработанной фармацевтической композиции «Мицефосфон» с действующими компонентами димефосфоном и природным кальция карбонатом.

3. Разработка методов качественного и количественного анализа компонентов в комбинированных фармацевтических композициях 3.1. Анализ гиалуроиовой кислоты Основной проблемой количественного определения натрия гиалуроната в присутствии фруктозы методами электронной спектроскопии или ВЭЖХ является образование близких по структуре окрашенных комплексов с индикаторами (например, карбазолом) фруктозы и продуктов деструкции гиалуроната в процессе пробоподго-товки.

Для исключения возможности образования комплексов карбазола с фруктозой, присутствующей в лекарственной форме, нами предложено отделение гиалуроиовой кислоты (в виде осадка) от водорастворимой фруктозы добавлением ацетонитрила в водную кислую среду. Отношение (масс. %) вода : ацетонитрил : НС1 (конц.) = 15:15:1. Кислота хлороводородная необходима также для перевода кальция карбоната в растворимый хлорид. Добавление соляной кислоты в суспензию должно быть проведено перед добавлением ацетонитрила в полученный гомогенный раствор. После центрифугирования и полного удаления фруктозы в осадок гиалуроиовой кислоты последовательно добавляли воду, натрия тетраборат в сернокислой среде для связывания продуктов окисления М-ацетилглюкозамина ([К-ЫН3+]Н504") образующейся борной кислотой:

[К-МН3]+-Н804- + Н3В03 - [Я-МНзрН2В03" + Н2304 (2)

На заключительной стадии добавляли карбазол, взаимодействующий с 5-карбоксифурфуролом с образованием окрашенного комплекса = 530 нм). Используя метод «введено-найдено» для трех точек модельных смесей, была получена линейная зависимость А = Дс) для = 530 нм (рис. 8), имеющая уравнение у = 0,5789х - 0,1463 с коэффициентом корреляции Я2, равным 0,9098.

Аотн.

0 ,8 -

0,6 0,4 -02

-0,5

-0,2-

0,5

Рис. 8. Спектрофотометрический анализ модельных смесей суспензий кальция карбоната с карбазолом: 1 - масс. 0,7%; 2 - масс. 1,0%; 3 - масс. 1,2% натрия гиалуроната

1,5 С,%

Внутрилабораторные точность и прецизионность методики определения содержания натрия гиалуроната в суспензии представлены в таблице 4.

Таблица 4

Показатели внутрилабораторной точности и прецизионности методики определения содержания натрия гналуроната в суспензии

№ Масса навески, г А, отн. ед. Содержание, % Статистические данные

1 3,007 0,3047 0,779 х = 0,7940; 82 = 0,0002812; 8 = 0,01677; = 0,006846; ^бл. (95%, 5) = 2,5706 Дх = 0,017598 х ±Лх =0,7940± 0,0176 8=2,2164

2 2,969 0,3301 0,823

3 2,985 0,3093 0,787

4 2,992 0,3157 0,798

5 2,979 0,3070 0,783

6 3,021 0,3197 0,805

Сходимость результатов оценивалась по величинам выборочного стандартного отклонения Б (0,01677), среднего значения выборки х (0,7940) и относительного стандартного отклонения КБЭ, % = Э / х (2,1%), что характеризует предлагаемую методику натрия гиалуроната в суспензии как точную и прецизионную.

При данной чувствительности прибора предел обнаружения натрия гиалуроната в суспензии «Мицеостин» был равен 0,256 %, а диапазон применения - 0,256-1,635%. При определении количественного содержания в суспензии (СНуа1 0,8 %) диапазон применения составляет 90-110%.

Правильность как степень соответствия между известным истинным значением ц (в нашем случае 0,8%) и значениями, полученными по данной методике, характеризовали через величину систематической погрешности - смещения ( х- р). Смещение в пределах диапазона применения в предлагаемой аналитической методике определе-

ния количественного содержания натрия гиалуроната и вышеуказанной прецизионности равно 0,6%, что указывает на правильность разработанной методики.

3.2. Установление подлинности и количественного определения компонентов суспензии Анализ кальция в ЛФ осложнен присутствием примеси ионов магния, поэтому количественное определение кальция проводили гравиметрически по кальция оксала-ту (К, СаС204 = 2,3-10"9 и К5 Р^С204 = 8,5Т05), после чего титриметрически оценивали концентрацию примеси магния. Примесные ионы металлов (железо, медь, марганец) определяли в надосадочной жидкости атомно-абсорбционной спектроскопией.

Количественное определение фруктозы проводили спектрофотометрическим методом с резорцином, используя аликвоту водо-ацетонитрильного кислого раствора (раствор Б).

Для анализа неорганических фосфатов и димефосфона первоначально проводили минерализацию окислительной смесью азотной и хлорной кислот аликвоты раствора Б с последующим фотометрированием комплекса молибденованадатных гете-рополикислот. Пробоподготовка для ВЭЖХ-анализа метилпарабена включала обработку аммония оксалатом раствора Б, удаление ионов кальция фильтрацией и смешивание с элюентом (буфер рН 7,0 - ацетонитрил =1:1).

3.3. Спецификация и нормы качества разработанных фармацевтических композиций В результате проведенных исследований были разработаны спецификации на суспенции для приема внутрь «Мицеостин» и «Мицефосфон».

СПЕЦИФИКАЦИЯ МИЦЕОСТИН, суспензия для внутреннего применения ООО «Славянская аптека», Россия

Показатели Методы Нормы

Описание Визуальный Белая с кремовым оттенком суспензия без запаха. Вкус сладкий.

Подлинность 1. Качественные химические реакции на кальций, калий, натрий, фосфаты (ГФ XI, вып.1, с. 159). 2. Спектрофотомет-рия (натрия гиалу-ронат) 1. Препарат должен давать качественные реакции на кальций, калий, натрий, фосфаты. 2. Электронный спектр поглощения раствора, приготовленный для количественного определения натрия гиалуроната в области 450-600 нм, должен соответствовать электронному

спектру поглощения градуировочных растворов натрия гиалуроната, измеренных в этих же условиях.

3. Спектрофотомет-рия (фруктоза) 3. Электронный спектр поглощения раствора, приготовленный для количественного определения фруктозы в области 350-600 нм, должен соответствовать электронному спектру поглощения раствора СО фруктозы, измеренного в этих же условиях.

4. ВЭЖХ (метилпарабен) 4. Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора, приготовленного для количественного определения, должно соответствовать времени удерживания пика на хроматограмме градуировочных растворов метилпарабена.

рН среды Потенциометриче-ски, ГФ XII, стр. 89 От 7,2 до 8,5

Номинальный объем нд От 95 до 105 мл

Устойчивость суспензии Визуально Не должно наблюдаться расслаивания в течение 10 мин

Количествен ное определение Кальция карбонат Гравиметрия от 1,5 до 2,1 г (на 100 г суспензии)

Фосфор Спектрофотометр ия от 0,17 до 0,20 (на 100 г суспензии)

Фруктоза Спектрофотометр ия от 9,0 до 11,0 г (на 100 г суспензии)

Натрия гиалуронат Спектрофотометр ия от 0,72 до 0,88 г (на 100 г суспензии)

Метилпарабен ВЭЖХ от 0,18 до 0,22 г (на 100 г суспензии)

Микробиологическая чистота ОФС 42-0067-07 Категория 3 Б

Упаковка НД По 100 мл во флаконы стеклянные коричневые нейтрального стекла

Маркировка НД В соответствии с ФС

Транспортировка В соответствии с РД 9301-006-05749470-93

Хранение НД В прохладном месте, при температуре от 0 до +10°С

Срок годности 3 года

" Установлен методом «ускоренного старения» в ООО «Славянская аптека».

СПЕЦИФИКАЦИЯ

МИЦЕФОСФОН, суспензия для внутреннего применения ООО «Славянская аптека», Россия

Показатели Методы Нормы

Описание Визуальный Белая с кремовым оттенком суспензия со специфическим запахом. Вкус сладковато-горький.

Подлинность 1. Качественные химические реакции на кальций, фосфаты (ГФ XI, вып.1, с. 159). 1. Препарат должен давать качественные реакции на кальций, фосфаты.

2. Качественная реакция на метоксиль-ную группу в ди-мефосфоне. 2. Фиолетовое окрашивание

3. Спектрофотомет-рия (натрия гиалу-ронат) 3. Электронный спектр поглощения раствора, приготовленный для количественного определения натрия гиа-луроната в области 450-600 нм, должен соответствовать электронному спектру поглощения градуировочных растворов натрия гиалуроната, измеренных в этих же условиях.

4. Спектрофотомет-рия (фруктоза) 4. Электронный спектр поглощения раствора, приготовленный для количественного определения фруктозы в области 350-600 нм, должен соответствовать электронному спектру поглощения раствора СО фруктозы, измеренного в этих же условиях.

5. ВЭЖХ (метилпа-рабен) 5. Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора, приготовленного для количественного определения, должно соответствовать времени удерживания пика на хроматограмме градуировочных растворов метилпарабена

рН среды Потенциометриче-ски, ГФ XII, стр 89 От 7,7 до 8,5

Номинальный объем нд От 95 до 105 мл

Устойчивость суспензии Визуально Не должно наблюдаться расслаивания в течение 10 мин

Количественное определение Кальция карбонат Гравиметрия от 1,5 до 2,1 г (на 100 г суспензии)

Димефосфон Спектрофотометрия от 9,0 до 11,0 г (на 100 г суспензии)

Фруктоза Спектрофотометрия от 13,5 до 16,5 г (на 100 г суспензии)

Натрия гиалуронат Спектрофотометрия от 0,72 до 0,88 г (на 100 г суспензии)

Метилпарабен ВЭЖХ от 0,18 до 0,22 г (на 100 г суспензии)

Микробиологическая чистота ОФС 42-0067-07 Категория 3 Б

Упаковка нд По 100 мл во флаконы стеклянные коричневые нейтрального стекла

Маркировка нд В соответствии с ФС

Транспортиравка В соответствии с РД 9301-006-05749470-93

Хранение нд В прохладном месте, при температуре от 0 до +10°С

Срок годности3 3 года

выводы

1. Исследованы коллоидно-химические свойства суспензии природного кальция карбоната, такие как размер частиц (от 1 до 100 нм), фазовый состав (98% кальция карбоната и 2% органических примесей), условная плотность отрицательного заряда (не менее 0,11±0,05 мкмоль/г).

2. Разработаны методы анализа для контроля качества суспензии Мицеллат, стандартизован метод количественного определения кальция карбоната по осаждению оксалата и содержания примесей (магния, марганца, меди и железа) методом атомно-абсорбционной спектрометрии, а также оценки условной плотности отрицательного заряда адсорбционным титрованием катионным индикатором.

3. В эксперименте на животных (бройлеры, куры-несушки, молочные поросята, телята, собаки) доказано специфическое ремоделирующее действие 5-7% водной суспензии кальция карбоната («Алексанат-Зоо») на костную ткань.

4. Показана эффективность использования натрия гиалуроната в качестве стабилизатора суспензий природного кальция карбоната. Разработана методика качествен-

3 Установлен методом «ускоренного старения» в ООО «Славянская аптека».

ного и количественного анализа натрия гиалуроната в присутствии природного подсластителя - фруктозы на основе фотоколориметрического метода Dische.

5. Разработан состав фармацевтической композиции «Мицеостин», содержащей 5% водную суспензию кальция карбоната, натрия гиалуронат, натрия гидрофосфат и калия дигидрофосфат как источники фосфат-ионов. Ремоделирующее действие на костную ткань «Мицеостина» доказано в эксперименте на кроликах.

6. Разработан состав фармацевтической композиции «Мицефосфон», содержащий 5% водную суспензию кальция карбоната, димефосфон и натрия гиалуронат, эффективность действия которого доказана на модели глюкокортикоидного остеопо-роза на крысах. Положительный эффект действия димефосфона обусловлен хемо-сорбционным его связыванием с поверхностью частиц кальция карбоната.

7. Разработаны методы идентификации, количественного содержания основных и вспомогательных веществ в новых лекарственных средствах, а также разработаны спецификации и нормы качества фармацевтических композиций «Мицеостин» и «Мицефосфон».

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Большакова, А.Е. Суспензия для профилактики и лечения заболеваний костной ткани на основе карбоната кальция и натрия гиалуроната / А.Е. Большакова, Н.Б. Мельникова, JI.H. Нистратова, И.П. Пьянзина, Т.В. Саликова, С.А. Гаврилова, Е.В. Красильникова // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т. 46, № 7. - С. 4551.

2. Мельникова, Н.Б. Разработка фармацевтической композиции Мицефосфон с ди-мефосфоном и ее исследование при моделировании остеопороза / Н.Б. Мельникова, А.Е. Большакова, М.В. Сидорова, И.П. Пьянзина, И.В. Гуляев, О.П. Тихобразова, Т.Н. Соловьева, И.В. Мухина // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т. 46, № 8. -С. 33-38.

3.Bol'shakova, А.Е. Suspension based on calcium carbonate and sodium hyaluronate for the prevention and treatment of bone diseases / A.E. Bol'shakova, N.B. Mel'nikova, L.N. Nistratova, I.P. P'yanzina, T.V. Salikova, S.A. Gavrilova, E.V. Krasil'nikova // Pharmaceutical Chemistry Journal. - 2012. - Vol. 46, Issue 7. - P. 449-455.

4.MeInikova, N.B. Development of the pharmaceutical composition micephosphone containing dimephosphone and its study by modeling osteoporosis / N.B. Melnikova, A.E. Bolshakova, M.V. Sidorova, I.P. Pyanzina, I.V. Guljaev, O.P. Tikhobrazova, T.I. Solov'eva, I.V. Mukhina // Pharmaceutical Chemistry Journal. - 2012. - Vol. 46, Issue 8. - P. 498503.

5. Фармацевтическая композиция «Мицеостин», стимулирующая регенерацию опорной ткани и суставного хряща (варианты) : пат. 2444365 Рос. Федерация / Большакова А.Е., Боришпольский А.Л., Князькин Г.Ю., Мельникова Н.Б., Полухин И.В.,

Полухин О.В., Пьянзина И.П. - № 2010151156/15 ; заяв. 15.12.2010 ; опубл. 10.03.2012, Бюл. № 7.

6. Фармацевтическая композиция «Мицефосфон», стимулирующая регенерацию опорных тканей : пат. 2442592 Рос. Федерация / Большакова А.Е., Боришпольский А.Л., Князькин Г.Ю., Мельникова Н.Б., Полухин И.В., Полухин О.В., Пьянзина И.П. -№ 2010151157/15 ; заяв. 15.12.2010 ; опубл. 20.02.2012, Бюл. № 5.

7. Мельникова, Н.Б. Структура и механизм действия препарата «Мицеллат» / Н.Б. Мельникова, O.E. Жильцова, А.Е. Большакова, И.П. Пьянзина, Г.Ю. Князькин, С.А. Малютин // VI международный симпозиум «Экология человека и медико-биологическая безопасность населения» : тезисы докладов (Греция, г. Салоники, 24 октября - 03 ноября 2010 г.). - М„ 2010. - С. 102-106.

8. Мельникова, Н.Б. «Алексанат-Зоо» - новый отечественный препарат системного действия / Н.Б. Мельникова, А.Е. Большакова, И.П. Пьянзина, Г.Ю. Князькин, С.А. Малютин // III съезд ветеринарных фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» : материалы науч.-практ. конф. (Санкт-Петербург, 08-10 июня 2011 г.). - СПб.: Изд-во СПбГАВМ, 2011.-С. 326-327.

9.Фомичев, Ю.П. Мицеллат углекислого кальция - средство доставки минеральных элементов к органам-мишеням // Ю.П. Фомичев, Л.А. Никанова, И.П. Пьянзина, Н.Б. Мельникова, O.E. Жильцова, А.Е. Большакова, Г.Ю. Князькин // VII международный симпозиум «Экология человека и медико-биологическая безопасность населения» : материалы науч.-практ. конф. (Испания, Мурсия, 26 октября - 05 ноября 2011 г.).-С. 83-85.

10. Большакова, А.Е. Мицеллированный карбонат кальция как основа лекарственных средств для профилактики и лечения заболеваний костной ткани / А.Е. Большакова, М.В. Сидорова // Всероссийская молодежная научная школа «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» : тезисы докладов (Казань, 18-22 июня 2012 г.). - Казань : Отечество, 2012. - С. 50.

11. Фармацевтическая композиция «Мицеостин», стимулирующая регенерацию опорной ткани и суставного хряща (варианты) : Международная заявка № PCT/RU2011/000913, номер международной публикации WO 2012/082013 А2 от 21.06.2012 / Большакова А.Е., Боришпольский А.Л., Князькин Г.Ю., Мельникова Н.Б., Полухин И.В., Полухин О.В., Пьянзина И.П.

12. Фармацевтическая композиция «Мицефосфон», стимулирующая регенерацию опорных тканей : Международная заявка № PCT/RU2011/000914, номер международной публикации WO 2012/082014 А2 от 21.06.2012/ Большакова А.Е., Боришпольский А.Л., Князькин Г.Ю., Мельникова Н.Б., Полухин И.В., Полухин О.В., Пьянзина И.П.

Автор выражает глубокую признательность ООО «Славянская аптека» и ООО «СОЗИДАТЕЛЬ» за финансовую поддержку исследований и лично И.П. Пьянзиной.

БОЛЬШАКОВА Анастасия Евгеньевна

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ И СТАНДАРТИЗАЦИИ НОВЫХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЙ С ПРИРОДНЫМ КАЛЬЦИЯ КАРБОНАТОМ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано в печать 26.02.13. Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,45. Тираж 100 экз. Заказ № 586.

Отпечатано «Издательский салон» ИП Гладкова О.В. 603022, Нижний Новгород, Окский съезд, 2, оф. 501 тел./факс: (831) 439-45-11; тел.: (831) 416-01-02