Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка методик анализа отходов производства маточного молочка и таблеток тонизирующего и антигипоксического действия на их основе



На правах рукописи Ои«э"--

КРАСОВСКАЯ СОФЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК АНАЛИЗА ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА МАТОЧНОГО МОЛОЧКА

И ТАБЛЕТОК ТОНИЗИРУЮЩЕГО И АНТИГИПОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА ИХ ОСНОВЕ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

5 ^СЛ 2

МОСКВА - 2009

003482572

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Лазарян Джон Седракович

доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических Дорофеев Владимир Львович

наук, профессор

доктор фармацевтических Киселева Татьяна Леонидовна

наук, профессор

Ведущая организация: ГОУ ВПО Ярославская Государственная Медицинская Академия

Защита состоится «24» декабря 2009 г. в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (119019, Москва, Никитский бульвар, 13 ).

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ММА им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49 .

Автореферат разослан «39» ^О 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.208.040.09,

, Наталья Петровна Садчикова

доктор фармацевтических наук,

профессор

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Изыскание высокоэффективных лекарственных средств является важной задачей для здравоохранения.

В условиях рыночных отношений важное фармакозкономическое значение приобретает возможность использования для изготовления медицинских препаратов отходов производства химической, пищевой и других отраслей промышленности.

С этой точки зрения представляют интерес отходы производства маточного молочка - маточные личинки пчел. За сезон от одной пчелиной семьи можно получить до 500 г маточного молочка и параллельно - около 1,17 кг маточного расплода, что позволяет в достаточном количестве обеспечивать отечественную фармацевтическую промышленность недорогим лекарственным сырьем российского производства.

Возможность использования отходов производства маточных личинок пчел в медицине была отмечена ранее. В литературе описаны состав основных биологически-активных веществ, присутствующих в сырье, и приведены примеры его использования в качестве анаболического, актопротекторного и иммунотропного средства при внутреннем применении, и противовоспалительного и ранозаживляющего действия при наружном использовании; на основе маточных личинок пчел были получены таблетки и мягкие лекарственные формы - мазь и крем, разработаны методики их стандартизации.

Критический анализ данных литературы показал, что перспектива более эффективного использования этого ценного лекарственного сырья исследована недостаточно.

На основании сравнения данных о химическом составе маточного молочка и отходов его производства было сделано предположение о наличии у препаратов из маточных личинок пчел действия, стимулирующего деятельность центральной нервной системы (ЦНС), повышающего запасы биологической энергии и антиги-поксического действия, ранее экспериментально доказанное у маточного молочка.

Дефицит кислорода лежит в основе таких заболеваний, как вегето-сосудистая дистония, нарушения мозгового кровообращения, болезнь Альцгеймера, ишемиче-ская болезнь сердца, инфаркт миокарда, анемия, постатеросклеротическая гипоксия. Большинство из этих заболеваний характеризуется хроническим течением. Очевидно, что помимо препаратов для купирования острой гипоксии, в арсенале медицины должны быть средства, предотвращающие развитие и корригирующие течение гипоксии.

з

Одним из аспектов внедрения новых лекарственных веществ в клиническую практику является разработка методик их фармацевтического анализа, опирающаяся на всесторонние исследования физико-химических и химических свойств.

Создание препарата с иной фармакологической активностью делает необходимой разработку и валидацию новых методик стандартизации сырья и получаемого на его основе лекарственного средства согласно современным требованиям фармацевтического анализа.

Предмет исследования данной работы - гомогенат маточных личинок пчел относится к практически нетоксичным соединениям, что благоприятствует его использованию в педиатрической и гериатрической практике.

Исследования, изложенные в данной диссертационной работе, связаны с реализацией национального проекта «Здоровье народа», который в качестве одного из направлений предполагает повышение эффективности научных исследований по разработке и освоению новых отечественных лекарственных средств, в том числе на основе использования отходов других производств.

Цель и задачи исследования:

Целью диссертационной работы являлась разработка способов оценки качества и стандартизации субстанции маточных личинок пчел и таблеток тонизирующего и антигипоксического действия на их основе.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать физические, химические и физико-химические характеристики сырья, их лабильность и взаимосвязь изменений, происходящих при хранении;

- провести скрининг методик качественного и количественного определения биологически-активных веществ в изучаемой субстанции с целью стандартизации;

- установить сроки годности сырья с учетом выбранных показателей;

- разработать методики идентификации и количественного определения сырья и лекарственной формы на его основе по соединениям, имеющим взаимосвязь с его фармакологической активностью и провести их валидационную оценку;

- изучить наличие антигипоксической и стимулирующей деятельность ЦНС активности субстанций маточных личинок пчел (СМЛ), спрогнозированной на основе данных о химическом составе сырья;

- разработать оптимальную композицию ингредиентов с целью стабилизации СМЛ, снижения себестоимости и обеспечения требуемых технологических свойств для получения гранулята и таблеток;

- провести фармацевтический анализ таблеток, изучить их стабильность при хранении и сравнить их фармакологическую активность с активностью таблеток апилака.

Научная новизна работы.

Установлены показатели качества (кислотное число, йодное число, число омыления, количество аминокислот в пересчете на кислоту глутаминовую, количество общего азота) на основе которых изучена стабильность и определены сроки годности субстанций и лекарственной формы на ее основе.

Предложена методика ТСХ и оптимальные условия анализа подлинности сырья и его лекарственной формы, что позволило надежно идентифицировать субстанцию маточных личинок пчел в кратчайшие сроки и отличать ее от других видов пчелиного расплода.

Разработана унифицированная методика количественной оценки сырья и лекарственной формы на его основе по сумме аминокислот в пересчете на кислоту глутаминовую, антигипоксическое действие которой экспериментально доказано.

Комплексное физико-химическое и фармакологическое изучение свойств субстанции маточных личинок пчел и таблеток на его основе позволило доказать антигипоксическое и стимулирующее активность ЦНС действие исходного сырья и научно обосновать показатели качества нового препарата на его основе.Доказано наличие тонизирующего и антигипоксического действия СМЛ у здоровых экспериментальных животных и на фоне свинцовой интоксикации.

Доказана эквивалентность антигипоксического и стимулирующего активность ЦНС действия предлагаемых таблеток и таблеток апилака.

Практическая значимость работы

Для анализа препарата антигипоксического действия и исходного сырья предложены методики, отличающиеся специфичностью, чувствительностью, не требующие наличия дорогостоящих реактивов и оборудования, удобные для использования в условиях заготовки и производства.

Оптимизирован состав адсорбента путем использования кальция карбоната основного, который обеспечивает стабильность сырья, позволяет снизить себестоимость получаемых на его основе таблеток, в отличие от состава для адсорбции на основе лактозы и пектина, предложенного ранее, и позволяет закладывать разовую терапевтическую дозу в одну таблетку.

Разработанный препарат не уступает по фармакологической активности прототипу - таблеткам апилака, при этом ожидаемая себестоимость его ниже за счет использования отходного сырья и уменьшенного количества вспомогательных веществ.

Результаты проведенных исследований по разработке стабилизированного гомогената маточных личинок пчел (ГМЛ) могут быть использованы в учебно-методическом процессе в рамках темы: «Иммобилизация ферментов».

Внедрение результатов исследования в практику

В соавторстве с другими исследователями оформлены и утверждены ТУ №9882-040-01962942-2001 на субстанции маточных личинок пчел «Апилармил» Ставропольским центром метрологии и стандартизации. Материалы ТУ приняты к внедрению на предприятии ЗАО «Вифитех», г. Москва.

По результатам диссертационной работы разработано информационное письмо, утвержденное проблемной комиссией ПятГФА 25 мая 2007 г. (протокол №13). Материалы информационного письма приняты к внедрению на предприятии ЗАО «Вифитех», г. Москва.

Основные положения, выносимые на защиту:

- обоснование выбора качественных и количественных характеристик для стандартизации субстанции маточных личинок пчел и таблеток антигипоксического действия на их основе;

- результаты разработки методик идентификации субстанции маточных личинок пчел и таблеток на ее основе методом тонкослойной хроматографии и их количественного анализа методом УФ-спектрофотометрии;

- результаты разработки составов адсорбентов для стабилизации субстанций маточных личинок пчел;

- результаты исследования антигипоксического и стимулирующего деятельность ЦНС действия субстанции маточных личинок пчел и таблеток на их основе в сравнении с таблетками апилака;

- результаты изучения стабильности при хранении исследуемого сырья и полученных на его основе таблеток.

Апробация и публикация результатов исследования:

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 55 -58-й региональных научно-практических конференциях по фармации, фармакологии и подготовке фармацевтических кадров (г. Пятигорск). По исследуемой теме опубликовано 13 научных работ, в т.ч. 6 - моноавторских, из которых 1 опубликована в журнале, рецензируемом ВАК.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа (номер государственной регистрации 01.990011965) выполнена в соответствии с соглашением о взаимодействии по созданию научно-технической продукции и использованию результатов научно-технической

деятельности между Федеральным агентством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава», номер 06/1049.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 179 страницах машинописного текста, содержит 57 таблиц, 8 рисунков, состоит из "Введения", "Обзора литературы", 3 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 171 источник, в том числе 11 иностранных и приложения.

В первой главе обзора литературы приведены данные по изучению химического состава, фармакологической активности и стандартизации маточного молочка, маточных и трутневых личинок и препаратов на их основе.

Во второй главе описаны материалы и методы, на основе которых выполнена данная работа.

В третьей главе изложены результаты скрининг-изучения методик анализа основных биологически-активных веществ сырья с целью стандартизации субстанций маточных личинок пчел и таблеток на их основе, обоснованы сроки годности сырья с учетом ранее не исследованных показателей.

В четвертой главе приведена оценка активности субстанций маточных личинок пчел в сравнении с таблетками апилака при гемической, гистотоксической и гиперкапнической моделях гипоксии. Изложены результаты биохимического изучения некоторых аспектов механизма антигипоксического и антитоксического действия исследуемой субстанции в сравнении с таблетками апилака у экспериментальных животных в норме и при свинцовой интоксикации.

Пятая глава посвящена изучению возможности стабилизации "гомогената маточных личинок пчел, а также стандартизации и оценке фармакологической активности таблеток, полученных на основе стабилизированного сырья.

Приложение включает технические условия на субстанцию маточных личинок пчел «Апилармил», информационное письмо «Использование отходов производства маточного молочка для получения препаратов коррекции сниженной работоспособности» и акты их внедрения.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Разработка и совершенствование способов стандартизации лекарственного вещества требует планомерного и систематического изучения комплекса информации о его физических и химических свойствах и их изменении при хранении. Информация нужна для определения параметров, характеризующих качество лекарственного вещества и отбора необходимых способов испытаний.

Как и любой другой объект природного происхождения, маточные личинки пчел содержат в своем составе комплекс фармакологически-активных соединений с различными химическими свойствами. Поэтому выбор методик исследования, а также показателей, как можно более объективно отражающих качественные и количественные характеристики субстанций маточных личинок пчел, представлял собой непростую исследовательскую задачу.

Для реализации поставленных задач изучали возможность применения для стандартизации гомогената и лиофилизата маточных личинок пчел (ГМЛ и ЛМЛ) методик исследования биологически-активных веществ, используемых в фармации, экспериментальной биохимии животных и растений, клинической биохимии.

Разрабатываемые методики стандартизации должны отвечать таким критериям, как точность, чувствительность, специфичность, экспрессность, возможность проводить анализ лекарственных форм с малой дозировкой в присутствии вспомогательных веществ, использование доступных реактивов и оборудования. Для объективной оценки качества маточных личинок пчел показатели также должны быть выбраны с учетом процессов взаимопревращений биологически активных компонентов при хранении.

1. Разработка методологического подхода к стандартизации субстанций маточных личинок пчел

Методики, регламентированные для оценки качества маточного молочка - объекта, сходного с ГМЛ по своим физико-химическим свойствам (ГОСТ 28888-90 «Пчелиное маточное молочко»), можно условно подразделить на две категории.

Первая категория включает показатели, описывающие физико-химические свойства маточного молочка и позволяющие судить о наличии и сохранности его фармакологической активности лишь косвенно, а именно: органолептические свойства; наличие механических примесей; массовая доля сухих веществ; массовая доля воска; показатель окисляемости; флюоресценция водного раствора; значение рН среды 1% водного раствора; массовая доля сырого протеина; массовая доля восстанавливающих Сахаров; антибактериальная активность, обсемененность продукта непатогенными микроорганизмами.

Вторая категория включает показатели, которые обеспечивают достоверный контроль подлинности и фармакологической активности маточного молочка. К ним относятся:

- наличие деценовых кислот (не менее 31%);

- контроль массы тела выращенных на маточном молочке в искусственных условиях личинок пчел.

Для стандартизации СМЛ, соответствующей современным требованиям фармацевтического анализа, следовало выявить их специфические особенности.

Выбор методик стандартизации субстанции маточных личинок пчел

Исследованию подвергали сырье, отобранное в период с 1999 по 2006 гг.

Изучены показатели качества сырья, рекомендуемые ГФ XI - массовая доля сухих веществ, рН среды водного раствора, массовая доля общей золы, количество «сырого протеина», показатель окисляемости. В отличие от ранее выполненных исследований для характеристики данного сырья, богатого липидами и ненасыщенными соединениями, определено йодное число, кислотное число и число омыления.

Для определения подлинности СМЛ предыдущими авторами было предложено использовать качественные реакции на белки (с биуретовым рактивом), восстанавливающие сахара (с реактивом Фелинга) и биоптерин (флуоресценция водного раствора). Биуретовый реактив является общим реагентом на белки, представители которых, как например, инсулин и глюкагон, могут обладать противоположным фармакологическое действием. Углеводы являются обширным классом соединений, а давать флюоресценцию способен ряд органических соединений различной химической структуры.

Согласно общепринятой в мире рекомендации по производству лекарств (правила GMP), стандартизацию необходимо проводить по соединениям, обеспечивающим фармакологический эффект разрабатываемого препарата. Поскольку фармакологическое действие СМЛ связано с наличием комплекса биологически-активных веществ, при стандартизации сырья необходимо как можно шире охватить этот комплекс.

Подлинность СМЛ определяли качественной реакцией на альфа-аминокислоты с нингидриновым реактивом и методом хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ).

Метод ТСХ широко используется в анализе лекарственного сырья природного происхождения (например Viburnum opulus или Crataegus sp.) и препаратов на его основе.

Учитывая сложность липидного состава СМЛ для идентификации использовали липидную фракцию сырья, полученную по методу Фолча. Анализ фракции СМЛ проводили в найденных оптимальных условиях: хроматографические пластинки "Silufol UV-254", хроматографическая система «гексан - диэтиловый эфир - концентрированная кислота уксусная (73:25:2)». Хроматографирование экстрактов проводили при температуре 20°С и относительной влажности воздуха 40%. Высота пробега фронта растворителя составляла 120 мм. В качестве «свидетелей» использовали

растворы хроматографических стандартов олеиновой и стеариновой кислот, трио-леата (ненасыщенные триглицериды), холестерина в аналогичном растворителе.

Полученные хроматограммы детектировали в УФ-светс, затем опрыскивали раствором кислоты фосфорно-молибденовой 10% и проявляли в нагретом до 80°С сушильном шкафу. Наблюдали хроматографические пятна, характерные для доброкачественного сырья маточных личинок пчел, представленные на рисунках 1 и 2.

мл ТЛ РЛ мм

V—^ \ —^

\ « / ч _ ✓ V В 1 __^

сэ сз Г—' - Г>4

СГ2 2 ^- г.........^ -ч

——Э1 1 V.----! 1

1 - фосфолипиды 4-холестерин 6 - воски насыщенные

2 - гликолипиды 5 - неидентифицированные соединения

3 - эфиры холестерина 7 - воски ненасыщенные

Рисунок 1 - Результаты детекции компонентов липидной фракции субстанций маточных личинок (МЛ), трутневых личинок (ТЛ), личинок рабочих пчел (РЛ) и маточного молочка (ММ) методом тонкослойпой хроматографии в УФ-свете.

воск.оле»г стеарат мл тл РЛ ■ ММ хопестеоин" триолеат

А б и о 10 у— О & 3 !8 О 10 и/ 4 3 2 г: Г} о 10 0 с£р 4 о © !9 \ И 0 О«

и1

1 - фосфолипиды 7 - насыщенные триглицериды

2 - гликолипиды 8 - ненасыщенные жирные кислоты 3,5 - эфиры холестерина 9 - насыщенные жирные кислоты

4 - холестерин 10 - ненасыщенные воски

б - ненасыщенные триглицериды 11 - линия «фронта»

Рисунок 2 - Общий вид хроматограммы после проявления раствором фосфорномолибденовой кислоты

На рисунках 1, 2 также представлены данные о характерных отличиях между экстрактами исследуемого сырья, других видов расплода и маточного молочка.

Полученные значения К[хроматографических пятен, детектируемых в исследуемых объектах в УФ-свете и с помощью раствора фосфорно-молибденовой кислоты, статистически обработаны и представлены в таблице 1:

п

Таблица 1 - Значения Ш хроматографических пятен липидной фракции маточных личинок пчел

Класс соединений, минимальный и максимальный М Способ детекции

Фосфодипиды- старт 0,01 -0,02 Флуоресценция фиолетового цвета (отличие от других видов расплода) Фосфорно-молибденовая кислота

Гликолипиды 0,037-0,038 Фосфорно-молибденовая кислота

Холестерин 0,16-0,18 Флуоресценция Фосфорно-молибденовая кислота

Триглицериды (насыщенные и ненасыщенные) 0,35-0,38 Фосфорно-молибденовая кислота

Жирные кислоты насыщенные 0,58-0,61 Фосфорно-молибденовая кислота

Жирные кислоты ненасыщенные 0,64-0,70 Фосфорно-молибденовая кислота

Воски насыщенные 0,91-0,92 Флуоресценция Фосфорно-молибденовая кислота

Воски ненасыщенные 0,94-0,97 Флуоресценция фиолетового цвета (отличие от других видов расплода) Фосфорно-молибденовая кислота

Доброкачественное сырье СМЛ в данных условиях анализа дает полную хрома-тографическую картину, аналогичную представленной на рисунках 1 и 2. Маточные личинки пчел отличаются от личинок трутневых и рабочих пчел по цвету флуоресценции пятен на линии «старта» и «финиша». Примесь трутневых личинок возможно обнаружить по появлению флуоресцирующего пятна «5» (см. рис. 1), принадлежащего неидентифицированным соединениям. У личинок рабочих пчел при детекции в УФ-свете флуоресцирующих зон адсорбции меньше, чем у остальных исследованных объектов и наблюдается различие в цвете флуоресценции

Одной из технологических характеристик ГМЛ, имеющей существенное значение при дозировании и адсорбции исследуемых субстанций, является массовая доля сухого вещества. Массовая доля влаги, определенная методом высушивания, составила 76,10 - 77,50%, что в пересчете на сухое вещество составляет 22,50-23,90%. Для экспресс-анализа массовой доли сухих веществ в исследуемом объекте в условиях заготовки разработана рефрактометрическая методика. Установлено, что в пределах естественного содержания сухих веществ в ГМЛ (17,8 - 25,0%) зависи-

12

мость показателя преломления субстанций от массовой доли влаги с коэффициентом корреляции 11=0,98 подчиняется уравнению линейной регрессии. Зависимость показателя преломления от массовой доли сухих веществ при 20°С выражается уравнением:

п 20г)= IV х ^0,00203; +1,32434

где - массовая доля сухих веществ в образце, %,

п20о - показатель преломления при температуре окружающей среды +20°С.

Использованная методика характеризуется удовлетворительной величиной относительной ошибки определения.

Для анализа массовой доли сухих веществ при температуре окружающей среды отличающейся от «+20°С» установлены величины температурных поправок.

Лабильным веществом, присутствующим в СМЛ, по количеству которого возможно судить об их доброкачественности и соблюдении условий хранения, является восстанавливающая гексоза - глюкоза. Количество восстанавливающих Сахаров до и после гидролиза в СМЛ, определенное йодиметрическим, спектрофотометрическим, фотоколориметрическим методами, составило от 10 до 23%. В связи с разноречивыми результатами для объективного определения количества глюкозы в сырье использован метод, основанный на работе глюкозооксидазы - фермента, обладающего абсолютной субстратной специфичностью по отношению к глюкозе. В результате исследований установлено, что содержание глюкозы в сырье в среднем составляет 2,56%, что достоверно ниже результатов, полученных другими методами и результатов, приведенных в литературных источниках. Глюкозооксидазный метод был использован в дальнейшем для контроля соблюдения условий хранения сырья.

Из данных литературы известно, что исследуемое сырье богато белком и аминокислотами, причем глутаминовая и аспарагиновая кислоты представлены в наибольшем количестве, как во фракции свободных аминокислот, так и во фракции аминокислот, полученной после гидролиза.

Известно, что кислота глутаминовая при введении в организм с высокой скоростью проникает схвозь гистогематические барьеры, повышает устойчивость к гипоксии, обеспечивая поддержку энергетического обмена нервной ткани. При декар-боксилировании глутаминовой кислоты образуется ГАМК, которая проявляет ней-ротропное действие. Конечным продуктом окисления глутамата в митохондриях является аспарагиновая кислота, исполняющая роль возбуждающего нейромедиатора. Поэтому, в отличие от ранее проведенных исследований, было предложено прово-

13

дить количественное определение сырья по сумме аминокислот в пересчете на кислоту глутаминовую - соединению-маркеру, фармакологическая активность которого доказана

В результате эксперимента установлено, что максимум поглощения продуктов реакции CMJI с нингидрином совпадает с максимумом поглощения продуктов реакции PCO кислоты глутаминовой с нингидрином (Х=570±2 нм) в водных растворах..

Зависимость оптической плотности растворов кислоты глутаминовой от концентрации является линейной в интервале концентраций 0,001 - 0,010 мг/мл. Результаты экспериментов показали, что предложенная методика обладает удовлетворительной прецизионностью, точностью и специфичностью, коэффициент корреляции аппроксимированной прямой составил 0,9997, что позволяет использовать данную методику для количественного определения CMJI.

Исследование процессов, происходящих при хранении и обоснование сроков годности субстанции маточных личинок пчел.

Предыдущими исследователями предлагалось проводить количественное определение CMJI по количеству липидов, фруктозы, общего азота и водорастворимого белка. Было показано, что из вышеперечисленных показателей при хранении изменяется только фруктоза. Однако рядом авторов были зафиксированы изменения в пептидном составе исследуемого объекта с течением времени, которое не удалось отследить при использовании определения общего азота и водорастворимого белка. Возможно, что использованные методики не охватили и другие показатели, описывающие сохранность фармакологической активности сырья. Анализ CMJI в процессе хранения по исследуемым показателям выявил лабильные критерии, взаимосвязанные с фармакологической активностью сырья, и показал, что качественные и количественные изменения в исследуемом объекте взаимосвязаны.

Результаты исследования лабильных показателей качества CMJI в процессе хранения при температуре от «-6° С» до «-10° С» (средние данные) представлены в таблице 2.

Таблица 2

Динамика физико-химических показателей субстанций маточных личинок

пчел при хранении

Показатель Свежий после 3-х месяцев хранения после 6-ти месяцев хранения после 9-ти месяцев хранения после 12-ти месяцев хранения после 18-ти месяцев хранения

Йодное число, г. 45,52 42,50 33,16 27,23 22,34 14,89

и

Продолжение таблицы 2

Кислотное число, мг. 109,93 113,70 116,74 122,75 124,30 132,69

Сумма аминокислот, % 15,34 14,80 14,55 12,45 10,29 9,96

Общий азот, % 43,40 45,49 46,08 47,94 51,01 53,68

рН водного раствора Незначительное снижение

Общий фосфор, % Без изменений

Массовая доля влаги, % 76,88 77,89 79,00 80,14 81,43 82,98

Как видно из данных таблицы, при хранении происходит уменьшение количества непредельных соединений и аминокислот, увеличение количества соединений, обладающих кислотными свойствами, повышение массовой доли влаги, снижение значения рН среды 1% водного раствора. Сумма аминокислот может уменьшаться вследствие их дезаминирования. Продуктом дезаминирования аминокислот служат соответствующие жирные кислоты, теоретический прогноз повышения количества которых согласуется с экспериментальными данными по изменению показателей «кислотное число» и «рН среды».

Азотсодержащие соединения в процессе метаболизма образуют аммиак, который, являясь основанием, связывается биологической буферной системой СМЛ. Это согласуется с фактом, что, несмотря на увеличение кислотного числа в сырье при хранении, и увеличении массовой доли общего азота, значение рН сырья на протяжении хранения изменялось незначительно.

Полученные данные согласовываются с теоретическими положениями о путях биодеградации органических соединений, и доказывают взаимосвязь изменений показателей качества СМЛ. Наиболее лабильным показателем является значение йодного числа субстанций маточных личинок пчел, характеризующего количество ненасыщенных соединений. В связи с этим определение йодного числа было включено в число методик для стандартизации исследуемого сырья.

Предыдущими исследователями срок годности ГМЛ был определен длительностью 1 год при хранении в условиях отрицательной температуры. С использованием новых показателей срок годности нестабилизированного сырья оказался меньше и составил 6 месяцев (контроль изменения величины йодного числа при сохранении количества аминокислот на нормируемом уровне).

Таким образов в ходе проведенных исследований для стандартизации СМЛ были выбраны показатели, объективно характеризующие доброкачественность и, как следствие, сохранность его фармакологической активности (см. таблицу 3). Выбранные методики учитывают показатели, связанные с фармакологической активностью сырья, применимы к условиям производства (малая трудоемкость, использование доступных реактивов и оборудования, малые затраты времени на проведение анализа).

Таблица 3

Показатели качества субстанций маточных личинок пчел

Показатель Нормы качества

гмл ЛМЛ

Описание Однородная жидкость кремового цвета, сметанообразной консистенции, со специфическим запахом, кислого вкуса Легкий, очень гигроскопичный порошок кремового цвета, со специфическим запахом

Посторонний запах Отсутствует Отсутствует

Растворимость Мало растворимы в холодной воде, умеренно растворимы в горячей воде, растворимы в 40% спирте и коагулируют в этиловом спирте 96% концентрации. Практически нерастворимы в эфире и хлороформе.

Подлинность реакция на а-аминогруппу с нингидрином Подлинность методом ТСХлипидной фракции субстанций Образование комплекса Руэмана сине-фиолетового цвета УФ-детекция Флуоресценция зоны адсорбции с Кг 0,01 фиолетового цвета(старт) Флуоресценция зоны адсорбции с Яг 0,16-0,18 голубого цвета (холестерин) Флуоресценция зоны адсорбции с Яг 0,91 - 0,92 голубого цвета Флуоресценция зоны адсорбции с 0,94 - 0,97 фиолетового цвета (воски ненасыщенные) Проявление раствором фосфорно-молибденовой кислоты - зоны адсорбции:фосфолипиды с 0,01-0,02 холестерин с Л/- 0,16-0,18 насыщенные и ненасыщенные триглицериды с 0,35-0,38 насыщенные жирные кислоты с Яг 0,58-0,61 ненасыщенные жирные кислоты с Яг 0,64-0,70 насыщенные воски с 0,91-0,92 ненасыщенные воски с 0,94-0,97

Продолжение таблицы 3

Значение рН среды 1% водного раствора (ГМЛ) и 0,3% раствора (ЛМЛ) 4,5 - 5,5 4,5 - 5,5

Массовая доля сухих веществ, % Не менее 18% Не менее 95%

Массовая доля общей золы (в пересчете на сухое вещество) Не более 5% Не более 5%

Йодное число (в пересчете на сухое вещество) 30-45 г йода 100 г субстанции

Количество глюкозы От 2% до 3,2% От 2% до 3,2%

Количественное определение свободных аминокислот в пересчете на кислоту глутамино-вую, % От 12,0% до19,0% От 12,0% до 19,0%

2. Изучение фармакологического действия субстанции маточных личинок пчел

Исходя из данных литературы о химическом составе и фармакологическом действии апилака, прогнозировали наличие антигипоксического и стимулирующего активность центральной нервной системы действия ГМЛ.

Гистотоксическую, гемическую и гиперкапническую гипоксии на фоне двухнедельного перорального приема ГМЛ моделировали введением животным подкожно растворов натрия нитропруссида, натрия нитрита и помещением в термокамеру. При этом ГМЛ в сравнении с апилаком показал достоверную эффективность при гисто-токсической и гемической моделях гипоксии (рисунок 2).

1 2 1 - гипоксическая гипоксия с гиперкапнией 3 - гемическая гипоксия

О тггакшыс

■ физиол раствор

О ГМЛ, 50 мг/кг

□ апилак, 50 мг/кг 3

2 - гистотоксическая гипоксия

Рисунок 2 - Сравнительное изучение активности гомогената маточных личинок пчел и таблеток апилака при различных моделях гипоксии

Комментируя рисунок 2, следует отметить высокие результаты, полученные в опытах с гистотоксической и гемической гипоксией, причем в последнем случае ГМЛ не уступал по своему действию маточному молочку. Учитывая это, а также тот факт, что среди применяющихся в настоящее время антигипоксантов немногие обладают эффективностью при гемической гипоксии, было предложено исследовать действие ГМЛ у животных с гемической гипоксией и у здоровых животных.

Сравнительная оценка влияния исследуемых веществ, а также предлагаемых таблеток на основе ГМЛ на гемические показатели и характеристики энергетического обмена, которые характеризуют обеспечение клеток энергией и кислородом, у здоровых экспериментальных животных проиллюстрировано на рисунке 3 (приведено в % по отношению к интактным животным).

НИнгактные

В Фго. раствор

□ ГМЛ, 50 иг/кг

□ Таблетки ГМЛ. мг/кг

■ Таблетки агашак иг/кг

1. содержание гемоглобина в крови

5. количество АТФ в ткани печени

2. окислительное фосфорилирование п ткани 6. количество сульфгидрильных групп в сы-

головного мозга

воротке крови

3. окислительное фосфорилирование в ткани 7. количество молочной кислоты в сыворот-печени ке крови

4. количество АТФ в ткани головного мозга

Рисунок 3 - Влияние субстанции маточных личинок пчел, таблеток на снове ГМЛ и «Апилака» на биохимические показатели у здоровых крыс

Вышеописанные клинико-биохимические показатели определяли также при ге-мической гипоксии экспериментальных животных, создаваемой введением ацетата свинца. Полученные результаты представлены на рисунке 4.

1. - содержание гемоглобина в крови 5. - количество АТФ в ткани головного

мозга

2. - количество эритроцитов в крови 6. - количество АТФ в ткани печени

3. - окислительное фосфорилирование в 7. - количество сульфгидрильных групп в

ткани головного мозга сыворотке крови

4. - окислительное фосфорилирование в 8. - количество молочной кислоты в сы-

ткани печени воротке крови

Рисунок 4- Влияние гомогената маточных личинок пчел, таблеток на основе ГМЛ и «Апилака» на биохимические показатели у крыс с экспериментальной патологией

Как следует из рисунка 4, у контрольной группы животных количество гемоглобина и эритроцитов, сульфгидрильных групп и АТФ, интенсивность окислительного фосфорилирования оказались резко сниженными, а количество молочной кислоты - повышенным. Применение ГМЛ и таблеток на его основе показало достоверную тенденцию к нормализации показателей наравне с «Апилаком.»

Активирование процессов биологического окисления под влиянием ГМЛ сказалось положительно на общем состоянии животных, о чем свидетельствовала динамика их массы тела. ГМЛ и таблетки на его основе наиболее стабильно поддерживали массу тела животных в ходе эксперимента, в то время как «Апилак» проявил свой эффект только к 14 дню.

3. Выбор оптимального состава адсорбента для стабилизации гомогената маточных личинок пчел и стандартизация таблеток «Гиполарм» на его основе

Наличие фармакологического эффекта ГМЛ, особенности физико-химических свойств, позволяют его использовать его в виде твердой дозированной лекарственной формы - сублингвальных таблеток.

Основной сложностью при стабилизации ГМЛ и последующем получении гра-нулятов и таблеток на его основе является высокая массовая доля влаги. Данный факт (по данньм предыдущих авторов) позволял закладывать в таблетку дозу действующего вещества, равную половине разовой терапевтической дозы.

ГФ XI в качестве basis при изготовлении таблеток регламентирует использовать крахмал, пектин, кальция карбонат основной, магния карбонат, аэросил, ПВП, лактозу, сахарозу, фруктозу и пр. Для стабилизации ГМЛ было приготовлено 26 комбинаций этих веществ в различных соотношениях. Для оценки поглощающей способности наполнителей прибавляли ГМЛ к приготовленным составам для адсорбции массой по 10,0 г. quantum satis до агрегатного состояния, обеспечивающего возможность изготовления гранулята. Пластичность определяли методом органолепти-ческой пробы - образования массы, не рассыпающейся при комковании и не прилипающей к рукам.

Далее под руководством доц. кафедры фармацевтической технологии Пятигорской ГФА Шевченко A.M. были выбраны составы стабилизированного ГМЛ, пригодные для получения сублингвальных таблеток.

Наилучшими технологическими свойствами обладал стабилизированный ГМЛ состава: «ГМЛ : пектин : сахароза : лактоза : кальция карбонат основной» в соотношениях «34,2 : 10 : 20 : 40 : 30» на основе которого были изготовлены экспериментальные образцы таблеток. Применение кальция карбоната основного в составе адсорбентов дало возможность заложить в одну таблетку разовую терапевтическую дозу ГМЛ уменьшить количество дорогостоящей лактозы в составе таблетки по отношению к сухой массе активных веществ.

Стандартизацию таблеток «Гиполарм» проводили по следующим показателям: внешний вид, распадаемость, истираемость, отклонения в средней массе одной таблетки, подлинность, количественное определение, микробиологическая чистота, стабильность. Для определения подлинности таблеток использована методика, аналогичная использованной при определении подлинности сырья.

Так как при хранении сырья изменение испытанных показателей качества (в частности, йодного числа субстанций и количества свободных аминокислот в пересчете на кислоту глутаминовую) оказалось взаимосвязанным, для количественного определения таблеток использована методика определения суммы свободных ами-

20

нокислот в пересчете на кислоту глутаминовую по реакции с нингидрином. В данной реакции вспомогательные вещества таблеток не мешают определению, что подтверждено контрольными опытами.

Показатели для стандартизации таблеток «Гиполарм» представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты стандартизации таблеток «Гиполарм»

Показатель Нормы показателя

Описание Таблетки диаметром 13 мм кремового цвета, в зависимости от использованного ароматизатора обладают соответствующим ароматом, на изломе однородны, излом мелкозернистый

Средняя масса таблеток и отклонения в массе отдельных таблеток Средняя масса таблетки 1,058 ± 0,043 г, что соответствует (±5%) требованиям ГФ XI

Определение распа-даемости таблеток Среднее время распадаемости полученных таблеток составило 8,0 ± 2,3 мин. (соответствует ГФ XI).

Прочность на истирание Средняя масса разрушенных таблеток не превышала 1,5% что соответствует требованиям ГФ XI.

Подлинность качественная реакция на альфа-аминогруппу Образование комплекса Руэмана сине-фиолетового цвета

Подлинность методом ТСХли-пидной фракции субстанций УФ-детекция Флуоресценция зоны адсорбции с 0,01 - 0,02 фиолетового цвета (старт) Флуоресценция зоны адсорбции с Яг 0,160,18 голубого цвета (холестерин) Флуоресценция зоны адсорбции с Яг 0,91 -0,92 голубого цвета (насыщенные воски) Флуоресценция зоны адсорбции с Яг 0,94 - 0,97 фиолетового цвета (воски ненасыщенные)

Проявление раствором фосфорно-молибденовой кислоты фосфолипидыс Лг 0,01-0,02

Продолжение таблицы 4

холестерин с Кг 0,16-0,18 насыщенные и ненасыщенные триглицериды с 0,35-0,38 насыщенные жирные кислоты с Яг 0,5 8-0,61 ненасыщенные жирные кислоты с И* 0,64 - 0,70 насыщенные воски с 0,91 -0,92 ненасыщенные воски с И* 0,94-0,97

Сумма аминокислот в таблетках спектрофо-тометрическим методом в пересчете на к-ту глу-таминовую (п=7) От 0,00815 до 0,01103в одной таблетке

При хранении полученных таблеток при комнатной температуре уже через год проявлялось изменение их внешнего вида и распадаемости. Поэтому проводили испытания таблеток при хранении в течение 2 лет в естественных условиях при температуре не выше +10°С. Таблетки оценивали по следующим показателям: внешний вид, запах, распадаемость, подлинность, количественное определение суммы аминокислот. Полученные данные свидетельствуют, что за 2 года хранения таблеток в естественных условиях при температуре не выше +10°С содержание аминокислот оказалось не менее 0,00815 г на 1 таблетку. По остальным показателям все серии таблеггок показали удовлетворительные результаты.

После двух лет хранения происходило изменение органолептических свойств таблеток. Серии таблеток по этим показателям отбраковывали, не проводя количественного определения. Учитывая полученные результаты, срок хранения таблеток следует ограничить двумя годами.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. На основе скрининг-изучения показателей качества гомогената и лиофили-зата маточных личинок пчел и взаимосвязи между ними разработан новый подход к стандартизации сырья с использованием физических, физико-химических и биохимических методов анализа.

2. Разработана методика определения массовой доли сухих веществ в гомоге-нате маточных личинок пчел методом рефрактометрии, отличающаяся от ранее предложенного метода высушивания возможностью проведения анализа в «полевых условиях», простотой исполнения, экспрессностью.

3. Для определения подлинности гомогената и лиофилизата маточных личинок пчел разработана методика с применением хроматографии в тонком слое сорбента, позволяющая идентифицировать вид исследуемого сырья и выявить возможные фальсификации.

4. Установлены числовые показатели гомогената и лиофилизата маточных личинок пчел: - кислотное число, число омыления, йодное число. Для стандартизации сырья и определения его стабильности предложено использовать показатель «йодное число» (согласно ГФ XI), определение количества глюкозы (глюкозооксидазным методом) и аминокислот в пересчете на кислоту глутаминовую. Срок годности нестабилизирован-ного сырья при температуре хранения от «-10°С» до «-6°С» составил 6 месяцев.

5. Впервые предложена методика спектрофотометрического количественного определения субстанций маточных личинок пчел по сумме аминокислот в пересчете на кислоту глутаминовую.

6. Разработаны технические условия ТУ №9882-040-01962942-2001 на гомо-генат маточных личинок пчел «Апилармил», утвержденные Ставропольским центром метрологии и стандартизации.

7. Доказано, что гомогенат маточных личинок пчел оказывает стимулирующее воздействие на активность ЦНС подопытных животных и обладает антипшоксической активностью, что подтверждено на различных моделях гипоксии. В условиях свинцовой интоксикации ГМЛ не уступает по своей эффективности препарату - прототипу, эффективнее стабилизирует массу тела экспериментальных животных, обладает при этом меньшей себестоимостью.

8. Установлено нормализующее влияние ГМЛ на исследованные клинико-биохимические показатели у здоровых экспериментальных животных, и у крыс со свинцовой интоксикацией, что свидетельствует об антитоксическом действии исследуемого объекта, позволяет рекомендовать его как основу для препаратов, повышающих устойчивость тканей к гипоксии, улучшающих работоспособность нервной системы и физическую выносливость, способствующих концентрации внимания, в том числе для нужд оборонной промышленности.

9. Предложен оптимальный состав стабилизатора гомогената маточных личинок пчел на основе кальция карбоната основного для получения таблеток надлежащего качества.

10. Разработаны методы стандартизации таблеток «Гиполарм» на основе гомогената маточных личинок пчел, определен их срок годности, который составил 2 года при хранении в условиях температуры не выше +10°С».

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Красовская C.B., Лазарян Д.С. Пчелиный расплод как новый источник получения лечебно-профилактических средств // Актуальные проблемы создания лекарственных препаратов природного происхождения (3; 1999; СПб.): материалы... - СПб, 1999.-С. 278-281.

2. Красовская C.B., Лазарян Д.С., Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б., Клишина И.И., Гончарова Л.В. Исследование физико-химических свойств и химического состава маточных личинок пчел // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (55; 2000; Пятигорск): материалы... - Пятигорск, 2000. - С. 110-111.

23

3. Красовская C.B., Лазарян Д.С., Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б. Исследование состава жирных кислот и свободной органической фракции маточного расплода пчел // Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности: материалы междунар. науч. конф. 27-29 июня 2000 г. - Томск, 2000. - С. 43-44.

4. Красовская C.B., Лазарян Д.С., Сотникова Е.М., Криков М.В., Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б. Количественное определение углеводов в гомогена-те расплода пчел // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (56; 2001; Пятигорск): материалы... - Пятигорск, 2001. - С. 108-109.

5. Красовская CJB., Лазарян Д.С. Исследование липидного состава маточного расплода методом тонкослойной хроматографии. // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: материалы Рос. конф. молодых ученых 24-28 алр. 2001 г. - М., 2001. С.248.

6. Красовская C.B. Изучение липидного состава маточных личинок пчел методом тонкослойной хроматографии // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (57; 2002; Пятигорск): материалы... - Пятигорск, 2002. - С.94-95.

7. Красовская C.B. Лазарян Д.С., Сотникова Е.М., Василенко Ю.К. Новый продукт пчеловодства как источник получения лекарственных и лечебно-профилактических средств // Новые технологии и комплексное использование природных ресурсов алтайского края для производства биологически-активных добавок: материалы науч. практ. конф. 17-20 июня 2003 г. - Бийск, 2003. - С.162-168.

8. Красовская C.B. Влияние маточного расплода на процессы биологического окисления в головном мозге // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2003. - Вып. 58. - С.315-316.

9. Красовская C.B. Сравнительное изучение антигипоксической активности маточных личинок пчел и маточного молочка у животных со свинцовой интоксикацией 11 «Фитофарм»: 9-й интернациональный съезд и конференция молодых ученых (9; 2005; СПб): материалы.. .СПб, 2005. - С. - С. 87-90.

10. Красовская C.B., Шевченко. А.М., Лазарян Д.С., Василенко Ю.К. Разработка таблеток «Гиполарм» на основе гомогената маточных личинок пчел и их стандартизация // «Фитофарм»: 9-й интернациональный съезд и конференция молодых ученых (9; 2005; СПб): материалы.. .СПб, 2005. - С. - С. 759-761.

И. Красовская C.B. Изучение эффективности маточных личинок пчел в сравнении с маточным молочком у животных с гемической гипоксией // Вестник Воронежского государственного университета. Серия химия, биология, фармация. - 2006. - №2, С.291-293.

12. Красовская C.B. Маточные личинки пчел как средство для лечения пониженной работоспособности // Научное обозрение. - 2007. - № 3. - С. 16 -18.

13. Красовская C.B. Стандартизация субстанций маточных личинок и таблеток на их основе // Научное обозрение. - 2007 - №6, стр.19-22.

Подписано в печать 28.10.09. Объем / ,5" п.л. Заказ № 13Ц

Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО КПСФ «Спецстройсервис-92» Отдел оперативной полиграфии 101000, Москва, ул. Мясницкая, 35, стр.2.