Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Исследование взаимодействия рентгеноконтрастных средств с белками плазмы крови методами ядерной радиоэлектроскопии

7 — о я ^

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСЗСР ВТОРОЙ, МОСКОВСКИЙ: ГОСУДАРСТВЕННЫЙ; МЩЩИНСШ ИНСТИТУТ ии, Н. И. Пироговэ

На правах рукописи

Панов Вадим Олегович

УДК 616-073.75;611-018.54

л

Исследование взаимодействия рентгеноконтрастшх средств о белками плазми, крови методами, ядерной радиоспектроскопии. •

14.00.25 - фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских'наук

Москва 1992

Работа ввдш^на на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии медико-биологического факультета 2 Московского Ордена Ленина государственного медицинского института иы.Н.И.Пирргова.

Научные.руководители: < доктор медицинских наук ГОииаяовский Н.Л., доктор физико-математических наук Дараган В.А.

Научный консультант: заведующий кафедрой молекулярной фармакологии и радиобиологии мэ-д,1ко-сиологического факультета 2 Московского Ордена Ленина государственного медицинского института им.Н.И.Нирогова, академик АМН, профвссоп, доктор медицинских наук Сергеев П.В.

Сфацаальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Фисенко В.П., доктор биологических наук Свиридов Н.К.

Ведущая организация - НИИ ФАРМАКОЛОГИИ АЫН

Защита состоится « /Ку> . ^¿-¿уо.???. 1992 г. в . часов на заседании специализированного совета Д 098.05.01 при ьЛШШ ни.С.Орджоникидзе.

Автореферат разослан « 3/у> . 1ЭЭ2 г.

Ученый секретарь

«

специализированного совета

кандидат иадицинских наук Сюбаев Р.Д.

ВВЕДЕНИЕ.

1 t-v;: Актуальность проблемы. Использование рентгеноконтрастных

сертаций~|

-ЩШЖСТ9 (РКС) многократно повышает эффективность рентгенологических исследований. РКС, применяемые для исследований сердечно-сосудистой системы, почек и мочевыводящих путей, гепато-билиарной системы и других органов, как правило, представляют собой низкомо-лекулярше трийодсодеряавде органические соединения. До сих'пор не синтезированы РКС, сочетайте фармакологическую инертность и высокую органоспецифпчность с достаточными контрасть*ми свойствами [Ьаевег в., 1988]. Разработка таких препаратов ваша, так как подавляющее большинство РКС вводятся в русло крови в больше.«! объеме в виде концентрированных растворов и вызывают различные по тяжести побочные реакции [Сергеев П.8., 1936].

Кровь является первой тканью, на которую, РКС влияют до разведения в максимальных дозах. В результате могут возникать нарушения функционирования свертывающей, иммунной и транспортной систем крови, во многом связанные с рва^тгей белков плазмы крови (Ж) на введение РКС [Хлввег е., 1987; Andes W., 1988; Усенко А.Н. и соавт., 1991 и др.]. РКС в ПК преимущественно связываются сывороточными альбуминами (СА), причем сродство РКС к СА определяется отсутствием заместителя в пятом положении трийодзамещеняо-го бензольного кольца (ТБК) и пропорционально их гепатотропности, времени полувыведения и токсичности [ Sovak II., 1984; Шимановский Н.Л. и соавт., 1986 и др.]. Белки других фракций ПК меньше вступают в комплексообразование с РКС, но такое взаимодействие может нарушать нормальное выполнение ими своих важных специфических функций. Этот вопрос и привлекает в основном внимание исследователей [Kutt н. е.а., 1962; Сергеев П.В., 1986; Шимановский Н.Л. и

роавт., 1968; Dawson P., 1988 и др.].

J Главным неО-агоприятным фактором при введении РКС в сосудистое русло считают их осмотическое действие [Сергеев П.В.: и со-рвт., 1980; Ьаввег В., 1988 и др.]. Гшгартоничность крови, возникающая из-за введения РКС, компенсируется появлением дополнительной воды в кровяном русле, за счет нарушения нормального ргопределения воды мевду связанным и свободным состояниями. Важнейшими компонентами крови, связывапцими молекулы воды и обуславливающими нормальное онкотическое давление крови, являются белки ПК. Проблема возникновения нарушений во взаимодействии белков с молекулами воды под влиянием РКС актуальна еще и потому, что динамическое равновесие в системе "белок-вода" лежит в основе нормального функционирования белков, во многом определяет третичную структуру протеинов и т.д. [Dreyer а., 1971; Аксенов С.И., 1990 и др.].

Исследование молекулярных механизмов взаимодействия РКС ( белковыми компонентами и водной фазой ПК, изменений в втой системе, кроме общетеоретической задачи изучения избирательной тропно-сти лигандов к макромолекулам и балансе вода в биологической среда имеет практическое значение для осуществления направленное синтеза новых РКС и подбора РКС при использовании их в клинике.

Целью настоящего исследования явилось изучение с; помощью ме тодов ядерного магнитного резонанса (ЯМР) молекулярных механизмо комплексообразования иопоноата Na, иоподата Na, билигноста 20% 50Ж, эндобила, трио^браста 76* (верогра$ина), липотраста, йодами да 38Q и метризащда с белками и водной фазой ПК, изменений во; ного баланса, возникающих в Ж и растворах балков ПК под влияние взаимодействии с органическими трийодэамещенными РНО. различно! отроения ц органотроцностя. Достижение данной цели npeflmwiaraj

: - IS -

решение следующих задач исследования;

1. Разработать критерии и подхода для анализа взаимодействия различных низкомолекулярных лигандов с биомакрообъектами при исследованиях, проводимых методами ЯМР.

2. Изучить методом ЯМР высокого разрешения взаимодействие иопаноата Na, иоподата Na, билигноста 20« и 50%, эндобила, триом-браста 76» (верографша), липотраста, йодамидч 380 и матризамида с СА, фибриногеном (Ф), а-гдоОуттат (а-Г), р-глобули- нами (р-Г) и 7-глобулинами (7-Г), ПК; определить силы, ои'еспечивавдие это взаимодействие.

3. Изучить методами релаксационного ЯМР и ЯМР с примьнением импульсного градиента магнитного поля взаимодействие РКС различной органотропности с молекулами вода - определить параметры этого взаимодействия. • , '

4. Изучить методами релаксационного ЯМР и ЯМР с применением импульсного градиента магнитного поля изменение гидратации СА, Ф, f-Г и баланса вода ПК под влиянием РКС -эзличноа органотропности.

Для решения поставленных задач был предложен простой метод анализа взаимодействия низкомолекулярных, лигандов с биомакрообъектами на основании данных, полученных с помощью ЯМР, показана корректность применения этого метода. Показано соответствие поо-тонных ЯМР спектров иопаноата Na, иоподата Na, билигноста 20% и 50%, эндобила, триомбраста 76% (верографина), липотраста, йодами-да 380 и метризамида их химической структуре и наличие неидентичных изменений ^-релаксационных характеристик протонов разных во-дородсодержащих груш этих РКС, имеющих ЯМР сигналы в виде синг-летов, при взаимодействии препаратов с белками ПК и таурохолевой. кислотой. Не выявлено влияния на процесс комплексообразования РКС

с белками ПК ионной силы раствора, а также билирубина, таурохола-вой кислоты и вз. .¡мной конкуренции РКС. Методами релаксационной ЯМР й ЯМР с импульсным градиентом магнитного шля показано уменьшение молекулярной подвижности ядер *В вода при растворении РКС, белков плазмы крови. Показано, что авгааурографические и холецис-тографическиа РКС по-разному взаимодействуют с балками ПК: р результате активного связывания холецистографаческих РКС сСА уменьшается количество молекул вода, связанной этим белйом, что проявляется и в цельной плазме крот. Была также исследовааа относительная вязкость растворов РКС различной органотропности, белков: показано отсутствие ее изменения при взаимодействии РКС с ^ими Оиомакроыолекулами. Проведены измерения осмотической активности всех изученных РКС в водных растворах.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской лаборатории молекулярной фармакологии при кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии МВФ 2 МОЛГМИ им.Н.И.Пиро-гова по теме "Исследования молекулярных механизмов органотропности и токсичности новых РКС" (тем.карта * 096 04, гос. регистрация Ц 01870078158 от 01.1987) в рамках сошной проблемы Л 34.01 и задания ГКНТ СССР А 344.

Научная новизна. Разработав алгоритм, позволяющий исследовать взаимодействие низкомолекулярных лигандов и макрообъектов с помощью нового критерия - коэффициента эффективного (КЗ) изменения времен ЯМР релаксации или коэффициента самодиффузии магнитных ядер низкомолекулярного лиганда под влиянием его комшюксообразо-вания с макрообъекгом, представляющий собой коэффициент пропорциональности между удельным изменением скоростей спин-решеточной, спт-стшощой релаксации или коэффициента самодиффузии магнитных

ядер лиганда и отношением общих концентраций биомакрообъекта и молекул лиганда.

Показано, что КЭ спин-Ьшшовой релаксации протонов химических групп РКС различной органотропносги при связывании их с бзл-каш ПК сильно коррелирует с острой токсичностью (Щ.п) этих гКС, что говорит о возможности использования его при скрининге новых РКС. Выявлено, что все изученные РКС взаимодействуют не только с СА, но и с Ф, а-Г, р-Г и т~Г ПК. Причем силы, обеспечивающие это взаимодействие, имеют универсальный гидрофобный характер. Показано, что холецистографическиа РКС могут образовывать комплексы с тэурохолевой кислотой.

В результате взаимодействия холецистографических РКС с СА, за счет уменьшения гидратации молекул СА, наблюдается уменьшение количества воды, связанной белками в ПК. Аналогичным, но более слабым влиянием на обладает метризамид. однако на состояние воды, связанной белками в цельной ПК, влияния метризамида обнаружено не было. Имеется корреляция между структурирующим влиянием РКС на водную фазу ПК и их осмотичносгью, острой токсичностью (Ы)50) и липофильностью. .

Практическая значимость. На основании анализа результатов диссертационной работы сделать следующие практические рекомендации: 1). При клиническом применении - для нивелирования способности холецистографических ЩС увеличивать количество несвязанной белками вода в ПК, что может приводить к изменению ее онкотичес-кого давления, следует вводить эти РКС совместно с СА, так как СА, значительно связывая РКС и воду, в минимальной степени из изученных белков влияет на вязкость ПК; при этом холецистографи-■ ческиэ РКС, имеющие в своей структуре большее количество гилро-

фильных групп предпочтительны, так как их влияние на общий баланс вода в ПК выражеь меньше (в частности, андобил в этом плане лучше, чем билигност 50«).

, > 2). При синтезе новых РКС - необходимо учитывать, что увеличение числа гидрофильных химических групп типа -со, -NH, -сон и т.д. в Соковых цепях РКС снижает их осмотичность и острую токсичность (корреляция здесь и в дальнейшей проводилась с приводимыми в литературе величинами Ы>50), повышает водорастворимость, при атом роль s тих групп при взаимодействии с белками ПК невелика по сравнению с трийодзамещенным бензольным кольцом с водородом в пятом положении; увеличение длины радикала в третьем положении три-лодзамещенного бензольного кольца РКС ослабляет (затрудняет) связывание РКС с белками ПК, не изменяя существо этого процесса, таким образом можно снизить влияние этих веществ на глобулиновые фракции белков Ж и СЛ.

Внедрение результатов исследования. Полученные экспериментальные данные используются на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии медико-биологического факультета 2 МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова, в научно-исследовательской лаборатории при изучении токсичности контрастных средств, в рамках задания ГКНТ * 344; предложенный методический подход используется при изучении взаимодействия других фармакологических препаратов и вода с биомакро-объектами. Материалы работы неоднократно докладывались на научных конференциях и конкурсах различного уровня.

Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены на VI Всесоюзном съезде фармакологов (Ташкент, 1988); на Всесоюзной конференции "ЯМР в народном хозяйстве" (Казань, 1988); на Московском обществе фармакологов (Москва, 1989); на VII Всесо-

юзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Черноголовка, 1989); на Всесоюзной научной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений" (Купавна, 1989); на Всесоюзной конференции "Физзшмия 90я (Москва, 1990); на Всесоюзном рабочем совещании с приглашением иностранных специалистов "Магнитный резонанс и динамика белков" (Казань, 1991); а такке на совместных научных конференциях кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии .медико-биологического факультета и НМЛ молекулярной фармакологии 2 МОЛГМИ им.Н.И.Шрогиаа и на семинарах лаборатории ЯМР Отдела строения вещества ИХФ АН СССР.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 194 машинописных страницах и состоит из введения, обз9ра литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 194 источников - из них 87 зарубежных авто^в. Иллюстративный материал представлен 1 схемой, 31 рисунком и 29 таблицами.

1

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Материалы и методы исследования.

В работе изучали следующие РКС и препараты: 1).холангиохоле-цистографические, предназначенные для: а).внутривенного введения: билигност 20% и 50% (ХФЗ им.М.В.Ломоносова, СССР), эндобил (Вгаооо, Италия); О).перорального введения: иоподаг Яа, иопаноат Иа - полученные в лабораторных условиях из кислот (ВНИХФИ им. С.Орджсникидзе, СССР); и).ангиоурографические РКС, предназначенные для внутривенного введения: а).ионоганныэ - йодамид 380, три-

омбраст 76* (ХФЗ им.М.В.Ломоносова, СССР); б).неионогенное - ыет-ризамид (Sigma, сША); III).сдленогепатографгаеское РКС, предназначенное для внутривенного введения, липотраст (ВДИиРИ, СССР), представляющее собой триомбраст 76«. инкапсулированный в лшосо-ыы. Исследованный диапазон концентраций РКС составлял: для иопа-ноата Na - 10"%1СГаМ; для иоподата Na - lCfs+2-10"'M; для мет-• ризамида - 10"'+1,4 Ы (раствор готовили ex tenpore); для остальных РКС - от 10"* до их ампульных концентраций. Были использованы i следующие препараты Селхов Ш: ,сд (íiuka ¿o, Швейцария; Serva, ФРГ; Signa, ODA), Ф (Sohuohardt Uunchen, ФРГ), а-Г, р-Г, 7~Г (Fluisa AQ, Швейцария). Растворы белков готовили на фосфатном буфере (рН 7,4) в концентрациях 1(Г*+10"а Ы. Эксперименты с ПК, полученной с помощью центрифугирования крови 53 здоровых доноров обоего пола в возрасте 18-50 лет, проводили In vitro. Кровь была стабилизирована 5* раствором трялона Б в соотношении 1:30. Билиг-вост 20%, который в настоящее время не выпускается, использовали для контроля влияния ыетилглюкамянового остатка, входящего в состав билигноста 50* вместо иона Na у билигноста 20*.

Основными методами в данной работе были методы, основанные на явлении протонного ЯМР (ПМР): ПМР спектроскопия высокого разрешения; ШР релаксометрия; ПМР метод спинового axa с.импульснш градиентом магнитного поля. ПМР спектры РКС получали на ЯМР-спектрометре высокого разрешения "Yarian HA10Û" ((Щ) с рабоче) частотой 100 МГц. температура в зазоре магнита составляла Т=30 К; диаметр ампул - 5 мм. В качестве стандарта использовали внеш ний эталон: запаянный капилляр с гексаметилдисилоксаном, имеющи резонансную частоту val-4 Гц. Изменение состояния ядер *Н в моле кул РКС при их взаимодействии с белками ПК оценивали по ширив

ПМР сигнала на половине его высота Av^s 1/(П-Т4).

Времена релаксации и коэффициент самодиффузии ядер *н воды измеряли на ШР-рэлакссиетре ИВР-1 (И5К5 АН СССР), модифицированном для получения импульсного градиента магнитного поля. Резонансная частота ИВР-1 для протонов 22 МГц. Максимальная величина импульсного градиента достигала 30 Тл/м. Диаметр рабочих ампул - 8 мм. Измерения проводили в диапазоне температур. 295*368 К. Для определения времен т и Т. использовали импульсные госледоватёльна-* 1 ^ •

сти Карра-Парсела-Ыейбума-Гилла и "инверсия-восстанивление" соответственно [Ватт A.A. и соавт., 1986]. D, протонов воды измеряли с помощью метода стимулированного спинового эха с импульсным градиентом магнитного поля [Маклаков А.И. и соавт., 1987].

В работе бия использован оригинальный подход расчета параметров взаимодействия малых молекул с макро<?бъектами по данным ЯМР. Мы показали, что любой из измеряемых параметров Tlt тг и Dt в условиях быстрого химического' обмена спинов меаду п связанными и свободным состояниями в обобщенном bit "ч описывается выражением:

.я , п f

я* =j i'iaj'ffj + (1-j^üj)-тг, где W - обобщенная запись скоростей релаксации l/nt ж или коэффициента самодиМузии Ds, индексы которой "er", "I" и "ь" указывают на значения соответственно измеряемой характеристики магнитного ядра в системе в целом, и ее же в свободном и в связанных состояниях; atj - юля спинов, находящихся в i-ом связанном состоянии и с одним и тем же значением параметра Wj. При ди*'= («"-Wi/W* и Aw^=(Wj-w)/w' поучим: Лгс'^Дсу AwJ. Если доля связанных ядер каждым j-ым центром описана выражением: O.J ж Aj• BD/ID, где Aj - обобщенная константа, характеризующая взаимодействие магнитных ядер с J-ым связываниям участком, лриве-денное выше уравнение принимает вид: aw* =b0/ld'jit v&wj* суша

jpjij■¿w* является постоянной величиной, характеризующей 'эффективность процесса изменения скорости ЯМР релаксации или коэффициента самодиффузии связанных магнитных ядер в j-ом состоянии. Обозначив константу j^aj-awj как коэффициент эффективности (КЗ), получили выражение: Äff*1 « В0/1^-КЭ. КЭ■ спин-решеточной релаксации дали обозначение "КЭ-ш,", КЭ спин-спиновой релакс-ции -"КЭ-та", КЭ влияния на само диффузию -"КЭ-вя", При анализе взаимодействия лигавдов с белками, имеющими молекулярный вес до 1Сf Дальтон, в предположении, что связанный лиганд имеет характеристики симбатные характеристикам биополимеров, для приведения скорости релаксации с точностью факторов, определяемых формой глобул оелка, предлагается делить ее на молекулярный вес [Аксенов С.А., 1990]. Непосредственный расчет усредненных равновесных кинетических параметров связывания по данным о ЯМР релаксации магнитных ядер основан на предположении, что макрообъект с общей концентрацией во имеет m независимых активных участков связывания лиганда с общей концентрацией с одинаковым значением констант диссоциации к4. По закону действующих масс получаем, что: K^atAW^'/AW*-!)- (b^bh^Awvaw"1 ). Минимизациошая процедуре позволяет рассчитать величины AW*, m й .

Эффективные значения энергии (энтальпии) активации АН и функции i(As), характеризующей изменение энтропии активации, вращательного и трансляционного движения протонов рассчитывали из линейных зависимостей соответственно lnU/T,) и ln(D#) от отношения 1/(R-T) К"1 методом наименьших квадратов по значению тангенса угла наклона и свободному члену (Вашман A.A. и соавт., 1986].

Относительную вязкость растворов измеряли при t=26"C на капиллярном вискозиметре Оствальда, определяя время, за которое ме-

ниск раствора понижался с фиксированного уровня до специальной отметки. Относительную вязкость рассчитывали по формуле {Кантор И. и соавт., 19841: т| = т^- (tp-Pp/ tB-pB), где т^- абсолютная вязкость вода ( "пв= 0,01 Пуаз); рв, Рр и tB, tp - плотность и измеряемые времена для вода в раствора соответственно.

Осмотичность растворов РКС в милиосмолях на литр определяли по точке замерзания с помощью термометра Бекмана по формуле: П = (Т - i'0)/ Тв, где Т и Т0 - температура замерзания соответственно раствора РКС и вода; Тв - константа, характеризующая снижение точки замерзания раствора с концентрацией < мМ/л яо сравнению с чистой водой (для воды Те= 1,853°С). ^

рН растворов измеряли на универсальном иономере ЭВ-74. Статистическую обработку данных и все расчеты в данной работе проводили с помощь» оригинальных программ, на ПЭВМ. Достоверность различий выборок по критерию Стьядента обозначали Pt, по парному критерию Вилкоксона - Рт, по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни - Р0. Достоверность линейного хг.-^ктера связей данных проверяли с помощью критерия Фишера - Рг.

*

2. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Изучение физико-химических механизмов мезмолекулярныг взаимодействий РКС с бел*"»ми ПК. Результаты идентификации пиков протонных ЯМР (ПМР) спектров РКС приведены в .таблице 1. При максимальных концентрациях ПЭГ, СА, Ф, а-Г, р-Г и 7-Г, а также при растворении РКС в ПК не наблюдалось достоверных (более 0,1 м.д.) отличий химических сдвигов ядер *н РКС от исходных значений, что говорит об отсутствии достоверных изменений в распределении электронной плотности этих

Таблица 1. Идентифицированнце пики ЩР спектров РКС.

Надйштв РКС хи.лчвский сдвиг. М.^- химическая группа pro, к которой отнесен водород данного пика

ЦОПАНОАТ ыГ" 1,04 ''' 2,76 3,46 8,28 (I)" сн,- груша атилпроционовай * Очковой цепи СН,- групца атилпропионовой боко- •• вой цепи, удаленная от ТБК сн,- группа атилпропионовой боко- • вой цепи, ближняя к ТБК сн - груша ТЁК

ИОПОДАТ Na 2,66 3,26 3,54 7,38 (II) 8.46 (I) СНа- группа пропионовой боковой цепи, удаленная от ТЕК сн - группы диметиламиномет^лен- аминовой боковой цепи сн,- группа пропионовой боковой цепи, ближняя к ТБК СН - группа даметиламинометилен- аминовой боковой цепи сн - группа ТБК

ЯВДОБИЛ з.ае 8,62 (I) снг- группы моста СН - группа ТБК

БИЛВДЮОТ Б(Я 2,24 2,86 8/70 (I) сн - группы моста, расположенные • центрально' сна- группы моста, ближние к ТБК сн - группы ТБК

ИОДАЩЦ 380 2,28 (II) ?f51 (I) сн.- группа ацетамидометильнои * боковой цепи сн - груше ацетамидной боковой * цепи

ТРИОМБРАСТ 76Ж ( ВЕРОГРАФИН ) 2,48 (I) сн,- группы ацетамидных боковых * цепей

липотраог " 2,53 "(Г) ' " 3,04. 3,43] 3.46Г 3,65J СН,- группы ацетамидных боковых цепей триомбраста сн,- группы лидосом и метил-■ глюкаминового остатка

ЫЕТРРАМИД 2,54 (И) 3,40 (I) 3,78 4.11 сн - группы матилацетамидноя и ацетамидной боковых цепей, удаленные от ТБК сн - группа метилацетамидной боковой цепи, ближняя к ТБК сна- группа гликозидного кольца сн - группы гликозидного кольца

" - ошибка определения химических сдвигов не более 0,1 м.д.

" - в скобках римскими цифрами обозначены исследовавшиеся в даль> нейшем химические группы.

***- для ионных трийодсодержащих препаратов представлена идентификация ГШР с.овалов анионов.

атомов. При добавлений в раствор! РКС ПЭГ, СА, Ф, а-Г, р-Г и т-Г и ф'астворёния РКС в' ПК во все! э'а' йскйчёнйеМ Йэ£; имела

ме'бтб дбст'овб'рнбе (С р£>0\9Ь) йзШнётё й сигналов протонов ПИР' спектров РКС при их прйсутствии в растворе s концентрации Ю~*410'ЧИ: Изменения шириш/ сигналов прй йёаоояьтх. концентрациях белков ПК минимальны для' a^oyporpaiferieckrac РКС - около 1СШ; имеют более выраженный характер для вн^тривйЕаШ: холеци'сгографя-чебких РКС - до 300%; й максимальны у оральных холецистографичес-ких РКС - до 800&. Имеется неидентичность изменения Ai>,-,z сйгна-лов ПЙР сяпектра РКС при взаимодействии РКС разами белками ПК.

Цри исследобашях влияний йа ШР спектр РКС СА в присутствии таурохолевой кислоты (20 мг/мл) подучено, что таурохолевая кислота увеличивает дирту' Av^- гайшюв ¡Щр водорода хблецистогра-фических РКО в среднем на 10+15Ж, но это изменение не превышает увеличения таурохолевой кислотой Avtx21H РКС в отсутствий СА с Р^О.Эб. Существенного влияния таурохолевой кислоты Да IftfP спектры ангиоурографических РКС н лшотраста нэ обнаружено.

Полученные достоверные й невдэнтичные изменения ширина' сигналов ядер водорода РКС на половине высоты пйка: их ПМР спектров в присутствии белков ПК указывают на наличие различного по выраженности уменьшения молекулярной подвижности протонсодеряащих х^ет-ческих груш изученных РКС при наличие в "детворе белков ПК. Уши-рение' сигнала' также' имело место при добавлении таурохолевой кислоты. Такое изменение подвижности может быть вызвано изменением макроскопической вязкости, а да взаимодействием РКС с белками или' таурохолевой кислотой. В связи с этим было исследовано изменение" относительной вязкости растворов при совместном присутствии РКС, таурохолевой кислоты и белков ПК и т.д. Полученные величины отно-

сительной вязкости всех изученных растворов и в том числе и растворов РКС, которые исследовались в максимальных из использованных концентрациях (0,05+5 М), не имели отличий от дистиллированной вода с уровнем достоверности Р^ ц г0,95, что указывает на отсутствие влияния РКС на относительную вязкость исследованных растворов макромолекул. Следовательно, изменения ЯМР параметров при "о-следованиях, проводимых с этими объектами, не связаны с изменением относительной вязкости раствора при взаимодействии РКС с белками ПК и ПЭГ. , • : На основании измеренных значений ширины пиков на полувысоте ПМР спектров были рассчитаны значения КЭ-тг для каждой группы РКС пр.! добавлении в раствор ПЭГ, СА, Ф, а-Г, р-Г, 7-Г; а также для СА и холецистографических РКС в присутствии таурохолевой кислоты. Полученные значения К3-Гг расположены в таблицах 2 + 8.

Сравнивая значения КЭ-тг холецистографических и ангиоурографических РКС с высоким уровне^ достоверности (Ри>0,95) можно ут-

Таблйца 2. Коэффициент эффективности спин-спиновой релаксации КЭ-®г(-10"э условных единиц) сигналов 1Н ТБК ПМР спектра ендобила при добавлении макромолекул.

название КЭ-2'г (I)",

полимера 10'3 усл. ед.

ПЭГ 0,54 + 0,58 ""

С* 1,97 ± 0,28

.Ф 2,43 + 0,39

а-Г 1,12 ± 0,83

е-г 1,80 ± 0,21

7-Г 1,71 ± 0,23

"-обозначения соответствуют таблице 1. -ошибка среднего значения приведена с Р^>0,95.

Таблица 3. Коэффициент эффективности спин-спиновой релаксащг* К3-Тг(-Ю"э условных единиц) сигналов 1Н ТБК ПМР спектра билигноста 50% и 20% при добавлении макромолекул.

-название полимера Билигност Ь0% КЭ-Тг(1), 10~эусл.ед. Билигност 20% КЭ-тг(1), 10"эусл.ед.

шг 0Í21 + 0,23' О,'18 " i 0,19 '

СА...... 1,ЬЬ + 0,13 l.bU ± 0,1b

Ф 2,30 + 0,99 ' 2,44 + 1,04

а-г 3,01 "г'0,42' 2,88 ± С 31' "

tí-Г 5,0S ±'1,94 4,9У + 1,9а

T-i' 2,за + U.2B ■¿,гч + и,за

Все обозначения как в таблице 2.

Таблица 4. Коэффициент эффективности спин-спиновой релаксации КЭ-Т2(• 10"3 условных единиц) сигналов 1Н ТБК 1Е-.СР спектр:, копаноата На ц иоподата Ка и дкметиламинометиленаминовой цепи иоподата На

при добавлении макромолекул.

название полимера Иопаноат Na КЭ-тг(1), 10"эусл.ед. Иоподат Na

кэ-т2(I), 10"3усл.ед. КЭ-Т2(П>, ^10~3усл.ед.

ПЭГ 0,26 + 0,26 0,Ь8 + 0,67

СА 13,S6 + 1.9U 5,44 ± 1,25 + U.oV

ф 26,оь + Ь,83 18,Ь6 ± 4,36 22,99+2,34

а-1' 23,83 ± 0,71 6,12 '±'1,37 8,46 + 1,Ь7

'¿8,26 ± 2,89 11,8S ± 1,49 ' 17,88' + 1 ,S8

7-Г "'21",22""±'5 24" 5,58 + 0,82 5,6b i 1,32

Все обозначения как е таблице 2.

Таблица 5. Коэффициент эффективности спин-сшшоеой релаксации КЭ-тг(• 10"3 условных единиц) сигналов 'н сяэ-групп пмр спектра йодамида 380 при добавлении макромолекул.

название полимера КЭ-Тг(1), 10"3усл.ед КЭ-Тг(11), 10'3усл.ед

' ' ПЭГ 0,04 + 0,24 а, ю ± а,2ь

СА 0,76 + U.U и,70 + 0,07

Ф " U,13 ± U.U7 U,26 + 0,15.........

а-Г 0,7Ь' ± С,13 и,8У + 0,07

А-Г 0,76 + 0,33 и,8Ь + 0,30

7-1' "","0;47' "± ОДУ и,Ь2 ± 0 10'

Все обозначения как в таблице 2.

Таблица 6.Коэффициент эффективности спин-Спиновой релаксации КЗ-5г(-10"3 условных ёдйниц) сигналов *н Сй3-груш' ПМР спектра тркоьйрастз 76% и липотраста йрй ДобавлёйЙ макромолекул.

название полимера !'рломбра^т 76% Лшотраст ■ кз-т2а)'* • 10"аусл.ед.

• шг - ■ 0;2ь ± и,зв '1,'ДЗ' ± 1.26

ПА • г ила -2Ж ± 0,39""

Ф .. 1.02 + СЛУ " ОГ/8 ± 0.43'

а--г 0,80 0,21...... 1,17 ± О.'ЗО

В-Г ■ - ±-О,67' ' 0,07" ± 0,19

7-1' а',82' ± 0,15' " О'.ЙЗ ±~0, 30" '

Все обозначения как в таблице 2.

. Таблица 7. Коэффициент эффективности сйин-сгашовой релаксации КЗ-1г(-ю"3 условных единиц) сигйалов *н ей.,-груш ПМР спектра метрйза'мида при добавлений макромолекул;.

Название полимера КЭ-Тг(1)', Ю"3усл.ёд КЭ-Тг(II), 10"'усл.ед

1ИГ " -0,03 ± и.иь "0,03 ±"0,13""

СА 0,20 ± О,02 0,33 +0.13

Ф 0,19 + и.Ш '0,31 '±"0.14

а-г 0.33 + и.Об " 0,58' " + 0,07 ' "

0-1' 0,12 + 0.01 " 0,17 +' 0,07 '

7-1' 0,2? ± 0,03 " " 0,26" ± 0,-18'

Все обозначения как „в таблице 2.

Таблица 8. Коэффициент эффективности спин-спиновой релаксации КЗ-шг(-10~3 Условных единиц) сигналов ПМР,спектров холецистографических РКС при добавлении СА в присутствии таурохолввой кислоты в . концентрации 20 мг/мл.

название РКС . иро тонсодержащая группа кэ-т2

ЭНЦОБКЛ . (I)" 1,84 ± 0,18""

БШСИуСТ 'БОЯ™ (I) ■ 1.39 ± и, 16

И011АН0АТ Ыа " ......(1Г ' 12,88 " + '1,6Ь

МОПОДАТ Ка (I) Б.10 ±'1.20

(Н) ■5.54 ± 0,64

"-обозначения соответствуют таблице 1.

сшибка среднего значения приведена с з? ,>0,Э5.

Таблица 9. Удельное ушрение (условные единицы) сигналов ПМР спекла РКО при добавлении их в ПК.

Название ркс Иротонсодашацая группа &Г/ усл.ец.

энцобил 1,36 + 0,11""'

бшшгност ъа% 0,91 ± 0,11

иопаноат На • 7 ,Ь2 + 1,00

иоподат На (I; "'3.04 ± 0,88

и) Ь,70 + 1,2Ь

йодамид 380 1 л * 0,76 1 и,10

(11) 0,Ь2 ± и,14

"" триомбраст '76Ж (I) и,«а + й, л

" лшютиот 2.33 г 1 М

1ЛЕТРИЗА1ЛИД ±

о.зз ± о.оа

"-обозначения соответствуют таблице 1.

ошбка среднего значения приведена с Р+>0,95.

верадать,, что при взаимодействии с СА, Ф, а-Г, {3-Г, 7-г эффективное увеличение скорости релаксации протонов холецис-тографических РКО выше, хотя и имеется определенная специфика. Взаимодействие натриевой ц метилглюкашновой солей билигноста (бшигност 20« и 50% соответственно) во всех случаях одинаково. Приведем РКС в по-рядаэ убывания максимальных величин КЭ-Т2 для каждого из белков:

- СА: иопаноат Ка, иоподат Ка, липотраст, эндобил и билигност

50%, триомбраст 76", йодамид 380, метризамлд;

- Ф: иопаноат На, иоподат N3, билигност ЕОй, эндобил, тряом-

браст 7в%, липотраст, метризамзд, йодамид 380;

- а-Г: иопаноат На, иоподат На, билигност 50%, лшютраст, зндо-

бил, йодамид 380, триомбраст 76%, метризамид;

- (3-Г: иопаноат На, иоподат На, билигност БОЙ, триомбраст 76й,

эндобил, йодамид 380, липотраст, метризаютд;

- 7-Г: иопаноат Иа, иоподат На, билигност 50%, эндобил, липо-

траст, триомбраст 75%, йодамид 380, метризагяэд. Получено, что таурохолавая кислота уменьигет время з?г прото-

нов РКС, не влияя достоверно (с Pt>0,95) на КЭ-тг *н РКС при вза-■> имодействаи РКС с СА.

При исследована связывания РКС в ПК вместо КЭ-тг рассчитано удельное уширение сигналов ЛЫР спектра РКС при растворении их в ПК по сравнению с водным раствором, представленное в таблице 9. Сравнение взаимодействия РКС с ПК и отдельными белками ПК, позволяет утверждать, что взаимодействие РКС с ПК больше всего аналогично связыванию РКС СА..

Проведенные исследования показывают, что при вазимодействии РКС с СА, Ф, а-Г, ß-Г, 7-Г и цельной ПК величина ширины сигнала на половине высоты ПМР спектра в наибольшей степени изменяется у незамащеннго водорода ТБК холецистографнческш. РКС. Замещение водорода в пятом положении ТЕГ боковой группой приводит к значительному уменьшению взаимодействия с белками ПК. Другие группы РКС определяют конктетный характер связывания с белками, не влияя на существо этого процесса.

Взаимодействие иопаноата Na, иоподата Na, билигноста 50«, эндобила, метризамида, йодамида 380, триомораста 76% и липотраста • с ПК осуществляется, согласно полученным результатам, аналогично связыванию РКС с СД, что, по-видимому, обусловлено преимущественным комплексообразованием РКС с СА в ПК. Однако аффинность ркс i белкам ПК уменьшается в ряду, в котором СА занимает лишь треты место: ß-Г, а-Г, СА, Ф и у-Т. Такое расположение белков на на! взгляд связано с тем, что в состав а-Г и ß-Г входят крупные бел ки, поверхность которых неспецифически связывает более значитель ное количество РКС, чем СА (тем не менее определяющему характе взаимодействия РКС с ПК в целом за счет гораздо большего содержа ния этого белка в ПК).

Высокий уровень значений коэффициента корреляции ЯЭ~?г основных груш взаимодействия РКС и белков ПК с липофильностью, ос-мотичностыо и острой токсичностью (г > 0,8) позволяет предложить КЭ-тг в качестве дополнительного критерия при скрининге новых РКС различной органотропности.

2.2. Изучение влияния РКС на состояние вода в ПК и растворах белков ПК с помощью измерения времен ЯШ> релаксации' и коэффициента самодиффузии протонов воды. ■ ■ Средние значения параметров 1г и а ПК составили: й 1,68 + 0,33 с, 0,66+0,26 с и (2,56+0,12)-Ю-5смг/с. Полученные при добавлении к ПК РКС результаты пересчитали по формулам: , , в"' АЧ, ,= -Ц- / - ', АИ = 1 - —г , ».г д.* • х,1 1.г х.а •

где т* 2, в[ - времена спин-решеточной, спин-спиновой релаксации и коэффициент самодиЗфузш в исходном растворе (в случае ПК - с учетом разведения), а т*г2, б*'- те ке параметры после добавления РКС. Зндобил,"билигност 20й и 50%, иоподат На, копаноат На, три-омбраст 76%, йодамид 380 и метризамид шзывали достоверное (С: Рц>0,95) уменьшение времен Т1, Тг и на 2С0+300Й, с соотзетст-.' вувдим увеличением расчетных показателей шх, А«'г и л?^, ядер водорода молекул вода при добавлении этих РКС' к ПК. Аналогичные измерения были проведены в водных растворах РКС.

Концентрационные зависимости ДИ1 и АЯш в ПК и в воде в присутствии ангиоурографических РКС триомбраста 76%, йодамнда 380 и метризамида одинаковы- (с Рц>0,95). Для холецистографаческих РКС иоподата На, битгпоста 20% и 50% и эндобила обнаружено наличие двух фаз в их влиянии на протоны воды ПК (с Ро>0,95): до концен-

Таблица Ю. КЭ- ядер молекул воды в плазме крови и водном растворе при добавлении РКС.

Название РКС КЭ-т,

плазма крови Водный раствор

Кояаноат Ыа. 142,46+ 18,28" 258,91+ 17,06

иоподат Иа 23В,3&+ 10,98 ""1Б5;и1± 12Д4" '

ьилигиост ьи% 222,24+" 11,47 "" 70,56+' ' 9ЛГ "

Зндобил "796,18? Ь2,77..... '448,09+ 41.01

1'РКОМОР£.ст 76% 22,45+ 5,21 "" 22,39+ "3;85"'"

иодамид зьи 1Ь;00+ 1,46" .....14,22+ 1;В7"

Метризамид 147,Ы+ 15,19 ' '1зв;з4+ 12:66 ■

Таблица П. КЭ-тг ядер *н молекул воды в плазме крови и водном растворе при добавлении РКС.

Название ■ РКС КЭ-тг

плазма крови водный раствор

Иопаноат Ка 379,32+ 19,99" 443,18+ 17,00

Коподат Ыа 416,70+ 15,2Ь ""'461' 15+""13,47

Билигнос? &0® '387,25+' 17,71"" "465,04+"21,00'

эндобил 922,30+ ЭЗ,1Ь 1188,76+ 97,90

'1'риомбраст 76% 37;а..л .....4,12" 194,46+ 11,02'

йодамид Зао 19.61+ 2,04 У8.34+ ь.ьЬ

Метризамид 278,36+ '!4,2Ь' " '532,38+ 17.59

Таблица 12. КЗ-о> ядер *н молекул воды в плазме крови и водном растворе при добавлении РКС.

Название РКС

Плазма крови водный раствор

Иопаноат Иа 42.67+ 5,02" 69,90+ 11,35

Моподат Иа '87.23+ ' '9,57'" 63,51+ '8,12

Билитност ьи% 105,и1+ 4,22 68,89+ 2,31 '

ьндооил 341,69+ 14,33 ' 228,24+ 9,97

Триомбраст 7б% ' 20.7В+ '" 1,6Ь " ' 14,72+ 1,28"

йодамид ЗВО 17 1,27 ' 14,06+ 1,01

Мэтризашд ЗУ, 17+ ¡¿¡'/У'" "' 32,61+ 2,Ь0

ошибка среднего значения приведена с Р4>0,95.

- / » ' я

яраций порядка 4,5-10 +5,5-10 М эти РКС в ПК менее эффективно • блиявт на вращательное и поступательное движение протонов вода, чем в водном растворе; а при более высоких концентрациях - более

У, '

эффективно. В водном растворе иопаноат Ыа в большей степени ока-"•*'' зявал влияние на состояние молекул воды,' чем в ПК. Отсутствие двухфззности в действии иопаноата Ыа связано с низкой растворимо-

стью (на более 6-Ю~гМ) этого РКС при физиологических значениях рН. Однако в целом, за исключением иопаноата На, КЭ-^ и КЭ-ва холецистографических РКС в ПК оказались больве (с \>0,95), чей в водном растворе. Ангиоурогра$ические РКС по величинам кэ-5^ в ПК и водном растворе не отличаются (с Р^О.95), а величины КЭ-3В для этих РКС в ПК немного больше (см. таблицы 10,12).

Между холецистографическими и ангиоурографичвскими РКС выявлено различие и по концентрационным зависимостям параметра №2 (с Ри>0,95): ангиоурографические РКС в ПК значительно меньше влияют на спин-спиновую релаксацию ядер водорода, чем в водном растворе; в то время как различия для холецистографических РКС не столь велики (см. таблицу 11).

По уменьшению эффективности влияния на протоны молекул воды в ПК РКС можно расположить, согласно величинам КЭ-Т4 и КЭ-1)в, з следующем ряду: эндобил, билигност 20% и 50%, иоподзт На, иопано-ат Ка и метризамид, триомбраст 76%, йодамид 380; а по значениям КЭ-Т, - эндобил, иоподат На, иопаноат Ма, билигност 20% и 50%, метризамид, триомбраст 75%, йодамид 380.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии влияния РКС,. на релаксационные параметры и поступательную подвижность спинов.' водорода водных молекул, а значит и состояние воды в ПК. При этом влияние холецистографических РКС связано как с процессами гидратации самих молекул РКС, так и со связыванием РКС белками ПК, а воздействие ангиоурографических средств на изученные величины может быть отнесено на счет их влияния на водную фазу ПК.

С помощью ПМР методов молекулярная подвижность воды в растворе СА была изучена более подробно. Показано, что незначительная вязкость растворов СА может быть связана с аномально низким влия-

v , 1, >\

■ ' " л

л.

0.20 -q iW,. yen. ел.

0.10 ^

O.OO -i

-0.10 -

-0.20 -

-0.30 t

-0.40 -

-0.50 • | 11 w 0.00

Рисунок

114 II | II) III 1 П 1III 1111 П 111111 И 11111 I IIIII I | Cnc^Ctb У0"- ед

100.00 200.00 300.00 +00.00 500.00

1. ЗАВИСИМОСТЬ УДЕЛЬНОГО ИЗМЕНЕНИЯ СКОРОСТИ СПИН-РЕШЕТОЧНОЙ РЕЛАКСАЦИИ Д«,' ЯДЕР ГН вода ОТ КОЛИЧЕСТВА МОЛЕКУЛ ИОПАНОАТА Ua(t), ИОПОДАТА К&(2У ЕИ-

ЛИГНОСТА 50* (3) И ЭНДОВИЛА (4), ПРИХОДЯЩИХСЯ НА ОДНУ МОЛЕКУЛУ СА В ВОДНОМ РАСТ-Е0РЕ(ТЕШ1ЕРАТУРА ЗГС? рН 7.4). ОТ1ШШЕЛЬНЬ1Е ОШИБКИ СРВДНИХ ВЕЛИЧИН НЕ ПРЕВЫШАЮТ 10 *.

ПО ОСИ АБСЦИСС - ОТНОШЕНИЕ МОЛЯРНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ РКС И СА В УСЛОВНЫХ ЕДИНИЦАХ ПО ОСИ ОРДИНАТ - УДЕЛЬНОЕ ИЗМЕНЕНИЕ СКОРОСТИ СПИН-РШПОЧКОЙ РЕЛАКСАЩШ ПРОТОНОВ ВОДЫ В УСЛОВНЫХ ВДИНИЦАХ.

тем СА на трансляционное движение молекул воды. Мы предполагаем, что такой характер воздействия белковой глобулы на поступательное движение молекул воды объясняется значительным растяжением водородной сетки и соответствующим увеличением величины элементарного "прыжка" при обмене молекул воды. При атом основным механизмом уменьшения взаимодействия молекул воды с СА следует считать изменение количества связывающих участков, а не изменение равновесной констаты взаимодействия.

Добавление' РКС в концентрациях 1СГ*+1 М к растворам СА привело к следующим результатам: триомбраст 7в%, йодамид 380 и мет-ризамад уменьшали Т,, 1г и Bt 'н (с Р„> 0,95) в той же мере, как и в водных растворах. Иопансат Na, иоподат Na, бялигност 20% и 50Ж и эндобил оказывали двухфазное действие, похожее на то, которое было получено при добавлении этих РКС в ПК. На рисунке 1 изображены зависимости обозначенных "AWt" удельных изменений 1/0^ при добавлении соответственно иопаноата Na, иоподата Na, билигно-ста 50Ж и эндобила в растворы СА от отношения молярных концентраций холецистографических РКС и С А. Зависимости удельного изменения DB протонов вода были аналогичными, но противоположными цо; знаку. Добавление РКС на всем диапазоне концентраций Ф приводило/ к одинакововму уменьшению и Dg *н в растворе белка и в водных', растворах. Аналогичные результаты были получены при добавлении РКС в растворы 7-Г, за исключением метризамида, который при концентрации более 3- 10"ЭМ (включительно) и концентрациях у-Г более 9- 10"*М вызывал в растворе белка не уменьшение, а достоверное увеличение Tt и Ds *Н молекул воды сходное с влиянием холецистографических PKG в растворе СА.

Полученные данные измерения осмотической активности РКС по-

Таблица 13. Величины КЭ-Т1, КЭ-гг, КЭ-1»а *н молекул, Нго для водных растворов РКС.

Название вещества КЭ-Т1 кэ-тг . K3-D6

Иопаноат Ка 158,91+10,62" 452,15+ 15,30 70,90+12,13

иоподзт Из 171,37+11,15 482,4Ь+ 1У,44 75', 55+ 9.76

ь'и.тагаост ьо% 210,00+ 8,04 ' 579,65+'11,69 37 ,6-4+ 3 ,16 '

ёндобил 419,07+39,58 ' 1315,61+101,56 ' 114,16+ 9,62

лнпотраст 17,29+ 2,21 Ь6,8Ь+ 6,03 ~ " 5,87+ 0,45"'

Тшомбраст 76% "77,39+'5,80 1 203;ь3+ 14,90 "10,13+ 0,33

Йодамид зии ЬУ,УЬ+ Ь.У/ 118,Ь8+ 3,27 ' 8,45+ 0,51"

мвтшзамид "167", 67+13,48' '563,42+ lb, 29 28,50+ 2,30 '

ошибка среднего значения приведена с Pt>0,95.

Таблица 14. Показатели анергии активации вращательной и

трансляционной подвижности ядер *н молекул воды в водном растворе РКС п чистом растворителе.

Название вещества С, М ДНу. кДк 1(Аб)г, кДж кДж ¿(АЙ)а, КДж

моль моль-град моль моль-град

Иопаноат Ка ■ 0,05 17,93+0, оГ -8,54+0,70 15,81+0,58 -5,33+0,76

иоподат■На "0,37 2U.1U+1,ЗЬ -8,69+0,52 12,42+1,47 -5,48+0,57

БИЛИГНОСТ ьи% ' 0 21 18;28+0,8Ь" "-3,1Ь±0,32 12,93+0,26 -5,72+0,96

андобил "0;22 21,58+0,78 -8,40±и,2Э 14,48+0,23 -5,69+0,09

липотраст 4, US 17,13+0 -7,20±0,18 17,49+0,91 -6,71+0,34

Ттяюмбраст- '/6Ж 23,96+0,14 -8.81+и,Ь1 16,02+0,13 -5,87+0,50

иодзмид а80 25,74+1,08" -9,36'+0,40 15,06+0,83 -5,51+0,31

Метризамид 1,2Т 21113+0,93 -7,91+0,35 12,76+1",24 -5,24+0,47

Диет.вода bb.bri 17 62±0|5'1 " -8,03+0,19 15,43+0,36 -7,02+0,13

ошибка среднего значения приведена с Р^>0,95.

казали, что осмотичность РКС убывает в ряду : иопаноат Ма, иопо-дат Иа, билигност 20% и 50%, эвдобил, йодамид 380, триомбраст 76%, метризамид. При этом не имеют достоверных различий (с ?г>0,95) по осмотичности попарно между собой: билигност 50% и билигност 20&, йодамид 380 и триомбраст 76%; растворы метризамида до я после длительного (в течении трех суток) хранения.

При добавлении РКС в водные растворы, как уже отмечалось выше, Еремена релаксации Т1, 1г и ^ 'н (с Ри> 0,95) уменьшались. Результаты вычисления значений КЗ для времен ЯМР релаксации и коэффициента самодиффузии ядер водорода в водных растворах РКС по-

мещевы в таблицу 13 (КЭ-Бв равен числу гидратации РКС).

Сравнительный анализ величин КЗ-?1, КЭ-тг я' КЭ-3„ показывает, что значения КЭ-Тг, КЭ-тг РКС достоверно (с Рг > 0,95) линейно связаны с величинами КЭ-Г»В, то есть гидратационных чисел РКС.

Полученные числа гидратации и величины КЭ-з?г и КЭ-тг совпадают в тенденциях и показывают, что взаимодействие с водой уменьшается в ряду: эндобил, иоподат Ка и иопаноат На, билигност (оба его соли), метризамид, тркомбраст 76% и йодамид 380.

В таблице 14 приведены вычисленные из. температурных зависимостей величины энергии активации (ее энталышйного (АН) и энтропийного (Х(АБ)) вкладов) отдельно для вращательной и поступательной подвижности протонов воде, отмеченные в таблице индексами "г" и "т" соответственно. Для сравнения в той же таблице помещены результаты аналогичных расчетов для дистиллированной воды.

В целом РКС увеличивают энтальпию активации вращательного движения и уменьшают времена релаксации и коэффициент самодиффузии *н молекул вода, за счет процессов сольватации, и следовз-тельно оказывают на воду структурирующее действие. Снижение энтальпии активации поступательного движения молекул вода в семи. РКС, за исключением триомбраста 76%, липотраста и йодамида 380,.' объясняется тем, что молекулярное движение самих РКС увлекает за собой молекулы воды сольватной части молекул воды переходных слоев (ближайших к молекуле РКС), облегчая, таким образом, переключение водородных связей.

Отдельно для ангиоурографических и холецистографических РКС наблюдается сильная обратная корреляция (г > 0,8) между количеством гидрофильных груш в молекулах и их осмолярностью.

РКС в больших концентрациях (более 10~3М) значительно умень-

шают времена релаксации и коэффициент самодиффузии ядер водорода, что отражает сильное взаимодействие этих веществ с молекулами вода и позволяет ис^-шьзовать методы ЯМР для исследования этого процесса. Однако полученные концентрационные зависимости влияния FKC на ЯМР характеристики протонов вода в целом указывают на нецелесообразность применения РКС для искусственного контрастирования при проведении магнитно-резонансной томографии.

Учитывая влияние РКС на тг и DQ в водных растворах, воз.' действие холецистографических РКС на состояние вода в ПК ыокно объяснить двумя механгзмами: 1). связывание РКС белками ПК (в гидрофобных зонах) уменьшает количество молекул РКС, с которыми может осуществляться взаимодействие молекул вод.; 2). в результате комплексообразовения РКС с С/ ПК происходит уменьшение связывания молекул воды с этим белком ПК. Индукция холецистографическими РКС снижения способности СА ПК поддерживать нормальное онкотическое давление ПК может сопровождаться изменением артериального давления и диуреза, нарушениями микроциркуляции и т.д. Кроме того, в увеличению диуреза при введении РКС в организм долкно приводит! значительное взаимодействие РКС с молекулами вода. Говоря о медико-биологическом значении полученных результатов исследовать следует отметить, что корреляция интенсивности воздействия холецистографических РКС на водно-белковое связывание с острой токсичностью РКС указывает на его важную роль в реализации биологической активности РКС и является обоснованием направленного поисю РКС с минимальной активностью по отношению к водному балансу.

вывода.

1). Для количественного анализа результатов изучения взаимодействия ютзкомолекулярзых лигандов с биополимерами методам! ядерного магнитного резонанса предложен новый критерий - коэффициент эффективности изменения времен' ЯМР релаксации или коэффициента са-модаффузли магнитных ядер малой молекулы в присутствии-полимера.

2). Коэффициент эффективности спин-спиновой релаксации ядер водорода химических групп PKG при взаимодействии их с белками плазмы крова мохет быть использован при скрининге новых РКС различной органотрошости.

3). Сродство РКС к белкам плазш крови зависит от химической структуры РКС и уменьшается в ряду: испаноат i.'a, коподат На, ск-лигносг 20% и 50%, эндобил, липотраст, триомбраст 76% (верогра-фин), йодамид 380, метризамид. Все изученные РКС в значительной мере взаимодействуют с сывороточным альбуминам, фибриногеном, сс-глобулинами, (3-глобулинами и т-глобулинаш; однако связывание РКС суммарной белковой-фракцией в плазме крови определяется преимущественным взаимодействием РКС с сывороточным альбумином.

4). Трийодзамещенное бензольное кольцо РКС принимает наиболее ак-: гишое участие во взаимодействии с белками плазш крови по срав-' нению- о другими химическими грушами РКС. При этом, чем меньше' объем заместителей в третьем и пятом положениях трийодзамещенного бензольного кольца, тем сильнее происходит его иммобилизация на поверхности белков плазмы крови в основном за счет гидрофобного взаимодействия.

5). Иопаноат Na, иоподат Na, билигност 20% и 50%, эндобил, липотраст, триомбраст 76% (верографин), йодамид 380 и мэтризамид (добавляемые в эквимолярлых концентрациях) не оказывают взаимного

/

влияния в комплексообразовании их с белками плазмы крови при соотношении общие концентраций РКС и бежов 100:1.

6). Таурохолевая к. слота и билирубин в концентрациях до 10"г Н н^

/

изменяют связывание РКС различной органотропности с сывороточнкм альбумином при соотношеныи общих концентраций РКС и белка 100:1. Показано, что таурохолевая кислота способна иммобилизовать молекулы холзцистографических РКС иопаноата Na, иоподата Na, билигно-ста 20% и 50%., эндобила.

7). РКС оказывают структурирующее действие на водную фазу плазмы крови, уменьшая подвижность и увеличивая энергетический барьер вращательного движения молекул воды. Взаимодействие РКС с водными молекулами в плазме крови по величинам коордш зционных чисел гидратации уменьшается со 114 ~р 8 в ряду: эндобил, иоподата Na, иопаноат Na, билигаост 20% и 50%, метризамид, триомбраст 76% (ва-рографан), лшотраст, Йодамид 380. Уменьшение времен ЯМР релаксации и коэффициента самодиффузии протонов плазмы крови на 50% достигается при высоких (более 0,5 М) концентрациях РКС в растворах.

8). Взаимодействие холецистографических РКС иопаноат.а Na, иоподата Na, билигноста 20% и 50%, эндобила (в уменьшающейся в этом ряду степени) с сывороточным альбумином приводит к снижению количества белково-связанной вода в плазме крови приблизительно на 10%. Аналогичное дегидратирующее влияние на 7-глобулин оказывает комплексообразование с ним метризамида.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: " 1. Критерий оценки взаимодействия лигандов с макромолекулами по данным ЯМР спектроскопии высокого разрешения.// Биофизика. -1988. - т.33. - J6 5. - с.776-780. (соавт. Шимановский Н.Л.\ Сте-

панянц А.У., Сергеев П.В.)

2. Исследование взаимодействия рентгеноконтрастннх средств с белка»,от плазмы крови методом ЯМР высокого разрешения.// Тезиса докладов Всесоюзной конференции "Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве". - Казань. - 1988. - ч.2. - с.35-26. (с.озвт. 'Шимановский Н.Л., Степанянц А.У., Краснова М'.М.)

3. Молекулярные механизмы органотропности и токсичности рентгеноконтрастных средств. // Тезисы докладов VI Всесоюзного съезда фармакологов - сборник " Фармакология и научно-технический прогресс". - Ташкент. - 1988. - с.424-426. (соавт. Шимановский Н.Л., Болотова E.H., Пухальская Т.Г., Мануйлов К.К., Наполов Ю.К., Усенко А.Н.)

4. Использование ЯМР спектроскопии и релаксационных методов ЯМР для изучения взаимодействия РКО с компонентами крови.// Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подхода". - Москва. - 1989. - с.244. (соавт. Едаарал И.В., Степанянц А.У., ШиыаноЕ-ский Н.Л.). "

5. Использование ЯМР релаксации для изучения взаимодействия лекарственных средств с компонентами кроЕи.// Тезисы докладов VII Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине". - Черноголовка. - 1989. - 0.228-229". (соавт. Краснова М.М., Еднерал И.В., Маркова М.М., Шимановский Н.Л.)

6. Исследование взаимодействия воды с йодсодерхащими ароматическими соединениями методами ЯМР релаксации.// Тезисы докладов Все-' союзной научной конференции "Фязхимия SO". - Москва. - 1990. .-■ с.133. (соавт. Сергеев П.В., Дараган В.А., Шимановский Н.Л., Еднерал И.В.)