Исследование стереоизомеров амлодипина хроматографическими методами и изучение их фармакокинетики

Чеча, Ольга Александровна

Диссертации по медицине → Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование стереоизомеров амлодипина хроматографическими методами и изучение их фармакокинетики

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Чеча, Ольга Александровна Старая Купавна 2011 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.03.06

Автореферат диссертации по медицине на тему Исследование стереоизомеров амлодипина хроматографическими методами и изучение их фармакокинетики

На правах рукописи

ЧЕЧА Ольга Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТЕРЕОИЗОМЕРОВ АМЛОДИПИНА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФАРМАКОКИНЕТИКИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.04.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия.

- 8 ЛЕК 2011

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Старая Купавна - 2011г.

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России

Научные руководители:

доктор медицинских наук

Миронов Александр Николаевич

доктор фармацевтических наук, профессор

Бунятян Наталья Дмитриевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Яворский Александр Николаевич

доктор фармацевтических наук,

Чистяков Виктор Владимирович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития России

диссертационного с_______ __. , йский научный центр

по безопасности биологически активных веществ» (ОАО «ВНЦ БАВ») по адресу: 142450, Московская обл., г. Старая Купавна, ул. Кирова, д.23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ.

Автореферат разослан « » /¿¡¡^Я-^!^/ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук В.В. Яснецов

Защита состоится

часов на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Большое количество зарегистрированных в России лекарственных средств (ЛС) представляют собой рацематы (смесь лево- и правовращающихся стереоизомеров). Энантиомеры (стереоизомеры) при одинаковых химических и физических параметрах могут иметь разные фармакокинетические и фармакодинамические свойства.

Проблема использования рацемических препаратов состоит во взаимодействии каждого из стереоизомеров с рецепторами человеческого организма. При этом терапевтический эффект в рацемате может проявлять только один из стереоизомеров, в то время, как второй остается малоактивным. Так, левовращающие стереоизомеры селективных р-блокаторов амлодипина и метопролола обусловливают блокаду ргадренергических рецепторов, а Я-стереоизомеры значительно менее активны и проявляют относительно небольшую р2-антагонистическую активность [Воронков Л.Г., 2007, Алексеев В .В., 1998]. Известны примеры использования рацемических препаратов, когда один из стереоизомеров оказывал выраженное токсическое действие, что приводило к трагическим последствиям [Арсеньева К.Е. 2008; Дадык А.И. и соавт., 2008, Лутай М.И. и соавт.,2009]. Это объясняет неэффективность некоторых синтезированных ЛС и нежелательное их воздействие на организм человека. Поэтому при оценке качества ЛС необходимо оценивать оптическую активность стереоизомеров.

стереоселективным и связь с S (-) изомером в 1000 раз сильнее, чем с R (+) -изомером [Zhang Х.Р., 2002; Арсеньева К.Е., 2008]. Стереоселективность рецепторов к S (-) и R (+) изомерам объясняет различия в клиренсе, биодоступности и клинической активности препарата. Применение левовращающего S (-) изомера амлодипина вместо его рацемической смеси может иметь важные преимущества, т.к. необходимая доза и системная токсичность при этом будут снижены [Арсеньева К.Е., 2008]. Однако R -энантиомер не является полностью фармакологически инертным [PatilP.A., Kothekar М.А., 2006]. Считается, что именно присутствие R - энантиомера в рацемате амлодипина обусловливает развитие наиболее характерной для препарата побочной реакции - периферических отеков [Blankfield R.P., 2005; Лутай М.И. и соавт., 2009].

В связи с тем, что стереоизомеры амлодипина имеют близкие физические и химические свойства, при их исследовании и разделении используются в первую очередь хроматографические методы анализа (тонкослойная - ТСХ и высокоэффективная жидкостная хроматография - ВЭЖХ) [Ананьева И.А. и др., 2003; Буданова Н.Ю., 2005; Abdoul-Einen H.Y., 1999].

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным изучение стереоизомеров R (+) - и S (-) - амлодипина с последующим исследованием их фармакокинетики, что и определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: разделение смеси стереоизомеров R (+) - и S (-) -амлодипина хроматографическими методами и исследование фармакокинетики препаратов амлодипина различных производителей.

Задачи исследования.

1. Разработать качественную и количественную методику разделения R (+) - и S (-) - амлодипина с помощью хроматографических методов.

2. Определить процентное содержание R (+) - и S (-) - стереоизомеров амлодипина в субстанциях и таблетках различных производителей.

3. Провести изучение сравнительного высвобождения R (+) - и S (-) -амлодипина из таблеток различных производителей в условиях in vitro.

4. Разработать методику количественного определения R (+) - и S (-) -стереоизомеров амлодипина в плазме крови добровольцев.

5. Изучить фармакокинетику R (+) - и S (-) - амлодипина у добровольцев после однократного приема изучаемых препаратов.

Научная новизна. Впервые разработаны методики количественного определения смеси стереоизомеров амлодипина в субстанциях, таблетках и в биологической жидкости; впервые установлено процентное соотношение стереоизомеров R (+) - и S (-) - амлодипина в субстанциях и таблетках различных производителей; впервые изучены особенности фармакокинетики стереоизомеров R (+) - и S (-) - амлодипина после однократного приема препаратов амлодипина различных производителей; впервые исследована динамика высвобождения R (+) - и S (-) - амлодипина из таблеток в условиях in vitro.

Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику. Использование разработанного нами хроматографического способа разделения смеси стереоизомеров R (+) - и S (-) - амлодипина в субстанциях и таблетках позволяет с высокой точностью определять количественное содержание энантиомеров при проведении контроля качества JIC. Получен патент: «Способ разделения оптических изомеров амлодипина» № 2357781 РФ на разработку метода ТСХ, который используется в Испытательном Центре экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России.

Разработанная нами методика количественного определения смеси стереоизомеров R (+) - и S (-) - амлодипина в плазме крови позволяет изучать фармакодинамику стереоизомеров in vitro. Данная методика используется в аналитической и клинической практике Центра Клинической Фармакологии ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России, в педагогическом и научном

процессе кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова.

Связь задач исследования с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и в соответствии с планом НИР Института клинической фармакологии ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора на 2005-2010г. по теме: «Разработка методологии оценки качества субстанций на основе изучения содержания в них оптических и стереоизомеров лекарственных средств» (номер Государственной регистрации - 01.3.009.6454).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006г.); на Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнология» (Самара, 2008г.); на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Клязьма, 2008г.); на 2-ом Конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (Москва, 2010г.); на совместной научно-практической конференции Филиала «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН, кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних заболеваний ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова, Центра клинической фармакологии ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России (Москва, 2011г.).

Личный вклад автора: Автору принадлежит роль в подготовке биологического материала к проведению аналитического исследования, непосредственном анализе биопроб на ВЭЖХ, расчете фармакокинетических параметров с использованием необходимых компьютерных программ. Непосредственно автором разработан способ количественного разделения стереоизомеров амлодипина с помощью методов ТСХ и ВЭЖХ. Лично автором проводился хроматографический анализ субстанций и таблеток амлодипина различных производителей. Статистическая обработка данных, анализ результатов исследования, подготовка иллюстрационного материала и оформление диссертационной работы выполнены автором самостоятельно.

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ и 1 Патент.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработка качественной и количественной методики разделения смеси стереоизомеров амлодипина методом ТСХ.

2. Разработка методики количественного определения стереоизомеров Я (+) - и 8 (-) - амлодипина в субстанциях и таблетках различных производителей методом ВЭЖХ.

3. Разработка методики количественного определения Я (+) - 8 (-) -амлодипина в плазме крови методом ВЭЖХ.

4. Усредненная динамика концентраций Я (+) - и 8 (-) - амлодипина после однократного приема препаратов амлодипина различных производителей.

5. Усредненная фармакокинетика Я (+) - и 8 (-) - амлодипина после однократного приема препаратов амлодипина различных производителей.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Список литературы включает 186 источников литературы, в том числе 126 на иностранных языках.

Результаты эксперимента обработаны статистически и обобщены в 32 таблицах и проиллюстрированы 16 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Для разработки качественных и количественных методик разделения стереоизомеров амлодипина были выбраны методы ТСХ и ВЭЖХ.

Для проведения исследований было использовано следующее оборудование и материалы: хроматографические пластинки «Chiralplate»; высокоэффективные жидкостные хроматографы фирмы «Shimadzu C-R3A» с УФ - спекгрофотометрическим детектором «Shimadzu» и фирмы «Agilent 1100» (США) с масс-спектрометрическим детектором; УФ-детектор; весы электронные; мешалка лопастная; лабораторная центрифуга; электронный рН-метр; вибровстряхивательУоПех; роторный испаритель с вакуумным насосом; холодильная (+4°С) и морозильная (-35°С) камеры.

При приготовлении подвижных фаз и пробоподготовке использовались следующие растворители: формальдегид, метанол, ацетонитрил класса HPLC gradiet, ледяная уксусная кислота ХЧ, спирт этиловый, вода дистиллированная, кислота соляная ЧДА, калия дигидрофосфат ЧДА, кислота ортофосфорная ХЧ.

Объектом исследования служила субстанция амлодипина бесилат:

Рисунок 1. Химическая формула стереоизомеров Я (+) - и Б (-) -амлодипина.

Для определения содержания стереоизомеров Я (+) - и Б (-) - амлодипина использовались субстанции следующих производителей:

ОАО «Гедеон Рихтер», Венгрия и ЗАО «Биоком», Россия. Для определения содержания И. (+) - и Б (-) - амлодипина использовались следующие таблетки:

- Амловас, Юник Фармасьютикал Лабораториз, Индия;

- Амлодипин-Биоком, ЗАО «Биоком» Россия;

- Амлодипин, ЗАО «Аптека-Валента» Россия;

- Нормодипин, ОАО «Гедеон Рихтер» Венгрия.

Фармакокинетическое исследование проводилось на здоровых добровольцах. В качестве добровольцев были привлечены мужчины и женщины, добровольно изъявившие желание участвовать в исследовании. Добровольцы в период 1-14 дней проходили углубленное врачебное исследование (сбор анамнеза, врачебный осмотр, биохимическое исследование крови, общий анализ крови и мочи).

Добровольцы были проинформированы о том, что во время всего исследования они должны соблюдать стандартный режим: не подвергаться физической и психической нагрузке, не употреблять кофе, спиртные напитки и различные лекарственные препараты. Также они обязаны были сообщать о любых изменениях режима и самочувствия до и после фармакокинетического исследования. После получения полной информации о ходе проведения исследования при наличии письменного согласия добровольцев, наличия у них критериев включения и отсутствии критериев исключения проводилось страхование добровольцев в соответствии с требованиями клинических испытаний. В день проведения клинического исследования врач делал соответствующую запись в индивидуальной карточке добровольца.

Добровольцы принимали внутрь, натощак таблетку в дозе 5 мг (Я,Б) -амлодипина, запивая 200 мл воды. Образцы крови отбирались из локтевой вены в количестве 10 мл в стеклянные пробирки с добавлением гепарина до и после приема препарата в определенные интервалы времени в соответствии с утвержденным протоколом.

Для оценки пригодности хроматографической системы рассчитывали: величину подвижности (1^); число теоретических тарелок (Ы); коэффициент емкости (к); селективность (а); степень разделения (Я). Статистическая обработка результатов количественного определения проводилась в

соответствии с требованиями ГФ XI издания с помощью пакета Microsoft Office Exel - 2007 для персонального компьютера. Обработка экспериментально полученных фармакокинетических кривых производилась с помощью программы «KinetiKa2000».

Разработка методики разделения стереоизомеров амлодипина методом тонкослойной хроматографии

Для разделения стереоизомеров амлодипина требуется подбор оптимальных условий хроматографирования. Правильный выбор сорбента и подвижной фазы определяет эффективность (полноту) разделения. Разделение смеси стереоизомеров амлодипина стало возможным на оптически-активных пластинках. Подбор подвижной фазы обусловливается природой

анализируемой смеси.

В качестве неподвижной фазы использовали хроматографическую пластинку «Chiralplate». Пластинку предварительно активировали при температуре 100°С в течение 15 мин. На линию старта подготовленной пластинки наносили в виде точек по 0,3 мкл субстанции (рацемической смеси) амлодипина и по 0,3 мкл стандартных растворов R (+) - амлодипина и S (-) -амлодипина. Хроматографировали одномерным восходящим способом, без предварительного насыщения хроматографической камеры. Наилучшие результаты показала система формалин-ацетонитрил-метанол в соотношении 6:2:4. После прохождения системой растворителей 8-ми см пластинку вынимали из камеры и сушили в вытяжном шкафу до удаления запаха растворителей. При просматривании в УФ-свете при 254 нм на хроматограмме обнаруживалось разделение рацемической субстанции амлодипина на R (+) -амлодипин с Rf - 0,42 и S (-) - амлодипин с Rf - 0,56. Обрабатывали хроматографическую пластинку с помощью видеоденситометра «Сорбфил» (рис.2).

Рисунок 2.Денситограмма разделения стереоизомеров амлодипина

В таблице 1 представлены хроматографические параметры разделения стереоизомеров амлодипина.

Таблица 1.

Хроматографические параметры разделения амлодипина

Пик Яг Площадь пика С% Высота пика Н% ЧТТ В ЭТТ Симм етрия пика

Я 0,42 10717 46,8 978 44,6 250 0,19 0,98

э 0,55 12181 53,2 1217 55,4 435 0,14

сумма 22898 2195

Таким образом, данные хроматографического разделения показывают оптимальное разделение рацемата амлодипина на отдельные стереоизомеры Я(-) - иБ (+) - амлодипина. Симметрия пика 0,98, при требовании 1,0 говорит о достаточном разделении одного пика от другого.

Разработка методики разделения стереоизомеров методом ВЭЖХ в субстанциях и таблетках различных производителей

Для количественного разделения стереоизомеров Я (-) - амлодипин и Б (+) - амлодипина необходима высокоэффективная и селективная методика.

Поэтому нами был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с хиральной колонкой на циклодекстрине. Данный метод является широко используемым для анализа ЛС. Большое значение для разделения стереоизомеров являлся подбор оптимальных условий хроматографического разделения стереоизомеров Я (-) - и 8 (+) - амлодипина. Одним из важных условий хроматографирования являлся выбор подвижной и неподвижной фазы.

Неподвижная фаза - хроматографическая колонка СЫгаЭех® (250x4 мм, 5 цт) иСЬгоСаЛ. С целью воспроизводимости времен удерживания аналитическую колонку термостатировали при температуре 20°С. Подвижную фазу перед использованием фильтровали и дегазировали под вакуумом в течение 15 мин. Для установления стабильности базовой линии систему уравновешивали с помощью выбранной подвижной фазы. Разделение проводили при комнатной температуре. При выборе подвижной фазы использовали элюенты разного состава и соотношения. Скорость потока составляла 0,1 мл/мин, детектирование проводили при длине волны 237 нм.

Объем пробы 10 мкл.

В таблице 2 представлены хроматографические параметры разделения изомеров амлодипина при использовании различных подвижных фаз:

Хроматографические параметры разделения изомеров

амлодипина в изученных подвижных шах

Вариант системы Время 1 удерживания Б-амлодипина Время удерживания Л-амлодипина Коэффициент емкости Селективность Степень разделения

метанол - вода 2 мин 2 мин 2 1 0

ацетонитрил-метанол-буферный раствор рНЗ,0 5,8мин 4,6 мин 4,8/3,6 0,75 1,4

ацетонитрил - фосфатный буфер 6 мин 6 мин 6 1 0

метанол - дигидрофосфатный буфер 6 мин 6 мин 6 1 0

ацетонитрил - дигидрофосфатный буфер 6 мин 6 мин 6 1 0

ацетонитрил-метанол-буферный раствор рН 3,5 6 мин 5,5мин 6 0,82 од

В представленной таблице показаны хроматографические параметры разделения амлодипина в изученных подвижных фазах, наиболее эффективное разделение показала подвижная фаза состава: ацетонитрил-метанол-буферный раствор рН 3,0 в соотношении 60:35:15.

В таблице 3 даны хроматографические характеристики разделения изомеров амлодипина.

Хроматографические характеристики разделения изомеров амлодипина

Параметры Я(+)-амлодипин 8(-)-амлодипин

Время удерживания (1) 4,6 5,8

Коэффициент емкости (к1) зд 4Д

Число теоретических тарелок (Ы) 6500 6900

Фактор симметрии (Аэ) 0,95 1,0

Селективность (а) 0,75

Коэффициент удерживания (Я) 1,4

Согласно представленным данным хроматографические характеристики разделения изомеров свидетельствуют о достаточно полном разделении пиков на хромато грамме.

С целью количественной оценки содержания изомеров амлодипина в образцах проб строили калибровочный график зависимости площади пика от концентрации препарата в диапазоне концентраций 10-250 мкг/мл. Калибровочная зависимость носила линейный характер.

Уравнение калибровочной зависимости для определения Б (+) -амлодипина: у = 969,41х +903,77.

Уравнение калибровочной зависимости для определения Я (-) -амлодипина: у = 963,65х +634,98.

Величина коэффициента регрессии оказалось близка к 1 как в случае анализа 8 (-) - амлодипина (Я2 - 0,9989), так и в случае анализа Я (+) -амлодипина (Я2- 0,9968).

Для оценки точности и воспроизводимости разработанной методики количественного определения амлодипина в растворе по результатам 10-ти параллельных измерений 5-ти концентраций препарата были рассчитаны метрологические характеристики метода. Проведение статистической обработки полученных результатов показало их достоверность: относительная

ошибка метода не превышала 10%. В связи с этим были изучены хроматографические параметры разделения изомеров амлодипина в субстанциях производства ОАО «Гедеон Рихтер», Венгрия и производства ЗАО «Биоком», Россия. Данные хроматографических параметров субстанций представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Хроматографические параметры разделения изомеров амлодипина в субстанциях различных производителей

Параметр Амлодипин, производства ОАО «Гедеон Рихтер», Венгрия Амлодипин, производства ЗАО «Биоком», Россия

Ш+) Я(+)

Коэффициент емкости (к') 0.58 1.01 0.52 1.08

Число теоретических тарелок (Ы) 6900 6500 6900 6500

Селективность (а) 1,74 2,07

Степень разрешения (Я) 2,3 3,5

Таким образом, согласно данным хроматографических параметров (селективности и степени разрешения), данную методику можно использовать для количественного разделения стереоизомеров амлодипина различных производителей методом ВЭЖХ.

В таблице 5 представлено процентное содержание в субстанциях амлодипина производства ОАО «Гедеон Рихтер», Венгрия и ЗАО «Биоком», Россия.

Процентное содержание в субстанциях изомеров

Я (+) - амлодипина иБ (-) - амлодипина_

Субстанция Я-амлодипин Б-амлодипин

Амлодипин, производства, ОАО «Гедеон Рихтер», Венгрия 50±0,01% 50±0,01%

Амлодипин, производства, ЗАО «Биоком», Россия 50±0,01% 50±0,01%

Согласно проведенного исследования, различия в содержании Я (+) -амлодипин и Б (-) - амлодипин были статистически достоверными (р> 0,05).

Таким образом, достоверно установлено, что субстанции одного и того же производителя имеют сходное соотношение изомеров и представляют собой рацемическую смесь. Однако такое соотношение стереоизомеров может изменяться в процессе изготовления лекарственной формы. В связи с этим, целью дальнейших исследований стало количественное определение содержания Я (+) - амлодипина и Б (-) - амлодипина в готовой лекарственной форме - таблетках различных производителей (таблица 6).

Таблица 6

Содержание изомеров амлодипина в таблетках_

Производитель Я-изомер, % Б-изомер, %

Нормодипин, АОА «Гедеон Рихтер», Венгрия 51 49

Амлодипин-Биоком, ЗАО «Биоком», Россия 50 50

Амлодипин, ОАО «Аптека-Валента», Россия 52 48

Амловас, Индия 55 45

Из представленных в таблице 6 данных следует, что таблетки амлодипина содержат как Б (-) -, так и Я (+) - изомеры амлодипина, отличающиеся

незначительно друг от друга на 3-5%, что, по всей видимости, может быть обусловлено с особенностями в технологическом процессе при изготовлении лекарственной формы.

На следующем этапе исследований необходимо было определить кинетику высвобождения Я (+) - амлодипина и Б (-) - амлодипина из таблеток различных производителей.

На рисунках 4 и 5 представлена усредненная кинетика высвобождения Я (+) - амлодипина и 8 (-) - амлодипина из таблеток различных производителей. На рисунке 4 представлена кинетика высвобождения Я-амлодипииа.

----—амлод-Биоком

А_

_«"й^амлодипин

—■—нормодипин 30 н амловас

Рисунок 4.Усредненная кинетика высвобождения Я - амлодипина in vitro из таблеток различных производителей.

На

100 80 60 40 20 О

Рисунок 5. Усредненная кинетика высвобождения S-амлодипина in vitro из таблеток различных производителей

Как видно из рисунков 4 и 5, кинетика высвобождения Я (+) - и S (-) -амлодипина из таблеток различных производителей достоверно не различалась,

амлодипина.

—ф—амлод-Биоком амлодипин

........——нормодипин

К амловас

рисунке 5 представлена кинетика высвобождения S -

т.е. скорость и степень высвобождения отдельных стереоизомеров амлодипина из лекарственных форм были сопоставимы.

Изучение фармакокинетики изомеров амлодипина

Выявление фармакокинетических особенностей отдельных изомеров открывает перспективное направление в совершенствовании уже известных лекарственных препаратов. Разработка методики количественного определения любого лекарственного препарата из биологического материала методом ВЭЖХ включает в себя: подбор условий хроматографирования, извлечение лекарственного вещества из биологической жидкости, количественный анализ.

Подготовку проб проводили разработанным нами способом: к 1 мл плазмы добавляли 4 мл хлороформа, смесь встряхивали на механическом шейкере в течение 10 минут, затем центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин, отбирали органический слой, упаривали, а сухой остаток растворяли в 150 мкл подвижной фазы. Аликвоту (100 мкл) вводили в хроматограф. Пробы готовили непосредственно перед анализом. Разделение проводили на колонке ChiraDex® (250x4 мм, 5 цш) LiChroCart при комнатной температуре. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил-метанол-буферный раствор рН 3,0 в соотношении 60:35:15. Скорость потока составляла 0,1 мл/мин, детектирование проводили при длине волны 237нм.

Изучение фармакокинетики R,S - амлодипина в плазме крови после однократного перорального приема таблеток амлодипина в дозе 5 мг

Значения усредненной динамики концентраций R (+) - и S (-) -амлодипина и их фармакокинетики после однократного приема препарата Амлодипин-Биоком производства ЗАО «Биоком», Россия в дозе 5 мг представлены на рисунке 7.

о 2 А в в Ю 12 1-* 16 18 20 22 24 Время, мае

Рисунок 7. Динамика концентрации изомеров Я (+) - и Б (-) - амлодипина в таблетках Амлодипин-Биоком, производства ЗАО «Биоком», Россия.

Как видно из рисунка, характер фармакокинетических кривых изомеров амлодипинам сходен, при этом, индивидуальная вариабельность концентраций изомеров примерно одинакова.

В таблице 7 представлены усреднённые значения фармакокинетических параметров таблеток Амлодипин-Биоком производства ЗАО «Биоком», Россия после однократного приема в дозе 5 мг.

Таблица 7

Усреднённые значения фармакокинетических параметров таблеток Амлодипин-Биоком после однократного приема в дозе 5 мг

Стереоизомер ^шах? Час Стгх, нг/мл АиС, нг-ч/мл \.т, час

Б-амлодипин 3 130 1867 6,5

Я-амлодипин 4 120 2543 5,5

Обращает внимание статистически достоверные различия (р<0,05) в параметрах фармакокинетики. Максимальная концентрация Я - амлодипина (130 нг/мл) была выше уровня Б - амлодипина (120 нг/мл). Период полувыведения левого изомера амлодипина на 1 час больше, чем правого изомера, а время достижения максимальной концентрации на 1 час меньше (1тах Б -амлодипина 3 часа, и» Я -амлодипина 4 часа).

Значения усредненной динамики (Я, Б) - амлодипина в плазме крови и их фармакокинетики после однократного приема препарата Амлодипин производства ЗАО «Аптека-Валента», Россия представлено на рисунке 8.

вре мя, MAC

Рисунок 8. Динамика концентрации изомеров R (+) - и S (-) - амлодипина производства ЗАО «Аптека-Валента», Россия

Как видно из представленных данных, концентрация R (-) - амлодипина выше, чем S (+) - амлодипина. Из представленных данных видно, что профиль динамики концентрации S - амлодипина характеризуется статистически достоверно более низкими параметрами Cmax, AUC, t1/2(p< 0,05).

Усреднённые значения фармакокинетических параметров (R, S)-амлодипина после однократного приема таблеток Амлодипина ЗАО «Аптека-Валента» в дозе 5 мг представлены в таблице 8.

Таблица 8

Усреднённые значения фармакокинетических параметров (Я,Б) - амлодипина

после однократного приема таблеток Амлодипина в дозе 5 мг _производитель ЗАО «Аптека-Валента», Россия _

Стереоизомер tmax, час Стах, НГ/МЛ AUC, нг-ч/мл t1/2, час

S-амлодипин 3 95 1956 6,5

R-амлодипин 4 135 2134 8,2

Как видно из таблицы, максимальная концентрация 8 (-) - амлодипина (95 нг/мл) была ниже уровня Л (+) - амлодипина (135 нг/мл). Период полувыведения левого изомера амлодипина меньше, чем правого изомера, а время достижения максимальной концентрации было на 1 час больше у Я (+) -амлодипина - 4 часа, а у Б (-) - амлодипина - 3 часа.

Усреднённые значения фармакокинетических параметров (Я, Б) -амлодипина после однократного приема таблеток Нормодипина производства ОАО «Гедеон Рихтер», Венгрия представлена на рисунке 9.

С 8 Ю 12 1А 16 1в 20 22 24

Время, час

Рисунок 9. Динамика концентраций изомеров R(+)- и S(-) -амлодипина, при приеме таблеток Нормодипина, производства ОАО «Гедеон Рихтер»Венгрия

Из рисунка видно, что кривая R (+) - амлодипина имеет более сглаженный профиль, чем кривая S (-) - амлодипина. Пик максимума концентрации менее выражен и растянут во времени. При этом основные фармакокинетические параметры tmax, Cmax, AUC, t1/2 статистически достоверно различаются (р<0,05).

Таблица 9

Усреднённые значения фармакокинетических параметров (Я,Б) - амлодипина после однократного приема таблеток Нормодипин _в дозе 5 мг производства ОАО «Гедеон Рихтер», Венгрия_

D Д U Стереоизомер tmax, час Стах, нг/мл AUC, нг-ч/мл tie, час

S-амлодипин 4 84 1598 7

Я-амлодипин 4 128 2645 8

Как видно из таблицы 9, максимальная концентрация S - амлодипина (84 нг/мл) была ниже уровня R - амлодипина (128 нг/мл). Период полувыведения левого изомера амлодипина меньше на 1 час, чем правого изомера, а время достижения максимальной концентрации было одинаковым (W S -амлодипина 4 часа, t,^ R - амлодипина 4 часа).

Выводы

1. Разработана качественная и количественная методики определения R(+) - и S (-) - стереоизомеров амлодипина в субстанциях и таблетках методом ТСХ и ВЭЖХ с применением УФ-детектора и хиральной неподвижной фазы (колонки), что позволило провести идентификацию и количественное определение стереоизомеров амлодипина.

2. Установлено процентное соотношение R (+) - и S (-) -стереоизомеров амлодипина в субстанциях различных производителей. Показано, что у субстанций амлодипина производства ОАО «Гедеон Рихтер», Венгрия и ЗАО «Биоком», Россия соотношение стереоизомеров статистически достоверно не различалось.

3. Определено процентное содержание R (+) - и S (-) - стереоизомеров амлодипина в таблетках разных производителей. Установлено, что соотношение стереоизомеров амлодипина незначительно отличается у различных производителей.

4. Изучены степень и скорость высвобождения стереоизомеров амлодипина из таблеток в условиях in vitro различных производителей, которые достоверно различаются.

5. Исследования плазмы крови добровольцев после однократного приема таблеток амлодипина различных производителей показали, что фармакокинетические параметры стереоизомеров R (+) -и S (-) - амлодипина статистически достоверно отличаются.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чеча O.A., Пахомов В.П. Хроматография в исследовании оптических изомеров лекарственных препаратов // Ведомости научного центра экспертизы медицинского применения. - М. -2006 г. №3.- С. 38-42.

2. Чеча O.A., Пахомов В.П. Выделение оптически активных субстанций с использованием препаративной жидкостной хроматографии // Фармацевтическая промышленность. - М., -2007, №1. - С. 80-82.

3. Чеча O.A., Пахомов В.П. Стереоспецифичность лекарственных препаратов // Фармацевтическая промышленность. - М.,-2007, №5-6,- С. 104106.

4. Чеча O.A. , Пахомов В.П. Высокоэффективная жидкостная и тонкослойная хроматографии в исследовании лекарственных препаратов. // Фармацевтическая промышленность. - М., -2008 г, № 2, - С. 69-71.

5. Чеча O.A., Пахомов В.П. Тонкослойная хроматография в исследовании оптически активных лекарственных препаратов // Тезисы доклада Всероссийского симпозиума «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия». -Клязьма,-2008г.-С 141.

6. Чеча O.A., Пахомов В.П., Аззам Нисрин Исследования оптически активных лекарственных субстанций // Фармацевтическая промышленность. -М., 2008,№5.-С. 84-86.

7. Чеча O.A., Пахомов В.П. Планарная хроматография в исследовании оптически активных лекарственных препаратов // Химико-фармацевтический журнал, М., -2010, -Т.44, -№ 2. - С. 54-56.

8. Чеча O.A., Пахомов В.П., Яшин Я.И. Хроматографическое исследование оптически активных лекарственных соединений // Тезисы доклада «Аналитическая химия - новые методы и возможности», - Клязьма, -2010.-С.220.

9. Чеча O.A., Горошко O.A., Пахомов В.П., Исмагилов Т.Д. и др. Сорбенты для тонкослойной хроматографии в фармацевтическом анализе // Химико-фармацевтический журнал, М.,-2010, -Т.44, -№ 9. - С. 53-56.

10. Патент: «Способ разделения оптических изомеров амлодипина» № 2357781 РФ

Подписано в печать: 23.11.2011 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 565 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Страстной бульвар, д. 6,стр. 1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru

Оглавление диссертации Чеча, Ольга Александровна :: 2011 :: Старая Купавна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Теоретические основы оптической активности

1.2.Связь стереохимии с эффективностью и безопасностью лекарственных средств

1.3.Фармакокинетические различия в действии оптических изомеров амлодипина

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 .Материалы, оборудование, реактивы

2.2.Стандартные образцы и препараты содержащие амлодипин

2.3 .Оценка хроматографических параметров

2.4.Тактика фармакокинетического исследования

2.5.Статистический анализ фармакокинетических данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Разработка методик разделения изомеров И. (+) - и 8 (-) - 61 амлодипина в тонких слоях сорбента

3.2.Выбор оптимальных хроматографических условий 65 разделения стереоизомеров Я (+) - и 8 (-) - амлодипина методом ВЭЖХ

3.3.Количественное определение стереоизомеров амлодипина 73 ВЫВОДЫ

ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ

СТЕРЕОИЗОМЕРОВ АМЛОДИПИНА В СУБСТАНЦИЯХ И ТАБЛЕТКАХ РАЗЛИЧНЫХ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

4.1 .Определение содержания стереоизомеров амлодипина в 80 образцах субстанций различных производителей 4.2.Изучение высвобождения стереоизомеров из таблеток 82 амлодипина разных производителей

ВЫВОДЫ

ГЛАВА 5 .ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

СТЕРЕОИЗОМЕРОВ Я (+) - и 8 (-) -АМЛОДИПИНА 5.1 .Методика определения стереоизомеров амлодипина в плазме крови

5.2. Изучение фармакокинетических параметров амлодипина в 92 плазме крови

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Чеча, Ольга Александровна, автореферат

Актуальность темы

Большое количество зарегистрированных в России лекарственных средств (ЛС) представляют собой рацематы (смесь лево- и правовращающихся стереоизомеров). Энантиомеры (стереоизомеры) при одинаковых химических и физических параметрах могут иметь разные фармакокинетические и фармакодинамические свойства.

Проблема использования рацемических препаратов состоит во взаимодействии каждого из стереоизомеров с рецепторами человеческого организма. При этом терапевтический эффект в рацемате может проявлять только один из стереоизомеров, в то время, как второй остается малоактивным. Так, левовращающие стереоизомеры селективных р-блокаторов амлодипина и метопролола обусловливают блокаду рг адренергических рецепторов, а Я-стереоизомеры значительно менее активны и проявляют относительно небольшую (^-антагонистическую активность [И, 1]. Известны примеры использования рацемических препаратов, когда один из стереоизомеров оказывал выраженное токсическое действие, что приводило к трагическим последствиям [4, 17, 27]. Это объясняет неэффективность некоторых синтезированных ЛС и нежелательное их воздействие на организм человека. Поэтому при оценке качества ЛС необходимо оценивать оптическую активность стереоизомеров.

Одним из наиболее часто применяемых ЛС при лечении сердечнососудистых заболеваний является амлодипин. До последнего времени его использовали в виде рацемической смеси право- и левовращающих стереоизомеров. Вместе с тем, установлено, что способность блокировать кальциевые каналы Ь-типа принадлежит преимущественно левовращающему Б-стереоизомеру [27]. Изучение амлодипина показало, что присоединение к дигидропиридиновым рецепторам является стереоселективным и связь с 8 (—) 5 изомером в 1000 раз сильнее, чем с К (+) -изомером [4, 85]. Стереоселективность рецепторов к 8 (—) и Я (+) изомерам объясняет различия в клиренсе, биодоступности и клинической активности препарата. Применение левовращающего Б (-) изомера амлодипина вместо его рацемической смеси может иметь важные преимущества, т.к. необходимая доза и системная токсичность при этом будут снижены [4]. Однако Я -энантиомер не является полностью фармакологически инертным [147]. Считается, что именно присутствие II - энантиомера в рацемате амлодипина обусловливает развитие наиболее характерной для препарата побочной реакции - периферических отеков [27, 81].

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным изучение« стереоизомеров Я (+) - и Б (-) - амлодипина с последующим исследованием их фармакокинетики, что и определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: разделение смеси стереоизомеров Я (+) - и Б (-) -амлодипина хроматографическими методами и исследование фармакокинетики препаратов амлодипина различных производителей.

Задачи

1. Разработать качественную и количественную методику разделения Я (+) - и Б (-) - амлодипина с помощью хроматографических методов.

2. Определить процентное содержание Я (+) - и 8 (-) -стереоизомеров амлодипина в субстанциях и таблетках различных производителей.

3. Провести изучение сравнительного высвобождения R (+) - и S (-)

- амлодипина из таблеток различных производителей в условиях in vitro.

4. Разработать методику количественного определения R (+) - и S (-) - стереоизомеров амлодипина в плазме крови добровольцев.

Научная новизна

•Впервые разработаны методики количественного определения смеси стереоизомеров R (+) - и S (-) - амлодипина в субстанциях.

•Впервые разработаны методики количественного определения смеси стереоизомеров R (+) - и S (-) - амлодипина в таблетках.

•Впервые установлено процентное соотношение изомеров R (+) - и S (-)

- амлодипина в субстанциях различных производителей.

•Впервые установлено процентное соотношение изомеров R (+) - и S (-)

- амлодипина в таблетках различных производителей.

•Впервые разработаны методики количественного определения смеси стереоизомеров R (+) - и S (-) - амлодипина в плазме крови.

•Впервые изучены особенности фармакокинетики R (+) - и S (-) -амлодипина после однократного приема препаратов различных производителей.

•Впервые исследована динамика высвобождения R (+) - и S (-) -амлодипина из таблеток в условиях in vitro.

Разработанная нами методика количественного определения смеси стереоизомеров R (+) - и S (-) - амлодипина в плазме крови позволяет изучать, фармакодинамику стереоизомеров in vitro. Данная методика используется в аналитической и клинической практике Центра Клинической Фармакологии ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России, в педагогическом и научном процессе кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова.

Связь задач исследования с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и в соответствии с планом' НИР Института клинической фармакологии ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора на 2005-20 Юг. по теме: «Разработка методологии оценки качества субстанций на основе изучения содержания в них оптических и стереоизомеров лекарственных средств» (номер Государственной регистрации - 01.3.009.6454).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006г.); на Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнология» (Самара, 2008г.); на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Клязьма, 2008г.); на 2-ом Конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (Москва, 2010г.); на совместной научно-практической конференции Филиала «Клиническая фармакология». НЦ БМТ РАМН, кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних заболеваний ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова, Центра клинической фармакологии ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России (Москва, 2011г.).

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Разработка методики количественного определения стереоизомеров К (+) - и 8 (-) - амлодипина в субстанциях и таблетках различных производителей методом ВЭЖХ.

3. Разработка методики количественного определения К (+) - 8 (-) -амлодипина в плазме крови методом ВЭЖХ.

5. Усредненная фармакокинетика II (+) - и 8 (-) - амлодипина после однократного приема препаратов амлодипина различных производителей.

Объем и структура диссертации

Результаты эксперимента обработаны статистически и обобщены в 32 таблицах и проиллюстрированы 16 рисунками.

Заключение диссертационного исследования на тему "Исследование стереоизомеров амлодипина хроматографическими методами и изучение их фармакокинетики"

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработана качественная и количественная методика определения R (+) -и S (-) - изомеров амлодипина в субстанциях, таблетках различных производителей, методом ТСХ и ВЭЖХ с применением УФ - детектора и хиральной неподвижной фазы (колонки), что позволило добиться разделения стереоизомеров амлодипина.

2. Определено соотношение стереоизомеров амлодипина в субстанциях различных производителей. Показано, что у субстанции Амлодипин производства АОА «Гедеон Рихтер», Венгрия и в субстанции Амлодипин, производства ЗАО «Биоком», Россия соотношение составляло 1:1.

3. Определено процентное содержание R (+) - и S (-) - амлодипина в таблетках разных производителей. Установлено, что соотношение R (+) -и S (-) - изомеров амлодипина отличается незначительно у различных производителей. Изучено высвобождение R (+) - и S (-) - амлодипина из таблеток в условиях in vitro. Определено, что степень и скорость высвобождение R (+) - и S (-) - амлодипина у препаратов, выпущенных на разных производствах, может достоверно различаться.

4. Изучена фармакокинетика R (+) - и S (-) - амлодипина в плазме крови добровольцев после перорального приема таблеток амлодипина разных производителей. Показано, что уровни R (+) - и S (-) - амлодипина в крови могут статистически достоверно отличаться при приеме препаратов разных производителей. В изучаемых таблетках амлодипина максимальная концентрация R (+) - амлодипина была выше уровня S (-) -амлодипина.

5. Исследования плазмы крови добровольцев после однократного приема таблеток амлодипина различных производителей показали, что фармакокинетические параметры стереоизомеров R (+) - и S (-) -амлодипина статистически достоверно отличаются.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время все большее применение находят так называемые «гибридные» методы в практике количественного определения содержания лекарственных веществ в биологических субстанциях. Под этим подразумевается сочетание масс-спектрометрии с хроматографическими методами разделения. По той же причине, что и ВЭЖХ все больше вытесняет газовую хроматографию из фармацевтического анализа, так и в «гибридных» подходах сочетание с масс-спектрометрией (ЬС-МБ) становится преобладающим методом анализа биологических образцов. Так как ЬС-МБ позволяет анализировать нелетучие и термонестабильные вещества. главным преимуществом в клинической фармакокинетике ЬОМЗ по сравнению с традиционными методами жидкостной и газовой хроматографии является более высокая чувствительность количественного определения концентрации лекарственных веществ. Таким, образом, масс-спектрометрия является мощным орудием идентификации и количественного определения органических соединений.

Разработанная в ходе решения поставленных задач оригинальная аналитическая методика с применением ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием позволила с высокой точностью определить концентрации стереоизомеры амлодипина в плазме крови во всем интервале наблюдения.

В таблице ниже представлена сравнительная характеристика фармакокинетических параметров изомеров амлодипина в таблице 32

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Чеча, Ольга Александровна

1. Алексеев В.В. Оптическая изомерия и фармакологическая активность лекарственных препаратов // Соровский образовательный журнал. — 1998. Химия №1- С. 49-55.

2. Ананьева И.А. Высокоэффективная хроматография оптически активных азотсодержащих соединений: Автореф. диссер. — М., 2001, 25с

3. Арсеньева К.Е. S(-) амлодипин: новые возможности фармакотерапии артериальной гипертонии // РМЖ. 2008. - № 16(21). - С. 1466-1496.

4. Арсеньева К.Е. Применение амлодипина в кардиологической практике // Российский медицинский журнал. 2009. - № 17(8). - С. 610-613.

5. Багрий А.Э. Роль блокаторов кальциевых каналов в лечении пациентов с артериальной гипертензией // Украинский кардиологический журнал. -2006.-№ 1.С. 12-14.

6. Бакстон Ш., Роберте С. Введение в стереохимию органических соединений: Пер. с англ. М.: М,. - 2005. - 125 с.

7. Бобров В.А., Давыдова И.В., Медведенко О.И., Клименко Л.В. Применение S-амлодипина в лечении больных с мягкой и умеренной артериальной гипертензией // Здоровая Украина. 2007. № 12/1. - С. 14.

8. Буданова Н.Ю. Капиллярное электрофоретическое разделение энантиомеров при использовании олиго- и полисахаридных хиральных селекторов. Автор. Диссер. На соиск. К.х.н. М. 2005, 26 с.

9. Буданова Н.Ю., Шаповалова E.H., Лопатин С.А., Варламов В.П., Шпигун O.A. // Вестник МГУ.- 2000. Т. 42, № 2. - С. 112-115.

10. Воронков JI.Г. Клиническое использование хиральных молекул как новое направление в кардиоваскулярной медицине // Здоровая Украина. 2007. - № 21/1. - С. 31-32.

11. Галанова A.C., Осия А.О., Шилов A.M. (2007) Патофизиологические аспекты блокаторов кальциевых каналов влечении сердечнососудистых заболеваний // Российский медицинский журнал. — 2007. — №20.-С. 1494-1497.

12. Голиков С.Н., Кузнецов С.Г., Зацепин Э.Н. Стереоспецифичность действия лекарственных веществ. М.¡Медицина.- 1973.- 183с.

13. Государственная Фармакопея МЗ СССР. 11-е изд., доп. — М.: Медицина. - 1989. - 400 с.

14. Государственный реестр лекарственных средств М.: МЗ РФ, 2008.

15. Даванков В.А., Навратил Дж., Уолтон X. Лигандообменная хроматография Пер. с англ. —1990.—. М.: —. Мир,, 294 с.

16. Дядык А.И., Багрий А.Э., Щукина Е.В. и др.Применение S-амлодипина в лечении больных артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца // Здоровая Украина. 2008 — № 23-24. —. С. 54-55.

17. Ефимцева Т.К., Спасокукоцкий А.Л., Миронова О.В.// Надлежащая 1 клиническая практика. — 2002. — 2(28). —С. 129-160

18. Измайлов H.A., М.С. Шрайбер. Открытие тонкослойной хроматографии. — 2007. — М. ГЕОС. —128 с

19. Илиел Э. Основы стереохимии. — 2005—БИНОМ. Лаборатория знаний. — М. — 119 с.

20. Илиел Э., Вайлен С., Дойл М. Основы органической стереохимии М., «БИНОМ. Лаборатория знаний», 2007. с. 703.

21. Карпов Ю.А., А.П. Савостин Методы пробоотбора и пробоподготовки. — 2003. — М. — БИНОМ. Лаборатория знаний. — 243 с.

22. Князькова И.И. Современное состояние проблемы клинического применения антагонистов кальция дигидропиридинового ряда. // Провизор. —. 1999. —. №13 —С. 16 54 .

23. Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии. — 2005. — СПб ХИМИЗ ДАТ. — 232 с.

24. Кривдин Л.Б. Оптическая изомерия в биохимии // Соровский образовательный журнал. —. 2001. —. № 11. — Т.7

25. Леонова М.В. Амлодипин в современных клинических исследованиях // Качественная клиническая практика. —. 2002. — №3. — С. 23-30.

26. Лутай М.И., Лысенко А.Ф., Моисеенко О.И. Использование оптических изомеров известных сердечно-сосудистых средств— путь к повышению их эффективности и переносимости //Украинский кардиологический журнал. — 2009. — № 4. — С.374.

27. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2 т.—14-е изд., перераб., испр. и доп.—М.: ООО "Издательство Новая Волна": Издатель С.Б. Дивов, 2002. 608 с.

28. Методические указания МЗиСР РФ «Проведение качественных исследований биоэквивалентности лекарственных средств». М.:, 2004. '

29. Морозова Т.Е., Захарова В.Л. Место амлодипина в кардиологической практике // Лечащий врач. —2008. — № 2. — С. 14-17.

30. Олехнович Л.П. Многообразие строения и форм молекул органических соединений // Соровский образовательский журнал. 1997. № 2. С.44-50.

31. Отчет о проведении клинического исследования, ФГУ «ГНИЦ ПМ Росздрава» под руководством акад РАМН Оганова Р.Г. — 2006 год

32. Пальцев М.А., Кукес В.Г., Хабриев Р.У. Молекулярные механизмы нежелательных эффектов лекарственных средств. — М.: Издательский дом «Русский врач» . -— 2005. —294 с.

33. Патент на изобретение «Способ разделения изомеров амлодипина» № 235781

34. Пахомов В.П., O.A. Чеча Хроматография в исследовании оптических энантиомеров лекарственных препаратов // Ведомости научного центра экспертизы медицинского применения. —. 2006. —№3. — С. 38-42.

35. Пахомов В.П., O.A. Чеча, O.A. Горошко //Тонкослойная хроматография в фармацевтических исследованиях/ Тезисы докладов XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». -2006. -. М. -с.245

36. Пахомов В.П.Исследование оптически активных лекарственных субстанций // Фармацевтическая промышленность -.2008. № 5. - С. 8486.

37. Петере Д., Д. Хайес, Хафтье Г. Химическое разделение и измерение. Теория и практика аналитической химии, перевод с англ. — 1998. — М. — Химия. — с. 816

38. Раменская Г.В., Д.В. Чу гаев Влияние оптических изомеров на фармакокинетику лекарственных средств // Фармация. — 2008. —1.

39. Руденко Б.А., Г.И. Руденко Высокоэффективные хроматографические процессы. Том 2 Процессы с конденсированными подвижными фазами. — 2003. — М. — Наука. — с.278

40. Садек П. Растворители для ВЭЖХ (методы в химии). БИНОМ.

41. Лаборатория знаний, пер. с англ. A.A. Горбатенко и Е. И. Ревиной,2006. —М. —704 с.

42. Свидетельства терапевтической активности амлодипина (Обзор литературы) // Медицина. —. 2003. — № 2. — С. 86-89 .111

43. Сиянко П.И. Лекции по стереохимии на курсе органической химии химического факультета Алтайского государственного университета. -2001.-c.265.

44. Скрябин К.Г Хитин и хитозан: получение, свойства. — 2002 — М. -Наука, с.368

45. Солдатенков А.Т., Колядина Н.М., Шендрик И.В. Основы органической химии лекарственных веществ М.: Мир; БИНОМ. Лаборатория знаний. — 2007. — с. 191

46. Сумина Е.Г., С.Н. Штыков, Н.В. Тюрина Тонкослойная хроматография. Теоретические основы и практическое применение Саратов, изд. Сарат. Ун-та. - 2006. - с. 112

47. Терещук Н.В. Сравнительное изучение изомеров лекарственных средств //тезисы доклада XIII Российский научный конгресс «Человек и лекарство» 2006. М., С. 301.

48. Турковская Е.А. История развития ТСХ в России: Материалы семинара Современные проблемы планарной хроматографии 2000. — М. — С.7-8.

49. Тюкавкина Н.И., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия М.: Дрофа, 2008.-c.542.

50. Тюкавкина Н.И., Бауков Ю.И. Органическая химия. 2008 - М. -Дрофа-с.322.

51. Ушкалова Е.А. Фармакологические свойства амлодипина -антагониста кальция последнего поколения // Кардиология. — 2004. — № 14, С. 91.

52. Филиал «Клиническая фармакология» ГУ НЦ БМТ РАМН Академик РАМН Кукес В.Г. Отчет о результатах сравнительного клинического исследования «С-НУМЛО». М. 2006.

53. Черних В.П. Фармацевтическая энциклопедия. -2005. 845 с.

54. Чеча О.А., Пахомов В.П. // Тонкослойная хроматография в исследовании оптически активных лекарственных препаратов/ тезисы

55. Всероссийского симпозиума «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия». — 2008 — Клязьма — с 141

56. Чеча О.А., ,О.А. Горошко. В.П. Пахомов, Ю. Рувинов, Т. Д. Исмагилов Сорбенты для тонкослойной хроматографии в фармацевтическом анализе // Химико-фармацевтический журнал

57. Чеча О.А., Пахомов В.П. // Тонкослойная хроматография в исследовании оптически активных лекарственных препаратов/ тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия». 2008. - Клязьма. - с 141.

58. Чеча О.А., Пахомов В.П. // Тонкослойная хроматография в исследовании оптически активных лекарственных препаратов/ тезисы докладов XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». 2008. - М. - с. 568.

59. Чирейкин, JT.B., Шубик, Ю.В. Амлодипин // Вестник—аритмологии. -1999. -.№14.-63-70.

60. Шпигун О.А., Ананьева И.А., Буданова Н.Ю., Шаповалова Е.Н. // Успехи химии. 2003. - Т.72, №12. - С. 1167-1189.

61. Abdoul-Einen, H.Y. et al., Application of thin-layer chromatography in enantio-meric chiral analysis —An overview./ZBiomed. Chromatogr. — 1999.—13.-P.531.

62. Abernethy D.R. The pharmacokinetic profile of amlodipine.//Am. Heart, 118- (5 Pt. 2) -24. P. 1100-1103.

63. Abernethy D.R. Amlodipine: pharmacokinetic profile of a low-clearance calcium antagonist. //J. Cardiovasc. Pharmacol. — 2001. —17-P.4-7.

64. Abernethy D.R. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of amlodipine.//Cardiology. 2002. - 80. -P. 31-36.

65. Abernethy DR, Soldatov NM. Structure-functional diversity of human L-type Ca2+ channel: perspectives for new pharmacological targets.//J.

66. PharmacolExpTher. — 2002. -. 300(3): -724-738.113

67. Alak, A. and Armstrong, D.W., Thin-layer chromatographic separation of optical, geometrical, and structural isomers.// Anal. Chem. P.582, 2006.

68. Alam M.G. — Systolic blood pressure is the main etiology for poorly controlled hypertension. //Am J Hypertens. —2003. — 16(2) — P.140-143.

69. Amlodipine reduces transient myocardial ischemia in patients with coronary artery disease: double-blind Anti-Ischemia Program in Europe (CAPE Trial).// J Am CollCardiol. — 2004. — 15. — 24(6). — P. 1460-1467.

70. Ananieva I.A., Davankov V.A., Armstrong D.W. Study of the enantioresolution of native amino acids and derivatized amino acids on macrocyclic antibiotics//13 th International Symposium "Chirality 2001".— 2001.-P.72.

71. Aneja P., Srinivas A., Das Biswas A. Comparative clinical study of the efficacy and safety of S-metoprolol ER tablet versus a racemate metoprolol ER tablet in patients with chronic stable angina//Intern. J. Clin. Pharm. Therap. 2007. - 45. - P.253-258.

72. Bada, J.L. Paleoanthropological applications of amino acids racemizatiori dating of fossil bones and teeth.//Anthrop. Anz. 2000. 45. - P. 1.

73. Bada, J.L. Racemization of amino acids in nature.//Interdiscip. Sci. Rev. -2000.-7.-P.30.

74. Bauer K., Gros L., Sauer W. Thin Layer Chromatography. An introduction. -Merck.-2001. -P.66.

75. Benetos A. et al — Efficacy, safety, and effects on quality of life of bisoprolol/hydrochlorothiazide versus amlodipine in elderly patients with systolic hypertension.//Am Heart J. -2000. 14(4) -P.l 1.

76. Benny K., Adithan C. Genetic polymorphism of CYP2D6 // Ind. Pharmacol. -2001. -33. -P.147-169.

77. Berezkin V.G.,Lapin A. B., Kepsky J.B.// J Chromatograpy.-2008.-10 P.84.

78. Bhushan, R. and Arora, M., Resolution of enantiomers of dl -amino acids on silica gel plates impregnated with optically pure (-)-quinine.// Biomed. Chromatogr. 2001 - 15. P. 433.

79. Bhushan, R. and Parshad, V., Thin-layer chromatographic separation of enan-tiomeric dansyloamino acids using a macrocyclic antibiotic as a chiral selector// J. Chromatogr. A. 2001. - 73. - P. 255.

80. Birkett D.J. Racemates or enantiomers: regulatory approaches. //Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2002. - 16(6). -P. 479^183.

81. Blankfield R.P. Fluid matter in choosing antihypertensive therapy: a hypothesis that the data speak volumes.// J. Amer. Board. Farm. Pract. — 2005. — 18. -P.113 -124.

82. Blankfield R.P., Dekker R. //J. Amer. Board. Farm.Pract-2009. -8. P. 13-22.

83. Brückner, H. and Wachsmann, M., Design of chiral monochloro-s-triazine. — 2000. 8. -P.135-140.

84. Burges RA, et al Calcium channel blocking properties of amlodipine // J Cardiovasc Pharmacol. 2007. - 9(1). - P. 130-139

85. Burke D., Henderson D.J. Chirality: a blueprint for the future. //Br. J. Anaesth. -2002. 88. - P.563-576.

86. Camag Bibliography Service, №93, September 2004; №87-88, 2001.

87. Cass O.B., Bassi A.L., Matlin S.A. // Chirality. 2006. -V.8. - P. 131-135

88. Chemical Reagents «Merck». 2002. -P. 1312.

89. Cherma, J. and Fried, B.,Chromatography, 2nd edn., Eds., Taylor and Francis.-2008.-P.131-146.

90. Cogolludo A., Perez-Vizacaino F., Tumargo J. New insights in the pharmacological therapy of arterial hypertension // Curr. Opin.Nephrol.Hypertens. 2005. - 14. -P.423-427.

91. Davankov V.A., Bochkov A.S.,Unger R.K.//Chromatographie. 1999-P.677

92. Duchame J., Fernandez C., Gimenez F., Farinotti R.// J. of Chromatography B.-2006.-P. 65-75.

93. Elke Hahn-Deinstop. TLC Plates: Iniciale Treatment Pre -wasthig, Activation conitioning. of planer Chromatography, 1993, v.6 p. 313-318

94. FDA Development of new stereoisomeric drugs .-2005.).

95. Franco P., Senso A., Minguillon C., Oliveros L. // Chromatogr. A. 2008. -V. 796.-P. 265-272

96. Gokiewicz, W. and Polak, B., Relationship between capacity factors and composition of a mobile phase in thin-layer liquid exchange chromatography of enantiomers of some amino acids, //J. Planar Chromatogr.2004 —7—P.453.

97. Grimm R.H. Jr et al -Amlodipine versus chlorthalidone versus placebo in the treatment of stage I isolated systolic hypertension.// Am J Hypertens. 2002.-15(1).-P.31-36.

98. Günther, K. and Möller, K., Enantiomer separations, in Handbook of Thin-Layer. 2002. - 144. - P.234-236.

99. Hughes A.D., Wijetunge S. The action of amlodipine on voltage-operated calcium channels in vascular smooth muscle.// Br. J. Pharmacol. 2001. -109.-P. 120-125.

100. Gurjar M. The future lies in chiral purity: A perspective. J. Indian Med. Assoc. -2007. -105(4). -P.177-178.

101. Janchem D. //Thin layer Chromatography. Muttzen. 2002. - P.380.

102. Janchem D.//Thin layer Chromatography. Muttzen. Camag. 2006. - P.300

103. Jette M., Sidney K., Blumchent G. Metabolic equivalents (METS) in exercise testing, exercise prescription, and evaluation of functional capacity. //Clin. Cardiol. 2000. - 13. - P. 555-565.

104. Kannel W.B. Prevalence and implications of uncontrolled systolic hypertension.// Drugs Aging. 2003. -20(4). - P. 277-286.

105. Kim M., Shen D., Eddy A., Nelson W., Roskos L.K. Inhibition of the enantioselective oxidative metabolism of metaprolol by verapamil in human liver microsomes // Drug Metab. Dispos. — 2003. — 21 — P.309-317.

106. KirchnerJ.G.Thin layer Chromatography,NY Interscience Pubb.2009.— P.788.

107. Kulig K., Nowicki P., Malawska B. Influence of the absolute configuration on pharmacological activity of antihypertensive and antiarrhythmic drugs. //Pol. J. Pharmacol. 2004. - 56. -P.499-508.

108. Kungys G., Naujoks H., Wanner C. Pharmacokinetics of amlodipine in hypertensive patients undergoing haemodialysis.// Eur. J. Clin. Pharmacol. -2003.-59.-P. 291-299.

109. Laufen H., Leitold M. Enantioselective disposition of oral amlodipine in healthy volunteers. //Chirality. 1999. - 6(7). -P.531-536.

110. Laurence DR etal. Arterial Hypertension, Angina Pectoris' Myocardial information. // Clinical Pharmacology eighth edition, Churchill Livingstone -2001.-P.425-457.

111. Lennard M.S. (1991) Clinical pharmacology through the looking glass: reflections on the racemate vs enantiomer debate. Br. J. Clin. Pharmac. — 2000. -31.- P.623-625.

112. Lennard M.S. Genetic polymorphism of sparteine / debrisoquine oxidation // Pharmacol. Toxicol. 2000. - 67. - P.273-283.

113. Lennard M.S., Tucker G.T., Silas J.H. et al. Differential stereoselective metabolism of metoprolol in extensive and poor debrisoquinmetobolizers //Clin. Pharmacol.Ther. 2001. - 34. -P.732-737.

114. Lepri, L. et al., Planar chromatography of optical isomers with bovine serum albumin in the mobile phase// J. Planar Chromatogr. — 2002 — 5. P. 175.

115. Lepri, L. et al., Reversed phase planar chromatography of optically active fluorenyl-methoxycarbonyl amino acids with bovine serum albumin in the; mobile phase// J. Planar Chromatogr. 2002. — 5. — P. 294.

116. Lepri, L., Del Bubba, M., and Cincinelli, A., Chiral separations by TLC in Planar Chromatography, A Retrospective View for the Third Millennium, Nyiredy, Sz., Ed., //Springer Scientific Publisher, Budapest 2001. - P. 517.

117. Lepri L., Enantiomer separation by TLC //J. Planar Chromatogr. — 2007 — 10 -P.320.

118. Lilling B. Git Fachz. //Lab. Supplement Chromatographic. — 2002. — P. 27.

119. Luksa J., Josik Dj., Kremser M., Kopitar Z., Milutinovic S. "Pharmacokinetic behaviour of R-(±) and S-(-) amlodipine after single enantiomer administration". J. Chromatogr. B. - 2003. - 703. - P.185-193.

120. Man, E.H. et al., Accumulation of d -aspartic acid with age in the human brain// J. Cardiol. 2008 - 12. -P.82.

121. Mandora V.P. Safety and efficacy of S-metoprolol succinate extended release tablet in the treatment of hypertension coexisting with COPD // Ind. Med. Cazette. 2006. - P.28-32.

122. Marcel Dekker// New York, Basel. 2000. - 20. P. 621-681.

123. Marfey, P., Determination of d -amino acids. II. Use of a bifunctional reagent// J. Chromatogr. B. 2000. - 703. - P.185-193.

124. Martens, J. and Bhushan, R., TLC enantiomeric separation of amino acids, Int. J. Chromatogr. B. 2007 . -306. - P.185-193.

125. Mason RP, Mason PE. Critique of a biologic mechanism linking calcium antagonists to increased risk for cardiovascular events in diabetes. // Lancet. 2009. - V. 33. - P. 760-764.

126. McahonS., PetoR.,CutlerJBloodpressure, stroke and CHD. Part 1. Prolonged differences in blood pressure: Prospective Observational studies collected for the regression dilution bias//Lancet2000. V. 335. - P. 765-774.

127. Medic-Saric M. Males Z. J. //of Planer Chromatography2001. V.10. -P.182-189

128. Mehvar R., Brocks D. Steriospecific pharmacokinetics and pharmacokodynamics of P-adrenergic blockers in humans // J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 2001. - 4. - P. 185-200.

129. Merck. Dyeing Reagents for Thin Layer and Paper Chromatography.-Darmstadt. 2002. - P. 114.

130. Nagata, Y., Iida, T., and Sakai, M., Enantiomeric resolution of amino acids by //J. Pharmacolol. Exp. Ther. 2002; 245. J. Pharmacolol. Exp. Ther. -2001.-245-P.94-101.

131. Nathanson J.A. Stereospecificity of P-adrenergic antagonists: R-enantiomers show increased selectivity for beta-2 receptors in ciliary process // J. Pharmacolol. Exp. Ther. 2001 - 255 - P.94-101.

132. Nayler W.G. Pharmacological aspects of calcium antagonism. Short term and long term benefits. Drugs. 2005- 46(2) - P.40-47.

133. Nayler WG. Pharmacological aspects of calcium antagonism. Short term and long term benefits. Drugs. -2001.-46 (Suppl) 2. P.40^17.

134. Niderwieser G. Pataki. Progress im Thin Layer Chromatography. // Ann Arbor Humphery. Sci. Pubb. Ann Arbor Mich. 2006 - 17. -P 30.

135. Nishi,H.etal.,New Chiral derivatization reagent for resolution of amino acids as diastereomers by TLC and HPLC//Chromatographia-2004.-27.-P 301.

136. Novabiochem, Catalog 2006/2007. Merck- 2006 - P411

137. Nyiredy Sz. Planar Chromatography //Chromatography (6 th edition) / E. Heffmann (Ed). Pt. A. Amsterdam : Elselvier. 2004 - P. 253-296

138. Ohmori M, Arakawa M, Harada K et al. Stereoselective pharmacokinetics of Amlodipine in elderly hypertensive patients.// American Journal of Therapeutics. 2003. - 10. - P.29-31.

139. Ohmori M., Arakawa M. Stereoselective pharmacokinetics. //Am. J. Ther. — 2002.- 10(1).-P. 29-31.

140. Okamoto I., Kawashima M., Hatada K. // Ibid. 2007. -V. 363. P. 173-178.

141. Okamoto Y., Noguchi J.,Yashima E. // React. Funct. Polymers. 2001. V.37.-P. 183-188.

142. Patil P.A., Kothekar M.A. Development of safer molecules through chirality.//Indian J. Med. Sci. -2006- 60. P. 427^37.

143. Patil P.A., Kothekar M.A.// Ind. J. Med. Sci. 2009. - 68. - P. 422-430.

144. Paulson D. J., ShugA. L. Tissue specific depletion of L-camitine in rat heart and skeletal muscle by D-carnitine. //Life Sci. -2000. 28(26). - P. 2931

145. Perna G.P., De Luca G., Stamslao M. et al. Efficacy and tolerability of amlodipine in patients with stable angina pectoris. Results of multicenter study // Clin. Drug. Invest. 2007. - 13. - P. 149-155.

146. Perrin C, Matthijs N., Maftouh M., Massart D.L., Vander Heyden Y. //J. of Chromatography A. 2002. - V.947. - P. 69-83.

147. Peter, A. and Toth, G., Chromatographic methods for the separation of enantiomers and epimers of p -alkyl amino acids and peptides containing them// Anal. Chim. Acta. 1999 - 352 - P.335.

148. Peter, A Planar Chromatography A Retrospective View for the ThirdMillenium // Sz. Nyiredy. Budapest: Springer. Peter A - 2001. -P. 614.

149. Polak, B., Go3kiewicz, W., and Tuzimski, T., Effect of the mobile phase pH*// J. Chromatogr. 2003. V. 353. - P. 143-148

150. Rajakyla E. // J. Chromatogr. 2001.-V. 353.-P. 143-148

151. Rebouche C. J. Carnitine movement across muscle cell membranes. Studies in isolated rat muscle./ZBiochim. Biophys. Acta. 2005 — 471. - P. 145-155.

152. Rocha E. et al —- Isolated systolic hypertension—epidemiology and impact in clinical practice.// Rev Port Cardiol. -2003 22(1) - P.7-23.

153. Ruterbories, KJ. and Nurok, D., Thin-layer chromatographic separation of diaste-reomeric amino acid derivatives prepared with Marfey's reagent// Anal. Chem. 59. - 2735. - P.2007.

154. Rutar S., S. Atmaca. Determination of amlodipine in human plasma by highperformance liquid chromatigraphy with fluorescence detection.// J. Chromatogr.B. -2001. 758. -P.305-310.

155. Sajewicz M., Pietka R., Pienak A., Kowalska T. : Application of Thin-Layer Chromatography to investigate oscillatory instability. —2005. 58. -P.311.

156. Satoskar Ch. R.S. et al. Pharmacotherapy of Hypertension. In Pharmacology and Pharmacotherapeutics, Popular Prakashan. —2000. — P. 386 417.

157. Senso A., Oliveros L., Minguillon C. // Ibid. A. 1999. -V. 839. P. 15-21. separation of enantiomers//J. AOAC Int. - 2001. - 84. - 1242.

158. SESA study — Safety and efficacy of S(-)Amlodipine. //JAMA-India. -2003.-2 (8).-P. 87-92.

159. SMART Trial (S-Metoprolol Assessment in Hypertension Trial). The SMART Trial Study Group // Cardiology Taday. 2005 - 9. - P. 1-8.

160. Srinivas N., Barbhaiya R.H., Midha K.K. Enantiomeric drug development: issues, considerations, and reculatory requirements // J. Pharmacol. Sci. -2000. — 90. P.1205-1215.

161. Staessen J.A., Fagard R., Thijs L. et al. Randomised double-blind comparison of placebo and active treatment for older patients with isolated systolic hypertension // Lancet. 2007. - V. 350. - P. 757-764

162. Stangier J, .Su C.A . Pharmacokinetics of repeated oral doses of amlodipine and amlodipine plus telmisartan in healthy volunteers.//J. Clin. Pharmacol. — 2000.-40.-P. 1347.

163. Szejtli, J., Cyclodextrins and Their Inclusion Complexes, Akademai Kiado

164. Tempesta J. L. A pharmacological profile of the effects of carnitine and acetylcamitine on the central nervous system. Int. J. Clin. Pharm. Res. 3 : 295—306. 1983.

165. Terfloth G. From Nonograms to Tons. Chiral Stationary phases in the pharmaceutical Indastrya LC-GC. J Europa-Novewber. 1999. - P. 698-702.

166. Thacker H.P. S-amlodipine — The 2007 Clinical Review. //J. Indian Med. Assoc.-2007- 1005.-P. 180-190.

167. The European Pharmacopoeia. 5th edit. 2002. P. 1877-1878.

168. The Pharmacopoeia of the United States, XXIV. P.2000.

169. Toyo-Oka T., Nayler W.G. Third generation calcium entry blockers.// Blood Pressure. 2005. - 206-208.

170. Veig, E. and Lindner, W., Epimeric N-substituted 1 -proline derivatives as chiral selectors for ligand-exchange chromatography.// J. Chromatogr. A. -2000.-660.-P.255.

171. Volpe M. et al — Comparison of the blood pressure- lowering effects and tolerability of Losartan and Amlodipine-based regimens in patients with isolated systolic hypertension. //ClinTher. - 2006. - 20(4). - P. 1466-1499.

172. Waldo A.L., Camm A.J., De Ruyter H. et al. Effect of D-sotalol on mortality in patients with left ventricular dysfunction after recent and remote myocardial infarction // Lancet. 2003. - 348. - P.7-12.

173. Weber M.A., Julius S., Kjeldsen S.E. et al. Blood pressure dependent and independent effects of antihypertensive treatment on clinical events in the VALUE Trial // Lancet. 2004. - V. 363. - P. 2049-2051.

174. Webster J, Robb OJ, Jeffers TA, et al. Once daily Amlodipine in the treatment of mild to moderate hypertension. //Br. J. Clin. Pharmacol. — 2002. -35(5). P.499-50.

175. Webster J. et al — a comparison of amlodipine with enalapril in the treatment of isolated systolic hypertension.// Br J ClinPharmacol. — 2003. — 5(5). 499-505.

176. Weinstein, S., Isolation of optical isomers by thin-layer chromatography, Tetrahed-ron Lett.- 2004. -25. P. 985.

177. Williams D.M., Cubeddu L.X. Amlodipine pharmacokinetics in healthy volunteers.// J.Clin. Pharmacol. 2008. -28. - P.990-994.

178. Witherow L., T.D. Spurway, R. J. Ruane and J.D. Wilson Problems and solutions in chiral thin-layer chromatography: a two-phase "Pirkle" modified amino-bonded plate// J. of Chromatography. -2001. 553. - 497-501.

179. Y.P. Patel, S. Patil, I.C. Bhoir, and M. Sundaresan// J. Chromatogr. A. -2001.-828.-P. 283

180. Zhang X.P., Loke K.E., Mitai S. et al. Paradoxical release of nitric oxide by an L-type calcium channel antagonist, the R+ enantiomer of amlodipine.// J. Cardiovasc. Pharmacol. 2002. - 39(2). -P. 208-214.

181. Zhang X.P., Loke K.E., Mitai S. et al. calcium channel antagonist, the R+ enantiomer of amlodipine // J. Cardiovasc. Pharmacol. 2005- 36-P.206