Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследование полифенольных соединений одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной (Cerasus vulgaris Mill.)

На правах рукописи

Волкова Алла Андреевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ОДНО- И ДВУЛЕТНИХ ПОБЕГОВ ВИШНИ ОБЫКНОВЕННОЙ (CERASUS VULGARIS MILL.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 1 АВГ 2011

Пятигорск 2011

4852037

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор фармацевтических наук, профессор Оганесян Эдуард Тоникович

доктор фармацевтических наук, профессор Попова Ольга Ивановна

доктор фармацевтических наук, профессор Бубенчикова Валентина Николаевна

ГБОУ ВПО «I Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвитш России

Защита состоится « 21 » сентября 2011 годав9°° на заседании Диссертационного совета Д 208.069.01 при ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Флавоноиды, как и другие полифенольные соединения, получили широкое применение в медицинской практике благодаря их высокой эффективности при ряде заболеваний. Их биологическая ценность определяется, в первую очередь, антиоксидантной активностью. По мере появления новых экспериментальных данных о различных видах биологической активности потребность в соединениях полифенольной природы возрастает с каждым годом. Вместе с этим растет потребность в новых сырьевых источниках, поскольку в настоящее время ресурсы традиционных источников полифенольных соединений по многим объективным причинам не удовлетворяют запросам фармацевтической промышленности. В этой связи можно решать столь важную проблему поиска новых сырьевых источников полифенольных соединений за счет культивируемых пищевых растений, агротехника которых хорошо изучена на территории России.

К числу таких растений относится вишня обыкновенная, которая произрастает во всех климатических зонах Российской Федерации, за исключением Крайнего Севера.

Известно, что плоды вишни обыкновенной помимо применения в качестве пищевого продукта наряду с другими частями растения широко используются в народной медицине при атониях кишечника, как противовоспалительное, кровоостанавливающее, ранозаживляющее средство. На современном фармацевтическом рынке присутствуют поликомпонентные БАДы, в состав которых входят плодоножки и плоды вишни обыкновенной, которые обладают выраженным мочегонным, противовоспалительным, антибактериальным свойствами (Биодрайв 2, Вита-плант, ИМТ и др.).

В качестве источника биологически активных веществ одно- и двулетние побеги вишни обыкновенной практически не используется и

з

причиной тому является недостаточная изученность их химического состава, в том числе не изучен полифенольный состав.

Более подробное изучение этих частей растения позволило бы в значительной мере обосновать их использование как дополнительного сырьевого источника полифенольных соединений и тем самым восполнить недостатки сырьевой базы.

Кроме того, следует учитывать и тот факт, что побеги вишни обыкновенной после ежегодной подрезки накапливаются в значительных количествах и, к сожалению, уничтожаются, что является не только нерациональным, но и экологически вредным.

Учитывая сказанное, следует считать, что изучение полифенольных соединений побегов вишни обыкновенной является актуальной проблемой для фармации и медицины.

Цель и задача исследований. Целью настоящей работы является исследование химического состава одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной и разработка рациональных путей получения на их основе суммарных фракций, обладающих биологической активностью.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• исследовать качественный и количественный состав биологически активных веществ одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной;

• разработать оптимальные условия экстракции биологически активных фракций с последующим изучением их фармакологической активности;

• получить очищенную сумму полифенольных соединений и осуществить идентификацию индивидуальных компонентов;

• провести морфолого-анатомические и товароведческие исследования побегов вишни;

• разработать проект фармакопейной статьи предприятия на одно- и двулетние побеги вишни обыкновенной.

Научная новизна. Химическое изучение состава одно- и двулетних

побегов вишни обыкновенной позволило выявить наличие следующих

4

биологически активных соединений: флавоноидов, дубильных веществ, кумаринов, производных коричной кислоты, антраценпроизводных, витаминов, аминокислот и полисахаридов.

Количественный анализ показал, что наибольший интерес представляют флавоноиды, проантоцианидины, дубильные вещества.

Методом ВЭЖХ-анализа и хромато-масс-спектрометрии впервые идентифицированы в побегах вишни обыкновенной флавоноиды (виценин, витексин, скопалетин, генкванин, апигенин) и производное 1,8-дигидроксиантрахинона (2-метилдантрон).

Изучена возможность использования спектрофотометрического метода для количественного определения проантоцианидинов и суммы фенольных соединений. Найдены оптимальные условия для разработки методик определения указанных групп веществ в побегах вишни обыкновенной.

Разработаны условия получения сухих экстрактов с учетом технологических характеристик сырья.

Экспериментально установлено, что использование в качестве экстрагента спирта этилового 40% и 70% позволяет получать в последующем сухие экстракты с высокой биологической активностью:

- экстракт, полученный 40% спиртом этиловым, — характеризуется антиоксидантной, антимикробной, аюотротекторной активностью;

- экстракт, полученный 70% спиртом этиловым, - оказывает стимулирующее действие на желудочно-кишечноный тракт, а также антимикробную, актопротекторную активность.

Практическая значимость. Проведенные химические исследования одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной свидетельствуют о том, что они. могут быть использованы в качестве дополнительных сырьевых источников получения биологически активных веществ.

Предложена технологическая схема переработки сырья и получения сухих экстрактов, обладающих биологической активностью.

Внедрение результатов исследования. На основе проведенных исследований разработан проект ФСП «Вишни обыкновенной побеги Cormus Cerasi vulgaris». Предложенные методики анализа прошли апробацию в ГНУ «Крымская опытно-селекционная станция СКЗНИИСиВ РАСХН» (акт апробации от 12.04.2011 г.).

Положения, выдвигаемые на защиту:

- обоснование использования сырья одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной в качестве источника для получения биологически активных веществ (БАВ);

- результаты исследования химического состава исходного сырья;

- разработка технологии сухих экстрактов побегов вишни обыкновенной и очищенной фракции флавоноидов, результаты изучения их химического состава;

- результаты предварительного фармакологического скрининга сухих экстрактов из побегов вишни обыкновенной.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-

исследовательской работы (НИР) ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава, а

также в соответствии с соглашением о выполнении НИР между Федеральным

агентством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО

Пятигорской ГФА Росздрава (№06/1049).

Апробация и публикация результатов исследования. Основные

фрагменты диссертационной работы доложены и обсуждены на 62-й и 63-й

региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке

кадров ПятГФА (Пятигорск, январь 2007 г., январь 2008 г.).

По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 в журналах,

рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена

на 156 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора

литературы, 4-х глав собственных исследований, общих выводов, списка

6

литературы, включающего 156 источника, в том числе 13 иностранных; содержит 61 таблииу, 24 рисунка и приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Исследование химического состава одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной (Cerasus vulgaris Mill.)

В качестве объекта исследования использовались одно- и двулетние побеги вишни обыкновенной (далее именуется «сырье»), длиной 15-20 см, диаметром 2-3 мм, красно-бурого цвета и с характерным запахом, предоставленные «Опытно-селекционной станцией» г. Крымска. Сырье собрано в начале вегетации (февраль-март).

Для предварительного анализа получали извлечения с помощью 40%, 70% и 96% спирта этилового. В полученных извлечениях качественными реакциями установлено наличие флавоноидов, проантоцианидинов, дубильных веществ, антраценпроизводных, кумаринов, стероидных соединений (Р-ситостсрин), водорастворимых (аскорбиновая кислота) и жирорастворимых витаминов ф-каротин, а-токоферол).

Для определения фенолокислот проводили фракционирование извлечения, полученного спиртом этиловым 96%. После концентрирования извлечения при стоянии выделялся осадок, который отделяли и обозначили как фракция 1. Часть фракции 1 растворяли в небольшом количестве этанола и перекристаллизовали из спирта. Получено вещество, которое обозначено как фракция 2.

Фильтрат, оставшийся после отделения фракции 1, разбавляли водой и отделяли выделившийся осадок (фракция 3). Маточный раствор после отделения фракции 3 экстрагировали эфиром диэтиловым. К эфирному извлечению добавляли четырехкратный объем воды и оставляли на сутки при комнатной температуре. Выделившийся осадок отделяли (фракция 4), а оставшийся фильтрат выпарили на водяной бане до получения сухого остатка (фракция 5). Каждую фракцию анализировали хроматографическим методом на бумаге (БХ) и в тонком слое сорбента (ТСХ). Использовали

7

следующие системы растворителей: БУВ (4:1:2), 15% кислота уксусная, хлороформ - этанол (10:1), бензол - этанол (8:2).

Хроматограммы для идентификации фенолокислот просматривали в видимом и УФ-свете с последующей обработкой реактивом Паули, спиртовым раствором калия гидроксида, 2% раствором железа (III) хлорида, 0,5М спиртовым раствором натрия гидроксида; пластинки ТСХ опрыскивали кислотой серной концентрированной и сравнивали значения исследуемых фракций с ЯГ растворов стандартных образцов.

В таблицах 1 и 2 представлены результаты хроматографирования. Таблица 1 - Идентификация фенолокислот методом бумажной

хроматографии

Идентифицированные кислоты Окраска пятен при действии Исследуемые фракции

УФ-свет уф. СВСТ+ +Ш3 КОН в этаноле реактив Паули ЕеСЬ

галловая фиолет ярко-фиолет — — темно-синяя 1,2,3

салициловая голубая — — желтая красно-фиолето вая 2,3,4

п-оксибензойная фиолетов ая — — слабожелтая желтая 1,2,3

хлорогеновая голубая зеленая красная желто-коричневая зеленая 1,2,3,4

п-кумаровая слабо-фиолетов ая темно-фиолето вая зелено-желтая красноватая желто-оранже вая 1,2,3,4 (после кислотного гидролиза)

Таблица 2 - Идентификация органических кислот методом ТСХ

Окраска пятен при действии 3 » 8 I я

я В к К 3 0 "§* 5 о о § К е + >. я га И н °

Р 3 5 Е й К 1 о >. В Е. и и * а я ЕЯ О <и о л с О. а

кофейная голубая голубая серо-фиолетовая коричневая серая 5,4

хлорогеновая голубая зелено-голубая серо-фиолетовая желто-коричневая серая 1Д3,4

Хроматографический анализ в сочетании с качественными реакциями позволил идентифицировать в исследуемых фракциях галловую, салициловую, п-оксибензойную, кофейную, хлорогеновую и п-кумаровую кислоты.

Анализ содержания катехинов в исследуемом сырье проводили методом бумажной хроматографии. Для этого была получена сумма катехинов зеленого чая и побегов вишни обыкновенной по методики М.Н. Запрометова, после чего осуществлено хроматографирование в системе растворителей БУВ 40:12:28. Хроматограммы проявляли 1% раствором ванилина в концентрированной кислоте хлористоводородной. Значения 1У исследуемого объекта (0,85) сравнивали с катехинов зеленого чая (0,87), в результате идентифицирован эпикатехингаллат.

Далее был проведен количественный анализ некоторых групп БАВ. В таблице 3 представлены результаты количественного анализа содержания суммы фенольных соединений, флавоноидов и проантоцианидинов в извлечениях, полученных спиртом этиловым 40 %, 70 % и 96 %.

Определение суммы фенольных соединений осуществляли спектрофотометрическим методом по величине оптической плотности растворов продуктов взаимодействия с фосфорномолибденово-вольфрамовым реактивом (реактив Фолина-Дениса) в щелочной среде. Расчет содержания суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту в исследуемых извлечениях проводили по уравнению градуировочного графика.

Количественное содержание суммы флавонов и флаванолов определяли методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на кверцетин; флаванонов и изофлавонов прямым спектрофотометрическим методом (в пересчете на гесперитин).

Для определения проантоцианидинов исследуемые извлечения подвергали гидролизу раствором 5% кислоты хлористоводородной в бутаноле, добавляя в качестве катализатора раствор железоаммонийных

9

квасцов. Оптическую плотность полученных окрашенных растворов измеряли при длине волны 550 нм. Содержание проантоцианидинов рассчитывали по значению удельного показателя поглощения цианидин-3,5-дигликозида.

Таблица 3 - Содержание фенольных соединений в извлечениях, полученных спиртом различной концентрации

БАВ Количественное содержание БАВ в извлечениях, полученных спиртом этиловым различной концентрации

40% 70% 96%

Сумма фенольных соединений,% 5,71±0,07 4,10±0,01 3,57±0,06

Суммы флавонов и флаванолов,% 0,31±0,01 0,31±0,01 0,21±0,01

Сумма флаванонов и изофлавонов,% 0,72±0,01 0,90±0,02 0,72±0,02

Проантоцианидины,% 3,22±0,04 3,04±0,09 1,61±0,03

Как следует из представленных данных, спиртом этиловым 40% и 70% извлекается большее количество суммы фенольных соединений, флавоноидов и проантоцианидинов, что является основанием для более углубленного изучения именно этих извлечений на предмет их химического состава и биологической активности.

Перманганатометрически определяли содержание дубильных веществ, которое составило 5,38±0,44%. Количественное определение органических кислот проводили по методике, описанной в ГФ XI, в пересчете на кислоту яблочную, которое составило 2,15±0,22%.

Методом спектрального анализа на приборе ДФС-8-1 изучен макро- и микроэлементный состав одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной. Обнаружены 24 элемента, среди которых преобладающими по содержанию в пересчете на золу являются кальций (до 30,0%), калий (до 10,0%), магний (до 5,0%), фосфор (до 3,0%), кремний (до 2,0%).

Количественно аскорбиновую кислоту определяли титриметрически, используя в качестве титранта 0,001М раствор

ю

2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия; определение Р-каротина и а-токоферола проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром». Результаты количественного анализа витаминов представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Витаминный состав одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной

Наименование образца Р-каротин, мг/% а-токоферол, мг/% аскорбиновая кислота, мг/г

Исследуемое сырье 4,0 0,23 2,02

Качественно свободные аминокислоты в сырье определяли с помощью нингидриновой реакции, а также с помощью БХ и ТСХ. Таким путем удается идентифицировать только Ь-гистидин и пролин. Более точные данные получены при использовании аминокислотного анализатора.

Качественный состав свободных Сахаров изучали хроматографически на бумаге в системе БУВ (4:1:5; 4:1:2) в присутствии достоверных образцов моносахаридов. По значению 11Г идентифицирована фруктоза и глюкоза.

Определение полисахаридов в побегах вишни обыкновенной проводили по методу Н.К. Кочеткова и М. Бтега, основанном на гравиметрическом анализе четырех фракций полисахаридов: 1 - водорастворимые полисахариды (ВРПС); 2 - пектиновые вещества (ПВ); 3 - гемицеллюлоза А (Гц А); 4 - гемицеллюлоза Б (Гц Б).

Во всех фракциях после кислотного гидролиза определяли содержание моносахаридов методом бумажной хроматографии в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Идентификацию проводили сравнением значений ЯГ исследуемых веществ с растворами стандартных образцов ■ моносахридов. Внешний вид, качественные и количественные характеристики выделенных фракций и их моносахаридный состав, представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Качественный и количественный анализ фракций полисахаридов в побегах вишни обыкновенной

Фракции Содержание фракций, % Внешний вид, полученных фракций Обнаруженные моносахариды

ВРПС 0,32 кристаллический порошок серовато-коричневого цвета, с характерным блеском арабиноза, рамноза,

ПВ 0,66 коричневый кристаллический порошок, со специфическим запахом глюкоза, рамноза, галактуроновая кислота

Гц А 5,70 серовато-кориченевый порошок, со специфическим запахом галактоза, арабиноза

Гц Б 1,76 темно-коричневый порошок, имеет специфический запах галактоза, ксилоза, галактуроновая кислота

Химический состав экстрактов из одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной и оптимизация процесса их получения

Для оптимизации процесса получения экстрактов с целью максимального выхода БАВ нами были исследованы технологические параметры сырья.

Установлено, что для получения сухих экстрактов целесообразно использовать измельченное сырье с размером частиц 1,2 мм; соотношение сырье: экстрагент 1:5, кратность экстракции - 3.

На основании полученных данных была разработана технологическая схема получения сухих экстрактов, в качестве экстрагента использовали спирт этиловый 40% и 70%. Конечные продукты обозначены соответственно В-40 и В-70.

Экстракцию проводили методом мацерация. Измельченное сырье заливали соответствующим экстрагентом и настаивали трижды в течение 1,5 часов. Промежуточный продукт жидкий экстракт упаривали под вакуумом при температуре 40°С и давлении 0,69 мПа до полного удаления растворителя, после чего остаток продолжали сушить в сушильном шкафу при температуре 50-60"С до постоянной массы.

12

Полученный готовый целевой продукт (сухой экстракт) представляет собой порошок темно-бурого цвета, гигроскопичный, горького вкуса. Выход сухого экстракта составляет 15,8% в пересчете на сухое сырье, что соответствует степени истощения сырья - 78,8%.

Для анализа сухих экстрактов были использованы приемы и методы, описанные выше. Спектрофотометрическим методом установлено, что спиртом этиловым 40% фенольные соединения извлекаются в большей степени (26,89%), чем спиртом этиловым 70% (22,06%).

Для изучения качественного и количественного состава фенольных соединений использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Помимо сухих экстрактов В-40, В-70 для исследования были получены фракции следующим образом: сухой экстракт В-70 последовательно обрабатывали диэтиловым эфиром (фракция B-70-эф) и этилацетатом - очищенная фракция флавоноидов (B-70-ф).

Анализ осуществляли на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "GILSTON", модель 305 (Франция); инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 (США) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для "Windows".

Для определения использовали металлическую колонку размером 4,6x250 мм PLATINUM EPS С 18 100, размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза - метанол-вода-фосфорная кислота концентрированная (400:600:5). Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 0,5 мл/мин. Детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора "GILSTON" UV/VIS модель 151, при длине волны 254 нм. Оценку количественного содержания идентифицированных образцов проводили по площади пиков, используя метод внутренней нормализации. Результаты анализа представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Анализ фенольных соединений исследуемых фракций методом

ВЭЖХ

Название соединения Время выхода,сек Концентрация вещества в исследуемой фракции, %

В-40 В-70 В-70ф

Хлорогеновая кислота 373,4 23,26 20,71 20,52

Кофейная кислота 501,6 - 6,05 12,43

Ци коревая к-та 594,6 37,07 10,58 -

Феруловая к-та 742,3 - 2,48 -

Гесперидин 813,9 - 8,87 6,80

Лютеолин-7гликозид 920,0 - 3,82 -

Гиперозид 1215,0 4,31 6,24 3,86

Апигенин 1354,0 - 7,30 2,45

Рутин 1527,0 0,18 - -

Витексин 1687,0 2,32 9,17 6,45

Виценин 2256,0 3,37 - 33,76

О-метоксикумаровая кислота 2818,0 0,13 5,12 6,28

Кверцетин 3221,0 0,13 1,86 4,72

Катехин 4602,0 7,87 - 1,56

Лютеолин 5292,0 0,53 - 0,32

Таким образом, методом ВЭЖХ удалось идентифицировать

флавоноиды (гесперидин, гиперозид, апигенин, рутин, витексин, виценин, кверцетин, лютеин, лютеолин-7-гликозид), катехин, фенолокислоты (коричная, хлорогеновая, кофейная, О-метоксикумаровая кислота).

Помимо вышеописанных методов для анализа качественного состава фенольных и нефенольных соединений мы использовали метод хромато-масс-спектрометрии.

Исследования проводили на приборе «6890-5973N» фирмы «Agilent Technologies» (США), работавшем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ и оборудованном капиллярной колонкой HP - 5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм. В качестве газа-носителя использовали гелий, поток составлял 1,2 мл/мин. После проведения хроматографирования масс-спектры, соответствующие вершинам хроматографических пиков, сравнивали по стандартной методике с масс-спектрами библиотек «PMW_TOX3», «NIST05» и «Wiley7N».

Полученные результаты представлены в таблицах 7 и 8.

Таблица 7 ~ Фенольные соединения эфирного извлечения и сухой очищенной

фракции флавоноидов

Время удерживания, мин Идентифицированные соединения Исследуемая фракция

4,086 эвгенол B-70-ф

4,987 4-пропил-1,2-бензиндиол B-70-ф; B-70-эф

5,469 4-((1 Е)-3-гидрокси-1 -пропенил)-2-метоксифенол B-70-ф

5,597 n-оксикоричная кислота B-70-ф; B-70-эф

5,859 феруловая кислота B-70-эф

6,219 скопалетин B-70-эф

7,358 пиностробин B-70-ф; B-70-эф

7,881 2-метилдантрон B-70-ф

7,550 пиноцембрин B-70-эф

8,114 хризин B-70-ф; B-70-эф

8,346 сакуранетин B-70-ф; B-70-эф

8,625/8,619 нарингенин B-70-ф; B-70-эф

8,730 / 8,727 генкванин B-70-ф; B-70-эф

9,038/9,050 генисгеин B-70-ф; B-70-эф

Таблица 8 - Нефенольные соединения эфирного извлечения и сухой

очищенной фракции флавоноидов

Время удерживания, мин Идентифицированные соединения Исследуемая фракция

3,186 бензойная кислота B-70-эф

4,238 2-метил-2(ЗН)-бензофураи B-70-эф

4,464 кумарин B-70-эф

4,320 коричная кислота B-70-эф

4,633/4,697 Б-аллоза B-70-ф; B-70-эф

9,700 токоферол B-70-эф

11,025 (3-ситостерин B-70-эф

3,453 2,3-дигидробензофуран B-70-ф

4,243 дигидрокумарин B-70-ф

Таким образом, в исследуемых фракциях содержится не менее 11

веществ фенольной и 9 нефенольной природы.

Из фенолокислот методом БХ и ТСХ в обоих экстрактах (В-40 и В-70) идентифицированы n-оксибензойная, хлорогеновая, n-кумаровая и кофейная кислоты. В экстракте В-70 идентифицирована салициловая кислота.

Качественными реакциями в исследуемых экстрактах также было установлено наличие кумаринов и кислоты щавелевой.

Аминокислоты в сухих экстрактах определяли на аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (Microtecha, Чехословакия). Установлено, что в их состав входит 15 аминокислот, в том числе 8 незаменимых. В обоих экстрактах в наибольшем количестве представлена глютаминовая кислота, причем в экстракте В-40 ее содержание выше. Содержание свободных и связанных аминокислот в экстракте В-40 составляет 58,57 г/кг, а В-70 -43,39 г/кг.

Стандартизация сырья и сухого экстракта из одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной При сравнительном морфологическом анализе строения одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной выявлено, что на границе между ними обнаружены остатки листовых почек (в виде рубцов). Этот признак удобно использовать при осуществлении сбора сырья.

Микроскопический анализ проводился на живых, свежесобранных и нефиксированных вегетативных побегах. Побег вишни обыкновенной имеет типичное строение стебля для древесных двудольных растений.

Выявлены такие анатомические признаки, как наличие годичного кольца (рисунок 1), образованного сосудистыми и трахеальными элементами, а также наличие сердцевинных лучей, которые имеют явные расширения в области границы между однолетним и двулетним участком древесины у двулетнего побега, в которых накапливаются биологически активные вещества, что наблюдается при окраске препаратов 10% раствором гидроксида натрия - фуско- и руброфлобафены, окрашенные в красный цвет (рисунок 3,4). Клетки-идиобласты, расположенные в паренхиме сердцевины, при обработке флороглюцином и кислотой серной, приобретают желто-оранжевое окрашивание (рисунок 2).

Рисунок 1 - Поперечный срез Рисунок 2 - Фрагмент поперечного среза побега

двулетнего побега вишни обыкновенной (зона первичной ксилемы и

(при увеличении в 9 раз) сердцевины при увеличении в 40 раз)

Рисунок 3 - Поперечный срез однолетнего Рисунок 4 - Ксилема и идиобласты в

побега вишни обыкновенной (после сердцевине (фрагмент рисунка 8) при

окрашивания 10% раствором №ОН в увеличении в 40 раз этаноле) при увеличении в9 раз

Товароведческие показатели побегов вишни обыкновенной

определяли фармакопейными методами. Стандартизацию сырья проводили по содержанию основных групп БАВ - суммы фенольных соединений (по реакции с фосфорномолибденово-вольфрамовым реактивом - появление интенсивно синего окрашивания) и проантоцианидинов (реакция с 6% раствором хлористоводородной кислоты в бутаноле - появление малиново-красного окрашивания).

Для количественного определения суммы фенольных соединений использовали спектрофотометрическую методику, основанную на реакции фенольных соединений с фосфорномолибденово-вольфрамовым реактивом (реактив Фолина-Дениса) в щелочной среде. Рассчитывали содержание суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту. Предварительными исследованиями установлена валидность данной методики по критериям прецизионность, линейность и правильность.

17

На основании результатов анализа 5 серий сырья одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной были предложены нормы качества как для цельного (таблица 9), так и для измельченного сырья.

Таблица 9 - Нормы качества цельного сырья побегов вишни обыкновенной

Показатели Методы Нормы

1 2 3

Внешние признаки Визуальный ГФ XI, вып. 1, с. 252-267 Соответствует требованиям ФСП

Микроскопия Микроскопический ГФ XI, вып. 1, с. 277 Соответствует требованиям ФСП

Качественные реакции: - фенольные соединения - проантоцианидины Качественная реакция с фосфорномолибденово-водьфрамовым реактивом Качественная реакция с 6% раствором хлористоводородной кислоты в этаноле Интенсивно синее окрашивание Малиново-красное окрашивание

Числовые показатели содержание суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту - влажность - золы общей - золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной частиц, изменивших окраску других частей, не соответствующих описанию - органической примеси - минеральной примеси Спектрофотометр ический ГФ XI, вып. 1. с. 285-286 ГФ XI, вып.2. с. 24 ГФ XI, вып.2. с. 25 ГФ XI, вып.1. с. 276 ГФ XI, вып.1. с. 276 ГФХ1, вып.1. с. 276 ГФ XI, вып.1. с. 276 Не менее 5,0% Не более 14% Не более 5% Не более 1% Не более 5% Не более 5% Не более 1% Не менее 0,5%

Микробиологическая чистота ГФ XII, 4.1, с. 160 ОФС 42-0067-07 Категория 4Б

Результаты фотохимического исследования побегов вишни обыкновенной, а также методика количественного определения суммы фенольных соединений послужили основой для создания нормативной

документации - проекта ФСП «Вишни обыкновенной побеги Connus Cerasi vulgaris».

Оценку качества сухого экстракта В-70 побегов вишни обыкновенной предложено проводить по следующим показателям: описание, подлинность, количественное определение суммы фенольных соединений, потеря в массе при высушивании, гранулометрический состав, микробиологическая чистота, срок годности.

Фармакологические исследования извлечений из побегов вишни

обыкновенной

Планируя фармакологические исследования, мы учитывали в первую очередь сведения о применении вишни обыкновенной в народной медицине. С другой стороны, подробный анализ полифенольного состава полученных фракций позволяет прогнозировать такие виды активности, как антоксидангная, антигипоксическая и актопротекторная.

Фармакологические исследования проводились на кафедре фармакологии, физиологии и патологии, биохимии Пятигорской ГФА совместно с доцентом Кулешовой С.А., Огурцовым Ю.А. и Сергеевой Е.О., за что мы приносим глубокую благодарность.

Сухие экстракты В-40 и В-70 подвергали фармакологическому скринингу. Установлено, что исследуемые экстракты относятся к малоопасным веществам (4-й класс опасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 «ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности»).

Исследование суммарного содержания антиоксидантов амперометрическим методом на приборе «Цвет Яуза-01 -АА», основанном на способности молекул антиоксидантов окисляться на поверхности рабочего электрода показало, что содержание суммы антиоксидантов в экстракте В-40 составляет 2,13 мг/г в пересчете на кверцетин и 1,35 мг/'г - на галловую кислоту; в экстракте В-70 -1,94 мг/г и 1,23 мг/г соответственно.

В результате дальнейших экспериментов установлено:

19

- экстракты В-40 и В-70 обладают актопротекгорной активностью, то есть повышают физическую выносливость у животных, причем большую активность проявляет экстракт В-70;

экстракты повышают адаптационную функцию животных, увеличивают двигательную и исследовательскую активность;

- выявлено стимулирующее действие на моторику желудочно-кишечного тракта; большую активность проявляет экстракт В-70;

- предполагается, что механизм спазмогенного действия экстрактов связан с холиномиметическим действием. Для определения механизма действия была смоделирована атропиновая атония кишечника. Атропин вводили в концентрации 1:250000. Тонус кишечника снижался, и при повторном введении исследуемых фракций интенсивность перистальтики не изменялась;

- исследуя антиоксвдантные свойства экстрактов установлено, что в дозе 50 мкг/мл экстракт В-40 снижает перекисное окисление липидов в постьядерной фракции печени на 96 %, в то время как экстракт В-70 — на 38%. Результаты достоверны по отношения к контролю - кверцетину.

Таким образом, в результате фармакологического скрининга установлено, экстракт В-40 содержит большее количество суммы антиоксидантов, чем экстракт В-70 и проявляет большую антиоксидантную активность, в то время как В-70 - оказывает выраженное стимулирующее действие на желудочно-кишечный тракт и может быть рекомендован для создания лекарственного средства, применяемого при атонии кишечника.

Общие выводы

1. Химическими исследованиями одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной установлено, что:

- спиртом этиловым 40% извлекается наибольшее количество суммы фенольных соединений и составляет 5,71%, меньше извлекается спиртом этиловым 70% (4,10%) и 96% (3,57%);

- сумма флавонов и флавонолов больше извлекается спиртом этиловым 70% (0,327%), меньше -40 % (0,313%) и 96 % (0,217%);

- флаваноны и изофлавоны по сравнению с другими извлечениями больше экстрагируются спиртом этиловым 70%, количество которых составляет 0,897%, а 40 % и 96 % - 0,724% и 0,720% соответственно;

- максимальное содержание проантоцианидинов наблюдается в извлечении, полученном спиртом этиловым 40% (3,22%), а в двух других, полученных спиртом этиловым 70% и 96% - составляет 3,04% и 1,61% соответственно;

- сумма полисахаридов составляет 8,44%; органических кислот -2,15%, макро- и микроэлементов - 52,63% в пересчете на золу; Р-каротина -4,0мг/%; токоферола - 0,23 мг/%, аскорбиновой кислоты 2,02 мг/%.

2. Суммарное содержание антиоксидантов, установленное амперометрическим методом, в экстрактах одно- и двулетних побегах вишни обыкновенной составляет: в извлечении, полученном 40% спиртом этиловым 1,35 мг/г; 70 % этанолом -1,23 мг/г; в извлечении на 96% этаноле - 0,26 мг/г.

3. Разработана технология получения сухих экстрактов из побегов вишни обыкновенной методом мацерации при соотношении сырье : экстрагент 1:5 и трехкратном настаивании, с последующим полным удалением экстрагента и высушиванием до получения сухого остатка темно-бурого цвета.

4. Методом ВЭЖХ выявлен состав полифенольных соединений:

- в сухом экстракте, полученном 40% спиртом этиловым, установлено наличие 13 соединений, из которых идентифицированы 6 веществ флавоноидной природы (гесперидин, лютеолин-7гликозид, гиперозид, апигенин, витексин, квецетин), 5 фенолокисяоты (хлорогеновая, кофейная, цикоревая, феруловая, О-метоксикумаровая кислоты); два соединения неидентифицированы;

- в сухом экстракте, полученном экстракцией сырья 70% спиртом этиловым, обнаружено 12 соединений, из них идентифицировано 7 веществ флавоноидной природы (гиперозид, рутин, витексин, виценин, кверцетин,

лютеолин, катехин), 3 фенолокислоты (хлорогеновая, цикоревая, О-метоксикумаровая); два соединения неидентифицированы; - в очищенной сумме флавоноидов (B-70-ф) идентифицировано 12 полифенолов, представленных флавоноидами (гесперидин, гиперозвд, апигенин, витексин, виценин, кверцетин, катехин, лютеин), фенолокислотами (коричная, хлорогеновая, кофейная, о-метоксикумаровая); из флаванонов присутствуют сакуронетин, нарингенин; флавонов - хризин; изофлавонов -генистеин. Впервые идентифицированы виценин, витексин, апигенин.

5. Методом хромато-масс-спектрометрия изучен состав суммы фенольных соединений и установлено наличие флаванонов - сакуронетина, нарингенина; флавонов - хризина; изофлавонов - генистеина. Впервые идентифицированы скопалетин, 2-метилдантрон.

6. Предварительные фармакологические исследования сухих экстрактов позволили выявить антиоксидантное, актопротекторное, антигипоксическое действие и стимулирующее влияние на желудочно-кишечный тракт.

7 Установлены макро- и микроскопические признаки сырья и определены его товароведческие показатели. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия «Вишни обыкновенной побеги Cormus Cerasi vulgaris».

Основное содержание диссертационной работы изложено в публикациях:

1. Волкова, A.A. Исследование одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной в качестве источника полифенольных соединений в условиях экосистемы человека / A.A. Волкова // Экология человека. - 2007. - №7 С. 8-11.

2. Оценка токсичности сухих экстрактов одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной / A.A. Волкова, С.А. Кулешова, O.A. Андреева, М.Н. Ивашев // Токсикол. вестн. - 2008. - Вып. 2. - С. 47.

3. Изучение элементного и аминокислотного составов побегов вишни обыкновенной и соцветий хризантем корейской / A.A. Волкова, М.И. Кодониди, Э.Т. Оганесян, O.A. Андреева // Известия Самарского научного центра Российской академии наук: спец. вып. «ХП конгресс «Экология и

Кодониди, Э.Т. Оганесян, O.A. Андреева // Известия Самарского научного центра Российской академии наук: спец. вып. «XII конгресс «Экология и здоровье человека». - Самара, 2007. - Т. 2. - С. 159-162.

4. Волкова, A.A. Морфолого-анатомическое исследование побегов вишни обыкновенной / A.A. Волкова, O.A. Андреевна, Ф.К. Серебряная // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ: материалы 3-й Всеросс. науч.-методич. конф., Воронеж, 22-24 марта 2007 г. -Воронеж: Воронежский государственный университет, 2007. - С. 9697.

5. Волкова, A.A. Предварительные исследования химического состава и биологической активности однолетних побегов вишни обыкновенной (Cerasus vulgaris Mill.) / A.A. Волкова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. E.H. Вергейчика, H.H. Каревой / ПятигорскаяГФА, Санкт-ПетербургскаяГФА. - Пятигорск, 2007. - Вып. 62 - С. 30-31.

6. Волкова, A.A. Влияние различных экстрактов побегов вишни обыкновенной на моторику желудочно-кишечного тракта / A.A. Волкова, С.А. Кулешова, O.A. Андреева // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск.ГФА.- Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 396-397.

7. Изучение химического состава и антибактериальной активности вишни обыкновенной (Cerasus vulgaris) побегов экстракта сухого / A.A. Волкова [и др.]. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск.ГФА.-Пятигорск, 2010. - Вып. 65. - С. 437-438.

8. Исследование фармакологических свойств молодых побегов вишни обыкновенной / A.A. Волкова [и др.] // Аптечный форум: «От производителя до аптеки и потребтеля»: тезисы докладов / Москва. -2007.-С.65-67.

9. Волкова, A.A. Изучение технологических характеристик сырья (степень измельченности побегов вишни обыкновенной) / A.A. Волкова, В.В. Верещагина // Человек и лекарство: тез. докл. 15 Рос. нац. конгр. 14-18 апр. 2008,- М., 2008.- С.392.

Ю.Волкова, A.A. Изучение актопротекторной активности экстрактов одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной / A.A. Волкова, С.А. Кулешова // Человек и лекарство: тез. докл. 15 Рос. нац. конгр. 14-18 апр. 2008 г.- М., 2008,- С.603.

h'

ВОЖОВА АЛЛА АНДРЕЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ОДНО- И ДВУЛЕТНИХ ПОБЕГОВ ВИШНИ ОБЫКНОВЕННОЙ (CERASUS VULGARIS MILL.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати _2011 г. Формат бумаги 60x84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №

62S

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИТЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

(357532, г Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Актуальность проблемы. Флавоноиды, как и другие полифенольные соединения, получили широкое применение в медицинской практике благодаря их высокой эффективности при ряде заболеваний. Их биологическая ценность определяется^ в. первую очередь, антиоксидантной активностью. По мере появления новых экспериментальных данных о различных видах биологической активности потребность в соединениях полифенольной природы возрастает с каждым годом. Вместе с этим растет потребность в> новых сырьевых источниках, поскольку в настоящее время ресурсы традиционных источников полифенольных соединений по многим, объективным причинам не удовлетворяют запросам фармацевтической промышленности. В этой связи можно решать столь важную проблему поиска новых сырьевых источников полифенольных соединений за счет культивируемых пищевых растений, агротехника которых хорошо изучена на, территории России.

К числу таких растений относится вишня обыкновенная, которая^ произрастает во всех климатических зонах Российской Федёрации, за исключением Крайнего Севера.

Известно, что плоды вишни обыкновенной помимо применения^ в качестве пищевого продукта наряду с другими частями растения широко используются в народной медицине при атониях кишечника, как противовоспалительное, кровоостанавливающее, ранозаживляющее средство. На современном фармацевтическом рынке присутствуют поликомпонентные БАДы, в состав которых входят плодоножки и плоды вишни обыкновенной, которые обладают выраженным мочегонным, противовоспалительным, антибактериальным свойствами (Биодрайв 2, Вита-плант, ИМТ и др.).

В качестве источника биологически активных веществ одно- и двулетние побеги вишни обыкновенной практически не используется и причиной тому является недостаточная изученность их химического состава, в том числе не изучен полифенольный состав.

Более подробное изучение этих частей растения позволило бы в значительной мере обосновать их использование как дополнительного сырьевого источника полифенольных соединений и тем самым восполнить недостатки сырьевой базы.

Кроме того, следует учитывать и тот факт, что побеги вишни обыкновенной' после ежегодной подрезки накапливаются в значительных количествах и, к сожалению, уничтожаются, что является не только нерациональным, но и экологически вредным.

Учитывая сказанное, следует считать, что изучение полифенольных соединений побегов вишни обыкновенной является актуальной проблемой для фармации и медицины.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является исследование химического состава одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной и разработка рациональных путей получения на их основе суммарных фракций, обладающих биологической активностью.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• исследовать качественный и количественный состав биологически активных веществ одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной;

• разработать оптимальные условия экстракции биологически активных фракций с последующим изучением их фармакологической активности;

• получить очищенную сумму полифенольных соединений и осуществить идентификацию индивидуальных компонентов;

• провести морфолого-анатомические и товароведческие исследования побегов вишни;

• разработать проект фармакопейной статьи предприятия на одно- и двулетние побеги вишни обыкновенной.

Научная новизна. Химическое изучение состава одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной позволило выявить наличие следующих биологически активных соединений: флавоноидов, дубильных веществ, кумаринов, производных коричной кислоты, антраценпроизводных, витаминов, аминокислот и полисахаридов.

Количественный анализ показал, что наибольший интерес представляют флавоноиды, проантоцианидины, дубильные вещества.

Методом ВЭЖХ-анализа и хромато-масс-спектрометрии впервые идентифицированы в побегах вишни обыкновенной флавоноиды (виценин, витексин, скополетин, генкванин, апигенин) и производное 1,8-дигидроксиантрахинона (2-метилдантрон).

Изучена возможность использования спектрофотометрического метода для количественного определения проантоцианидинов и суммы фенольных соединений. Найдены оптимальные' условия для разработки методик определения указанных групп веществ в побегах вишни обыкновенной.

Разработаны условия получения сухих экстрактов с учетом технологических характеристик сырья.

Экспериментально установлено, что использование в качестве т. экстрагента спирта этилового 40% и 70% позволяет получать в последующем сухие экстракты с высокой биологической активностью:

- экстракт, полученный 40% спиртом этиловым, — характеризуется антиоксидантной, антимикробной, актопротекторной активностью;

- экстракт,, полученный 70% спиртом этиловым, - оказывает стимулирующее действие на желудочно-кишечноный тракт, а также антимикробную, актопротекторную активность.

Практическая значимость работы. Проведенные химические исследования одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной свидетельствуют о том, что они могут быть использованы в качестве дополнительных сырьевых источников получения биологически активных веществ.

Предложена .технологическая схема переработки сырья и получения сухих экстрактов, обладающих биологической активностью. s F

Внедрение результатов в практику. На основе проведенных исследований разработан проект ФСП «Вишни обыкновенной побеги

Cormus Cerasi vulgaris». Предложенные методики анализа прошли апробацию 1 в ГНУ «Крымская опытно-селекционная станция СКЗНИИСиВ РАСХН» (акт апробации от 12.04.2011 г.).

Положения, выдвигаемые на защиту:

- обоснование использования сырья одно- и двулетних побегов вишни i г обыкновенной в качестве источника для получения биологически активных веществ (БАВ);

- результаты исследования химического состава исходного сырья; j разработка технологии сухих экстрактов побегов вишни обыкновенной и очищенной фракции флавоноидов; результаты изучения их \ химического состава;

- результаты предварительного фармакологического скрининга сухих экстрактов из побегов вишни обыкновенной.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы (НИР) ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава, а также в соответствии с соглашением о выполнении НИР между Федеральным агентством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (№06/1049).

Апробация работы и публикации. Основные фрагменты диссертационной работы доложены и обсуждены на 62-й и 63-й региональных конференциях по- фармации, фармакологии и подготовке кадров ПятГФА (Пятигорск, январь 2007 г., январь 2008 г.).

По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 163 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, общих выводов, списка t 10 i литературы, включающего 156 источника, в том числе 13 иностранных; содержит 65 таблиц, 27 рисунков и приложения.

Общие выводы

1. Химическими исследованиями одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной установлено что:

- Химическими исследованиями одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной установлено, что:

- спиртом этиловым 40% извлекается' наибольшее количество суммы I фенольных соединений и составляет 5,71%, меньше извлекается спиртом этиловым 70% (4,10%) и 96% (3,57%);

- сумма флавонов и флавонолов больше извлекается спиртом этиловым 70% (0,327%), меньше - 40 % (0,313%) и 96 % (0,217%);

- флаваноны и изофлавоны по сравнению с другими извлечениями больше экстрагируются' спиртом этиловым 70%, количество которых составляет 0,897%, а 40 % и 96 % - 0,724% и 0,720% соответственно;

- максимальное содержание проантоцианидинов наблюдается в извлечении, полученном спиртом этиловым 40% (3,22%), а в двух других, полученных спиртом этиловым 70% и 96% - составляет 3,04%<и 1,61% соответственно;

- сумма полисахаридов составляет 8,44%; органических кислот -2,15%, макро- и микроэлементов — 52,63% в пересчете на золу; р-каротина -4,0мг/%; токоферола - 0,23 мг/%, аскорбиновой кислоты 2,02 мг/%.

2. В сухих экстрактах одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной, содержится 15 аминокислот, 8 из которых — незаменимые; в обоих случаях количественно преобладает глютаминовая кислота.

3. Суммарное содержание антиоксидантов, установленное амперометрическим методом, в экстрактах одно- и двулетних побегах вишни обыкновенной составляет: в извлечении, полученном 40% спиртом этиловым 1,35 мг/г; 70 % этанолом - 1,23 мг/г; в извлечении на 96% этаноле - 0,26 мг/г. I

4. Разработана технология получения сухих экстрактов из побегов вишни обыкновенной методом мацерации при соотношении сырье : экстрагент 1:5 и трехкратном настаивании, с последующим полным удалением экстрагента и высушиванием до получения сухого остатка темно-бурого цвета.

146

5. Методом ВЭЖХ выявлен состав полифенольных соединений:

- в сухом экстракте, полученном 40% спиртом этиловым, установлено наличие 13 соединений, из которых идентифицированы 6 веществ флавоноидной природы (гесперидин, лютеолин-7гликозид, гиперозид, апигенин, витексин, квецетин), 5 фенолокислот (хлорогеновая, кофейная, цикориевая, феруловая, О-метоксикумаровая кислоты); два соединения неидентифицированы;

- в сухом экстракте, полученном экстракцией сырья 70% спиртом этиловым, обнаружено 12 соединений, из них идентифицировано 7 веществ флавоноидной природы (гиперозид, рутин, витексин, виценин, кверцетин, лютеолин, катехин), 3 фенолокислоты (хлорогеновая, цикориевая; О-метоксикумаровая); два соединения неидентифицированы;

- в очищенной сумме флавоноидов (В-70-ф) идентифицировано 12 полифенолов, представленных флавоноидами (гесперидин, гиперозид, апигенин, витексин, виценин, кверцетин, катехин, лютеин), фенолокислотами коричная, хлорогеновая, кофейная,, о-метоксикумаровая); из флаванонов присутствуют сакуронетин,- нарингенин; флавонов — хризин; изофлавонов — генистеин. Впервые идентифицированы виценин, витексин, апигенин.

6. Методом хромато-масс-спектрометрия изучен состав суммы фенольных соединений и установлено наличие флаванонов - сакуронетина, нарингенина; флавонов - хризина; изофлавонов — генистеина. Впервые идентифицированы скополетин, 2-метилдантрон.

7. Предварительное фармакологическое исследование позволило выявить антиоксидантное, актопротекторное, антигипоксическое действие и стимулирующее влияние на желудочно-кишечный тракт

8. Установлены, макро- и микроскопические признаки сырья и определены его товароведческие показатели. Предложена методика стандартизации сухого- экстракта одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной по таким показателям, как: описание, подлинность, количественное определение суммы фенольных соединений (21,02%), потеря

147 в массе при высушивании (2,82%), принято за норму значение потери массы при высушивании не более 3%; микробиологическая чистота: в 1,0 г экстракта Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, бактерий . семейства Enterobacteriaceae — не обнаружены; срок годности сухого экстракта составляет 2 года.