Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследование по стандартизации сырья и настоек гомеопатических матричных безвременников

На правах рукописи

КАБАЛОЕВА Диана Руслановна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ И НАСТОЕК ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ МАТРИЧНЫХ БЕЗВРЕМЕННИКОВ

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

31 ОКТ 2013

Москва-2013

005536590

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук Терёшина Наталья Сергеевна

Официальные оппоненты:

Сокольская Татьяна Александровна - доктор фармацевтических наук, профессор, первый зам. директора по научной работе ГНУ ВИЛАР Потанина Ольга Георгиевна - доктор фармацевтических наук, директор Центра научных исследований и разработок ЦКП НОЦ РУДН

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России

Защита состоится «20» ноября 2013 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова, по адресу: 119991, г. Москва, Никитский бульвар, д.13.

С диссертацией можно ознакомится в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан « » октября 2013 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук,

профессор Демина Наталья Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. За последнее время отмечается возросший интерес к гомеопатическому методу лечения, который продолжает раскрывать свои возможности в фармакотерапии. Гомеопатические лекарственные средства, благодаря своей эффективности и безопасности, отвечают всем требованиям современной медицины. Более 70% современных гомеопатических средств получают из лекарственного растительного сырья. Учитывая важную роль лекарственных растений в изготовлении гомеопатических препаратов, исследования по стандартизации сырья и матричных настоек, представляют несомненный интерес.

Одним из важных лекарственных растений является безвременник, который широко используется в официнальной медицине, гомеопатии и народной медицине. Наибольшее практическое применение нашли два вида: безвременник осенний (Colchicum autumnale L.) и безвременник великолепный (Colchicum Speciosum Stev.J.

Безвременник осенний используется преимущественно в гомеопатической практике. Клубнелуковица безвременника осеннего является исходным сырьем для изготовления гомеопатической матричной настойки, которая может служить субстанцией для разработки лекарственных средств, применяемых для лечения подагры, суставного ревматизма, циститов, мочекаменной болезни, невралгий, нарушений кровообращения, бронхиальной астмы, воспалительных процессов пищеварительной и дыхательной систем. Сырье и настойка гомеопатическая матричная безвременника осеннего описаны Гомеопатическими Фар-макопеями Германии, Франции, Великобритании, США, Индии. В России фармакопейным видом является безвременник великолепный. В официнальной медицине препараты безвременника применяются при лечении раковых заболеваний, в том числе крови, молочной железы, кожи. В основном используются препараты на основе алкалоидов, выделенных из клубнелуковиц и семян: колхамина и колхицина.

Оба вида безвременника входят в перечень гомеопатических препаратов, разрешенных к применению в соответствии с приказом Минзравмедпрома России от 29.11.95 № 335. Однако отечественная нормативная документация на сырье и настойку гомеопатическую матричную двух видов безвременника в настоящее время отсутствует.

Исходя из вышесказанного, исследования по стандартизации сырья и матричных настоек безвременника осеннего, а также безвременника великолепного, который ранее не применялся в гомеопатической практике, направ-

з

ленные на разработку фармакопейных статей, представляют несомненный интерес для нашей страны и для фармации в целом.

Цель исследования — стандартизация сырья и настоек гомеопатических матричных безвременников осеннего и великолепного, разработка проектов фармакопейных статей на сырье и настойки гомеопатические матричные двух видов безвременника.

Задачи исследования:

• провести анализ отечественной и зарубежной научной литературы и нормативной документации, регламентирующей качество сырья безвременников осеннего и великолепного и гомеопатических матричных настоек;

• провести сравнительное изучение морфолого-анатомическое строения клубнелуковиц двух видов безвременника и выявить диагностические признаки для идентификации сырья;

• изучить качественный состав биологически активных веществ настоек гомеопатических матричных клубнелуковиц безвременника осеннего и великолепного;

• определить количественное содержание основного класса биологически активных веществ в настойках гомеопатических матричных безвременников осеннего и великолепного;

• разработать методики определения подлинности и оценки содержания суммы алкалоидов в матричных настойках и другие показатели качества для включения в проекты фармакопейных статей;

• установить показатели качества матричных настоек безвременников осеннего и великолепного и их нормы;

• изучить биологическую активность матричных настоек и гомеопатических разведений двух видов безвременника в сравнительном аспекте на культуре клеток Hela-,

• разработать проекты фармакопейных статей на сырье и настойки гомеопатические матричные двух видов безвременника.

Научная новизна работы. Впервые проведена сравнительная оценка макро- и микроскопических признаков сырья клубнелуковиц безвременников осеннего и великолепного, выявлены диагностические признаки сырья для установления подлинности, определены различия в зависимости от вида.

С использованием современных методов исследования (ТСХ, ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС) автором выявлены различия химического состава алкалоидов и аминокислот настоек гомеопатических матричных двух видов безвременника.

Подобраны оптимальные условия качественного и количественного анализа биологически активных веществ и разработаны методики контроля каче-

ства матричных настоек на основе современных физико-химических методов. Впервые в сравнительном аспекте изучена биологическая активность матричных настоек и гомеопатических разведений из двух видов безвременника в опытах in vitro на культуре клеток Hela.

Практическая значимость работы. На основе проведенных исследований разработаны проекты Фармакопейных статей для включения в ГФ XII:

- «Клубнелуковицы и настойка гомеопатическая матричная безвременника осеннего»;

- «Клубнелуковицы и настойка гомеопатическая матричная безвременника великолепного».

Разработанные проекты переданы для утверждения в установленном порядке.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XXI Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (Москва, 2011 г.), XXII Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (Москва, 2012 г.), Всероссийской научно-практической интернет-конференции «Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм» (Курск, 2011 г.), заседании Научного совета НИИ Фармации Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (Москва, декабрь 2012).

Личный вклад автора. Автором проведен анализ отечественной и зарубежной нормативной и справочной документации и других источников информации. Вся экспериментальная работа выполнена автором самостоятельно. Автором проведено сравнительное изучение анатомо-диагностических признаков сырья двух видов безвременника, разработаны показатели качества сырья, разработаны методы получения настоек гомеопатических матричных и проведено сравнительное изучение их химического состава; разработаны методики стандартизации сырья и настоек гомеопатических матричных; изучена биологическая активность гомеопатических разведений матричных настоек; разработана нормативная документация на сырье и настойки гомеопатические матричные безвременника.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 -Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3, 5 и 6 паспорта специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Связь задач исследований с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом Первого МГМУ имени И.М. Сеченова по теме: «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного

5

сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учетом влияния антропогенных факторов» (код темы 04.07.093, проблема № 1006 АМН РФ, Государственный регистрационный номер 01200110546).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 5 - в рекомендуемых ВАК изданиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Результаты сравнительного морфолого-анатомического изучения клубнелуковиц двух видов безвременника и вариабельность диагностических признаков в зависимости от вида безвременника.

• Данные по качественному составу биологически активных веществ (алкалоидов, флавоноидов, аминокислот, органических кислот) и содержанию суммы алкалоидов матричных настоек двух видов безвременника.

• Результаты стандартизации матричных настоек двух видов безвременника;

• Результаты оценки биологической активности матричных настоек и разведений двух видов безвременника.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 32 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 115 источников, в том числе 29 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования

Материалами для исследования Служили образцы опытных партий свежих клубнелуковиц безвременника осеннего и безвременника великолепного, предоставленные ботаническим садом ВИЛАР, а также собранные на территории Кабардино-Балкарской Республики (окрестности г. Нальчика) в 2009-2010 гг (табл. 1). Заготовку производили в апреле в период появления листьев и в октябре во время цветения растений.

Методы исследования

В работе использованы реактивы, растворители, стандарты, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.

Исследования макроскопических и микроскопических признаков сырья выполнялись на микроскопах «JIOMO МИКМЕД - 1» (окуляр 7х и объективы: 3,7х, 10х, 20х, 40х) и «МИКМЕД - 6» (окуляр 10х и объективы: 4х, 10х, 40х, 100х) в соответствии с требованиями фармакопейных статей ГФ XI: «Корни,

б

корневища, клубни, луковицы, клубнелуковицы», «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья». Фотоснимки выполнялись с помощью цифровой фотокамеры Canon Digital IXUS 80 IS; обработка снимков проводилась с использованием программы Microsoft Office Picture Manager. Определение влажности лекарственного растительного сырья проводили согласно методике ГФ XI изд.

Таблица 1

Опытные образцы лекарственного растительного сырья

Обозначение образца Вид безвременника Место сбора Срок сбора

CAI Colchicum autumnale Ботанический сад ВИЛАР Апрель 2010

СА2 -«- Сентябрь 2010

САЗ -«- Окрестности г. Нальчика Апрель 2010

СА4 -«- -«- Сентябрь 2010

CS5 Colchicum speciosum Ботанический сад ВИЛАР Апрель 2010

CS6 -«- -«- Сентябрь 2010

CS7 -«- Окрестности г. Нальчика Апрель 2010

CS8 -«- -«- Сентябрь 2010

Получение гомеопатических настоек двух видов безвременника проводилось в соответствии с ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные» по методу 2а. Определение числовых показателей матричных настоек (плотность, сухой остаток, микробиологическая чистота) проводили в соответствии с ГФ XI.

Для стандартизации матричных настоек двух видов безвременника проведена разработка соответствующих методик идентификации и количественного определения активных компонентов на основе анализа данных литературы и нормативной документации.

Идентификацию биологически активных веществ (алкалоидов, флавоно-идов, дубильных веществ) проводили с помощью качественных реакций и методом хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Мегск» (Германия), «Silufol UF-254» (Чехословакия), «Sorbfil» (Россия) в системах растворителей: 1) спирт н-бутиловый-кислота уксусная ледяная-вода (40:10:10); 2) спирт н-бутиловый-кислота уксусная ледяная - вода (66:17:17); 3) хлороформ-ацетон-раствор аммиака концентрированный (25-24-1); 4) хлороформ-ацетон-диэтиламин (70:20:10); 5) бензол-этилацетат-диэтиламин (70:20:10); 6) бензол-этилацетат-диэтиламин (50:40:10). Спектры поглощения соединений, исследуемых растворов в УФ- и видимой областях спектра записывали на приборах: СФ-46, Hitachi (Япония), «Сагу 50 Scan» фирмы Varian в кюветах с толщиной слоя 1 см. Качественный и количественный анализ алкалоидов матричных настоек двух видов безвременника проводили методом обращенно-фазной

ВЭЖХ; сбор и обработка хроматограмм осуществлялась с помощью программ ChemStation и AutoChrom1200/ACDlabs. В качестве неподвижной фазы использовали металлическую колонку размером 4,6x150 мм Germini Cl8 (производство Phenomenex) с градиентной подачей ПФ. В качестве ПФ были использованы: А- вода, В- ацетонитрил и С-1% раствор водный трифторуксусной кислоты с рН=2,0. Элюирование проводилось при скорости подачи элюента 1500 мкл/мин. Детектирование проводилось с помощью: 1) УФ-детектора при длине волны 350 нм, 2) фотодиодно-матричного детектора. Количественное определение колхицина и колхамина в анализируемых пробах проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе "Waters" (США), с последующей компьютерной обработкой результатов исследований с помощью программы «Мультихром для «Windows». Разделение проводили на металлической колонке Nucleosil 5С-18 (производство Macherey-Nagel, Германия) с градиентной подачей подвижной фазы. В качестве подвижной фазы использовали: А-ацетонитрил, В- 0,15 % фосфорная кислота в соотношении 27:73. Элюирование проводилось при скорости подачи элюента 1100 мкл/мин. Детектирование проводилось с помощью переменноволного УФ-спектрофотометрического детектора при длине волны 254 нм.

При разработке методик качественного и количественного определения основных групп БАВ были использованы стандарты: колхицин (ФС 42-2508-87; Sigma, CAS N 64-86-8); колхамин /демеколцин/ (ФС 42-2508-87; Sigma, CAS N 477-30-5); кислота галловая ([149-91-7] Merck), рутин (ФС 42-2508-87), кислота хлорогеновая (Sigma, Lot 56 Н7700).

Аминокислотный анализ водорастворимых фракций проводили на аминокислотном анализаторе фирмы «Хитачи» модель 835 на стальной колонке (0,4 х 15 см), заполненной катиообменной смолой марки 2619 (Hitachi Custom Ion-Exchange Resin).

Для исследования цитотоксичности гомеопатических матричных настоек и разведений применяли МТТ-тест (МТТ-3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид, производство «Sigma», США). В качестве клеточной культуры использовали HeLa (аденокарцинома шейки матки человека), в качестве инкубационной среды в - ДМЕМ, содержащей 10% телячью эмбриональную сыворотку (производство «BioWest», Франция). Элюирование проводилось с помощью МТТ до конечной концентрации 0.45 мг*мл"', образовавшийся МТТ-формазан растворяли подкисленным спиртом (50% изопропиловый спирт, 0.05 н. кислоты хлористоводородной). Детектирование проводилось с помощью УФ-спектрофотометрического детектора при длине волны 570 нм.

При обработке полученных результатов применяли метод вариационно-статистического анализа с использованием критерия достоверности по Стью-денту.

Макроскопический анализ

Исследование макро- и микроскопических признаков свежего сырья безвременников проводили на нескольких образцах, полученных из разных мест произрастания и времени вегетации. Определены характерные особенности для каждого вида.

Colchicum autumnale. Очищенные от корней клубнелуковицы грушевидно-приплюснутой формы, размером до 5 см длиной и до 3 см в диаметре. У места прикрепления корней находится плоско-треугольный вырост длиной до 1 см. С одной стороны клубнелуковицы сильновыпуклые, с другой - почти плоские или с желобовидной выемкой с остатком старого стебля. Наружная поверхность слегка морщинистая, покрыта темно-бурыми кожистыми чешуями (кроющими листьями). Цвет клубнелуковицы после удаления чешуи светло-коричневый, на свежем изломе - беловатый с кремовым оттенком и темными точками. Запах слабый специфический (Рис. 1).

Colchicum speciosum. Крупные, очищенные от корней клубнелуковицы коническо-удлиненной формы, часто неравнобокие, размером до 7 см длиной и до 4 см в диаметре. У основания рядом с местом прикрепления корней имеется клювовидный вырост размером около 1,5 см. С наружной поверхности клубнелуковицы покрыты буровато-коричневыми чешуями (кроющими листьями). Цвет наружной поверхности темно-коричневый, а после удаления чешуи - желтый, на свежем изломе - желтый с буроватым оттенком и темными точками. Запах слабый, специфический (Рис. 2).

» ! >' 4 ч « £ 3 I г' з 4 |

Рис. 1. Внешний вид клубнелуковицы Рис. 2. Внешний вид клубнелуковицы безвременника осеннего безвременника великолепного

Микроскопический анализ

Colchicum autumnale. При рассмотрении микропрепарата кроющего листа с поверхности видны клетки верхнего эпидермиса - полигональные или четырехугольные со слегка извилистыми клеточными стенками размером от 20 до 60 мкм (чаще от 30 до 40 мкм) длиной и от 40 до 45 мкм шириной (Рис. 3). Подстилающие клетки мезофилла крупнее эпидермальных и имеют заметную чет-ковидную утолщенность клеточных стенок. Нижний (внутренний) эпидермис кроющего листа клубнелуковицы состоит из изодиаметричных преимущественно четырехугольных, реже - многоугольных клеток с прямыми или слабоизвилистыми стенками. В клетках наблюдается аморфное содержимое бурого цвета. Устьица располагаются с обеих сторон и окружены 4 эпидермальными клетками. На поперечном срезе клубнелуковицы виден эпидермис, состоящий из крупных квадратных клеток со слегка утолщенной наружной стенкой и бурым содержимым. Основная ткань состоит из округлых или овальных клеток паренхимы. Закрытые проводящие пучки расположены и ориентированы хаотично. Сосуды ксилемы имеют преимущественно спиральную или лестничную вторичную утолщенность клеточных стенок. В клетках паренхимы наблюдается большое количество крахмала. Крахмальные зерна диаметром от 4 до 20 мкм, в основном простые - округлые, округло-усеченные или вытянутые, полусферической формы, часто с полостью и звездчатой трещиной.

Рис. 3. Наружный эпидермис кроющей чешуи

клубнелуковицы безвременника осеннего (ув.х40)

а б в

Рис. 4. Клубнелуковица безвременника великолепного а - эпидермис с поверхности кроющего листа с устьицей (ув.х40); б - спиральная или лестничная вторичная утолщенность клеточных стенок сосудов ксилемы (ув.х90); в - клетки эпидермиса кроющей чешуи с окрашенным содержимым (ув.х40)

Colchicum speciosum. При рассмотрении микропрепарата кроющего листа с поверхности видны клетки верхнего (наружного) эпидермиса - полигональные (чаще шестиугольные), изодиаметричные или удлиненные с утолщенными темно-коричневыми стенками. Клетки нижнего (внутреннего) эпидермиса кроющего листа имеют вытянутую форму и светло-коричневую окраску клеточных

стенок. Устьица располагаются с обеих сторон и окружены 4-6 эпидермальны-ми клетками (Рис. 4а).

Сосуды ксилемы имеют преимущественно спиральную или лестничную вторичную утолщенность клеточных стенок (Рис. 46). В клетках флоэмы, а также в клетках паренхимы, окружающих сосудисто-проводящие пучки, заметно маслянистое содержимое желтоватого цвета в виде капель, при окрашивании раствором Судана III приобретающее оранжевый цвет (Рис. 4в). В клетках паренхимы наблюдается большое количество крахмала. Крахмальные зерна простые или 2-х - 3-хсложные диаметром от 6 до 20 мкм. Простые зерна округлые, округло-усеченные или вытянутые полусферической формы, часто с полостью и звездчатой трещиной (Рис. 5а, б, в).

а б в

Рис. 5. Клубнелуковица безвременника великолепного: а-строение крахмальных зерен (ув.х90); б - локализация крахмала вокруг проводящего пучка (ув.х90); в- локализация крахмала по краю и вокруг пучков (ув.х40)

Получение настоек гомеопатических матричных на основе клубнелуковиц безвременника осеннего, великолепного и разработка методов их

стандартизации

Получение настоек гомеопатических матричных клубнелуковиц двух видов безвременника осуществляли с помощью мацерации по методу 2 ОФС «Настойки гомеопатические матричные» (ОФС 42-0027-05) из измельченного сырья с использованием 86% (по массе) спирта. По 2 методу, согласно ОФС «Настойки гомеопатические матричные», получают настойки из свежего растительного сырья с влажностью менее 60 %.

Изучение химического состава, определение показателей подлинности и количественного определения матричных настоек Анализ настоек на содержание важнейших групп биологически активных веществ, содержащихся в сырье по литературным данным (алкалоидов, флаво-ноидов и органических кислот), подразделялся на две стадии: качественные реакции на основные классы биологически активных веществ, методы хромато-

графии. Качественное определение биологически активных веществ проводили с помощью реакций осаждения и цветных реакций.

Объектами исследования служили экспериментальные образцы гомеопатических настоек, приготовленных из различных видов сырья (табл. 2). Основными действующими веществами клубнелуковиц безвременника являются алкалоиды. В связи с этим основная часть методов стандартизации направлена на изучение именно этого класса биологически активных веществ.

Таблица 2

Расчетное соотношение масс сырья и экстрагента для получения настоек гомеопатических матричных свежесобранных клубнелуковиц двух видов

безвременника

Обозначение образца сырья Масса сырья, кг Масса экстрагента (спирта этилового 86%), кг

CAI 0,500 0,913

СА2 0,500 0,881

САЗ 0,500 0,895

СА4 0,500 0,877

CS5 0,500 0,795

CS6 0,500 0,780

CS7 0,500 0,810

CS8 0,500 0,803

Изучение химического состава матричных настоек Изучение полифенольных соединений и органических кислот. Полифе-нольные соединения в растительном сырье определяли и качественной реакцией (цианидиновая проба) и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией в позитивном и негативном режиме детекции со стандартами: коричной кислотой, аромадендрином, таксифо-лином, галловой кислотой, петулетином, лютеолином, апигенином, хлорогено-вой, кофеиновой кислотами, рутином и кверцетином.

Качественные реакции на флавоноиды дали отрицательный результат. Исследование хроматографическим методом подтвердило отсутствие в настойках гомеопатических матричных флавоноидов (рис. 6-9). Массовые хромато-граммы, соответствующие молекулярным ионам, не обнаруживают пики с характерными ультрафиолетовым и масс-спектрами и временами удерживания, совпадающими со стандартами. На основании этого можно утверждать, что в исследуемом образце флавоноиды отсутствуют. Найдена кофейная кислота (рис. 10, 11).

Изучение аминокислот. По литературным данным клубнелуковицы безвременника осеннего и безвременника великолепного содержат несколько классов биологически активных веществ, среди которых присутствуют аминокислоты.

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии проведен сравнительный анализ аминокислотного состава настоек гомеопатических матричных двух видов безвременника (рис. 12-14).

боо.о -||Г!-т-~:"' ■■■■■-•-......-----.....-.....- —----------------------— -...... 5оо.о г: И "' ....... ■ ..... 11 п 1

ВЦ • •_______________________ ----—Вт-................. Щ а Na 1 - Leu Туг Pl-ie ОН- Lys ЕА His Arg Lys

Рис. 5. Сравнительный анализ аминокислотного состава матричных настоек безвременников осеннего и великолепного (№1 - матричная настойка безвременника осеннего; №2 - матричная настойка безвременника великолепного)

Преобладающими аминокислотами в матричной настойке безвременника осеннего являются: глютаминовая кислота - 30,45%, аспарагиновая кислота -25,87%, аргинин - 18,76% от суммы свободных кислот. Преобладающими аминокислотами в матричной настойке безвременника великолепного являются: аргинин - 27,16%, аспарагиновая кислота - 26,95%, глютаминовая кислота -11,54% от суммы свободных кислот. Достаточно высокое содержание таких жизненно важных аминокислот, как серин - 5,00%, треонин - 4,23%, лейцин -3,65%, валин - 3,50%, аланин, фенилаланин и лизин - 3,00%, пролин - 2,76%, изолейцин - 2,17% от суммы свободных кислот.

Изучение алкалоидов. Наличие алкалоидов устанавливали качественными реакциями и методом тонкослойной хроматографии. Матричные настойки двух видов безвременника дают характерные качественные реакции с калия гидроксидом, азотной и серной кислотами, описанные в литературе. Сравнительное исследование методом тонкослойной хроматографии в четырех подвижных фазах позволило установить, что качественный состав настоек из двух видов безвременника отличается составом некоторых минорных компонентов, однако показывает наличие двух основных алкалоидов: колхицина и колхами-на.

1

2

3

Рис. 14. Хроматограмма матричных настоек безвременников осеннего и великолепного

Подвижная фаза: спирт н-бутиловый - кислота уксусная ледяная - вода (40:10:10); 1 -раствор сравнения ( Rf 0,25 - колхицин; Rf 0,45 - колхамин); 2 - матричная настойка Colchicum autumnale; 3 —матричная настойка Colchicum speciosum.

Более детальное изучение качественного и количественного состава настоек гомеопатических матричных было проведено методом, высокоэффективной жидкостной хроматографии. Качественный состав матричных настоек безвременника осеннего, великолепного определяли методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-детекцией в градиентном режиме. Для пиков, обнаруженных на хроматограммах, были получены ультрафиолетовые и масс-спектры, на основании которых предложены возможные структуры веществ.

Один из основных компонентов на хроматограммах - пик с временем удерживания около 2 мин. Массовая хроматограмма 372 m/z , а также УФ- и MC-спектр данного пика позволяют предположить что этот компонент - деме-колцин. Второй доминирующий компонент на хроматограммах - пик с временем удерживания около 3,3 мин. Массовая хроматограмма 400 m/z , а также УФ- и MC-спектр данного пика позволяют предположить, что этот компонент -колхицин. Минорные компоненты на массовой хроматограмме 386 m/z имеют УФ- и MC-спектры, позволяющие предположить, что первый компонент имеет структуру -2-деметилколхицин-глюкозид, второй компонент - 2-деметилколхицин и третий компонент - 3-деметилколхицин (рис. 13-15).

В матричных настойках безвременника осеннего и великолепного обнаружено 7 и 9 соединений соответственно, установлена чистота пиков в трехмерных координатах (время - интенсивность поглощения - длина волны). Определено, что в настойках основными алкалоидами являются демеколцин и колхицин. Остальные обнаруженные вещества содержатся в минорных количествах и не оказывают существенного влияния на общую сумму алкалоидов в настойках.

В матричных настойках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии проведена количественная оценка суммы алкалоидов колхицина и демеколцина. Чувствительность метода составляет 0,1 мкг, линейная зависимость соблюдается в интервале 0,1-1,2 мкг. На рис. 16 приведены хромато-граммы раствора смеси стандартных образцов колхицина и демеколцина и гомеопатических настоек безвременника осеннего и великолепного. Содержание суммы колхицина и демеколцина в настойке безвременника великолепного составляет около 0,075%. Содержание суммы колхицина и демеколцина в настойке безвременника осеннего составляет около 0,086%.

Таблица 3

Метрологические характеристики метода количественного определения суммы алкалоидов в настойке безвременника методом ВЭЖХ

компонент Б X Е2 Б р Т(Р,0 Дх Е

Сумма алкалоидов 5 0,075 0,12x10"5 0,001 0,95 2,57 0,001 1,33

Рис.6. ВЭЖХ/МС в режиме детекции позитивных ионов исследуемого Рис.7. ВЭЖХ/МС в режиме детекции позитивных ионов иссле-образца, массовые хроматограммы 131 m/z, 189 m/z и 305 m/z дуемого образца, массовые хроматограммы 303 m/z и 317 m/z

OBA1JT 21-¿iiv2012 If

OBAU» -J'j. 2012 10:37:19

1414

áiüffiigi, .JiblLt'., г,::.:,,

]

.......Til

Рис.8. ВЭЖХ/МС в режиме детекции позитивных ионов исследуемого образца, массовая хроматограмма 287 m/z

Рис.9. ВЭЖХ/МС в режиме детекции позитивных ионов исследуемого образца, массовая хроматограмма 271 m/z

итрМ ОВА127 210(10-2012 Н'.1ТД2 С_а*-210в1И_-*и 1:ЗсалЕ$- с сШ —» 0.00 1.00 2<)0 \ 100 <00 ^ 37 „Г

и ОЭ7 -5 ,74 215 2572м1\17а 4М*** к" ■

С м-210в12-1_-м аатш* \ 1.8са»Е» •а ..-^'ь^_Л««.

А. . ? . «> У 3.2, % ю 4.30 Г® - «ач»«-« 100 100 4'°°. А с.от-2юв13-1_ А: «»285(2482 Ст (25МООКМ1:Э4>2222») 1 5оп Т... -1 1 «,.,1

С.<М-210в1И_-«1 V- _( Гвс» Ев- \01 . . С1'" -¿С" А 126#7 \ п о.?« ™ / Г^94—----иг__с***ъ\2л_-<я _^я5(г<в2)Дя(Г71:Л1-(ЗС342»23вСв9;) 1:5с 250 300 350 400 450 5С0 МО 600 650

с.о^се«.:.-«'00 100 4 001.8»1Е8. *] _ ¡а__________ 1667 1 1

Рис. 10. Определение органических кислот в НГМ безвременника методом ВЭЖХ-МС в режиме детекции негативных ионов

Рис. 12. ВЭЖХ НГМ безвременника осеннего

1.13 CüfecAid

IScanES-179 250e7

200 3.00 4.1» S.00 S.00 7.Ш

Test 7 ШИ-2510П-2129 (1.128) Cm (127:13^138:150+11^122))

t&anES-1.53Й

Test7mK-251011-21336 (1.113) Cm (1310:136^¡13S2H78t1203:!273))

t.Oe-1-0.0)

Рис. 11. Хроматограмма и спектры стандарта кофеиновой кислоты в режиме детекции негативных ионов

S ? i

I ? , . s J |р ff lili ! * lili 1.Ш л A b.iKÁ.t. um i Л V

ütr^ f-^Uüi^1 i 11" 1 ■*■ ' < 1 ' 1

Рис. 13. ВЭЖХ НГМ безвременника великолепного

зитивных ионов, массовая хроматограмма 372 m/z и спектры компонента с временем удерживания около 2 мин

следуемого образца, массовая хроматограмма 386 m/z и спектры трех компонентов с временами удерживания около 1.1,2.25 и 2.4 мин

Рис.14. ВЭЖХ/МС исследуемого образца в режиме детекции позитивных ионов, массовая хроматограмма 400 m/z и спектры компонента с временем удерживания около 3.3 мин

Ля****)»

liÜl

а б в

Рис. 16. ВЭЖХ: а - раствор стандартных образцов колхицина и демеколци-на; б - НГМ безвременника осеннего; в - НГМ безвременника великолепного

Разработка показателей качества настоек гомеопатических матричных безвременников осеннего и великолепного

На основании проведенных исследований разработаны показатели качества настоек гомеопатических матричных двух видов безвременника: сухой остаток, плотность, тяжелые металлы и количественное определение.

Проведена валидация методики количественного определения суммы алкалоидов в матричных настойках безвременников осеннего и великолепного.

Специфичность методики подтверждается тем, времена удерживания пиков колхицина и демеколцина (колхамина) на хроматограмме исследуемого совпадают со временами удерживания пиков на хроматограмме раствора стандартных образцов, как в случае использования матричных настоек, так и в опытах с добавками.

Линейность доказывается, если в выбранном диапазоне концентрации наблюдается прямо пропорциональное соотношение между площадями пиков алкалоидов и содержания в суммы алкалоидов колхицина и демеколцина. Линейная зависимость соблюдается в интервале 0,1-1,2 мкг.

Сходимость методики должна показать, что при проведении в одинаковых условиях (один человек, на одном приборе и в один день) обеспечивается получение сравнимых результатов. В таблице 12 приведены данные количественного содержания суммы алкалоидов.

Таблица 12

Сходимость ВЭЖХ методики

№ опыта Содержание суммы алкалоидов, %

1 0,0730

2 0,0750

3 0,0740

4 0,0750

5 0,0720

Таблица 13

Статистическая обработка результатов ВЭЖХ методики

Статистические характеристики, % Результаты, %

Наибольшее значение 0,0750

Наименьшее значение 0,0720

Среднее значение 0,0738

Стандартное отклонение 0,001

Коэффициент вариации 0,0135

Доверительный интервал (при Р = 95%) 0,073 8±0,003

Из таблицы 13 следует, что отклонение данных опытов незначительно, следовательно, данная методика достоверна.

Правильность доказывается с помощью метода добавок алкалоидов к анализируемой пробе. Относительная ошибка результатов опытов с добавками не превышает ошибку единичного определения и имеет отклонения в сторону положительных и отрицательных значений. Это что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки в разработанной методике высокоэффективной жидкостной хроматографии (табл. 14).

Таблица 14

Результаты определения правильности ВЭЖХ методики определения суммы алкалоидов (в матричной настойке безвременника осеннего)

Найдено Добавлено Добавлено Должно Найдено Ошибка

суммы алка- колхицина, колхамина, быть, мг/10 относительная,

лоидов, мг мг мг мг мл %

0,86 0,17 0,18 1,21 1,26 +4,13

0,86 0,21 0,20 1,27 1,25 -1,57

0,86 0,42 0,44 1,72 1,74 - 1,16

0,86 0,53 0,56 1,95 1,98 + 1,54

Робастность ВЭЖХ методики подтверждается стабильностью настойки при хранении в естественных условиях. Экспериментально показано, что в течение срока хранения (от 1 месяца до 2 лет) при соблюдении условий хранения, содержание суммы алкалоидов менялось незначительно во всех сериях настоек безвременника осеннего и безвременника великолепного.

Изучение биологической активности матричных настоек на основе клубнелуковиц безвременника осеннего, великолепного и их разведений

Изучение цитотоксической активности матричных настоек и гомеопатических разведений двух видов безвременника проводили на клеточной культуре HeLa. Все исследованные матричные настойки влияют на жизнеспособность клеток HeLa, которые более чувствительны к образцам матричных настоек безвременника осеннего по отношению к образцам матричных настоек безвременника великолепного. Исследования показали, что в концентрациях 150 мкмоль'л'1 исследуемые образцы матричных настоек не оказывали существенного влияния на рост клеток HeLa. Все гомеопатические разведения безвременников осеннего и великолепного обладают сходной цитотоксической активностью. В концентрации 0,3-0,4 мкг«мл"' они вызывают подавление жизнеспособ-

20

ности клеток на 60-70%. На рис.17 представлены результаты изучения цитоток-сического действия гомеопатических разведений: чем ниже столбик диаграммы, тем более высокой цитотоксическое действие оказывает гомеопатическое разведение. На основании полученных данных выяснилось, что наиболее высокой цитотоксической активностью обладают гомеопатические разведения 02, ОЗ, Э4 безвременника осеннего и 02, 04, 05, Об безвременника великолепного. Полученные данные позволяют сделать вывод, что цитотоксическая активность равных разведений двух видов безвременника различна.

Таким образом, исследованные образцы матричных настоек и гомеопатических разведений двух видов безвременника оказывают цитотоксическое действие на опухолевые клетки.

Рис. 17. Цитотоксическое действие гомеопатических разведений матричных настоек безвременника осеннего и великолепного

Разработаны и оформлены проекты фармакопейных статей «Клубнелуковицы и настойка гомеопатическая матричная безвременника осеннего», «Клубнелуковицы и настойка гомеопатическая матричная безвременника великолепного».

ВЫВОДЫ

1. Проведено информационно-аналитическое исследование литературных данных и нормативных документов по требованиям к качеству сырья и матричных настоек безвременника. Выявлены основные показатели качества сырья и настоек.

2. Проведено сравнительное изучение морфолого-ан атомического строения клубнелуковиц безвременника осеннего и безвременника великолепного и выявлены диагностические признаки для идентификации сырья. При проведении микроскопического исследования было установлено, что в отличие от безвременника великолепного наружная стенка эпидермиса у безвременника

осеннего, а также аморфное содержимое эпидермальных клеток имеют более интенсивную окраску. Количество крахмала в клубнелуковицах весеннего сбора значительно меньше, чем осеннего; крахмальные зерна локализуются преимущественно вокруг проводящих пучков и в 3-5 слоях паренхиматозных клеток, примыкающих к эпидермису, а в некоторых образцах полностью отсутствуют.

3. Изучен качественный состав биологически активных веществ матричных настоек двух видов безвременника и установлено присутствие алкалоидов, аминокислот, кофейной кислоты.

4. Проведено количественное определение основного класса биологически активных веществ - алкалоидов трополоного ряда в матричных настойках безвременников осеннего и великолепного. Обнаружено 7 и 9 соединений из класса алкалоидов соответственно, установлено, что доминирующими алкалоидами являются колхамин и колхицин.

5. Разработаны методики определения подлинности и оценки содержания суммы алкалоидов в матричных настойках качественными реакциями с помощью тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографий. Проведена валидация методики количественного определения суммы алкалоидов в матричных настойках безвременников осеннего и великолепного.

6. Установлены следующие показатели качества матричных настоек двух видов безвременника: сухой остаток, плотность, тяжелые металлы и содержание суммы алкалоидов.

7. Проведено сравнительное исследование цитотоксической активности матричных настоек и гомеопатических разведений двух видов безвременника на культуре клеток Hela. Установлено, что наиболее высокой цитотоксической активностью обладают гомеопатические разведения D2, D3, D4 безвременника осеннего и D2, D4, D5, D6 безвременника великолепного.

8. Разработаны и оформлены проекты фармакопейных статей «Клубнелуковицы и настойка гомеопатическая матричная безвременника осеннего», «Клубнелуковицы и настойка гомеопатическая матричная безвременника великолепного».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кабалоева Д.Р. Терёшина Н.С. Исследования по стандартизации сырья и настоек гомеопатических матричных безвременника // XXI Московская международная гомеопатическая конференция «Развитие гомеопатического метода в современной медицине», 28-29 января 2011 г.: Тезисы докладов. - М., 2011.-С. 164-166.

2. Кабалоева Д.Р., Бобкова Н.В., Терёшина Н.С. Изучение клубнелуковиц двух видов безвременника// Фармация. -2011. - №6. - С.15-18.

3. Кабалоева Д.Р., Бобкова Н.В., Терёшина Н.С. Сравнительное изучение микроскопических признаков клубнелуковиц безвременника осеннего и безвременника великолепного // Всероссийская научно-практическая Интернет-конференция «Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм», Курск, 27 апреля 2011 г. - Материалы Всероссийской научно-практической Интернет-конференции с международным участием. - С. 314-316.

4. Кабалоева Д.Р., Бобкова Н.В., Терёшина Н.С. Исследование морфо-лого-анатомических признаков сырья безвременника великолепного и безвременника осеннего // Н-Международная научно-практическая конференция «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки»/ Сборник работ молодых ученых. - Владикавказ. - 2011. Ч. 1. - С.211-214.

5. Кабалоева Д.Р. Терёшина Н.С. Анализ гомеопатических настоек безвременника методом ВЭЖХ // Традиционная медицина. - 2011. - №5 (28). -С. 194-197.

6. Кабалоева Д.Р. Терёшина Н.С. Исследования аминокислотного состава гомеопатических матричных настоек клубнелуковиц безвременника осеннего и великолепного // Традиционная медицина. - 2011. - №5 (28). -С. 197-200.

7. Кабалоева Д.Р. Терёшина Н.С. Состав биологически активных веществ и использование препаратов безвременника // Проблемы экологии, здоровья, фармации и паразитологии. Научные труды Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова. - М.: 2011.-С.30-35.

8. Кабалоева Д.Р. Терёшина Н.С. Исследования по стандартизации лекарственного растительного сырья и гомеопатических препаратов безвременника // Гомеопатический ежегодник. Сборник материалов XXII Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» М., 2012, с. 214-216.

9. Кабалоева Д.Р., Каденаци И.Б., Шустова Л.В., Терёшина Н.С. ВЭЖХ в анализе гомеопатической матричной настойки безвременника великолепного // Фармация. -2012. - №8. - С.14-16.

10. Кабалоева Д.Р. Терёшина Н.С. Изучение цитотоксической активности настоек гомеопатических матричных безвременника из клубнелуковиц безвременников осеннего и великолепного и их разведений // Гомеопатический ежегодник. Сборник материалов XXIII Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» М„ 2013, с. 173-174.

11. Кабалоева Д.Р., Терёшина Н.С. Изучение трополоновых алкалоидов гомеопатических настоек безвременника осеннего и великолепного // Фармация. - 2013. -№ 2. - С.17-20.

БАВ - биологически активные веще- НГМ - настойка гомеопатическая

ВЭЖХ - высокоэффективная жид- ТСХ - тонкослойная хроматография

Список сокращений

ства

матричная

костная хроматография

ТУ - технические условия УФ - ультрафиолетовый ФС — фармакопейная статья МТТ - метилтиазол-дифенилтетразолиум бромид

ГОСТ - государственный стандарт ГФ - государственная фармакопея ЛРС - лекарственное растительное сырье

МС - масс-спектрометрия

Подписано в печать: 20.10.2013 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 183 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru