Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изучение компонентного состава и стандартизация гомеопатической матричной настойки хелидониум

На правах рукописи

Фомичева Елена Анатольевна

ИЗУЧЕНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ГОМЕОПАТИЧЕСКОЙ МАТРИЧНОЙ НАСТОЙКИ ХЕЛИДОНИУМ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте Фармации ММА имени И.М. Сеченова

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук Коотенникова Зинаида Петровна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук,

профессор Даргаева Тамара Дарижаповна

Кандидат фармацевтических наук Кашникова Марина Вадимовна

Ведущая организация: Всероссийский научный центр по безопас-

ности биологически активных веществ (ГУП ВНЦ БАВ) г Купавна

Защита диссертации состоится «11» октября 2004 г в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: И 7216, г. Москва, ул Грина, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216 г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан «_» _2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01

к.с.-х.н. / 0 М. В. Кирцова

Актуальность темы. Гомеопатия является неотъемлемой частью практической медицины. Если методологические и опытно-экспериментальные основы официальной медициной особенно активно формировались с ХУП в, то гомеопатический метод лечения не находил научного подтверждения и лишь в настоящее время на основе достижений современной науки гомеопатический метод находит теоретическое обоснование. В настоящее время открываются пути к их взаимному обогащению

Издание Приказа Минздрава РФ № 335 от 29.11.95 г «Об использовании метода гомеопатии в практическом здравоохранении» явилось юридическим обоснованием гомеопатического метода лечения и гомеопатической фармации и способствовало интенсивному их развитию. Гомеопатический метод лечения получил официальный разрешение на использование в Государственной системе здравоохранения Российской Федерации.

В гомеопатии применяются, в основном, лекарственные средства природного (растительного, животного и минерального) происхождения. Это является одним из ее преимуществ, так как известно насколько велика цена использования химико-фармацевтических средств - это аллергические заболевания, лекарственная непереносимость и др. В этом кроется причина большой популярности гомеопатических лекарственных средств.

В связи с тем, что создаются отечественные гомеопатические препараты, стандартизация и контроль их качества становится особенно актуальным. Од-

нако методов контроля этой группы лекарственных средств до последнего времени в нашей стране практически не существовало, что в значительной степени обусловлено недостаточностью проведения теоретических исследований, так же отсутствием Государственной гомеопатической фармакопеи. Поэтому разработка современных методик анализа на гомеопатические лекарственные средства с использованием комплекса физико-химических методов с учетом требований стандартизации является актуальной

г

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящих исследований являлось изучение в сравнительном аспекте содержания биологически активных веществ (БАВ) и разработка методов контроля качества, широко применяемых в гомеопатии, гомеопатических настоек Хелидониум - чистотела большого (СЬеНёопшт та^ Ь.) сем. Маковых - (Рарауегасеае) с использованием современных физико-химических методов анализа. '

Выявить характерные отличия гомеопатической матричной настойки Хелидониум, используемой для изготовления гомеопатических лекарственных средств от других гомеопатических настоек Хелидониум.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить компонентный состав гомеопатических настоек Хелидониум, полученных из свежесобранного (трава, корневище с корнями) и высушенного (трава) сырья чистотела большого;

- разработать методики контроля качества БАВ, а также показатели качества гомеопатических настоек Хелидониум;

- изучить стабильность гомеопатической матричной настойки Хелидониум в процессе хранения.

Научная новизна. Изучен компонентный состав и разработаны методики качественного и количественного определения БАВ (алкалоидов, флавоноидов, фенолкарбоновых, жирных и аминокислот) в гомеопатических настойках Хелидониум, полученных из свежесобранного и высушенного сырья из разных частей чистотела большого (целое, корневище с корнями, трава) с использованием комплекса современных физико-химических методов (ВЭЖХ, ТСХ, хро-мато-масс-спектрометрии, дифференциальной спектрофотометрии и др.).

На основании математических расчетов эффективности разделения выбраны оптимальные условия хроматографирования алкалоидов, фенольных соединений и аминокислот.

Разработаны методики количественного определения доминирующих БАВ в гомеопатических настойках Хелидониум:

- с помощью метода дифференциальной спектрофотометрии определена сумма алкалоидов в пересчете на хелидонин;

- методом ВЭЖХ и УФ-спектрофотометрии количественно определены флавоноиды в пересчете на рутин;

- в сравнительном аспекте впервые с помощью ВЭЖХ, аминокислотного анализатора и хромато-масс-спектрометрии количественно охарактеризованы гомеопатические настойки по содержанию аминокислот, фенолкарбоновых и жирных кислот.

Разработана методика определения подлинности гомеопатических лекарственных средств - капель и гранул Хелидониум ОЗ, а также комплексного препарата «Холеодорон».

С использованием данных сравнительного анализа по компонентному составу и количественному содержанию доминирующих БАВ выявлены характерные отличия гомеопатической матричной настойки Хелидониум, полученной из свежесобранного корневища с корнями чистотела, от других гомеопатических настоек Хелидониум, полученных по гомеопатической технологии из свежесобранной и высушенной травы чистотела.

Научно-практическая значимость работы. На основании проведенных исследований установлен компонентный состав БАВ и выявлены различия гомеопатической матричной настойки Хелидониум, полученной из корневища с корнями чистотела от других гомеопатических настоек Хелидониум.

Разработаны показатели качества и требования для гомеопатической матричной настойки Хелидониум, которые включены в проект ФС на гомеопатическую матричную настойку Хелидониум (проект рассмотрен Фармакопейным комитетом МЗ РФ и рекомендован к утверждению).

Связь задач исследования с проблемным планом развития фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с пла-

ном научных исследований Научно-исследовательского института фармации ММА им. И.М. Сеченова (номер гос. Регистрации 0192.0017258), соответствует направлению проблемной комиссии по фармации 3608 РАМН МЗ РФ; включена в Отраслевую программу развития гомеопатического метода лечения и гомеопатической фармации, утвержденной МЗ РФ 20 января 1998 г.

Апробация работы. Результаты экспериментальных исследований доложены на Научно-практической конференции НИИ фармации «Современные проблемы фармации» в 1999, а также на Международных Московских конференциях по гомеопатии «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» в 2001 и 2003 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Положения выносимые на защиту:

- Результаты исследований по установлению компонентного состава и количественного содержания биологически активных веществ (алкалоидов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, аминокислот, липофильных веществ, в том числе жирных кислот) в гомеопатических настойках Хелидониум, с использованием методов ТСХ и ВЭЖХ, хромато-масс-спектрометрии, спектро-фотометрии.

- Исследования по разработке методики количественного УФ-спектрофотометрического определения флавоноидов в гомеопатических настойках Хелидониум, полученных из свежесобранного и высушенного сырья чистотела.

- Исследования по разработке методики количественного спектрофото-метрического определения суммы алкалоидов в пересчете на хелидонин в гомеопатической матричной настойке Хелидониум.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ш страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками. Список цитированной

литературы включает источника литературы, из них 33 иностранных

авторов.

В обзоре литературы изложены ботанико-фармакогностичсское описание лекарственного растительного сырья чистотела большого, сведения о биологически активных веществах, фармакологическом действии, применении в официальной, народной медицине и гомеопатии, а также описаны физико-химические методы анализа БАВ лекарственного растительного сырья и препаратов чистотела большого.

Вторая глава посвящена изучению методом ВЭЖХ компонентного состава алкалоидов свежесобранного сырья чистотела большого и гомеопатических настоек Хелидониум.

В третьей главе изложены исследования по установлению компонентного состава фенольных соединений настоек гомеопатических Хелидониум методом ТСХ, ВЭЖХ, результаты исследований аминокислотного состава настоек методами ТСХ и ВЭЖХ (аминокислотный анализатор), исследования жирно-кислотного состава, предложена методика количественного определения суммы флавоноидов методом УФ-спектрофотометрии в пересчете на рутин.

В четвертой главе представлены исследования по разработке показателей качества и установлению сроков годности гомеопатической матричной настойки Хелидониум, а также по разработке методики определения подлинности гомеопатических лекарственных средств, в состав которых входит Хелидониум.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Изучение компонентного состава алкалоидов лекарственного растительного сырья чистотела и гомеопатических настоек Хелидониум

Объектами исследования являлись свежесобранное сырье чистотела большого и гомеопатические настойки, полученных из различных частей растения.

Компонентный состав алкалоидов осуществляли с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Анализ проводили на приборе PERKIN ELMAR производства США с УФ-детектором при длине волны 280 нм. На обращеннофазной колонке Qg размером 15 X 4,6, при температуре 20 ± 2 °С, с использованием градиентного элюирования. В качестве элюента применяли ацетонитрил в 0,1 н растворе кислоты фосфорной в концентрации от 30 до 60 %. Скорость потока элюента 1,0 мл/мин. Объем вводимой пробы 1 мкл. Время хроматографирования 30 мин. Идентификацию проводили путем соотнесения экспериментальных данных с банком данных по временам удерживания.

В свежесобранном корневище с корнями чистотела, свежесобранной траве чистотела, а также в гомеопатической матричной настойке Хелидониум, полученной из свежесобранного корневища с корнями и в гомеопатической настойке, полученной из свежесобранной травы чистотела обнаружены хелидо-нин, сангвинарин, берберин и хелеритрин, что представлено в табл. 1. и на рис.1.

Таблица 1

Компонентный состав алкалоидов в свежесобранном корневище с корнями и траве чистотела большого

Вещества Время удерживания, мин Найдено, % от суммы

Свежесобранное корневище с корнями Свежесобранная трава Свежесобранное корневище с корнями Свежесобранная трава

Хелидо-нин 16,19 16,11 42,91 30,45

Сангвинарин 17,15 17,22 4,17 2,68

Берберин 17,74 17,87 9,97 0,58

Хлерит-рин 20,13 20,06 21,11 4,48

Рис. 1. Хроматограмма алкадоидов свежесобранного корневища с корнями чистотела большого

1,- хелидонин; 2. - сангвинарин; 3. - берберин; 4. - хелеритрин

Относительное содержание отдельных алкалоидов установлено методом внутренней нормализации. Основным алкалоидом, как в сырье, так и в гомеопатических настойках Хелидониум является хелидонин. Относительное содержание хелидонина, сангвинарина, берберина и хелеритрина в свежесобранном корневище с корнями выше, чем в свежесобранной траве чистотела большого. В гомеопатической матричной настойке Хелидониум, полученной из свежесобранного корневища с корнями, относительное содержание хелидонина (30,04 %), сангвинарина (2,92 %), берберина (6,98 %) и хелиретрина (14,78 %) выше, чем их относительное содержание в гомеопатической настойке Хелидониум, полученной из свежесобранной травы чистотела (21,32 %, 1,88% ,0,41% и 3,14 % соответственно).

2. Изучение компонентного состава флавоноидов в гомеопатических настойках Хелидониум

Компонентный состав флавоноидов изучали методами тонкослойной (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Оптимальное разделение флавоноидов в исследуемых настойках Хелидониум, достигнуто при использовании в качестве неподвижной фазы пластинок типа «Сорбфил», а в подвижной - бе!вол- метанол -кислота уксусная ледяная (43:9:4). Эффективность используемой системы математически обоснована. Коэффициент разделения (ц) флавоноидов в выбранных оптимальных условиях составляет 2,85.

Флавоноиды на хроматограммах иидентифицировали по растворам стандартных образцов рутина, кверцетина, люгеолина, гиперозида (табл. 3).

Таблица 3

Хроматографические характеристики флавоноидов в гомеопатических настойках Хелидониум

Объект исследования Rf* Свечение в УФ-свете при длине вол-

ны 360 нм после обработки 2 %

раствором алюминия хлорида

Гомеопатическая настойка 0,27 Зеленовато-желтое

Хелидониум, полученная из 0,43 Желтое

травы чистотела

Гомеопатическая матричная 0,07 Желтое

настойка Хелидониум, полу- 0,26 Зеленовато-желтое

ченная из корневища с кор- 0,44 Желтое

нями чистотела

Растворы стандартов

Кверцетин 0,27 Зеленовато-желтое

Лютеолин 0,43 Желтое

Рутин 0,07 Желтое

Гиперозид 0,39 Желтое

Примечание. * - среднее арифметическое из пяти определений

В гомеопатической матричной настойке Хелидониум, полученной из свежесобранного корневища с корнями чистотела, обнаружены кверцетин и лютеолин, а в гомеопатической настойке Хелидониум, полученной из свежесобранной травы чистотела, дополнительно обнаружен рутин.

В связи с малым содержанием фенолкарбоновых кислот в гомеопатических настойках и недостаточной разрешающей способностью метода ТСХ этот

к

класс соединений обнаружить весьма затруднительно, поэтому для наиболее достоверной идентификации флавоноидов и фенолкарбоновых кислот был ' применен более чувствительный метод ВЭЖХ. Предварительно выделение

флавоноидов и фенолкарбоновых кислот проводили на колонке с полиамидом.

Анализ проводили на приборе PERKIN ELMAR производства США с УФ-детектором при длине волны 255 нм. На обращеннофазной колонке С]8 размером 4,5 X 250, размер частиц 3 мкм., при температуре 20 ± 2 "С, с использованием метода градиентного элюирования. В качестве элюента применяли ацетонитрил в 2 % растворе кислоты уксусной в концентрации от 15 до 55 %.

Скорость потока элюента 1,0 мл/мин. Объем вводимой пробы 1 мкл. Время хроматографирования 45 мин. Идентификацию проводили в соответствии с растворами СОВС и банком данных по временам удерживания.

Относительное содержание флавоноидов в гомеопатической матричной настойке Хелидониум, полученной из свежесобранного корневища с корнями чистотела большого (образец 1) и гомеопатической настойке Хелидониум, полученной из свежесобранной травы чистотела большого (образец 2) и фенол-карбоновых кислот в гомеопатической настойке Хелидониум, полученной из целого свежесобранного растения (образец 3), устанавливали методом внутренней нормализации (табл. 4).

Таблица 4.

Компонентный состав флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в гомеопатических настойках Хелидониум, полученных из свежесобранных корневища

Вещества Время удерживания, мин Найдено от суммы, %

Образец 1 Образец 2 Образец 3 Образец 1 Образец 2 Образец 3

Рутин — 17,91 1,34 —

Кверцетин 37,14 36,80 — 52,99 1,34 —

Лютеолин 31,22 31,28 — 27,02 20,22 —

Гиперозид — 14,85 — — 4,90 —

Кислота галловая — — 4,73 — — 1,07

Кислота хлороге-новая 7,25 22,47

Кислота кофейная — — — — — —

Из данных таблицы видно, что в гомеопатической матричной настойке Хелидониум, полученной из свежесобранного корневища с корнями чистотела преобладает кверцетин, а в гомеопатической настойке Хелидониум, получен-

ной из свежесобранной травы чистотела - лютеолин, а в гомеопатической настойке Хелидониум, полученной из целого растения чистотела преобладает кислота хлорогеновая.

Для количественного определения флавоноидов в гомеопатических настойках Хелидониум, полученных из свежесобранной и высушенной травы чистотела большого разработана методика дифференциально спекгрофотомет-рического определения с использованием реакции комплексообразования флавоноидов с раствором алюминия хлорида. Анализ проводили на 11У - ШБ спектрофотометре (модель 1201) фирмы БЫтаёги (Япония) Определена область максимального светопоглощения - 410 нм. ± 2 нм. Показано, что оптическая плотность достигает максимума через 40 минут и остается стабильной в течение последующих 10-12 минут. Так как максимумы поглощения окрашенных продуктов реакции рутина и суммы флавоноидов гомеопатических настоек Хелидониум, полученных из свежесобранной и высушенной травы находятся в пределах 408 ± 4 нм., то в качестве стандартного образца целесообразно использовать рутин. Метрологические характеристики методики представлены в табл. 5. Как видно из данных таблицы, относительная ошибка определения среднего результата по предлагаемой методике с доверительной вероятностью 0,95 не превышает ± 3,7%. Достоверность полученных результатов была подтверждена методом "добавок".

Таблица 5.

Метрологические характеристики методики количественного спектрофото-метрического определения флавоноидов в гомеопатических настойках

Хелидониум

Объект исследования { (п-1) X Б ЭГ г(р; 0 Дх ±£%

Настойка Хелидониум из свежесобранной травы чистотела 6. 0,427 0,0027 0,0012 2,447 0,0066 1,55

Настойка Хелидониум, из высушенной травы чистотела 6 0,329 0,0021 0,00079 2,447 0,0051 1,54

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в гомеопатической настойках Хелидониум, полученной из травы чистотела (свежесобранное и высушенное сырье) составляет около 0,4% и 0,3% соответственно.

3. Изучение компонентного состава аминокислот в гомеопатических настойках Хелидониум

Широким спектром биологического действия обладают аминокислоты, состав которых в гомеопатических настойках Хелидониум ранее не изучался.

Исследование состава аминокислот гомеопатических настоек Хелидониум, полученных из свежесобранного и высушенного сырья проводили с использованием методов ТСХ и аминокислотного анализатора, в качестве растворов стандартных образцов веществ сравнения (СОВС) аргинина, пролина, аспара-гиновой кислоты, серина, аланина, глутаминовой кислоты, валина и фенилала-нина. На хроматограммах во всех изучаемых настойках присутствуют зоны со-тветствующие пролину, аланину, глутаминовой кислоте, валину, фенил алани-ну. Зона, соответствующая аспарагиновой кислоте обнаружена лишь в настойках Хелидониум из свежесобранного корневища с корнями и из свежесобранной травы. Идентифицировать все зоны на хроматограммах затруднительно, так как зоны некоторых аминокислот имеют близкие и совпадающие величины Rf (например, норвалин и метионин). Поскольку гомеопатические настойки Хелидониум, полученные из свежесобранного и высушенного сырья чистотела большого содержат наряду со свободными аминокислотами пептиды, то при анализе в тонком слое сорбента значения Rf коротких пептидов могут совпадать с Rf свободных аминокислот, что затрудняет анализ свободных аминокислот методом тонкослойной хроматографии. Поэтому для более глубокого изучения аминокислот в настойках применяли аминокислотный анализатор. Анализ свободных аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе фирмы «Hitachi» (Япония) модель 835 на стальной колонке (0,4x15 см), заполненной катионообменной смолой марки 2619 (Hitachi Custom Jon Exchange Resin).

Площади пиков идентифицированных аминокислот определяли автоматически, а для неидентифицированных соединений регистрировали время выхода и площади пиков. В качестве стандарта использовали смесь, состоящую из 24 стандартных аминокислот. Относительное содержание идентифицированной аминокислоты определяли в аликвотах. Результаты анализа приведены в табл. 6., из данных которой видно, что по компонентному составу и в количественном отношении аминокислот гомеопатическая матричная настойка Хелидо-ниум, полученная из свежесобранногого корневища с корнями значительно меньше насыщена, чем гомеопатические настойки Хелидониум, полученные из свежесобранной или высушенной травы чистотела, и обнаружены: глутамин, гидроксилизин, аспарагин и аспарагиновая кислота, цистеин, аланин, пролин.

4. Изучение компонентного состава жирных кислот в гомеопатических настойках Хелидониум

При анализе данных литературы по составу жирных кислот в гомеопа-

тиических настойках Хелидониум нами не найдено. Исследование жирнокис-лотного состава гомеопатических настоек Хелидониум проводили методом хромато-масс-спектрометрии на хроматомасс-спекрометре НР-6890 (HEWLETT PACKARD, USA) с масс-селекгивным детектором (MSD) 5973. Для исследований применяли колонку с сорбентом средней полярности (состава 95% диме-тилполисилоксана, 5% дифенилполисилоксана) HP-5-MS длиной 30 м. В качестве газа-носителя использовали гелий со скоростью потока 1 мл/мин. Скорость нагрева 3° С /мин. Интервал температур составлял от 35 до 290 °С.

Идентификацию компонентов настоек проводили по времени удерживания специфичному для отдельных компонентов. На всех хроматограммах изучаемых объектов обнаружены пики жирных кислот: пальметиновой, линоле-

Таблица 6

Результаты количественного определения аминокислот в гомеопатических __настойках Хелидониум___

Наименование аминокислоты Матричная настойка Хелидониум из свежесобранного корневища с корнями Настойка Хелидониум из свежесобранной травы Настойка Хелидониум из высушенной травы

мг/мл % от суммы мг/мл % от суммы мг/ мл % от суммы

Гидроксипролин 0,047 0,02 0,321 0,45 0,321 0,032

Аспарагиновая 22,73 9,68 83,69 11,77 4,053 0,40

кислота и аспа-

рагин

Треонин* 5,39 2,29 22,72 3,20 15,27 1,51

Серии 4,33 1,84 22,78 33 20,26 1,20

Глутаминовая 66,38 28,26 219,68 30,89 266,33 26,28

кислота и глу-

тамин

Пролин 12,98 5,53 90,79 12,77 124,77 12,31

Глицин 9,05 3,86 21,84 3,07 29,85 2,95

Алании 14,39 6,12 52,19 7,48 157,56 15,55

Цистеин 0,08 0,03 1,12 0,16 0,99 0,1

Валин* 17,69 7,53 41,20 5,79 60,68 5,99

Метионин* 1,00 0,43 1,25 0,18 3,97 0,39

Изолейцин 9,54 4,06 23,48 3,3 36,60 3,61

Лейцин* 7,06 3,01 30,39 4,27 44,76 4,42

Тирозин 1,05 0,45 1,97 0,28 0,71 0,07

Фенилаланин* 3,00 1,28 14,58 2,05 16,89 1,67

Гидроксшшзин 48,80 20,78 47,01 6,61 188,50 48,20

Орнитин 1,76 0,75 6,64 0,93 7,80 0,77

Лизин* 3,76 1,60 16,38 2,30 16,26 1,60

Гистидин 0,79 0,32 0,10 0,14 1,96 0,19

Аргинин* 8,09 3,45 12,05 1,69 15,96 1,57

Сумма 234,83 100 711,09 100 1013,49 100

Примечание. * - незаменимые аминокислоты

вой, линоленовой. В гомеопатической матричной настойке Хелидониум, полученной из свежесобранного корневища с корнями в отличие от других го-

меопатических настоек обнаружены небольшие пики кислот: миристиновой, 9-гексадекановой и олеиновой. Наблюдается также незначительный пик гепта-декановой кислоты. Количественное содержание жирных кислот в исследуемых объектах определяли методом внутренней нормализации (табл. 7).

Таблица 7.

Результаты количественного определения жирных кислот в _гомеопатических настойках Хелидониум_

Наименование кислоты жирной Найдено кислоты, ох суммы жи рных кислот (%)

Матричная настойка Хелидониум из свежесобранного корневища с корнями Настойка Хелидониум из свежесобранной травы Настойка Хелидониум из высушенной травы

Миристиновая 4,34

9-гексадекановая 2,19 -------

Пальмитиновая 15,75 5,0 15,63

Гептадекановая 0,68

Олеиновая 2,9

Линолевая 24,2 5,24 20,6

Линоленовая 10,28 4,74 19,22

Общее содержание жирных кислот, % 60,24 14,98 45,45

Из данных таблицы видно, что в компонентном отношении жирных кислот больше содержится в гомеопатической матричной настойке Хелидониум, (миристиновая, 9-гексадекановая, гептадекановая, олеиновая, линоленовая, ли-нолевая, из которых преобладает последняя). В гомеопатических настойках Хелидониум, полученных из травы (свежесобранное и высушенное сырье) содержится в количественном отношении значительно меньше жирных кислот (пальмитиновая, линолевая и линоленовая, из которых доминирует линолевая). Вместе с тем относительное содержание жирных кислот в гомеопатической настойке Хелидониум, полученной из высушенного сырья, в количественном отношении превышает содержание жирных кислот в гомеопатической настойке

Хелидониум, полученной из свежесобранного сырья (14,98%) и, составляет 45,45%,

5. Разработка показателей качества и установление срока годности гомеопатической матричной настойки Хелидониум

Нами были также разработаны показатели качества и установлены сроки годности гомеопатической матричной настойки Хелидониум. Подлинность настойки Хелидониум предложено устанавливать по реакциям с реактивом Несс-лера и с раствором аммиака концентрированного. Поскольку эти реакции -групповые и не являются специфичными, то подлинность гомеопатической матричной настойки Хелидониум предложено так же определять методом тонкослойной хроматографии на пластинках типа «Сорбфил», с использованием в качестве подвижной фазы н-бутанол - кислота уксусная ледяная - вода (40:10:10), и растворов свидетелей берберина (Яг=0,3), хелидонина =0,53), сангвинарина (Яг =0,79)

На хроматограмме исследуемой настойки в УФ-свете при длине волны 365 нм обнаруживаются зоны голубого цвета с Я5 около 0,93, желто-зеленого с Я, =1,0 (берберин), красного с около 1,77 (хелидонин), голубого с Я5 около 2,03 и около 2,43, а также красного с около 2,63 (сангвинарин).

После обработки хроматограммы реактивом Драгендорфа обнаруживаются зоны красно-оранжевого цвета, принадлежащие алкалоидам с К, = 0,93, Я* =1,0 (берберин), Я, около 1,77 (хелидонин) и слабо оранжевого цвета с Я, около 2,63 (сангвинарин) (рис. 2).

Разработанная методика определения подлинности гомеопатической матричной настойки Хелидониум методом ТСХ была использована при определении гомеопатических лекарственных средств Хелидониум ОЗ в гранулах и каплях, а также в комплексном препарате «Холеодорон». Методика позволяет идентифицировать Хелидониум до БЗ (третьего десятичного разведения).

<о О

-»—I--»—<-г—н

к г з 4

Рис.2. Хроматограмма алкалоидов гомеопатической матричной

настойки Хелидониум, полученной из свежесобранного корневища с корнями 1а. в УФ-свете при длине волны 365 нм 16. после обработки реактивом Драгендорфа

2. берберин;

3. хелидонин;

4. сангвинарин.

Количественное содержание алкалоидов в пересчете на хелидонин в гомеопатической матричной настойке Хелидониум предложено определять спек-трофотометрическим методом с использованием реакции комплексообразова-ния алкалоидов с хромотроповой кислотой.

Предварительно устанавливали оптимальные условия количественного определения. Было показано, что максимальное значение оптической плотности продуктов реакции при длине волны 570 нм достигается через 90 минут при использовании испытуемого раствора и 0,1 % раствора хромотроповой кислоты в соотношении (1:1) (рис. 3).

Результаты количественного определения суммы алкалоидов представлены в табл. 8., из данных которой видно, что относительная ошибка не превышает ± 3,38 %.

Содержание суммы алкалоидов в пересчете на хелидонин предложено регламентировать в пределах от 0,06 % до 0, 15 %, что согласуется с данными аналогичной фармакопейной статьи Гомеопатической фармакопеи Германии.

Результаты исследований включены в проект фармакопейной статьи на гомеопатическую матричную настойку Хелидониум.

Нами изучена стабильность настойки на серийных образцах и установлено, что в течение 2-х лет хранения настойка по всем показателям отвечает требованиям фармакопейной статьи.

1,0

0,8

(А

3

0,6-1 '/->

{

0,4- /

/

0,2-)

!

0,0 1' - - -- ,----- -

400 500

(пш)

600

Рис.3. УФ-спектры поглощения продуктов реакции алкалоидов гомеопатической матричной настойки Хелидониум с хромотроповой кислотой Комплексные соединения алкалоидов с хромотроповой кислотой

1 - гомеопатическая матричная настойка Хелидониум

2 - раствор хелидонина

Таблица 8.

Результаты количественного спектрофотометрического определения суммы алкалоидов в пересчете на хелидонин в гомеопатической матричной настойке Хелидониум

Серия Содержание суммы алка- Метрологические характеристи-

лоидов в пересчете на ки

хелидонин, %

1 2 3

0,093 Х=0,0934; 8'= 1,3* 106;

0,095 8х*=5,099 *\0~*; Р= 0,95;

010900 0,092 {=4; АХ = ±3,13* 10"3

0,093 ±е = 3,38 %

0,094

0,097 Х= 0,0964; Б2 = 8* 10';

0,095 в-=8,94 ♦ 10ц; Р=0,95;

020900 0,097 {=4; ДХ =±2,48 *10"3;

0,097 ±£ = 2,58 %

0,096

0,095 Х= 0,0948; $,2 = 7* 107;

0,094 Б-=8,37 * 10"4; Р-0,95;

030900 0,095 {=4; ДХ =±2,32 *103;

0,096 ±е = 2,45 %

0,094

ВЫВОДЫ

1. На основании анализа данных литературы и собственных исследований обоснована правомерность постановки вопроса по изучению компонентного состава БАВ в настойках гомеопатических, полученных из свежесобранного и высушенного лекарственного растительного сырья, их стандартизации и создания нормативных документов, связанных со спецификой технологии их получения.

2. Изучен компонентный состав и разработаны методики качественного и количественного определения доминирующих БАВ (алкалоидов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, аминокислот и жирных кислот) в гомеопатических настойках Хелидониум с использованием современных физико-химических ме-

тодов (ТСХ, хромато-масс-спектроскопии, ВЭЖХ, дифференциальной спек-трофотометрии и др.).

3. Определены характерные отличия гомеопатической матричной настойки Хелидониум, которая широко используется как базисная для последующего приготовления гомеопатических лекарственных средств, от других гомеопатических настоек, приготовленных по различным технологиям как из свежесобранного или высушенного сырья, так и по используемой части растения (корневище с корнями или трава).

4. Выбраны оптимальные условия разделения алкалоидов и фенольных соединений гомеопатических настоек Хелидониум методом ТСХ с использованием математических расчетов эффективности разделения зон адсорбции.

5. Показана сходство в компонентном составе алкалоидов в гомеопатических настойках Хелидониум и различие в их количественном отношении: в гомеопатической матричной настойке Хелидониум, из свежесобранного корневища с корнями, относительное содержание хелидонина и хелеретрина выше, чем содержание в гомеопатической настойке Хелидониум, из свежесобранной травы чистотела.

6. Разработана методика количественного спектрофотометрического определения суммы алкалоидов в пересчете на хелидонини в гомеопатической матричной настойке Хелидониум, основанная на реакции образования комплекса алкалоидов с хромотроповой кислотой. Относительная ошибка определения на превышает ± 3.38 %.

7. Методом ВЭЖХ в гомеопатической матричной настойке Хелидониум из свежесобранного корневища с корнями чистотела обнаружены флавоноиды: кверцетин (52,99 %) и лютеолин (27,02 %), а в настойке из свежесобранной травы чистотела - рутин (4,9 %), кверцетин (1,34 %), лютеолин (20,22 %) и гиперо-зид (1,34 %). Из фенолкарбоновых кислот в гомеопатической настойке, полученной из целого растения, преобладает хлорогеновая кислота (22,47 %) и гал-

ловая (1,07 %). В гомеопатической матричной настойке Хелидониум фенолкар-боновые кислоты не найдены.

8. Разработана методика количественного спектрофотометрического определения флавоноидов в гомеопатических настойках Хелидониум, полученных из свежесобранной и высушенной травы чистотела. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в гомеопатических настойках Хелидониум, полученных из травы чистотела (свежесобранное и высушенное сырье) составляет около 0,4 % и 0,3 % соответственно.

9. Впервые изучен компонентный состав свободных аминокислот гомеопатических настоек Хелидониум, полученных из свежесобранного корневища с корнями, свежесобранной травы и высушенной травы методом ВЭЖХ (аминокислотный анализатор). Установлено, что наиболее насыщены свободными аминокислотами гомеопатические настойки Хелидониум из свежесобранной и высушенной травы чистотела, существенно меньше их содержит гомеопатическая матричная настойка Хелидониум, из свежесобранного корневища с корнями.

10. Методом ВЭЖХ изучен компонентный состав жирных кислот в гомеопатических настойках Хелидониум. Установлено, что гомеопатическая матричная настойка Хелидониум, полученная из свежесобранного корневища с корнями содержит жирных кислот - 60,24 %, в том числе пальмитиновая (15,75 %), ми-ристиновая, 9-гексадекановая, гептадекановая, линолевая (24,2 %), олеиновая и линоленовая (10,28 %), гомеопатическая настойка Хелидониум, полученная из свежесобранной травы чистотела - 14,98 %, а из высушенного - 45,45 %.

11. Разработана методика определения подлинности гомеопатических лекарственных средств Хелидониум - капель и гранул 03, а также комплексного препарата «Холеодорон», позволяющая идентифицировать препараты до ГО (третьего десятичного разведения).

12. Разработаны показатели качества и требования для гомеопатической матричной настойки Хелидониум, которые включены в проект Фармакопейной статьи «Хелидониум настойка гомеопатическая матричная». Проект рассмотрен

Фармакопейным комитетом МЗ РФ и рекомендован к утверждению. По результатам исследований опубликовано 11 научных работ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Копытько Я.Ф., Лякина М.Н., Селиванчикова И. Б., Фомичева Е.А., Яковлева Е.В., Костенникова З.П. Использование физико-химических методов при контроле качества настоек гомеопатических матричных. // Материалы Международной научной конференции «Фармация в XXI веке, инновации и традиции» - СПб., 1999. - С. 5- 6.

2. Фомичева Е.А., Костенникова З.П., Копытько Я.Ф Определение подлинности алкалоидов в гомеопатической настойке Хелидониум матричной. // Материалы VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». -М., 2000.- С. 625.

3. Акашкина Л.В., Копытько Я.Ф., Селиванчикова И.Б., Фомичева Е.А. и др. Использование физико-химических методов при контроле качества настоек гомеопатических матричных. // Материалы Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности». Томск, 2000. - С. 76-77.

4. Фомичева Е.А., Костенникова З.П. Сравнительное изучение компонентного состава флавоноидов настоек чистотела, полученных из различных частей свежего растения.// Материалы XI Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной в современной медицине», -М., 2001.- С. 149-150.

5. Фомичева Е.А., Костенникова З.П. Исследование жирно-кислотного состава гомеопатических настоек чистотела большого методом хромато-масс-спектрометрии.// Фармация.- 2001,- №1,- С. 39-40

6. Фомичева Е.А., Костенникова З.П. Изучение компонентного состава флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в гомеопатических настойках чистотела хроматографическими методами. Сообщение №1.// Фармация.- 2001.- №3.-С. 17-19.

7. Костенникова З.П., Акашкина Л.В., Копытысо Я.Ф., Терешина Н.С., Цуканов Ю.В., Лякина М.Н., Селиванчикова И.Б., Яковлева Е.В., Фомичева Е.А., Григорьева Т.В., Можайская Е.А. Разработка методов контроля качества настоек гомеопатических. // Материалы VIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». -М., 2001. - С. 694.

8. Костенникова З.П., Лякина М.Н., Селиванчикова И.Б., Фомичева Е.А., Яковлева Е.В. Исследование липофильных веществ настоек гомеопатических арники, туи и хелидониум методом хроматомасспектрометрии. // Материалы VIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». -М., 2001. -С. 694.

9. Фомичева Е.А., Костенникова З.П. Спектрофотометрическое количественное определение алкалоидов в гомеопатической матричной настойке Хелидониум (Чистотел).// Материалы XIII Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине». -М., 2003,- С.129-130.

10. Фомичева Е.А., Костенникова З.П. Сравнительное изучение компонентного состава алкалоидов гомеопатических настоек Хелидониум.// Материалы XIY Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине». -М., 2004. - С.88-89.

11. Фомичева Е.А., Лякина М.Н., Костенникова З.П. Определение флавоноидов в гомеопатической настойке.// Фармация.- 2004,- №2,- С. 44- 46.

г i

v>

04" 1 56 9 0

РНБ Русский фонд

2005-4 9415

подписано к печати 25.07.2004 Г. Ф А5 Бум офс Печ ризогр Тираж 100 экз.

Научно-исследовательский и учебно-методический Центр БМТ ВИЛАР, 123056, Москва, ул. Красина, 2