Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследование по стандартизации плодов растений, содержащих вещества антоциановой природы

На правах рукописи

Егорова Анна Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ ПЛОДОВ РАСТЕНИИ, СОДЕРЖАЩИХ ВЕЩЕСТВА АНТОЦИАНОВОЙ ПРИРОДЫ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

16 МАЙ ¿073

Самара-2013

005059794 Сої

005059794

Диссертационная работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович Официальные оппопенты:

Кудашкина Наталья Владимировна - доктор фармацевтический наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии, заведующая кафедрой

Пурыгин Петр Петрович - доктор химических наук, профессор, Федеральное Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный университет», кафедра органической, биоорганической и медшшпской химии, заведующий кафедрой

Ведущая организация:

Пятигорский медико-фармацевтический институт государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « » 2013 г. в "/¿¿-^ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171.

Автореферат разослан « _ C^-^yié-Afl 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент Петрухина Ирина Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Поиск новых перспективных источников получения растительных биологически активных веществ (БАВ) является одной из стратегических задач современной фармации. Благодаря комплексному воздействию БАВ растительного происхождения особую актуальность приобретает разработка препаратов на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) (Киселева Т.Л. и др., 2008; Куркин В.А., 2007; Самылина И.А. и др., 2003, 2010). В настоящее время особое внимание уделяется изучению лекарственных растений (ЛР), обладающих антиоксидантной активностью. В этом отношении интерес представляет ЛРС, содержащее антоцианы. Поскольку этиологию многих заболеваний (сердечно-сосудистые, онкологические заболевай™, артрит, сахарный диабет, болезнь Альцгеймера и др.) ассоциируют с разрушающим эффектом свободных радикалов, в этих условиях необходимо дополнительное поступление веществ с антиоксидантной активностью. Многие лекарственные препараты, относящиеся к группе антиоксидантов, являются синтетическими, однако большой интерес представляют растительные вещества фенольной природы, в частности антоцианы. Кроме того, наряду с антиоксидантной активностью антоцианы обладают противовоспалительными, антимикробными, гепатопротекторными свойствами. Вещества антоциановой природы обнаружены в растворенном виде в клеточном соке почти во всех частях растений — в листьях, стеблях, запасающих органах, хотя наибольшее их количество содержится в цветках и плодах. В этом отношении интерес представляют плоды таких растений, как черника обыкновенная, арония черноплодная, смородина черная, черемуха обыкновенная и другие. Однако, на наш взгляд, в изучении сырья некоторых из вышеперечисленных видов лекарственных растений существуют нерешенные вопросы. Так, современное состояние действующей нормативной документации (НД) на плоды аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной требует глубокого анализа и переосмысления устаревших данных. В частности, в разделах существующей НД, посвященных качественному анализу сырья, данные по морфолого-анатомическим особенностям плодов обсуждаемых растений представлены не в полном объеме, отсутствует визуальная поддержка данных признаков. Набор качественных реакций также, на наш взгляд, нуждается в дополнении более специфическими. В разделе, посвященном количественному определению, не находят отражения методики, основанные на физико-химических методах с применением современных инструментальных возможностей, а также

отсутствуют числовые показатели качества сырья. Кроме того, обсуждаемое ЛРС не изучено в сравнительном плане, что создает определенные трудности при идентификации сырья и препаратов. Достаточно высокая нестабильность антоциановых соединений создает трудности при выделении индивидуальных компонентов и последующем их хранении. В этой связи ЛР, содержащие данную группу веществ, должны быть востребованы, прежде всего, как источник получения суммы антоцианов, а также в качестве препаратов на их основе. В этой связи целесообразньм представляются исследования по стандартизации ЛРС, содержащего антоцианы, а также разработка методик качественной и количественной его оценки.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящей работы являлется исследование по стандартизации некоторых видов лекарственного растительного сырья растений, содержащих вещества антоциановой природы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выявление диагностических признаков плодов аронии черноплодной.

2. Выявление диагностических признаков плодов смородины черной.

3. Выявление диагностических признаков плодов черемухи обыкновенной.

4. Сравнительное изучение анатомо-морфологических и гистологических особенностей плодов аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной.

5. Сравнительное изучение химического состава плодов аронии черноплодной, плодов смородины черной, плодов черемухи обыкновенной.

6. Разработка методик качественного определения антоцианов в плодах аронии черноплодной.

7. Разработка методики качественного определения антоцианов в плодах смородины черной.

8. Разработка методики количественного определения суммы антоцианов в плодах аронии черноплодной.

9. Разработка методики количественного определения суммы антоцианов в плодах смородины черной.

10. Определение числовых показателей качества сырья «Аронии черноплодной плоды».

11. Определение числовых показателей качества сырья «Смородины черной плоды».

12. Разработка проектов ФС на сырье «Аронии черноплодной плоды» и «Аронии черноплодной плоды свежие».

13. Разработка состава и технологии получения нового лекарственного препарата «Аронии черноплодной сироп».

Научная новизна. В результате проведенного сравнительного анатомо-морфологического исследования впервые выявлены диагностические признаки сырья «Аронии черноплодной плоды», заключающиеся в наличии одноклеточных волосков, характерных следов мест прикрепления волосков с неравномерно утолщенными одревесневшими клетками, групп склереид с характерным строением, семенной кожуры с тонким ослизняющимся эпидермисом и слоем склеренхимы с широкопросветными клетками. Для сырья «Смородины черной плоды» выявлены признаки: наличие неотпадающего, сросшегося с ягодой, околоцветника; наличие крупных щитовидных (пельтатных) эфиромасличных железок, определяемых по всей поверхности плода; «паркетный» эндокарп околоплодника; гребневидный эпидермис семенной кожуры. Впервые для сырья «Черемухи обыкновенной плоды» проведено исследование анатомического строения плодоножки. Обоснована целесообразность стандартизации ЛРС «Аронии черноплодной плоды», «Смородины черной плоды» по сумме антоцианов в пересчете на цианидин-З-О-глюкозид. Подобраны оптимальные условия для проведения качественной и количественной оценки суммы антоцианов в плодах аронии черноплодной, смородины черной с использованием хроматографических и спектрофотометрических методов, позволяющих определить качество и подлинность лекарственного растительного сырья. В результате сравнительного исследования спектральных характеристик извлечений из плодов аронии черноплодной свежих и воздушно-сухих показана целесообразность переработки свежего сырья для получения лекарственных препаратов с высоким содержанием антоцианов. Изучены показатели качества сырья «Аронии черноплодной плоды», «Аронии черноплодной плоды свежие» «Смородины черной плоды», «Черемухи обыкновенной плоды».

Впервые разработаны унифицированные методики качественного и количественного анализа плодов аронии черноплодной, смородины черной и препаратов на их основе по сумме антоцианов.

Практическая значимость. Разработаны унифицированные методики качественного и количественного анализа плодов аронии черноплодной и смородины черной, заключающиеся в определении антоцианов методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и спектрофотометрии. Методики

количественного анализа ЛРС «Аронии черноплодной плоды», «Смородины черной плоды» базируются на определении содержания суммы антоцианов в пересчете на цианидин-З-О-глюкозид методом спектрофотометрии при аналитической длине волны 534-538 нм. Разработаны показатели качества ЛРС «Аронии черноплодной плоды», «Аронии черноплодной плоды свежие», «Смородины черной плоды» и лекарственного препарата (ЛП) «Аронии черноплодной сироп». Разработаны и оформлены проекты ФС «Аронии черноплодной плоды свежие», «Аронии черноплодной плоды», направленные на экспертизу в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения РФ (вх. № 1230/01-37-187; 1230/0137-215).

Разработаны состав и технология получения нового лекарственного препарата «Аронии черноплодной сироп».

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедрах фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, химии фармацевтического факультета, фармацевтической технологии, управления и экономики фармации ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, в ГУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области», в ЗАО «Самаралектравы» (акты внедрения от 2012 г.).

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России (№ Гос. регистрации 01200900568).

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты сравнительного анатомо-морфологического исследования плодов аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной.

2. Результаты сравнительного изучения химического состава плодов аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной.

3. Результаты исследований по разработке подходов к стандартизации ЛРС аронии черноплодной плоды, аронии черноплодной плоды свежие, смородины черной плоды и ЛП на основе плодов аронии черноплодной.

4. Методики качественного анализа ЛРС «Аронии черноплодной плоды», «Аронии черноплодной плоды свежие», «Смородины черной плоды» и ЛП «Аронии черноплодной сироп» с использованием методов ТСХ и спектрофотометрии.

5. Методики количественного анализа JIPC «Аронии черноплодной плоды», «Аронии черноплодной плоды свежие», «Смородины черной плоды» и ЛП «Аронии черноплодной сироп» с использованием методов ТСХ и спектрофотометр ИИ.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на XIV и XVI Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2010, 2012); конференции дипломированных специалистов Аспирантские чтения «Молодые ученые - медицине» (г. Самара, 2010; 2011; 2012); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2011); IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007); International Conference on Polyphenols Communications (Salamanca - Spain, 2008; Montpellier - France, 2010).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 15 научных работах, из них 7 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором. Автором выполнены исследования по сравнительному изучению анатомо-морфологических особенностей строения плодов некоторых видов растений, содержащих вещества антоциановой природы; автором апробированы и подобраны оптимальные условия экстракции антоцианов из плодов аронии черноплодной, смородины черной. Автором разработаны методики качественной и количественной оценки исследуемых видов лекарственного растительного сырья. Автор самостоятельно рассчитал метрологические характеристики методик качественного определения суммы антоцианов в исследуемых видах сырья. Автором разработан лекарственный препарат «Аронии черноплодной сироп», методики его качественной и количественной оценки, показатели качества.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит: 14 таблиц и 53 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов собственных экспериментальных исследований (главы 3-6), общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 153 источника, из которых 60 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, показаны научная новизна и практическая значимость полученных результатов, изложены положения, выносимые на защиту. Первая глава посвящена обзору современного состояния исследований растений, содержащих

вещества антоциановой природы, в котором систематизированы сведения по изучению химического состава, фармакологических свойств, применению в медицине, стандартизации сырья и препаратов на основе аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной. Глава 2 содержит характеристику объектов и методов исследования. В 3 главе отражаются результаты морфолого-анатомического анализа плодов растений, содержащих вещества антоциановой природы. В главе 4 представлены результаты фитохимического изучения плодов изучаемых растений - аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной. Глава 5 посвящена исследованиям по стандартизации плодов, содержащих вещества антоциановой природы. В 6 главе приведены результаты исследований по разработке лекарственных средств на основе сырья, содержащего антоцианы.

В Приложение вынесены акты внедрения, проекты ФС на сырье «Аронии черноплодной плоды», «Аронии черноплодной плоды свежие», рационализаторское предложение на методику анализа сырья «Аронии черноплодной плоды».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование плодов, содержащих вещества антоциановой природы

В рамках диссертационной работы проведены анатомо-морфологические исследования плодов некоторых растений, содержащих вещества антоциановой природы. При этом изучены диагностические признаки плодов аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной в сравнительном аспекте (рис. 1). Для сырья «Аронии черноплодной плоды» были выявлены следующие диагностические признаки: наличие одноклеточных волосков, групп склереид с характерным строением, семенной кожуры с тонким ослизняющимся эпидермисом и слоем склеренхимы с широкопросветными клетками. В качестве диагностических признаков для смородины черной предложены: наличие крупных щитовидных (пельтатных) эфиромасличных железок, определяемых по всей поверхности плода; «паркетный» эндокарп околоплодника; гребневидный эпидермис семенной кожуры; зародыш, расположенный у основания семени. Впервые для сырья «Черемухи обыкновенной плоды» был проведен микроскопический анализ плодоножки, доля которых в готовом продукте весьма значительна. Кроме того, были дополнены микроскопические характеристики плодов черемухи обыкновенной. Результаты проведенных исследований

включены в раздел «Микроскопия» на сырье «Смородины черной плоды». По результатам анатомо-морфологических исследований впервые в РФ разработан раздел «Микроскопия» в проекте ФС на «Аронии черноплодной плоды» и «Аронии черноплодной плоды свежие».

Рис. 1. Диагностические признаки плодов некоторых растений, содержащих вещества антоциановой природы

Обозначения: А1-А9 - диагностические признаки плодов аронии черноплодной; Б1-Б9 - диагностические признаки плодов смородины черной; В1-В9 - диагностические признаки плодов черемухи обыкновенной.

2. Фотохимическое исследование плодов, содержащих вещества антоциановой природы

В настоящем разделе приводятся данные сравнительного анализа компонентного состава плодов аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной, проведенного методами бумажной хроматографии (БХ), тонкослойной хроматографии (ТСХ), спектрофотометр™.

2.1. Сравнительное изучение компонентного состава плодов некоторых

растений, содержащих вещества антоциановой природы В ходе исследования анализировались извлечения из плодов аронии черноплодной, смородины черной и черемухи обыкновенной, полученные экстрагированием 70% спиртом этиловым из измельченного сырья. Хроматографическое исследование полученных извлечений показало, что наилучшее разделение комплекса соединений на используемых хроматографических пластинках («Сорбфил ПТСХ-ПА-А-УФ» ТУ 26-11-17-89, зернение 5-17 мкм, тип сорбента - силикагель СТХ-1А, Россия) достигается в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении 4:1:2 (рис. 2).

*

2

Рис. 2. Сравнительный анализ антоцианов в плодах аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной методом ТСХ:

А - хроматограмма в системе растворителей н-бутанол - ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2) при просмотре в видимом свете;

Б - хроматограмма в системе растворителей этанол- хлороформ - вода (26:16:3) при просмотре в видимом свете.

Обозначения: 1 - водно-спиртовое извлечение из плодов аронии черноплодной; 2 - водно-спиртовое извлечение из плодов смородины черной; 3 - водно-спиртовое извлечение из плодов черемухи обыкновенной; 4 - ГСО рутина.

Кроме извлечений из исследуемых плодов на хроматограмму наносили ГСО рутина с целью изучения возможности стандартизации исследуемого сырья, как источника Р-витаминного комплекса. Пятно с величиной Яг около 0,4 (рутин) в плодах аронии черноплодной и смородины черной, судя по полученным данным, не является доминирующим, а преобладающими флавоноидами являются антоцианы. Это свидетельствует о нецелесообразности стандартизации данного сырья по ГСО рутина. В плодах черемухи обыкновенной, напротив, пятно рутина проявляется более четко, нежели пятна антоциановых структур. Эта характеристика уже на этапе качественного анализа позволяет отличить плоды черемухи от других темноокрашенных плодов, что может быть использовано в целях идентификации сырья.

Апробированный метод ТСХ-анализа для водно-спиртовых извлечений из плодов аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной является наиболее показательным, чувствительным, специфичным для обнаружения в объектах антоциановых гликозидов. Кроме того, ТСХ-анализ может быть использован в качестве экспресс-метода при определении подлинности темноокрашенных плодов. Разработанная методика ТСХ-анализа включена в раздел «Качественные реакции» проектов ФС «Аронии черноплодной плоды» и «Аронии черноплодной плоды свежие». Что же касается плодов черемухи обыкновенной, то, принимая во внимание полученные данные о наличии доминирующего пятна на уровне ГСО рутина, на наш взгляд, целесообразной является стандартизация по преобладающему флавоноиду (рис. 2).

2.2. Сравнительное исследование спектральных характеристик плодов некоторых видов растений, содержащих вещества антоциановой

природы

В рамках качественного анализа УФ-спектроскопия полезна при детектировании легко окисляемых витаминов, в частности, Р-витаминного комплекса, представленного антоцианами. При этом отклонение от характерного профиля спектральной кривой поглощения может свидетельствовать о степени окисленности активных компонентов и, как следствие, о низком качестве сырья.

Спектральные характеристики снимались в интервале длин волн от 190 до 700 нм. Согласно экспериментальным данным, антоцианы, содержащиеся в анализируемых нами плодах, имеют характерные максимумы поглощений в УФ-области (260 - 290 нм) и в видимой области (530 - 540 нм) спектра. В связи с таутомерными превращениями антоцианов при создании кислой среды

происходит заметное увеличение оптической плотности в длинноволновой области спектра, поэтому экстракцию антоцианов осуществляли в условиях кислой среды. Характер полученных УФ-спектров в сравнительном аспекте отражен на рисунке 3.

51358

—»___I «омы. И"

А Б В

Рис. 3. Спектральные характеристики извлечений из плодов растений, содержащих вещества антоциановой природы

Обозначения: А - водно-спиртовое извлечение из плодов смородины черной; Б - водно-спиртовое извлечение из плодов аронии черноплодной; В - водно-спиртовое извлечений из плодов черемухи обыкновенной.

Таким образом, электронные спектры поглощения водно-спиртовых извлечений из плодов аронии черноплодной и смородины черной являются характерными и могут быть рекомендованы в качестве дополнительного метода анализа в раздел «Качественные реакции», а также могут быть использованы для количественной оценки антоцианов в исследуемом сырье.

3. Исследование по стандартизации плодов некоторых видов растений, содержащих вещества антоциановой природы

На основании анализа разделов НД на сырье «Аронии черноплодной плоды», «Смородины черной плоды», «Черемухи обыкновенной плоды», посвященных качественному и количественному анализу, предложены новые объективные подходы для оценки подлинности и качества сырья.

3.1. Качественный анализ плодов растений, содержащих вещества антоциановой природы

Для качественного анализа антоцианов в плодах аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной предложен метод тонкослойной хроматографии и спектроскопии в УФ- и видимой области спектра.

Методика качественного анализа плодов аронии черноплодной свежих. 2,0 г размороженных плодов помещают в коническую колбу со шлифом,

добавляют 20 мл 95% этилового спирта, содержащего 1% хлористоводородной кислоты, закрывают пробкой и перемешивают 30 мин. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр марки «красная полоса». На линию старта хроматографической пластинки «Сорбфил-ПТСХ-АФ-А-УФ», проведенную на расстоянии 1,5-2 см от нижнего края хроматографической пластинки, микропипеткой наносят 5 мкл извлечения в виде пятна диаметром около 5 мм. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 10 мин, затем помещают в хроматографическую камеру, которую предварительно насыщают смесью растворителей н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:2) в течение суток, и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 8 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 минут и просматривают в видимом свете.

Полученные результаты представлены на рисунке 4.

Цианидин-З-глюкозид Дельфинидин-3 -глюкозид

Рис. 4. Качественный анализ плодов некоторых видов ЛР методом ТСХ. Система н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении 4:1:2

Обозначения: 1 - водно-спиртовое извлечение из плодов аронии черноплодной; 2 - водно-спиртовое извлечение из плодов смородины черной; 3 - мальвидин-3-глюкозид; 4 - цианидин-3-глюкозид; 5 - дельфинидин-3-глюкозид.

С использованием разработанной методики ТСХ-анализа проанализированы также плоды смородины черной.

Спектр поглощения 25-кратного разведения полученных извлечений в области от 200 до 700 нм имеет максимумы при 280 (282)±2 и 534 (544)±2 нм; отношение оптических плотностей в максимумах поглощения в видимой и УФ-области (А534/А280) должно быть от 0,82 до 1,04 (от 0,46 до 0,8). Характерный максимум поглощения при длине волны 282 нм имеет и извлечение из плодов черемухи обыкновенной, что может быть использовано в целях идентификации. Однако максимум поглощения извлечения из плодов черемухи при длине волны в видимой области спектра практически не выражен, что доказывает нецелесообразность стандартизации данного вида сырья по веществам антоциановой природы.

На основании экспериментальных данных, полученных в результате качественного анализа плодов аронии черноплодной и смородины черной, обоснована стандартизация данных видов ЛРС по антоцианам.

3.2. Количественное определение суммы антоцианов в плодах некоторых видов растений, содержащих вещества антоциановой природы Для количественной оценки антоцианов предложен метод прямой спектрофотометрии с использованием полученного значения удельного показателя поглощения цианидин-3-глюкозида (Куркин В.А., Рязанова Т.К., 2012). При этом нами изучены особенности условий экстракции антоцианов из плодов аронии черноплодной. Установлено, что оптимальными условиями экстракции антоцианов из плодов аронии черноплодной свежих являются: экстрагент - 96% этанол, соотношение сырье-экстрагент 1:30, время экстракции - 120 мин при комнатной температуре. В случае плодов аронии черноплодной воздушно-сухих условия отличаются: экстрагент - 60% этанол, соотношение сырье-экстрагент 1:30; время экстракции 30 минут на водяной бане.

Методика количественного определения суммы антоцианов в воздушно-сухих плодах аронии черноплодной. Около 1 г (точная навеска) воздушно-сухих плодов аронии черноплодной, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой и прибавляют 30 мл спирта этилового 60%, подкисленного хлористоводородной кислотой (1% по объему). Экстракцию проводят при нагревании на водяной бане в течение 30 минут. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой во флакон темного стекла.

1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 60%, подкисленным хлористоводородной кислотой (1% по объему).

Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 534 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют спирт 95%.

Содержание суммы антоцианов в пересчете на цианидина-З-О-глюкозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

25x30x100 ~ 100хтх1х(100-Ж)' где А - оптическая плотность испытуемого раствора; т - масса сырья, г;

100 - удельный показатель поглощения цианидин-З-О-глюкозида. Методика количественного определения суммы антоцианов в плодах аронии черноплодной свежих. Около 1 г (точная навеска) свежих плодов аронии черноплодной помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой и прибавляют 30 мл 96% спирта этилового, подкисленного хлористоводородной кислотой (1% по объему). Экстракцию проводят при комнатной температуре в течение 120 минут. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой во флакон темного стекла.

1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%, подкисленным хлористоводородной кислотой (1% по объему).

Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 534 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют спирт 95%.

Содержание суммы антоцианов в пересчете на цианидина-З-О-глюкозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

у4х 25x30x100 ~~ 100хтх1х(100-Ж)' где А - оптическая плотность испытуемого раствора; т - масса сырья, г;

100 - удельный показатель поглощения цианидин-З-О-глюкозида.

Метрологические характеристики методик количественного определения содержания суммы антоцианов в плодах аронии черноплодной представлены в таблицах 1,2.

Таблица 1

Метрологические характеристики методики количественного

определения антоцианов в воздушно-сухих плодах аронии черноплодной

/ X 5 Р, % АХ Е, %

10 3,15 0,0558 95 2,23 ±0,124 ±3,95

Таблица 2

Метрологические характеристики методики количественного

определения антоцианов в плодах аронии черноплодной свежих

/ X 5 Р, % г(РЯ АХ Е, %

10 5,17 0,1117 95 2,23 ±0,249 ±4,82

Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы антоцианов в воздушно-сухих плодах аронии и в плодах аронии свежих с доверительной вероятностью 95% составляет ±3,95% и ±4,82% соответственно (табл. 1, 2).

Содержание суммы антоцианов в плодах аронии свежих варьирует в пределах от 4,34%±0,21% до 5,17%±0,23%. Содержание суммы антоцианов в воздушно-сухих плодах аронии варьирует от 3,09%±0,15% до 3,22%±0,17%.

Таблица 3

Метрологические характеристики методики количественного

определения антоцианов в воздушно-сухих плодах смородины черной

/ X 5 Р, % і(Р,ї) АХ Е, %

10 6,18 0,204 95 2,23 ±0,124 ±4,62

Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы антоцианов в плодах смородины черной с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,62% (табл. 3).

Содержание суммы антоцианов в плодах смородины черной варьирует от 5,89%±0,24% до 6,44%±0,27%.

4. Обоснование целесообразности создания лекарственных средств на основе сырья, содержащего антоцианы

В настоящее время растения, содержащие антоцианы, активно изучаются на предмет создания препаратов, обладающих ангиопротекторным, антиоксид антным и капилляроукрепляющим эффектами. Актуальность разработки лекарственных средств растительного происхождения обусловлена тем, что основную долю лекарственных препаратов с данными эффектами на фармацевтическом рынке нашей страны составляют синтетические, а в незначительном сегменте лекарственных средств природного происхождения обсуждаемых фармакотерапевтических групп превалируют зарубежные ангиопротекторы и антиоксиданты. В то же время, по литературным данным известно, что антоцианы, полученные из растительных объектов, обладают высокой биологической активностью и меньшим количеством побочных эффектов. На наш взгляд, использование лекарственного растительного сырья в качестве источника антоцианов является приоритетным направлением в разработке отечественных лекарственных препаратов. Наиболее перспективными в плане фармакологического спектра и уровня накопления антоцианов являются темноокрашенные плоды. На основании результатов настоящих исследований химического состава аронии черноплодной и предложенных подходов к стандартизации данного сырья было проведено исследование по разработке состава и технологии изготовления препарата «Аронии черноплодной сироп». Известно, что именно благодаря антоцианам арония наряду с общеукрепляющим действием обладает антигипертензивным и капилляроукрепляющим эффектами. Нами предложен иной, нежели в большинстве известных препаратов, подход к изготовлению сиропа аронии черноплодной, заключающийся в добавлении в сироп сгущенного сока из свежих плодов растения, избегая введения водно-спиртового извлечения.

4.1. Разработка методики количественного анализа сиропа аронии черноплодной Методика количественного анализа суммы антоцианов была разработана для плодов аронии. Исходя из того, что сироп содержит сок из свежих (свежемороженых) плодов аронии черноплодной, предложенная методика была адаптирована для разработанного препарата, что соответствует принципу унификации методик анализа в ряду сырье - субстанция - лекарственная форма.

Количественное определение антоцианов проводили методом прямой спеюрофотометрии в соответствии с подходами к стандартизации, разработанными для сырья «Аронии черноплодной плоды свежие».

Содержание суммы антоцианов в 1 мл сиропа на основе плодов аронии варьирует от 0,33%±0,02% до 0,35%£0,03%.

Методика количественного определения суммы антоцианов в лекарственном препарате «Аронии черноплодной сироп» Около 1,0 г препарата (точная навеска) помещают в мерную колбу объемом 50 мл, доводят до метки 70% спиртом этиловым, содержащим 1% хлористоводородной кислоты. В качестве раствора сравнения используют 70% спирт этиловый, содержащий 1% кислоты хлористоводородной. Оптическую плотность измеряют при длине волны 534 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Содержание суммы антоцианов (X, %) рассчитывают по формуле: х_ Лх50 _0,5хЛ ~ а х100~ а ' где А — оптическая плотность испытуемого раствора; а — масса пробы, взятой на анализ.

Помещения, в которых осуществляется процесс производства сиропов, должны соответствовать 3-му и 4-му классам чистоты (С и Б). Для качественной оценки препарата нами предложено использовать комплексный подход, заключающийся в одновременном применении ТСХ-анализа и спектроскопии. Эти методы ранее апробированы на сырье аронии. При просмотре хроматограммы препарата «Аронии черноплодной сироп» в УФ-свете при длине волны 254 нм и 366 нм обнаруживается доминирующее пятно с величиной Яг - 0,36-0,37 (цианидин-3-глюкозид), менее интенсивное пятно с величиной Яг 0,5 - 0,53 (рутин) (рис. 5).

© © < СЗ С5 с ^

—о О О О

12 3 •»

Рис. 5. ТСХ-анализ сиропа аронии черноплодной

Обозначения: 1 - сироп аронии черноплодной; 2 - сок аронии черноплодной;

3 — цианидин-3-глюкозид; 4 - рутин.

Важной подтверждающей характеристикой для препарата «Аронии черноплодной сироп» является УФ-спектр. Электронный спектр поглощения 25-кратного разведения извлечения в области от 200 до 700 нм должен иметь максимумы поглощения при 280±2 и 534±2 нм; отношение оптических плотностей в максимумах поглощения в видимой и УФ-области (А534/А280) должно быть в диапазоне от 0,82 до 1,04.

Таблица 4

Метрологические характеристики методики количественного определения

антоцианов в лекарственном препарате «Аронии черноплодной сироп»

/ X 5 Р, % tiP.fi АХ Е, %

10 0,34 0,1117 95 2,23 ±0,249 ±4,05

Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы антоцианов в сиропе на основе плодов аронии с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,05% (табл.4).

выводы

1. В результате сравнительного анатомо-морфологического исследования антоциансодержащих плодов аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной выявлены диагностические признаки для аронии черноплодной (наличие множества одноклеточных волосков, групп склереид с характерным строением, семенной кожуры с тонким ослизняющимся эпидермисом и слоем склеренхимы с широкопросветными клетками); для смородины черной (наличие неотпадающего, сросшегося с ягодой, околоцветника, наличие крупных щитовидных (пельтатных) эфиромасличных железок, определяемых по всей поверхности плода, «паркетный» эндокарп околоплодника, гребневидный эпидермис семенной кожуры); для черемухи обыкновенной (особенности строения плодоножки - наличие прозенхимных эпидермальных клеток с друзами, наличие устьичного аппарата анамоцитного типа, наличие склерифицированных клеток колленхимы).

2. В результате изучения химического состава плодов аронии черноплодной, смородины черной, черемухи обыкновенной обоснованы новые подходы к стандартизации изучаемых видов сырья. Обоснован выбор аналитических методов качественной и количественной оценки сырья на содержание антоцианов: для качественной оценки - ТСХ-анализ и характер УФ-спектра; для количественного определения суммы антоцианов в плодах аронии и смородины черной — прямая спектрофотометрия с использованием вещества-стандарта цианидин-З-О-глюкозида (стандартизация плодов черемухи обыкновенной по сумме антоцианов нецелесообразна ввиду их минорного содержания в сырье).

3. Разработаны методики качественного анализа антоцианов в плодах аронии черноплодной и смородины черной с использованием метода тонкослойной хроматографии в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота -вода (4:1:2) и метода электронной спектроскопии в диапазоне длин волн 190-700 нм (обнаруживаются характерные для антоцианов плодов аронии черноплодной и смородины черной максимумы поглощения в УФ - области (280, 264, нм) и в видимой области (536, 534, нм) спектра соответственно).

4. Разработана методика количественного определения суммы антоцианов в плодах аронии свежих и воздушно-сухих в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид методом прямой спектрофотометрии. Содержание суммы антоцианов в плодах аронии черноплодной свежих варьирует от 4,34%±0,11% до

5,17%tO,13%. Содержание суммы антоцианов в воздушно-сухих плодах аронии черноплодной варьирует от 3,09%±0,10% до 3,22%±0Д1%.

5. Разработана методика количественного определения суммы антоцианов в плодах смородины черной в пересчете на цианидин-З-О-глюкозид. Содержание суммы антоцианов в воздушно-сухих плодах смородины черной варьирует от 5,89%±0,15% до 6,44%±0,19%.

6. Разработан состав лекарственного препарата «Аронии черноплодной сироп» на основе сока из плодов аронии черноплодной. Предложена технологическая схема изготовления, заключающаяся во введении в сироп сгущенного сока и стабилизатора —лимонной кислоты.

7. В соответствии с принципом унификации методик в ряду JIPC -препарат разработана методика качественного анализа лекарственного препарата «Аронии черноплодной сироп» с использованием для обнаружения антоцианов ТСХ-анализа и УФ-спектрофотометрии.

8. Разработана методика количественного определения содержания суммы антоцианов в лекарственном препарате «Аронии черноплодной сироп» методом УФ-спектрофотометрии в пересчете на цианидин-З-О-глюкозид. Содержание суммы антоцианов в препарате варьирует от 0,30%±0,02% до 0,35%±0,03%.

9. Результаты анатомо-морфологического и фотохимического исследования плодов аронии черноплодной были включены в проекты фармакопейных статей «Аронии черноплодной плоды» и «Аронии черноплодной плоды свежие», принятые на рассмотрение ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения РФ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Куркин, В.А. Анатомо-морфологическое исследование плодов Ribes nigrum/ В.А. Куркин, A.B. Егорова, Г.Н. Суворова, В.М. Рыжов, JI.B. Тарасенко, Т.К. Рязанова, Е.В. Каллина // Известия Самарского научного центра РАН. -2010. - Т. 1.- С. 2027-2031.

2. Куркин, В.А. Создание ресурсосберегающих технологий переработки лекарственного растительного сырья / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, O.E. Правдивцева, В.Б. Браславский, A.B. Куркина, М.В. Егоров, Л.В. Тарасенко, В.В. Стеняева, В.М. Рыжов, Н.Р. Шагалиева, Л.Н. Зимина, М.М. Анисимова, A.B. Егорова // Известия Самарского научного центра РАН. — 2010. — Т. 12. № 1 (3). - С. 737-740.

3. Куркин, В.А. Анатомо-морфологическое исследование плодов рябины черноплодной / В.А. Куркин, A.B. Егорова, В.М. Рыжов, JI.B. Тарасенко, Т.К. Рязанова, Е.В. Каллина // Медицинский альманах. — 2011. - № 2. — С. 326-328.

4. Егорова, A.B. Анатомо-морфологическое исследование плодов черники обыкновенной / A.B. Егорова // Аспирантский вестник Поволжья. — 2011. - № 56. - С. 244-247.

5. Куркин, В.А. Стандартизация плодов аронии черноплодной / В.А. Куркин, A.B. Егорова // Фармация. - 2012. - № 7. - С. 10-13.

6. Куркин, В.А. Изучение возможностей комплексного использования плодов черной смородины (Ribes nigrum L.) / В.А. Куркин, A.B. Егорова, A.M. Каримова // Известия Самарского научного центра РАН. - 2012. - Т. 14. - С. 2027-2031.

7. Куркин, В.А. Перспективы создания импортозамещающих лекарственных растительных препаратов / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, A.B. Дубищев, О.Л. Кулагин, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина, М.В. Егоров, В.М. Рыжов, В.В. Стеняева, A.B. Егорова, О.В. Шарова, М.М. Анисимова, JI.H. Зимина, Н.Р. Шагалиева, Е.И. Вельмяйкина, A.C. Акушская, Т.К. Рязанова, А.И. Хусаинова // Традиционная медицина. - 2011. - № 5 (28). - С. 230-232.

8. Куркин, В.А. Подходы к стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды и фенилпропаноиды / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина, М.В. Егоров, О.В. Шарова, Е.С. Артамонова, В.М. Рыжов, Ф.Ш. Сатдарова, A.B. Егорова, Д.Г. Буланкин, JI.H. Зимина // XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: сборник материалов. — 2008. — С. 545-546.

9. Егорова, A.B. Анатомо-морфологическое исследование плодов черемухи обыкновенной {Padus avium Mill.) / A.B. Егорова // «Молодые ученые -медицине»: сборник материалов Всероссийской конференции с международным участием.-2011.-С. 75.

10. Куркин, В.А. Флавоноиды и фенилпропаноиды — перспективные антиоксиданты лекарственных растений / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, O.E. Правдивцева, А.В.Куркина, O.JI. Кулагин, A.A. Царева, В.М. Рыжов, М.М. Анисимова, A.B. Егорова // Сборник тезисов «Российская академия наук». - 2009. -С. 1235.

11. Куркин, В.А. Вопросы фотохимического исследования сырья «Черники плоды» / В.А. Куркин, A.B. Егорова // «Новые достижения в химии и химической

технологии растительного сырья»: сборник материалов III Всероссийской конференции. - 2007. - С. 257.

12. Егорова, А.В. Анатомо-морфологическое исследование плодов черники обыкновенной / А.В. Егорова // «Молодые ученые - медицине»: сборник материалов Всероссийской конференции. - 2010. — С. 127.

13. Удостоверение на рационализаторское предложение № 206 ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России от 20 июня 2012 г. «Методики количественного определения суммы антоцианов в плодах аронии черноплодной» / А.В. Егорова, В.А. Куркин.

14. Kurkin, V.A. The new methodological approaches to the standardization of the some medicinal plants containing the flavonoids and phenylpropanoids / V.A. Kurkin, E.V. Avdeeva, V.B. Braslavsky, O.E. Pravdivtseva, A.V. Kurkina, M.V. Egorov, V.M. Ryzhov, O.V. Sharova, E.S. Artamonova, F.S. Satdarova, A.V. Egorova, Mohammed Lamrini, L.N. Zimina, M.M. Anisimova, D.G. Bulankin, A.V. Smirnov // XXIVth International conference on Polyphenols Communications: Vol.1., Salamanca, - Spain -2008.-P. 185-186.

15. Kurkin, V.A. The new methodological approaches to the standardization of the some medicinal plants containing the flavonoids / V.A. Kurkin, E.V. Avdeeva, V.B. Braslavsky, O.E. Pravdivtseva, A.V. Kurkina, M.V. Egorov, V.M. Ryzhov, D.G. Bulankin, M.M. Anisimova, A.V. Egorova, L.N. Zimina // XXVth International Conference on Polyphenols, Montpellier - France. - 2010. - P. 548-549.

Подписано в печать 19.04.2013. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1,39 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 645.

Отпечатано в типографии ООО «Офорт». 443080, г. Самара, ул. Революционная, 70, литера П. Тел.: 372-00-56, 372-00-57,932-00-50. E-mail: ofort-samara@mail.ru.