Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка технологии экстрактов и сиропа из плодов черники обыкновенной

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

МОЛЧАНОВ МАКСИМ ВАСИЛЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЭКСТРАКТОВ И СИРОПА ИЗ ПЛОДОВ ЧЕРНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

)5.00,М - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ПЯТИГОРСК, 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего

профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и

социальному развитию»

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, профессор

Погорелое Виктор Иванович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Муравьева Дарья Алексеевна

доктор фармацевтических наук, профессор Сампиев Абдул Магомедович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение * ♦ * „ >■ ' р1г вцсшего профе^сиональноуо образования «Самарский государственный медицинский 1 * уАй!ёрситёт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Зашита состоится «13» мая 2008 года в $ часов на заседании

, » / „ А - - • —'-

Диссертационного совета Д 208.069.01 при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава.

Автореферат разослан «

й.»

Ученый секретарь диссертационного совета доктор фармацевтических наук, профессор

Е В Компанцева

->

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Несмотря на интенсивное развитие синтетической органической химии интерес к природным соединениям не только не ослабевает, но и возрастает К таким соединениям относятся антоцианы, содержащиеся в плодах черники обыкновенной

Черника обыкновенная издавна используется в народной медицине в качестве вяжущего средства Научная медицина проявляет интерес к плодам черники, как к источнику комплекса биологически активных веществ, обладающему антиоксидантным действием, улучшающему реологические свойства крови, способствующему укреплению стенки кровеносных сосудов, ускоряющему восстановление обесцвеченного родопсина Однако, несмотря на ценные биологические свойства плодов черники, ока не нашла широкого медицинского применения в виде лекарственных средств

В Государственный Реестр лекарственных средств включены три

__——------ , ^ -------------------Л---/С Т Г I

I п^ппшл ирсиарала из илидис чсишиш чч¡VI > у о 1 1 1

Ь '11 му. V1.V и1иэаи, ^^апил^ Ь VIим .пчч.. 1 V 11 м\.

«Миртикам» (Камелия НПП, Россия) в форме гомеопатического сиропа Кроме того, в Российской Федерации зарегистрировано более ста наименований биологически активных добавок (БАД) полученных из плодов черники Недостатками указанных добавок является то, что их счандаршзация не все! да предусматривает определение оеновяых биологически активных веществ

В то же время, современные требования к средствам, предназначенным как для лечения, так и для профилактики, то есть к БАД, определяются качественным и количественным содержанием биологически активных веществ Такое требование может быть выполнено при разработке унифицированной технологии, соответствующей условиям производства, а также разработке надежных методов для стандартизации как сырья, так и промежуточных и конечных продуктов

Предпосылками для этого являются теоретические разработки по экстракции некоторых лабильных биологически активных веществ, а также

включение в НД современных методов для стандартизации, позволяющих определять вещества в процессе производства и в готовой продукции

Решение этих вопросов в отношении плодов черники и лекарственных препаратов из нее послужит базой для производства лекарственных препаратов и БАД

Поэтому разработка методов получения жидкого и сухого экстракта и сиропа из плодов черники обыкновенной является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики

Цель и задачи исследования Целью исследования является разработка технологии и норм качества для стандартизации экстракта черники жидкого, экстракта черники сухого и БАД к пище - сиропа, содержащего экстракт черники жидкий

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- установить критерии и предложить методики для количественной оценки качества плодов черники и фитопрепаратов из данного сырья,

- выбрать оптимальный экстрагент и определить технологические показатели плодов черники,

- провести теоретические и экспериментальные исследования по разработке оптимальных условий экстрагирования и оптимизации технологии при производстве экстрактов плодов черники жидкого и сухого,

- разработать нормы качества на экстракты плодов черники жидкий и сухой по содержанию действующих веществ и другим показателям в соответствии с требованиями ГФ XI,

- обосновать состав, разработать технологию и установить нормы качества БАД к пище - сиропа плодов черники,

- разработать экспрессную методику контроля сохранности полифенольного комплекса плодов черники в процессе приготовления сиропа черники;

- провести предварительные фармакологические исследования сиропа из плодов черники

Научная новизна. На основании проведенных исследований выявлены основные закономерности экстракции антопианов из плодов черники обыкновенной в зависимости от концентрации спирта этилового и содержания органических кислот Это позволило установить, что спирт 70%, содержащий 1% кислоты лимонной, извлекает максимальное количество антоцианов из плодов черники Определены технологические показатели сухих плодов черники содержание экстрактивных веществ, коэффициент съема готовой продукции, коэффициент поглощения сырья, коэффициент образования внутреннего сока, коэффициент увеличения сбъёмг лр>-1 растворении экстрактивных веществ

Проведена оптимизация процесса экстрагирования плодов черники, касающаяся соотношения фаз, постановки экстракционного процесса и количества диффузоров, что позволило достичь степени экстракции по знтоцианам 82,8% — при приготовлении экстракта жидкого методом реперколяции и 95,1% - при приготовлении экстракта сухого методом ремацерации

Впервые доказано, что предварительное смешивание сгущенного и очищенного извлечения из плодов черники с 20% водным раствором лактозы, после сублимационной сушки позволяет получить экстракт сухой, обладающий низкой гигроскопичностью и сохраняющий стабильными антоцианы в течение 1 года хранения

Обоснована целесообразность и возможность получения сиропа плодов черники, выполнено аналитическое обеспечение технологического пропесса Установлено, что сироп сахарный, содержащий экстракт плодов черники жидкий, позволяет стабилизировать антоцианы в процессе хранения Доказана приемлемость использования спектрофотометрии для стандартизации сырья и лекарственных препаратов из плодов черники

Практическая значимость. Разработана технология экстракта черники сухого и сиропа черники Показано, что содержание антоцианов

может служить показателем для оценки качества плодов черники и полученных из них лекарственных препаратов и Б АД Впервые предложена методика определения антоцианов в сухих плодах черники методом спектрофотометрии, с помощью которой установлена одна из норм качества сырья по количественному содержанию антоцианов

Представленный в работе экспериментальный материал фармакологических исследований, послужил основанием и подтверждением необходимости практического использования сиропа, содержащего экстракт черники жидкий в качестве БлД к пище, как дополнительного источника антоцианов

Внедрение результатов исследования в практику. По результатам исследовании разработаны проекты ТУ и ТИ на БАД «Сироп черники», которые прошли успешную технологическую апробацию на производственных участках ЗАО «Ростовская фармацевтическая фабрика», г Ростов и iA'J «Ростбалканфарм», г Азов

Положения, выдвигаемые на защиту:

1 Результаты определения количественного содержания антоцианов в плодах черники методом спектрофотометрии, позволяющим исключить влияние на результаты анализа сопутствующих веществ

2 Параметры технологических показателей плодов черники, установленные с использованием оптимального экстрагента - 1% раствора кислоты лимонной в 70% спирте этиловом

3 Результаты технологии экстракта плодов черники жидкого методом реперколяции с законченным циклом, в батарее из шести диффузоров

4 Обоснование технологии экстракта плодов черники сухого, полученного сублимационным высушиванием сгущенного и очищенного извлечения из плодов черники совместно с водным раствором лактозы

5 Итоги исследований по технологии сиропа с экстрактом плодов черники и его стандартизации

6 Результаты предварительных фармакологических исследований сиропа с экстрактом плодов черники

Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на ежегодных научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии в 2004, 2005 и 2006 гг По теме диссертации опубликовано 6 работ, в гом числе 2 статьи в журнале, рекомендованном ВАК

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Рэсздрава, номер государственной регистрации 01200215436

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 26 рисунков, сосшш ш введения, обзора лшерсиуры, 5 глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 1*72 источника, из которых 35 на иностранных языках, и приложений

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Определение антоцианов в высушенных плодах черники Качество плодов черники нормируется ст 35 ГФ XI изд «Плоды черники» по содержанию влаги и примесей Данные показатели не отражают количественного содержания фармакологически активных веществ в плодах черники, в первую очередь антоцианов, что затрудняет поиск оптимальных условий экстрагирования сырья и делает невозможным прогнозирование качества полученных фитопрепаратов

Антоцианы в плодах черники определяли методом спектрофотометрии, основанном на особенности антоцианов изменять величину светопоглощения в зависимости от рН среды Для этого использовали описанную в литературе методику определения (Руководство Р 4 1 1672-03 М . 2003), адаптированную для исследуемого сырья

При выявлении оптимальных условий, позволяющих провести исчерпывающее экстрагирование суммы антоцианов плодов черники, решались вопросы выбора экстрагента, соотношения сырье - экстрагент, времени температуры и кратнос ти экстракций

Для достижения полноты извлечения антоцианов из сырья подобран оптимальный экстрагент - 70% этанол Изучение спектров поглощения спиртового извлечения из плодов черники в буферных растворах с рН=1,0 и рН=4,5 позволило использовать в качестве аналитической длину волны 510 нм (рисунок 1)

1 - Спеетр поглощения

антоцианов плодов черники при рН=1,0,

2 - Спектр поглощения

антоцианов плодов черники при рН=4,5

Рисунок 1 - Спектры поглощения извлечения из плодов черники (экстрагент - спирт этиловый 70%) На основании проведенных исследований предложена методика определения суммы антоцианов в плодах черники, включающая трехкратное экстрагирование сырья спиртом этиловым 70% при соотношениях 1 100, 1 50, 1 50, в течение 20 минут каждая при температуре кипения экстрагента (извлечения объединяют), приготовление разведений в буферных растворах с рН=1 0 п рК-4 5. стабилизацию окраски растворов в течение двух часов, центрифугирование, спектрофотометрирование каждого раствора при

аналитических длинах волн 510 нм и 700 нм на фоне соответствующего буферного раствора в кювете с толщиной слоя 1 см Максимальный объем аликвоты спиртового извлечения из плодов черники взятого для анализа не должен превышать 5 мл

Величину оптической плотности раствора (А) рассчитывали по формуле

А = (А5ЮшГ-А.700пт)рН 1 0 — (А51ОШП-А700шп)рН 4 5 Содержание суммы антоцианов в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляли но формуле

А 449,2 Щ Ж2 100 ~ 26900 I т V (100-»;,) 10

где А - оптическая плотность полученного раствора, 449,2 - молекулярная масса дианидин-3-гликозида, - объем первого разведения, мл, \¥2 - объем второго разведения, мл, 26900 - коэффициент молярного поглощения цианидин-3-гликозида, 1 — длина кюветы, см, тп — масса навески, г, V — объем первой аликвоты, мл, — влажность сырья, %

Проведена валидационная оценка предлагаемой методики определения антоцианов в плодах черники В ходе определения линейности установлено, что график зависимости оптической плотности от концентрации антоцианов имеет линейный характер в диапазоне от 1 мкг/мл до 15 мкг/мл, что соответствует интервалу оптических плотностей от 0,1 до 0,8 Коэффициент линейной корреляции (г) равен 0,9941 Для определения прецизионности методики вычисляли величину относительного стандартного отклонения (ЯЗБ), которое составляет 3,97% Для подтверждения аналитической области методики, было определено содержание антоцианов в навесках сырья массой 0,3, 0,5 и 0,7 г В качестве критерия точности получаемых результатов, использовали открываемость (11,%) по отношению к среднему содержанию антоцианов в сырье, вычисленному в результате параллельного анализа шести одинаковых навесок плодов черники Граничные значения открываемое™ для данной методики составляют 96,9-102,3%

Нормирование качества сырья

Для получения экстрактов черники жидкого и сухого подобран оптимальный экстрагент, извлекающий максимальное количество антоцианов из плодов черники - 1% раствор кислоты лимонной в 70% спирте этиловом

Для разработки технологии, нормирования качества лекарственных и парафармацевтических препаратов выбраны дополнительные нормы качества сырья, содержание суммы антоцианов (в пересчете на цианидин-3-гликозид) и экстрактивных веществ, извлекаемых 1% раствором кислоты лимонной в 70% спирте этиловом

Анализ образцов плодов черники, приобретенных в аптечной сети г Пятигорска, а также заготовленных з Свердловской и Ленинградской областях, показал, что содержание суммы антоцианов находилось в пределах от 0,25 до 0,31%. а содержание экстрактивных веществ от 40,65 до 48.91% что позволило установить нормы качества сырья по сумме антоцианов не менее 0,25%. по экстрактивным веществам - не менее 40%

Определены технологические параметры сырья, которые легли в основу разработки способа экстракции и норм загрузки сырья и экстрагента коэффициент поглощения составил 0,70 см7г, коэффициент образования внутреннего сока - 1,07 см3/г, коэффициент увеличения объема при растворении экстрактивных веществ - 0,70 см7г

Определены характеристики, позволяющие правильно выбрать емкость диффузора коэффициент наполнения сухого сырья - 1,02 см7г, коэффициент вытеснения сырья - 0,62 см7г, насыпная плотность -0,61 г/см3

Разработка технологии экстракта плодов черники жидкого

Жидкий экстракт предложено получать способом реперколяции с завершенным циклом

Для определения режима экстракции установлено время наступления равновесия в системе экстрагент - сырье Оно составило 16-20 часов

Теоретически рассчитана эффективность реперколяции при коэффициенте съема готовой продукции 1,0 в зависимости от числа диффузоров в батарее Результаты представлены на рисунке 2

Л и о

X

ю £

£ о ■8-

Рисунок 2 - Зависимость степени истощения сырья от числа диффузоров в батарее Установлено, что при 6 диффузорах в батарее эффективность экстракции составляет 85% Дальнейшее увеличение числа диффузоров не целесообразно, т к не дает значительного прироста эффективности экстракции и не оправдано с экономической точки зрения

Экспериментально установлена фактическая эффективность экстракции, которая составила 82,8% по антоцианам и 82,6% по экстрактивным веществам

По результатам исследования разработана технология экстракта плодов черники жидкого Она включает подготовку сырья и экстрагента, экстрагирование сырья способом реперколяции с завершенным циклом в батарее из 6 диффузоров при коэффициенте съема 1,0 Периодичность настаивания (8-16 часов) укладывается в режим работы фармацевтических предприятий

Нормировать качество экстракта жидкого предложено по содержанию суммы антоцианов, содержанию спирта и плотности

На основании полученных данных определены нормы качества экстракта жидкого Норма содержания фармакологически активных веществ рассчитана для сырья с предельно низким содержанием антоцианов (0,25%) и экстрактивных веществ (40,65%), и максимально допустимой влажностью

сырья (12 1%), а плотность и содержание спирта рассчитаны для сырья с

И

60-1-,-,-,---1

0 2 4 6 8 10

Число диффузоров в батарее, п

максимально возможным содержанием экстрактивных веществ (48,91%) Этими нормами явились содержание суммы антоцианов не менее 0,20%, спирта - не менее 43%, плотность - не более 1,054 г/см"

Установленные нормы подтверждены экспериментально Результаты стандартизации экстракта плодов черники жид кого представлены в таблице 2 Таблица 2 - Результаты определения показателей качества серий экстракта

плодов черники жидкого (п=3)

Наименование показателя Серии экстракта жидкого Норма качества

1 2 з 4 5 6

Внешний вид прозрачная жидкость вишнево-красного цвета Тоже

Запах фруктовый Тоже

Вкус жгучий, вяжущий Тоже

Содержание спирта 45,21 45,07 46,60 46,65 47,57 46,78 Не менее 43%

Плотность 1 П1Л 1 1 плг 1 Л11 1,1/11 1 Ап/Г I ,\лг,и 1,036 1 ЛЛЛ 1 V/ ТТ„ __1 А 1С ии.ЧСС 1 ^и.'п

Содержание тяжелых металлов не более 0,01% Тоже

Количественное определение антоцианов 0,20 0,22 0,21 0,21 0,23 0,23 Не менее 0,20%

Данные показывают, что все серии экстрактов, полученные из различного сырья по предложенной технологии, укладываются в установленные нормы качества

Таким образом, полученный по предложенной технологии экстракт плодов черники жидкий с высоким содержанием антоцианов может быть использован в качестве исходного компонента в том числе и при произволе 1ве БАД к пище

Разработка технологии экстракта плодов черники сухого

Для получения извлечения предложено использовать тот же

экстрагент, что и для экстракта жидкого 1 % раствор кислоты лимонной в 70% спирте этиловом

При выборе способа получения извлечения исследована эффективность различных способов экстракции реперколяции, мацерации, ремацерации Реперколяция позволяет истощить сырье на 85%, мацерация при соотношении сырья и экстрагента 1 10 - на 90% При изучении ремаиерации варьировали соотношением сырья и экстрагента на ступени экстракции и числом ступеней Результаты представлены на рисунке 3

Чисто е^пеней экстракции п

Рисунок 3 - Зависимость эффективности ремацерации от соотношения фаз и числа ступеней экстракции

Теоретические расчеш эффективности ремацерации показывают, что при трехкратном экстрагировании плодов черники в соотношении 1 3 на ступени экстракции, сырье истощается на 97%, образуя минимальный объем извлечения Данный способ предложен для получения извлечения Для интенсификации рекомендовано проводить экстракцию с периодическим перемешиванием циркуляцией при экспозиции настаивания 16 часов

Нами определена фактическая эффективность способа, которая составила по действующим веществам 95,1%, по экстрактивным веществам -92,6%

Разработана технологическая схема получения экстракта плодов черники сухого (рисунок включающая подготовку сырья, получение извлечения способом ремацерации при перемешивании экстрагента, очистку от взвешенных частиц, концентрирование извлечения под вакуумом, очистку от балластных веществ, сушку, измельчение готового продукта и фасовку

13

ВР 1 1 Подготовка производственных помещений_

ВР 1 2 ' Подготовка технологического _| оборудования__

ВР 1 3 ! Подготовка персонала

ВР 1 4

Подготовка технологической одежды_

ВР 2 2 I Приготовление экстрагента

|ТП31 I Экстрагирование

ТП 3 2 Фильтоование извлечения

I ТП Сч 1 Рг\/11и^опа:1дикп

ТП 5 2 I Очистка извлечения

ТП 5 3

Смешивание извлечения с раствором лактозы_

ТП 5 5 Измельчение

УМО 6 1 Подготовка тары

УМО 5 2 | Расфасовка упаковка _| маркировка_

ВР 2 1 Измельчение плодов черники

ВР 2 3 Приготовление 20% раствора лактозы

| ТП 5 4 Сублимационная сушка

ВР 1 Санитарная подготовка производства_

ВР 2 Подготовка сырья

потери

механические

111 3 | Получение извлечения

I. потеси

механические

Чулдазаци1 отходов

ПОЛ Регенерация спирта

ТП 5 Получение готового лродукта

УМО 6

Расфасовка и оформление готового продукта__

Рисунок 4 - Технологическая схема производства экстракта плодов черники сухого Учитывая лабильность антоцианов, влагу из концентрированного извлечения удаляли п>тем сублимации Для уменьшения гигроскопичности экстракта сухого было предложено проводить сублимационную сушку в присутствии лактозы, которую добавляли к подготовленному извлечению в виде 20% водного раствора непосредственно перед началом процесса сушки

Т1ттП41Гтп1.члгт,„л ПИЛПППЧП I ЦП и^^лп^п Т 7 А^ /ГЛ^ПЧ-П 1-гплЛ п ^¿»Т^ТТТЮ ] С V 1 ириоидллп па 1С1П\_7£>Л^- V. 1 с}; VIСЛП I)/1; о I ^ -1 ч.. г 1 и1 и

до конечной температуры продукта 25 °С

Результаты стандартизации экстракта плодов черники сухого представлены в таблице 3 Таблица 3 - Результаты определения показателей качества серии экстракта плодов черники сухого (п=3)

Наименование показателя Серии экстракта сухого Норма качества

1 2 3 4 5 6

Внешний вид порошок вишнево-красного цвета тоже

Запах фруктовый тоже

Вкус кислый, вяжущий тоже

Потеря в массе при высушивании 2Д 1,8 2,0 2,9 2,8 2,5 не более 5%

Содержание тяжелых металлов не более 0,01% тоже

Количественное определение ангоцианов 0,227 0,227 0,227 0,245 0,245 0,245 не менее 0,22%

Для установления срока годности препарата, герметично упакованные образцы были заложены на хранение в естественных условиях при комнатной температуре. В течение 1 года наблюдений качество экстракта не изменилось

Разработка технологии сиропа плодов черники. Оценка качества, безопасности и эффективности сиропа

Сироп плодов черники готовили путем смешивания раствора сахара с экстрактом черники жилкам после предварительного удаления из него экстрагента

Экстракт жидкий готовили по ранее предложенной технологии методом противоточного многоступенчатого экстрагирования в батарее из шести диффузоров с завершенным циклом Однако для практической реализации технологии, было сокращено время получения экстракта С

учетом данных рисунка 2. число диффузоров в батарее уменьшили до четырех В этих условиях фактическая эффективность экстракции по действующим веществам составляет 74,1%, что позволяет получить экстракт с содержанием суммы антоцианов не менее 0,17%

При выборе основы сиропа оценивали, в первую очередь, влияние природы Сахаров на сохранность антоцианов в процессе хранения сиропов С этой целью готовили по 3 серии сиропов на фруктозе и сахарозе с содержанием антоцианов 0,15% Образцы были заложены на естественное хранение при комнатной температуре Полученные результаты приведены на рисунке 5 —

с, % о 16

О (4

012

О 1 ■{------——-—!---

0 6

Время хранения, мес

Рисунок 5 - Влияние характера основы на стабильность антоцианов в процессе хранения сиропа плодов черники

Как видно из данных рисунка 5, более высокий стабилизирующий эффект по отношению к комплексу антоцианов плодов черники в течении 1 года хранения оказывает сахароза

На основании проведенных исследований нами предложен оптимальный состав сиропа, содержащего антоцианы черники Технологическая схема сиропа приведена на рисунке 6.

12

ВР 1 1 Подготовка производственных помещений гл

ВР 1 2 Подготовка технологического оборудования

—

ВР 1 3 Подготовка персонала Ч

ВР 1 4 Подготовка технологической одежды *—

ВР 2 1

Измельчение сырья

^ ВР 2 2

Приготовление экстрагента

ВР 2 3 Отмеривание воды

ВР 2 4 Отвешивание натрия бензоата

| ТП 3 1 | Экстрагирование

-Гп

ТП 3 2

Упаривание экстракта

ТП 3 3

Очистка концентрата

ТП 5 1

Растворение в воде натрия бензоата

¡ПО 4

Кт

ТП 5 2 Варка сиропэ

ТП 5 3 | Смэи-ивание простого сахарного

I сиропа с коцентратом

ТП 5 4

Отстаивание и фильтрация

I УМО 6 1

Фасовка

УМО 6 2

Маркировка готовой продукции

УМО 6 3 Упаковка

ВР 1 ! Санитарная подготовка Кб производства

ВР 2 Подготовка сырья

Кх Кт

|

ТП 3 | Приготовление Кт, Кх | концентрата

Потери

Регенерация спирта

ТП 5 Приготовление сиропа

Кт, Кх

| Потери |

УМО 6 I Фасовка, маркировка, Кт Кх К6| упаковка

Г

Готовый продукт на склад

Рисунок 6 - Технологическая схема производства сиропа плодов

черники

Сироп получают растворением экстракта черники жидкого после предварительного отгона экстрагента и очистки в водном растворе сахарозы 64% с добавлением консерванта - 0,1% натрия бензоата Сахарный сироп получают растворением сахарозы по общепринятой технологии Растворение

сгущенного экстракта проводят в остывшем сиропе Сироп фильтруют и передают на фасовку Технология апробирована в заводских условиях на ЗАО «Ростовская фармацевтическая фабрика» (г Ростов-на-Дону) и ЗАО «Ростбалканфарм» (г Азов)

Стандартизацию сиропа плодов черники проводили на 5 сериях в соответствии с требованиями СанПин 2 3 2 1078-01 к БАД к пище Согласно требованиям, предъявляемым к БАД, оценивали внешний вид, запах, вкус, плотность и показатель преломления, а также содержание примесей тяжелых металлов, микробиологическую чистоту и количественное содержание антоцианов в соответствии с требованиями Р 4 1 1672-03 Результаты определения основных характеристик сиропа плодов черники приведены в таблице 4

Таблица 4 - Нормы качества сиропа плодов черники

Наименование покязятеггя Серии Норма качества

1 2 3 4 | 5

Внешний вид прозрачная жидкость вишнево-красного цвета Тоже

Запах фруктовый Тоже

Вкус кисло-сладкий слегка вяжущий Тоже

Плотность 1.315 1.310 1,320 1.330 1324 От 1.30 до 1.33

Показатель преломления 1,437 1,422 1,421 1,433 1,425 От 1,42 до 1,44

Содержание тяжелых металлов, РЪ, М отсутствует Отсутствие

Количественное определение антоцианов 0,14 0,14 015 0,16 0,16 Не менее 0,13%

Сироп плодов черники был подвергнут микробиологическому анализу в соответствии с требованиями СанПиН 2 3 2 1078-01 в лаборатории Санэпиднадзора г Пятигорска Установлено, что сироп отвечает требованиям по микробиологической чистоте, предъявляемым к ЬАД к пище, приготовленным на основе растительного сырья

Определение безвредности и специфической активности лекарственных препаратов является одним из важных этапов проведения

18

доклинической оценки, а в последние годы эти требования распространяются на БАД к пище Изучение токсичности и эффективности сиропа плодов черники проводили по методикам и моделям, рекомендованным Фармакологическим комитетом Минздравсоцразвития РФ при консультативной помощи канд фармац наук Л М Макаровой

Определение острой токсичности препарата, расчет Ц)50 проводили по методу Кербера В опытах не выявлено гибели животных даже при пероральном введении сиропа в дозе 5000 мг/кг, т е LDs0 > 5000 мг/кг, что позволяет считать сироп малотоксичным средством.

Определение влияния сиропа плодов черники на процессы п"рекись\"го окисления лияидов (ПОЛ) проводили на крысах-самцах линии Вистар при экспериментальной интоксикации 50% масляным раствором тетрахяорметана Установлено, что сироп черники обладает выраженной антиоксядантной активностью Его введение офаничивает накопление первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов на 45% к препятствует увеличению вторичных продуктов ПОЛ - ТЕК-активпых продуктов на 37% аналогично препарату сравнения - сиропу «Миртикам» Разработанный сироп в условиях интоксикации раствором тетрахлорметана увеличивает активность супероксиддисмутазы на 35,1% и лимитирует компенсаторное повышение активности каталазы на 28,7%, оказывая более выраженное действие, чем препарат сравнения Полученные результаты свидетельствует о способности предложенного сиропа черники оказывать мембранозащитное действие

Постадийный контроль технологического процесса при приготовлении

сиропа черники

Разнообразие действия лекарственных препаратов плодов черники на организм человека многими исследователями связывается с уникальным набором биологически активных веществ, в первую очередь антоцианов, которых в плодах черники насчитывается более трех десятков Учитывая лабильность антоцианов ко многим факторам, нами предложена методика определения методом ВЭЖХ качественного состава антоцианов в процессе

их выделения из плодов черники и получения сиропа Для анализа использовали жидкостной хроматограф «Миллихром А-02» с обращено-фазовой колонкой 2x75 мм сорбент Силасорб С)8 размер частиц 5 мкм, объем пробы 80 мкл Для градиентного элюирования использовалось два растворителя ортофосфорная кислота - вода (2 5 85) (растворитель А) и ацетонитрил (растворитель Б) Градиент - от 10% до 50% растворителя Б за 24 минуты Расход элюента 100 мкл/мин, температура колонки 35°С Регистрацию компонентов пробы проводили с помощью УФ-детектора при длине волны 280 нм

Для определения сохранности антоцианов при осуществлении технологического процесса, проводили сравнение профилей хрс»*атогрзл'м извлечения из исходного сырья (экстрагент - 70% спирт, содержащий 1% ортофосфорной кислоты), экстракта черники жидкого и сиропа черники, полученных в описанных выше условиях На рисунках 7, 8 и 9 представлены хромато граммы исслсд^ с мы х образцов

2 ли / ч» •л »«ч ' Г 5 г Г л / Г С г / о. г- л е * ее*ч 1-1 • «я»;?®™»! « л 1 "Ъ» — = Л "»—»г.»« в«>

¡аабшп-,-■-,-,-

Рисунок 7 - Хроматограмма извлечения из плодов черники о г 4Г в

Рисунок 8 - Хроматограмма экстракта плодов черники жидкого

Ч80лт

г- «г* •

РЗё:

АЛЛ

а

тМ

■41» " * п»- ад

\ 71 "%н „

0 2 А1

Рисунок 9 - Хроматограмма сиропа черники

Как видно из полученных хроматограмм, хроматографические пики характеризуют смесь компонентов с близкими полярными свойствами Для характеристики степени сходства профилей полученных хроматограмм. нами выбран участок хроматограммы в интервале времен удерживания от 5 до 20 минут При многоволновом детектировании (270, 280 и 330 нм) установлено, что максимальное поглощение компонентов данной области наблюдается при 280 нк - это характерно для соединений фенольного типа Сравнивая абсолютное время удерживания каждого пика (в минутах) на хроматограммах извлечения из плодов черники, экстракта жидкого и сиропа, видно, что положение основных 12 пиков на них идентично (таблица 5) Это свидетельствует о том, что качественный состав полифенольного комплекса всех трех образцов одинаков и не подвергается существенному изменению в процессе экстрагирования сырья, концентрировашхя экстракта жидкого и получения сиропа

Таблица 5 - Характеристики степени сходства профилей хроматограмм по временам удерживания пиков

Время удерживания основных пиков, мин

1 2 3 4 э 6 7 8 9 10 11 12

Извлечение из плодов черники 664 7.07 7.39 7,80 8 29 868 9.02 955 10 38 10,94 11.49 12 69

Экстракт черники жидкий 6.83 7 17 7 52 7.97 8.32 8 86 9,10 9,73 10 57 И 15 11.71 12 90

Сироп чеоники 681 724 7 51 797 8.46 8 85 919 9 69 10 56 И 13 11 67 12.86

Таким образом, нами разработана технология сиропа плодов черники, предложены .методики качественного и количественного определения антоцианов, которые позволяют надежно и объективно оценивать эффективность проведения технологического процесса

Общие выводы

1 Установлены нормы качества плодов черники содержание экстрактивньгх веществ - не менее 40%, суммы антоцианов в пересчете на цианидин-3-гликозид - не менее 0,25% Определены технологические показатели плодов черники коэффициент поглощения сырья - 0,70 см7г, коэффициент образования внутреннего сока - 1,07 см3/г, коэффициент увеличения объема 0,70 смУг

2 Разработана методика количественного определения антоцианов в плодах черники методом спсктрофотомстрии и проведена сс валидащюнная оценка

3 Разработана технология экстрактов плодов черники жидкого и сухого с использованием оптимального экстрагента - 1% раствора кислоты лимонной в 70% спирте этиловом Определены оптимальные условия экстрагирования плодов черники, позволяющие истощить сырье (по антоцианам) на 82,8% - при получении экстракта жидкого методом реперколяции, на 95,1% - при получении экстракта сухого методом ремацерации

4 Установлены нормы качества на разработанные экстракты Для экстракта жидкого содержание антоцианов - не менее 0,20%, содержание спирта этилового - не менее 45%, плотность - не более 1,054 г/см'' Для экстракта сухого содержание антоцианов - не менее 0,23%, влажность -не более 5%

5 Обоснован состав и разработана технология сиропа плодов черники На основании проведенных исследований составлены технические условия и технологическая инструкция на БАД к пище «Сироп черники» Проведена стандартизация разработанной БАД В »ЛЮТВе ГСТВИи С требованиями НД

6 Выполнены предварительные фармакологические исследования сиропа плодов черники, показана его низкая токсичность (ЬО50 > 5000 мг/кг) и выраженная антиоксилантная активность.

Список опубликованных работ

1 Определение технологических показателей с цедью разработки оптимальной, технологии получения экстракта черники жидкого // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр / Пятигорск.ГФА. - Вып 59. - Пятигорск-ПятГФА, 2004-С. 114. (Соавт Погорелов В.И.) , , {»

2 Новые подходы получения полифенольного комплекса плодов черники и разработка на его основе лекарственных форм различного спектра действия // Человек и лекарство- тез. докл. 12 Рос. нац конгресса 18-22 апр. 2005 г.-М., 2005.-С. 685-686.

3. Технологические исследования по разработке экстракта черники жидкого как промежуточного продукта при производстве сиропов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч тр ' Пятигорск ГФА. - Вып 61. - Пятигорск ПятГФА, 2006.-С. 118-119.

4. Определение антоцианинов в плодах черники // Научное обозрение.-2006-№3.-С. 31-34.

5. Методы постадийного контроля технологического процесса при получении сиропа черники /^Известия высших учебных заведений. Сев.-Кавк. регион. Естественные,науки, Спецвыпуск. Клиническая медицина и фармакология. - 2006.-С 75-76

6. Перспективы создания лекарственных средств на основе полифенольного коматекса плодов черники " Известия высших учебных заведений. Сев.-Кавк. регион. Естественные науки Спецвыпуск Клиническая медицина и фармакология. - 2006.-С. 76-77 , ,

г

МОЛЧАНОВ МАКСИМ ВАСИЛЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЭКСТРАКТОВ И СИРОПА ИЗ ПЛОДОВ ЧЕРНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

15.00.01 - техноло! ия лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати ■ ^Ч ■ 2008 г Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная Печать - ротапринтная Уел печ л. 1,0. Тираж 100 экз Заказ № 46 9,

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, Ставропольский край, г Пятигорск, пр. Калинина. 11)

Актуальность темы. Несмотря на интенсивное развитие синтетической органической химии интерес к природным соединениям не только не ослабевает, но и возрастает. К таким соединениям относятся антоцианы, содержащиеся в плодах черники обыкновенной.

Черника обыкновенная издавна используется в народной медицине в качестве вяжущего средства. Научная медицина проявляет интерес к плодам черники, как к источнику комплекса биологически активных веществ, обладающему антиоксидантным действием, улучшающему реологические свойства крови, способствующему укреплению стенки кровеносных сосудов, ускоряющему I восстановление обесцвеченного родопсина. Однако, несмотря на ценные био- 1 логические свойства плодов черники, она не нашла широкого медицинского применения в виде лекарственных средств.

В Государственный Реестр лекарственных средств включены три лекарственных препарата из плодов черники: «Мирталене форте» (БЛЛ7.!., Италия) в форме капсул, «Стрикс» (Реггозап, Дания) в форме таблеток, «Миртикам» (Камелия НЛП, Россия) в форме гомеопатического сиропа. Кроме того, в Российской Федерации зарегистрировано более ста наименований биологически активных добавок (БАД) полученных из плодов черники. Недостатками указанных добавок является то, что их стандартизация не всегда предусматривает определение основных биологически активных веществ.

В то же время, современные требования к средствам, предназначенным как для лечения, так и для профилактики, то есть к БАД, определяются качественным и количественным содержанием биологически активных веществ. Такое требование может быть выполнено при разработке унифицированной технологии, соответствующей условиям производства, а также разработке надежных методов для стандартизации как сырья, так и промежуточных и конечных продуктов.

Предпосылками для этого являются теоретические разработки по экстракции некоторых лабильных биологически активных веществ, а также включение в НД современных методов для стандартизации, позволяющих определять вещества в процессе производства и в готовой продукции.

Решение этих вопросов в отношении плодов черники и лекарственных препаратов из нее послужит базой для производства лекарственных препаратов и БАД.

Поэтому разработка методов получения жидкого и сухого экстрактов и сиропа из плодов черники обыкновенной является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является разработка технологии и норм качества для. стандартизации экстракта черники жидкого, экстракта черники сухого и БАД к пище - сиропа, содержащего экстракт черники жидкий.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- установить критерии и предложить методики для количественной оценки качества плодов черники и фитопрепаратов из данного сырья;

- выбрать оптимальный экстрагент и определить технологические показатели плодов черники;

- провести теоретические и экспериментальные исследования по разработке оптимальных условий экстрагирования и оптимизации технологии при производстве экстрактов плодов черники жидкого и сухого;

- разработать нормы качества на экстракты плодов черники жидкий и сухой по содержанию действующих веществ и другим показателям в соответствии-с требованиями ГФ XI;

- обосновать состав* разработать технологию и установить нормы качества БАД к пище - сиропа плодов черники;

- разработать экспрессную методику контроля сохранности полифенольно-го комплекса плодов черники в процессе приготовления сиропа черники;

- провести предварительные фармакологические исследования сиропа из плодов черники.

Научная новизна. На основании проведенных исследований выявлены основные закономерности экстракции антоцианов из плодов черники обыкновенной в зависимости от концентрации спирта этилового и содержания органических кислот. Это позволило установить, что спирт 70%, содержащий 1% кислоты лимонной, извлекает максимальное количество антоцианов из плодов черники. Определены технологические показатели сухих плодов черники: содержание экстрактивных веществ, коэффициент съёма готовой продукции, коэффициент поглощения сырья, коэффициент образования внутреннего сока, коэффициент увеличения объёма при растворении экстрактивных веществ.

Проведена оптимизация процесса экстрагирования плодов черники, касающаяся соотношения фаз, постановки экстракционного процесса и количества диффузоров, что позволило достичь степени экстракции по анюцианам 82,8% — при приготовлении экстракта жидкого методом реперколяции и 95,1% — при приготовлении экстракта сухого методом ремацерации.

Впервые доказано, что предварительное смешивание сгущенного и очищенного извлечения из плодов черники с 20% водным раствором лактозы, после сублимационной сушки позволяет получить экстракт сухой, обладающий низкой гигроскопичностью и сохраняющий стабильными антоцианы в течение 1 года хранения.

Обоснована целесообразность и возможность получения сиропа плодов черники, выполнено аналитическое обеспечение технологического процесса. Установлено, что сироп сахарный, содержащий экстракт плодов черники жидкий, позволяет стабилизировать антоцианы в процессе хранения.

•Доказана приемлемость использования спектрофотометрии для стандартизации сырья и лекарственных препаратов из плодов черники.

Практическая значимость. Разработана технология экстракта черники сухого и сиропа черники. Показано, что содержание антоцианов может служить показателем для оценки качества плодов черники и полученных из них лекарственных препаратов и БАД. Впервые предложена методика определения антоцианов в сухих плодах черники методом спектрофотометрии, с помощью которой установлена одна из норм качества сырья по количественному содержанию антоцианов.

Представленный в работе экспериментальный материал фармакологических исследований, послужил основанием и подтверждением необходимости практического использования сиропа, содержащего экстракт черники жидкий в качестве БАД к пище, как дополнительного источника антоцианов.

Внедрение результатов исследования в практику. По результатам исследований разработаны проекты ТУ и ТИ на БАД «Сироп черники», которые прошли успешную технологическую апробацию на производственных участках ЗАО «Ростовская фармацевтическая фабрика», г. Ростов и ЗАО «Ростбалкан-фарм», г. Азов.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты определения количественного содержания антоцианов в плодах черники методом спектрофотометрии, позволяющим исключить влияние на результаты анализа сопутствующих веществ.

2. Параметры технологических показателей плодов черники, установленные с использованием оптимального экстрагента — 1% раствора кислош лимонной в 70% спирте этиловом.

3. Результаты технологии экстракта плодов черники жидкого методом ре-перколяции с законченным циклом, в батарее из шести диффузоров.

4. Обоснование технологии экстракта плодов черники сухого, полученного сублимационным высушиванием сгущенного и очищенного извлечения из плодов черники совместно с водным раствором лактозы.

5. Итоги исследований по технологии сиропа с экстрактом плодов черники и его стандартизации.

6. Результаты предварительных фармакологических исследований сиропа с экстрактом плодов черники.

Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на ежегодных научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии в 2004, 2005 и 2006 гг. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в журнале, рекомендованном ВАК.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава, номер государственной регистрации 01200215436.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 26 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 172 источника, из которых 35 на иностранных языках, и приложений.

Общие выводы

1. Установлены, нормы качества плодов черники: содержание экстрактивных веществ - не менее 40%, суммы антоцианов в пересчете на цианидин-3-гликозид — не менее 0,25%. Определены технологические показатели плодов черники: коэффициент поглощения сырья - 0,70 см /г; коэффициент образо3 вания внутреннего сока - 1,07 см /г; коэффициент увеличения объёма - 0,70 з см /г.

2. Разработана методика количественного определения антоцианов в плодах черники методом спектрофотометрии и проведена ее валидационная оценка.

3. Разработана технология экстрактов плодов черники жидкого и сухого с использованием оптимального экстрагента - 1% раствора кислоты лимонной в 70% спирте этиловом. Определены оптимальные условия экстрагирования плодов черники, позволяющие истощить сырье (по антоцианам) на 82,8% -при получении экстракта жидкого методом реперколяции, на 95,1% - при получении экстракта сухого методом ремацерации.

4. Установлены нормы качества на разработанные экстракты. Для экстракта жидкого: содержание антоцианов - не менее 0,20%; содержание спирта этилового - не менее 45%; плотность — не более 1,054 г/см . Для экстракта сухого: содержание антоцианов - не менее 0,23%, влажность — не более 5%.

5. Обоснован состав и разработана технология сиропа плодов черники. На основании проведенных исследований составлены технические условия и технологическая инструкция на- БАД к пище «Сироп черники». Проведена стандартизация разработанной БАД в соответствии с требованиями НД.

6. Выполнены предварительные фармакологические исследования сиропа плодов черники, показана его низкая токсичность (1Л}5о > 5000 мг/кг) и выраженная антиоксидантная активность.