Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование плодов и побегов черники обыкновенной

ш т 6

На правах рукописи

Рязанова Татьяна Константиновна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛОДОВ И ПОБЕГОВ ЧЕРНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

тсамим муятишб и

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

9 ОКТ 2014

Самара - 2014

005553293

005553293

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович Официальные оппоненты:

Копомиец Наталья Эдуардовна, доктор фармацевтических наук, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакогнозии с курсами ботаники и экологии, профессор кафедры Пурыгим Петр Петрович, доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный университет», кафедра органической, биоорганической и медицинской химии, заведующий кафедрой

Ведущая организация:

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 5 декабря 2014 г. в 12:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165Б).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (443001, г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171; http://www.samsmu.ru/science/referats/2014/ryazanova)

Автореферат разослан 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук,

доцент

Петрухина Ирина Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Растения являются одним из важнейших источников биологически активных соединений (БАС), находящих широкое применение в различных областях промышленности, однако особое значение имеет опыт их применения в медицине (Киселева Т.Л., 2009; Куркин В.А., 2009; Самылина И.А. и др., 2007; 2010). Отличительной особенностью многих препаратов растительного происхождения имеет комплексный и взаимодополняющий характер действия совокупности содержащихся в них БАС (Киселева Т.Л., 2009; Куркин В.А., 2009; Самылина И.А. и др., 2004; 2007).

Одним из ценным источников лекарственных препаратов является черника обыкновенная (Vaccinium myrtillus L.) - растение, широко используемое в народной и официнальной медицине. Фармакопейным сырьем являются плоды и побеги (Государственный реестр лекарственных средств, 2014). Однако более широкое применение в составе препаратов на фармацевтическом рынке получили именно плоды черники благодаря разнообразию своего химического состава. Плоды черники обыкновенной - растительное сырье, накапливающее значительное количество антоцианов, соединений, обладающих антиоксидантной, антиагрегантной, ангиопро-текторной, противовоспалительной активностью. Подобная активность антоцианов обусловливает их применение при комплексной терапии офтальмологических заболеваний (миопия, возрастная макулярная дегенерация, диабетическая ретинопатия) (Киселева Т.Н., 2007; Егоров Е.А., 2004). Побеги черники обыкновенной используются в составе противодиабети-ческих сборов («Арфазетин-Э», «Арфазетин-ЭК») (Государственный реестр лекарственных средств, 2014).

И для плодов, и для побегов черники обыкновенной недостаточно проработана стандартизация по группам действующих соединений. На данный момент в России существует фармакопейная статья (Государственная Фармакопея СССР XI издания, вып. 2) только на плоды черники воздушно-сухие, в то время как в европейских странах регламентируется качество как воздушно-сухих, так и свежих плодов, при этом в качестве источника антоцианов применяются только свежие плоды. Следует отметить, что и используемая в Российской Федерации фармакопейная статья (ФС) на плоды черники не соответствует современным требованиям к стандартам качества на ЛРС; в частности, не регламентируется количественное содержание действующих веществ, отсутствует ряд других показателей (Отраслевой стандарт 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения»). Возможно, с отсутствием содержащих современные требования стандартов качества на свежие плоды черники обыкновенной связаны немногочисленность отечественных лекарственных препаратов на их основе и

преобладание дорогостоящих импортных лекарственных средств («Стрикс», «Миртилене форте»).

Качество побегов оценивают по содержанию дубильных веществ, хотя по литературным данным известно, что в побегах также содержатся флавоноиды, которые являются более лабильной группой БАС, и соответственно их содержание является более достоверным показателем качества обработки сырья.

В связи с этим актуальным является более углубленное фармакогности-ческое исследования плодов и побегов черники обыкновенной для обоснования подходов к методам стандартизации сырья, а также проведение химико-фармацевтических исследований по разработке состава лекарственных препаратов из плодов черники. Решение поставленных задач будет способствовать реализации Стратегии развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2020 года, утвержденной приказом Минпромторга России № 965 от 23.10.2009 г.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящей работы является фармакогностическое исследование плодов и побегов черники обыкновенной, направленное на разработку и усовершенствование методов стандартизации сырья и препаратов на их основе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести анатомо-гистологическое исследование различных органов черники обыкновенной и других морфологически сходных видов лекарственного растительного сырья.

2. Провести сравнительное фитохимическое исследование различных органов черники обыкновенной, а также сравнение с другими морфологически сходными видами ЛРС.

3. Изучить химический состав плодов и побегов черники обыкновенной.

4. Разработать методики качественного и количественного анализа БАС в сырье черники обыкновенной.

5. Разработать проекты фармакопейных статей на черники обыкновенной плоды воздушно-сухие, черники обыкновенной плоды свежие и черники обыкновенной побеги.

6. Провести химико-фармацевтическое исследование по обоснованию состава препаратов из плодов и побегов черники обыкновенной («Черники обыкновенной сироп», «Черники обыкновенной пастилки», «Черники обыкновенной таблетки», «Черники побегов настойка»).

7. Разработать методики качественного и количественного анализа экспериментальных препаратов на основе ЛРС черники.

8. Провести фармакологические исследования по изучению влияния экспериментальных лекарственных препаратов из плодов и побегов черники обыкновенной на выделительную функцию почек крыс.

Научная новизна. С использованием оптической микроскопии получены микрофотографии, отражающие диагностические признаки побегов черники обыкновенной. Впервые проведено сравнительное анатомо-гистологи-ческое и фитохимическое исследование побегов черники с морфологически сходными, потенциально примесными видами (толокнянка обыкновенная, брусника обыкновенная).

Из плодов черники обыкновенной выделены и идентифицированы три соединения антоциановой природы: З-О-глюкозиды цианидина, мальвиди-на и дельфинидина. Впервые определен удельный показатель поглощения цианидина-З-О-глюкозида в 0,5% растворе аммиака в 95% спирте этиловом. Из побегов черники обыкновенной выделены и идентифицированы кверце-тин-З-О-ксилопиранозид, кофейная кислота и даукостерин, (3-ситостерин, из которых даукостерин впервые обнаружен в чернике, а кверцетин-З-О-кси-лопиранозид выделен впервые из черники, произрастающей на территории Российской Федерации.

Разработаны методические и методологические подходы к стандартизации свежих и воздушно-сухих плодов, а также препаратов черники обыкновенной, заключающиеся в оценке суммы антоцианов в пересчете на циа-нидин-З-О-глюкозид методом прямой спектрофотометрии в 95% этиловом спирте, содержащем 1% хлороводородной кислоты. Впервые разработана методика количественного определения антоцианов в ЛРС методом дифференциальной спектрофотометрии в 0,5% растворе аммиака в 95% спирте этиловом при аналитической длине волны 623 нм на фоне исходного раствора без добавления аммиака, разведенного аналогичным образом.

Обоснованы подходы к стандартизации побегов черники обыкновенной по сумме флавоноидов в пересчете на рутин методом дифференциальной спектрометрии с алюминия хлоридом при аналитической длине волны 420 нм.

Предложен состав и способ получения лекарственных препаратов «Черники обыкновенной таблетки», «Черники обыкновенной пастилки», «Черники побегов настойка», «Черники обыкновенной сироп».

Разработаны методики анализа экспериментальных лекарственных препаратов по содержанию флавоноидов, в том числе антоцианов, с использованием методов ТСХ и спектрометрии в соответствии с принципами унификации, предъявляемыми к современному фармацевтическому анализу (Самы-лина И.А. и др., 1994; 2007).

Проведено изучение влияния водных и водно-спиртовых извлечений из плодов и побегов черники на экскреторную функцию почек на белых беспородных крысах. Результаты исследования показывают, что умеренным диуретическим действием обладают водные извлечения из побегов и препараты на основе свежих плодов черники. По показателям диуретической активности,

натрийуреза, калийуреза и креатининуреза через 24 ч действие экстракта из свежих плодов черники обыкновенной было сравнимо с действием гипоти-азида. Под влиянием водно-спиртовых извлечений из воздушно-сухих плодов и побегов черники происходит уменьшение диуреза по сравнению с контрольной группой.

Практическая значимость. Разработаны разделы «Микроскопия», «Количественное определение», усовершенствован раздел «Качественные реакции» (ТСХ-метод и метод спектроскопии), включенные в проект фармакопейной статьи на «Черники плоды», «Черники обыкновенной побеги», «Черники обыкновенной плоды свежие».

Предложены методики качественного и количественного анализа, определены показатели качества, которые нашли отражение в разработанных и принятых на рассмотрение ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» ФС «Черники плоды» и «Черники обыкновенной плоды свежие» и «Черники обыкновенной побеги» (№ 1016 от 22.01.13 г., вх. №1020 от 28.01.13 г., вх.) с целью включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

Разработаны составы и способы получения, методы стандартизации препаратов из плодов и побегов черники. Получены Патент РФ на изобретение № 2484671 от 20.06.2013 г. «Сироп черники обыкновенной»; удостоверение на рационализаторское предложение № 219 от 21.09.2012 г. «Способ получения сиропа черники обыкновенной».

Результаты диссертационных исследований используются в учебных процессах на кафедрах фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, фармацевтической технологии, управления и экономики фармации, химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, ГБУ здравоохранения «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области», ЗАО «Самаралектравы».

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России (№ гос. регистрации 01200900568).

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Результаты сравнительных анатомо-гистологических исследований побегов черники обыкновенной и морфологически сходных, потенциально примесных видов.

2. Результаты сравнительного фитохимического исследования плодов и побегов черники обыкновенной и морфологически сходных видов.

3. Результаты исследований по разработке методик качественного анализа плодов и побегов черники обыкновенной.

4. Результаты исследований по разработке методик количественного определения суммы флавоноидов в плодах и побегах черники обыкновенной.

5. Данные по изучению стабильности антоцианов в зависимости от условий сушки сырья.

6. Результаты исследований по разработке способов получения лекарственных препаратов на основе плодов и побегов черники обыкновенной.

7. Данные по изучению показателей качества разработанных лекарственных препаратов («Черники обыкновенной сироп», «Черники обыкновенной пастилки», «Черники обыкновенной таблетки», «Черники побегов настойка»).

8. Результаты исследований диуретической активности экспериментальных препаратов на основе плодов и побегов черники обыкновенной.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на IV Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии, направленный поиск новых лекарственных средств» (г. Волгоград, 2012), II Международном Конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (г. Москва, 2012); XV, XVI, XVII Всероссийских конгрессах «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2010; 2011; 2012); Первой Всероссийской научно-практической конференция молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (г. Москва, 2013); в финале II Всероссийского конкурса УМНИК на СТАРТ 2011 (Самарская область, сентябрь 2011); конференциях дипломированных специалистов «Аспирантские чтения» (г. Самара, 2011; 2012; 2013).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 24 научной работе, из них 9 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором. Автором в сравнительном аспекте выполнены исследования по изучению морфологических и анатомо-гистоло-гических особенностей строения различных органов черники обыкновенной. Из плодов черники обыкновенной выделены и идентифицированы 3 основных антоциана, из побегов черники - кверцетин-З-О-ксилопиранозид, кофейная кислота и даукостерин, р-ситостерин, из которых даукостерин выделен впервые, а кверцетин-З-О-ксилопиранозид выделен впервые из черники, произрастающей на территории Российской Федерации. Разработаны методики стандартизации плодов и побегов черники по содержанию флавоноидов. Изучено влияние водных и водно-спиртовых извлечений из плодов и побегов на экскреторную функцию почек. Разработаны составы и способы получения экспериментальных лекарственных препаратов: «Черники обык-

новенной сироп», «Черники обыкновенной пастилки», «Черники обыкновенной таблетки», «Черники побегов настойка». Разработаны методики их анализа, определены основные показатели качества. Автором разработаны проекты ФС «Черники плоды» и «Черники обыкновенной плоды свежие», «Черники обыкновенной побеги».

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц, 59 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов собственных экспериментальных исследований (главы 3-6), общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 135 источников, из которых 47 - на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, показаны научная новизна и практическая значимость полученных результатов, изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 посвящена обзору современного состояния исследований черники обыкновенной, в котором систематизированы сведения по изучению химического состава, фармакологических свойств, применению в медицине, стандартизации сырья и препаратов на основе данного растения.

В главе 2 приведена характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики анатомо-морфологического, химического и физико-химического изучения лекарственного растительного сырья, индивидуальных соединений, методы оценки фармакологической активности и приготовления лекарственных препаратов.

В главах 3-6 экспериментальной части отражены результаты собственных исследований по фотохимическому изучению плодов и побегов черники обыкновенной, усовершенствованию методик стандартизации ЛРС и ЛП на его основе, разработке новых препаратов, оценке их качества, обоснованию целесообразности внедрения в медицинскую практику в качестве офтальмологических ЛС растительного происхождения.

В Приложения вынесены акты внедрения, проекты ФС на черники плоды воздушно-сухие и свежие, черники побега, патент РФ на изобретение, рационализаторское предложение.

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах, формулах, на рисунках, которые приведены в тексте диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили образцы сырья - плодов и побегов черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L., сем. Брусничные -Vacciniaceae), побегов брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea L., сем. Брусничные - Vacciniaceae) и побегов толокнянки [Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng., сем. Вересковые - Ericaceae], заготовленные в период с 2012 по 2013 гг. на территории Пензенской области, Республики Марий Эл. На этапе проведения физико-химических методов анализа объектами исследования служили лабораторные образцы разрабатываемых препаратов на основе исследуемого сырья (таблетки, сиропы, пастилки, настойки), а также государственные стандартные образцы рутина, арбутина, цианидин-З-О-глюко-зида, кверцетина, даукостерина, ß-ситостерина, кофейной кислоты, кверце-тин-З-О-ксилопиранозида.

Исследование микропрепаратов плодов, листьев, стеблей растения осуществляли с помощью цифровых микроскопов «Motic DM-111» (возможность увеличения 4x10, 10x10,40x10,100x10) и цифрового стереоскопического микроскопа «Motic DM-39C-N9GO-A» (возможность увеличения х20, х40).

Изучение химического состава плодов и побегов проводили методом адсорбционной жидкостной колоночной хроматографии. При исследовании плодов элюирование проводили в градиентном режиме смесями хлороформа и этилового спирта, содержащего 0,1% хлороводородной кислоты (хлороформ, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%-ное содержание подкисленного этилового спирта в хлороформе). При исследовании побегов хроматогра-фическое разделение проводили на сорбенте силикагеле L40/100 с использованием в качестве элюентов хлороформа, спирто-хлороформных смесей в различных соотношениях, 95% спирта этилового. В качестве сорбентов использовании силикагель L40/100 (Чехия) и полиамид марки «Woelm» (Германия).

Для тонкослойного хроматографического разделения использовали пластинки «Силуфол УФ-254», «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ», «Сорбфил-ПТ-СХ-П-А-УФ». Спектры снимали на спектрофотометре «Specord 40» (Analytik Jena) в кюветах с толщиной слоя 10 мм. 'Н-ЯМР спектры регистрировали на спектрометре «Bruker AM 300». Масс-спектры электронного удара регистрировали на масс-спектрометре «Kratos MS-30» при энергии ионизирующих электронов 70 эВ и варьировании температуры ионного источника от 30°С до 250°С. ВЭЖХ-анализ проводили на жидкостном хроматографе Biotronic; хро-матографическая колонка Phenomenex Luna CI 8(2) (250 мм х 4,6 мм, 5 мкм) с

использованием смесей ацетонитрила и буферного раствора (0,01 М КН2Р04, подкисленный Н3Р04 до рН 3,00±0,01), расход подвижной фазы 0,6 мл/мин; детекция при длине волны 280 нм.

Исследование диуретической и салуретической активности проводили с использованием различных субстанций из плодов и побегов черники. В качестве препарата сравнения использовали гипотиазид в дозе 20 мг/кг.

2. Морфолого-анатомическое исследование черники обыкновенной

Проведено анатомо-гистологическое исследование побегов черники обыкновенной в сравнении с другими морфологически сходными видами ЛРС (листьями толокнянки и брусники). Выявлены диагностические особенности: характерная форма главной жилки на поперечном сечении, наличие одноклеточных толстостенны прямых волосков с грубой боровчатой поверхностью по жилкам с верхней стороны, булавовидных железок по обеим сторонам листовой пластинки, наличие выраженной кристаллоносной обкладки вдоль жилки с нижней стороны листа, характерным строением хлорофилло-носной паренхимы под эпидермисом побегов с отходящими от нее тяжами переплетащаюхся клеток (рис. 1-4).

В связи с тем, что большое значение для диагностики ЛРС имеет строение черешка, нами были изучены его диагностические признаки с позиции петиолярной анатомии (рис. 5):

1. Форма поперечного сечения: полулунная форма, слегка сплюснутая с адаксиальной стороны;

2. В паренхиме черешка локализован один закрытый коллатеральный пучок (центральная жилка), расположенные по центру, ближе к адаксиальной стороне, армированный с обеих сторон.

3. Колленхима представлена по всему периметру, неоднородна; образует более крупные участки в ребрах, более угловатых, чем у других изучаемых видов. Количество слоев в абаксиальной части - 1-3.

4. Основная паренхима представлена тонкостенными клетками от 10 до 80 мкм в диаметре. Имеются крупные клетки (идиобласты), содержащие призматические кристаллы и друзы оксалата кальция

5. Эпидермис опушен с адаксиальной стороны простыми одноклеточными волосками с грубой бородчатой поверхностью длиной 23-52 мкм.

Рис. 1. Эпидермис листа черники (х400).

Обозначения: А - булавовидные железки; Б - бородавчатые волоски. 1 - основание железки; 2 - бородавчатые волоски, 3 - двурядная ножка железки; 4 - многоклеточная головка железки; 5 - устьице.

Рис. 2. Кристаллоносная обкладка вдоль жилки (х400).

Обозначения: 1 - кристаллы оксалата кальция; 3 - устьице.

. ,-чШ1 . г; .

I 50-^

50^-

Рис. 3. Особенности строения стебля черники (х 400).

Обозначения: А - Эпидермис и субэпидермальные слои; Б - Первичная кора и древесина. 1 - кутикула; 2 - эпидермис; 3 - основная хлорофиллоносная паренхима; 4 - флоэма; 5 - кольцо механической ткани; б - древесина.

Рис. 4. Главная жилка (х100).

Обозначения: 1 - колленхима; 2 - механическая ткань; 3 - проводящий пучок; 4 - кутикула; 5 - нижний эпидермис; б - толстостенный волосок; 7 - верхний эпидермис; 8 - столбчатая паренхима; 9 - губчатая паренхима.

Рис. 5. Особенности строения черешка листа черники.

Обозначения: А - поперечный срез (хЮО); Б - поперечный срез (х400); - поперечный срез, окраска сернокислым анилином (х400); В - поперечный срез, окраска Суданом III (х400).

3. Фитохимическое исследование лекарственного растительного сырья черники обыкновенной

С целью разработки методик качественного анализа методами тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии проведен фитохимический анализ побегов, свежих и воздушно-сухих плодов черники обыкновенной.

Определено, что оптимальное разделение антоцианов в условиях ТСХ-анализа происходит в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода

(4:1:2). Имеются некоторые различия в профиле антоцианов свежих и воздушно-сухих плодов в связи с тем, что анто-цианы легко разрушаются под воздействием повышенных температур. Общим для извлечений из свежих и воздушно-сухих плодов является наличие циани-дин-З-О-глюкозида (Я ~ 0,35) и мальви-дин-З-О-глюкозида (Я, ~ 0,50) (рис. 6). Также различия наблюдаются в электронных спектрах поглощения извлечений из плодов: извлечение из свежих плодов черники имеет максимумы поглощения при 282±2 нм и 545±2 нм, соотношение (А282/ А546) примерно составляет 1,0 :1,5; для воздушно-сухих плодов это соотношение изменяется в пользу коротковолнового максимума и составляет 1,0 : 0,10-^0,15 (рис. 7).

Методом адсорбционной колоночной хроматаграфии в сочетании с перекристаллизацией и различными химиче-

Рис. 6. Схема ТСХ в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:2).

Обозначения: 1 - спиртовое извлечение из воздушно-сухих плодов черники; 2 - спиртовое извлечение из плодов черники свежих; 3 - мальвидин-З-О-глюкозид; 4- цианидин-З-О-глюкозид; 5 - дельфинидин-З-О-глюкозид.

Рис. 7. Спектры поглощения водно-спиртового извлечения из свежих плодов черники обыкновенной (1), воздушно-сухих плодов черники обыкновенной (2) и цианидин-З-О-глюкозида (3) в 95% этиловом спирте, содержащем 1 % HCl.

скими превращениями (ферментативный и кислотный гидролиз) из побегов и плодов черники обыкновенной выделено 6 индивидуальных соединений (табл. 1). Для установления структуры выделенных веществ использованы данные УФ-, 'Н-ЯМР- и масс-спектров.

Таблица 1

Физико-химические константы и спектральные характеристики соединений, выделенных из плодов и побегов черники обыкновенной

№ п/п Название Химическая формула Физико-химические характеристики

1. Цианидин-З-О-глюкозид С21Н21О11 З-О-р-О-глюкопиранозил 3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил) хроменилия он "YxVU ¿н масс-спектр (m/z): 287 (fyf" агликона); т.пл. 244-246°C; УФ-спектр: >.max 281 hm; 537 hm (1% HCl в 95% EtOH)

г. Мальвидин-З-О-глюкозид С23Н25О12 З-О-р-Э-глюкопиранозил 3,5,7-тригидрокси -2-(4-гидрокси- 3,5-диметоксифенил)хроменилия OCH, HO—¿^^sZ-OH масс-спектр (m/z): 331 (ii агликона); т.пл. 240-245°C; УФ-спектр-. /. max 281 hm; 544 hm (1% HCl в 95% EtOH)

3. Дельфинидин-З-О-глюкозид С21Н21О12 З-О-Р-Э-глюкопиранозил 3,5,7-тригидрокси-2-(3,4,5-тригидроксифенил) хроменилия YYW™ AH Ho^j-ri^-oH масс-спектр (m/z): 331 (M+ агликона); т.пл. 255-260°C; УФ-спектр: 281 нм; 551 hm (1% HCl в 95% EtOH)

Окончание таблицы 1

№ п/п Название Химическая формула Физико-химические характеристики

4. Кверцетин-З-О-ксилопиранозид СгоН^Ою З-О- ß-D-ксилопиранозид 2-(3,4-дигидроксифенил)-3,5,7-тригидрокси-4Н-хромен-4-она ОН ......—Ху1 ОН О масс-спектр (m/z): 302 (М+ агликона); т.пл. 182-185°С (водный спирт); УФ-спектр: X imx 264 нм (плечо), 370 нм.

5. Кофейная кислота с9н8о4 (3-(3,4-дигидроксифенил)-2-пропенованя кислота Hoi^^Y0 ОН масс-спектр (т/г): 180; т.пл. 223-225°С; УФ-спектр. Я тах 327 нм (плечо)

6. Даукостерин Сз5НбоОб (З-О-глюкозид 17-(5-этил-6-метилгептан-2-ил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17- додекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-ола) • f' масс-спектр (т/г): 414 (М+ агликона); т.пл. 315-318°С

7. ß-ситостерин С29Н50О (17-(5-этил-6-метилгептан-2- ил)-10,13 -диметил-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-додекагидро-1Н-циклопента|а~|фенантрен-3-ол) | й Т й но'О^1 масс-спектр (m/z): М+ 414; т.пл. 136-140°С

Для цианидина-З-О-глюкозида определены значения удельного показателя поглощения в 1% растворе хлороводородной кислоты в 95% этиловом спирте при аналитической длине волны 546 нм (100±4,3) и в 0,5% спиртовом растворе аммиака при аналитической длине волны 623 нм (250±3,6), которые использовались в дальнейших исследованиях при разработке методик количественного определения.

4. Совершенствование методов контроля качества плодов и побегов черники обыкновенной

В соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» разработаны следующие методики контроля качества побегов, свежих и воздушно-сухих плодов черники обыкновенной, которые включены в проекты ФС на эти виды ЛРС.

4.1. Методики качественного анализа побегов черники обыкновенной.

Для оценки подлинности побегов также предложены методы ТСХ-анализа с использованием PCO рутина и электронной спектрометрии, которые включены в проект фармакопейной статьи «Черники обыкновенной побеги».

Условия ТСХ-анализа извлечений на 70% этиловом спирте из побегов черники обыкновенной: система этилаце-тат - безводная муравьиная кислота -вода (80:8:12), пластинку проявляютт раствором диазобензолсульфокислоты в насыщенном растворе натрия карбоната. Подлинность подтверждается наличием на пластинке пятен с Rs относительно пятна ГСО рутина 2,2-2,4 (доминирующий флавоноид - кверце-тин-З-О-Р-О-ксилопиранозид), допускается наличие других пятен (рис.9). Электронный спектр извлечения из побегов черники в области от 190 до 500 нм имеет характерные максимумы поглощения при 292±2 нм и 331±2 нм.

С целью определения возможности идентификации побегов черники при сравнении с другими близкородственными видами, проведен сравнительный фитохимический анализ побегов черники обыкновенной с морфологическими сходными видами ЛРС с использованием методов ТСХ и ВЭЖХ. Подтвержде-

О

о

I

т

Рис. 8. Схема ТСХ извлечений из листьев толокнянки, брусники и побегов черники на этиловом спирте 70% до и после фильтрования через слой алюминия оксида в системе хлороформ -спирт

этиловый 96% (6:4 об/об).

Обозначения:

1 - извлечение из листьев толокнянки до фильтрования;

2 - извлечение из листьев толокнянки после фильтрования;

3 - извлечение из листьев брусники до фильтрования;

4 - извлечение из листьев брусники после фильтрования;

5 - извлечение из побегов

черники до фильтрования;

6 - извлечение из побегов черники после фильтрования;

7 -стандартный образец арбутина.

но, что наличие пятна с относительно

пятна ГСО рутина 2,2-2,4 является диагностичным для изучаемого сырья.

Проведен ТСХ- и ВЭЖХ-анализ очищенных извлечений после фильтрования через слой алюминия оксида, необратимо связывающих полифеноль-ные соединения (рис. 8-10).

Следует отметить, что в описанных выше условиях для ВЭЖХ- и ТСХ-анализа арбутин в побегах черники обыкновенной не обнаруживается.

Рис. 9. ВЭЖХ-хроматограмма извлечения на 40% этиловом спирте из листьев толокнянки обыкновенной после фильтрования через слой алюминия оксида.

Рис. 10. ВЭЖХ-хроматограмма извлечения на 40% этиловом спирте из побегов черники обыкновенной после фильтрования через слой алюминия оксида.

4.2. Методики качественного анализа воздушно-сухих плодов черники обыкновенной.

Для идентификации сырья предложен метод ТСХ, который предусматривает получение настаиванием при комнатной температуре извлечения из сырья с использованием 95% этанола, содержащего 1% HCl, в соотношении «сырье - экстрагент» 1:5, хроматографирование в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:2) (пластинки «Сорбфил-ПТСХ-АФ-А-УФ») и обнаружение пятен при видимом свете. На хроматограмме обнаруживаются розовые пятна с величиной Rf 0,47 и 0,51 (гликозиды мальвидина), фиолетового цвета с Rf 0,36 (цианидин-3-глюкозид) и пятна синего цвета с Rf 0,20 и 0,33 (гликозиды дельфинидина) (рис. 6).

Также для качественного анализа может быть использован метод спектроскопии. Электронный спектр водно-спиртового извлечение из плодов

черники в кислой среде имеет два выраженных максимума поглощения при 282±2 нм и 545±2 нм (рис. 7).

4.3. Методики качественного анализа воздушно-сухих плодов черники обыкновенной.

Для качественного анализа воздушно-сухого сырья также предлагаются методы тонкослойной хроматографии и спектроскопии.

Условиях хроматографического анализа аналогичны условиях при анализе свежих плодов. На хроматограмме обнаруживаются розовое пятно с величиной около 0,5 (гликозид мальвидина) и пятно фиолетового цвета с величиной около 0,35 (цианидин-3-глюкозид); допускается наличие других пятен (рис. 6). Электронный спектр водно-спиртового извлечения из воздушно-сухих плодов черники в кислой среде также имеет два выраженных максимума поглощения при 282±2 нм и 545±2 нм. Однако для воздушно-сухих плодов соотношение (А546/А282) изменяется в пользу коротковолнового максимума и составляет 1,0 :0,10-^0,15.

4.4. Методика количественного определения суммы флавоноидов в побегах черники обыкновенной.

Проводят методом дифференциальной спектрометрии в присутствии ГСО рутина при аналитической длине волны 420 нм (рис. 12). Ошибка единичного определения суммы флавоноидов в побегах черники обыкновенной с доверительной вероятностью 95% составляет ±3,56% (табл. 2). В качестве нижнего предела содержания суммы флавоноидов рекомендовано значение «не менее 0,6%».

4.5. Методика количественного определения суммы антоцианов в свежих плодах черники обыкновенной.

Количественное определение проводят с использованием метода прямой спектрометрии в кислой среде при аналитической длине волны 546 нм. Оптимальные условиях для извлечения антоцианов: экстрагент - 1% раствор хлороводородной кислоты в 95% спирте этиловом, нагревание 30 мин на водяной бане, соотношение «сырье-экстрагент» - 1:50.

Ошибка единичного определения суммы антоцианов в пересчете на ци-анидин-З-О-глюкозида в плодах черники с доверительной вероятностью 95 % составляет 3,52 % (табл. 2). Нижний предел содержания суммы антоцианов рекомендован на уровне 3,5%.

4.6. Методика количественного определения суммы антоцианов в воздушно-сухих черники обыкновенной.

Для количественного определения также использовали метода прямой спектрофотометрии в кислой среде при аналитической длине волны 546 нм.

Оптимальные условиях для извлечения антоцианов: экстрагент - 1% раствор хлороводородной кислоты в 60% спирте этиловом, нагревание 60 мин на водяной бане, соотношение «сырье-экстрагент» - 1:50. Ошибка единичного определения суммы антоцианов в плодах черники с доверительной вероятностью 95% составляет 4,54% (табл. 2). По результатам анализа разных образцов нижний предел содержания предложен на уровне 3,0% в пересчете на абсолютно сухое сырье.

4.7. Методика определения суммы антоцианов в плодах черники обыкновенной (аммиачный метод)

Была исследована также возможность определения антоцианов дифференциальным методом при смещении рН в сторону щелочной реакции среды (рис. 13). Щелочную среду создавали 0,5% раствором аммиака в 95% спирте этиловом. Расчеты проводили с использованием удельного показателя поглощения цианидина-З-О-глюкозида. Содержание антоцианов в свежих плодах черники составило 0,60±0,02%, в воздушно-сухих 0,325±0,009%. Метрологические характеристики представлены в таблице 2.

180 240 290 340

Рис. 11. Электронные спектры поглощения водно-спиртового извлечения из побегов черники (1) и комплекса извлечения с раствором алюминия хлорида (2).

490 590 690

Д'1111111 15" Ш 1.1 им

Рис. 12. Электронные спектры поглощения исходного извлечения из воздушно-сухих плодов черники (1) и в 0,5% растворе аммиака в 95% спирте этиловом (2).

Таблица 2

Метрологические характеристики спектрофотометрических методик количественного определения, суммы БАС в плодах и побегах черники обыкновенной

Вид сырья, группы БАС X Б Р,% ДХ Е, %

Свежие плоды (антоцианы) 6 4,15 0,0580 95 2,45 0,14 ± 3,52

Воздушно-сухие плоды (антоцианы) 6 4,15 0,0767 95 2,45 0,18 ±4,54

Окончание таблицы 2

Вид сырья, группы БАС { X 5 Р,% 1(Р.О ДХ Е, %

Побеги (флавоноиды) 6 0,73 0,027645 95 2,45 0,026 ±3,56

Свежие плоды (антоцианы, аммиачный метод) 6 0,60 0,02160 95 2,45 0,02 ±3,33

Воздушно-сухие плоды (аммиачный метод) 6 0,325 0,00972 95 2,45 0,009 ±2,77

Разработанные методики качественного и количественного определения суммы флавоноидов в плодах и побегах черники обыкновенной включены в проекты ФС «Черники обыкновенной плоды свежие», «Черники плоды» и «Черники обыкновенной побеги», принятые на рассмотрение ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения».

5. Научное обоснование целесообразности разработки и стандартизации импортзамещающих лекарственных препаратов на основе плодов и побегов черники обыкновенной

В результате обзора имеющихся данных по состоянию рынка показана целесообразность разработки отечественных препаратов для улучшения функционального состояния сетчатки глаза на основании антоцианов плодов черники обыкновенной.

В результате предварительных исследований были подобраны оптимальные условия упаривания сока плодов черники с целью максимального сохранения антоцианов (под вакуумом при температуре + 60+2 °С).

В связи с тем, что основными действующими соединениями побегов черники обыкновенной являются флавоноиды, были подобраны условия для получения настойки (70% этиловый спирт).

Впервые изучено влияние полученных экспериментальных препаратов из плодов и побегов черники на экскреторную функцию почек. Результаты исследований показывают, что умеренным диуретическим действием обладают водные извлечения из побегов черники и препараты на основе свежих плодов черники. Возрастание диуреза, натрийуреза, калийуреза и креатининуреза через 24 ч после введения экстракта из свежих плодов черники обыкновенной было сопоставимо с действием гипотиазида в аналогичных условиях. Введение водно-спиртовых извлечений из воздушно-сухих плодов и побегов черники способствовало уменьшению диуреза в опытной группе по сравнению с контрольной. На наш взгляд, такое различие в действии экспериментальных препаратов обусловлено высоким содержанием дубильных веществ.

С учетом условий, необходимых для стабильности антоцианов, предложена схема получения таблеток из упаренного сока плодов черники прямым прессованием с использованием в качестве наполнителя микрокристаллической целлюлозы с добавлением аэросила. Предложен оригинальный состав сиропа на основе упаренного сока плодов черники с использованием в качестве корригентов сахарозы, фруктозы или сорбита в зависимости от сопутствующих заболеваний. Разработана схема получения пастилок из сока плодов черники с использованием агара.

Для стандартизации разработанных препаратов из плодов черники использован метод прямой спектрофотометрии при аналитической длине волны 546 нм в пересчете на цианидин-З-О-глюкозид. Нижний предел содержания антоцианов в одной таблетке 0,3 г - 18,0±0,2 мг; в сиропе - не менее 0,3%; в пастилках 1,7 г-не менее 35,0 мг. Препараты из побегов черники анализировали на содержание флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии с алюминия хлоридом в пересчете на рутин при длине волны 420 нм. Рекомендуемый нижний предел содержания флавоноидов в настойке - не менее 0,05% в пересчете на рутин.

выводы

1. В результате анатомо-морфологических исследований изучены листья, стебли, плоды черники обыкновенной. Получены микрофотографии диагностических признаков, которые включены в проекты фармакопейных статей «Черники плоды», «Черники плоды свежие» и «Черники обыкновенной побеги».

2. Впервые изучено анатомическое строение черешка листа черники обыкновенной, которое может иметь важное значение при морфоло-го-анатомической диагностике сырья.

3. В результате фитохимического исследования из побегов черники выделены и идентифицированы методами 'Н-ЯМР, масс-спектрометрии: кверцетин-З-О-ксилопиранозид (З-О-ксилопиранозид 3,5,7,3',4'-пен-тагидроксифлавона), кофейная кислота и даукостерин, (5-ситостерин, из которых даукостерин впервые обнаружен в побегах черники, а кверцетин-З-О-ксилопиранозид впервые выделен из черники обыкновенной, произрастающей на территории Российской Федерации.

4. Из плодов черники обыкновенной выделены и идентифицированы три соединения антоциановой природы: З-О-глюкозиды цианиди-на, мальвидина и дельфинидина. Изучены их спектральные характеристики и впервые определен удельный показатель поглощения цианидина-З-О-глюкозида в 1% растворе хлороводородной кислоты в 95% спирте этиловом и в 0,5% растворе аммиака в 95% спирте этиловом.

5. Разработаны методики качественного анализа водно-спиртовых извлечений из плодов черники обыкновенной методом тонкослойной хроматографии в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:2) и методом электронной спектрометрии по наличию максимумов поглощения при 281 ±2 и 546±2 нм.

6. Разработаны методики качественного анализа побегов черники обыкновенной методом тонкослойной хроматографии в системе этилаце-тат - безводная муравьиная кислота - вода (80:8:12) и методом электронной спектрометрии по наличию максимумов поглощения при 291+2 и 331 ±2 нм.

7. Разработана методика количественного определения суммы антоци-анов в свежих плодах черники обыкновенной методом прямой спектрометрии при аналитической длине волны 546 нм в пересчете на цианидин-З-О-глюкозид; а также методика количественного определения флавоноидов в побегах черники методом дифференциальной спектрометрии с алюминия хлоридом в пересчете на рутин при аналитической длине волны 420 нм.

8. Проведены исследования по возможности количественного определения антоцианов дифференциальной спектрометрией в щелочной среде (0,5% раствор аммиака в 95% спирте этиловом) на основании их способности к таутомерным превращениям.

9. В качестве нижнего предела содержания суммы антоцианов в сырье «Черники плоды» предложено значение «не менее 3,0%», в сырье «Черники плоды свежие» - «не менее 3,5%»; для сырья «Черники обыкновенной побеги» нижний предел содержания суммы флавоноидов предложен «не менее 0,6%».

10. На основании химико-технологических исследования разработаны состав и технология получения следующих препаратов «Черники сироп», «Черники таблетки» и «Черники пастилки», а также изучены показатели их качества.

11. В ходе фармакологических исследований было установлено, что настой и сок черники в дозе 50 мг/кг стимулируют диурез, натрийурез и креатининурез за 4 часа эксперимента, а экстракт плодов черники на 70% этаноле в дозе 50 мг/кг увеличивает почечную экскрецию воды, натрия и креатинина за 4 и 24 часа эксперимента.

12. Разработаны проекты ФС «Черники плоды», «Черники обыкновенной плоды свежие» и «Черники обыкновенной побеги», которые направлены в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» с целью включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куркин, В.А. Качественный и количественный анализ антоцианов плодов черники обыкновенной / В.А. Куркин, Т.К. Рязанова II Фармация. - 2012. -№2.-С. 10-13.

2. Куркин, В.А. Количественное определение суммы флавоноидов в побегах черники обыкновенной / В.А. Куркин, Т.К. Рязанова // Химико-фармацевтический журнал. - 2013. - Т. 47, №4. - С. 34-37.

3. Куркин, В.А. Новые подходы в области стандартизации плодов черники обыкновенной / В.А. Куркин, Т.К. Рязанова // Известия Самарского научного центра Российской Академии наук. - 2011. - Т. 13 (39), № 1 (8). — С.2010-2015.

4. Куркин, В.А. Новые подходы к комплексному использованию плодов и побегов черники обыкновенной / В.А. Куркин, Т.К. Рязанова // Известия Самарского научного центра Российской Академии наук. - 2012. - Т. 14, № 5 (3). — С. 757-761.

5. Куркин, В.А. Новые подходы к стандартизации плодов черники обыкновенной / В.А. Куркин, Т.К. Рязанова // Химия растительного сырья. - 2012. -№4.- С. 167-173.

6. Рязанова, Т.К. Фармакогностическое исследование плодов и побегов черники обыкновенной / Т.К. Рязанова // Фундаментальные исследования. -2013. - № 8 (часть 5). - С. 1136-1140.

7. Рязанова, Т.К. Оптимизация температурных условий высушивания плодов черники обыкновенной / Т.К. Рязанова // Аспирантский вестник Поволжья. - 2013. - № 1. - С. 210-213.

8. Куркин, В.А. Разработка методики определения антоцианов в лекарственном растительном сырье / В.А. Куркин, Т.К. Рязанова, А.В. Куркина, А.В. Егорова // Фармация. - 2014. - № 4. - С. 17-20.

9. Ryazanova, Т.К. Quantitative determination of total flavonoids in bilberry shoots / V.A. Kurkin, Т.К. Ryazanova // Pharmaceutical Chemistry Journal. - 2013. -Vol. 47 Issue 4 - P. 213.

10. Рязанова, Т.К. Исследование по созданию лекарственных препаратов из сока плодов черники обыкновенной / Т.К. Рязанова // Аспирантские чте-ния-2013. - Самара, 2013. - С. 195-198.

11. Рязанова, Т.К. Сравнительное фитохимическое исследование плодов и побегов черники обыкновенной и разработка подходов к их стандартизации / Т.К. Рязанова // Сборник тезисов Первой Всероссийской научно-практи-

ческой конференции молодых ученых: Проблемы разработки новых лекарственных средств. - Москва, 3-5 июня 2013 г. - С. 106.

12. Рязанова, Т.К. Актуальные вопросы стандартизации надземных органов черники обыкновенной / Т.К. Рязанова // Сборник тезисов «Всероссийская молодежная научная школа «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности». - Казань, 2012. - С. 47.

13. Рязанова, Т.К. Вопросы стандартизации плодов и побегов черники обыкновенной / Т.К. Рязанова // Тезисы IV Всероссийского научно-практического семинара молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств». - Волгоград, 2012. - С. 62-63.

14. Рязанова, Т.К. Вопросы стандартизации плодов черники обыкновенной и препаратов на их основе / Т.К. Рязанова II Материалы Всеукраинской научно-практической конференции «Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств». - Харьков, 2012. - С. 108.

15. Рязанова, Т.К. Исследование по разработке и стандартизации лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья, содержащего антоцианы / Т.К. Рязанова// Материалы докладов конкурса программы УМ.Н.И.К. - Самара, 2010. - С.36-38.

16. Рязанова, Т.К. Исследование по разработке лекарственных препаратов на основе плодов черники обыкновенной / Т.К. Рязанова // V Всероссийская (79-я Итоговая) студенческая научная конференция: сборник материалов - Самара, 2011. - С. 184.

17. Рязанова, Т.К. Фармакогностическое исследование побегов черники обыкновенной / Т.К. Рязанова // Аспирантские чтения-2012. - Самара, 2012. -С. 220-223.

18. Куркин, В.А. Перспективы создания импортозамещающих нейротроп-ных, иммуномодулирующих, антиоксидантных и гепатопротекторных фитопрепаратов / В.А. Куркин, A.B. Дубищев, Е.В. Авдеева, О.Л. Кулагин, В.Б. Браславский, Т.К. Рязанова и др.// Материалы научных трудов научно-практической конференции «Средства и методы традиционной китайской медицины в России»,- Москва, 2011. - С. 23-24.

19. Куркин, В.А. Исследование по стандартизации побегов черники обыкновенной / В.А. Куркин, Т.К. Рязанова // Сборник научных материалов II Международного конгресса «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации». - Москва, 2012. - С. 257-261.

20. Куркин, В.А. Исследование фенольных соединений побегов черники обыкновенной / В.А. Куркин, Т.К. Рязанова // Материалы VIII Международного

Симпозиума «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты». Москва, 2-5 октября 2012 г. - С. 641-645.

21. Петрухина, И.К. Изучение факторов, влияющих на выбор препаратов, используемых для улучшения функционального состояния сетчатки глаза / И.К. Петрухина, Л.В. Логинова, Т.К. Рязанова // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы: материалы XI Международной конференции, 17-18 мая 2013 г., Минск. - Минск, 2013. - С. 89-91.

22. Петрухина, И.К. Результаты маркетинговых исследований номенклатуры лекарственных средств, применяемых при заболевания глаз / И.К. Петрухина, Л.В. Логинова, Т.К. Рязанова // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы: материалы X Международной конференции, 6-7 апреля 2012 г., Минск. - Минск, 2012. - С. 435-437.

23. Рязанова, Т.К. Фитохимическое исследование плодов черники обыкновенной и разработка лекарственных препаратов на их основе / Т.К. Рязанова // Аспирантские чтения-2011. - Самара, 2011. - С. 327-331.

24. Патент 2484671РФ.МПК А23Ы/30, А231Л/212,А61К36/45 Сироп черники обыкновенной / Куркин В.А., Рязанова Т.К. - Дата поступления заявки 15.11.2011. - Опубл. 20.06.2013.

Подписано в печать 24.09.2014 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1,45 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ 1346.

Отпечатано в типографии ООО «Офорт». 443080, Самара, ул. Революционная, д. 70, литера П. Тел. 372-00-56,372-00-57,932-00-50. E-mail: ofort-samara@mail.ru