Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Исследование на доклиническом уровне иммунотропных свойств низкомолекулярных пептидов коллагена

На правах рукописи

Милешина Светлана Евгеньевна

ИССЛЕДОВАНИЕ НА ДОКЛИНИЧЕСКОМ УРОВНЕ

ИММУНОТРОПНЫХ СВОЙСТВ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ КОЛЛАГЕНА

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология 14 00 36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

003177566

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Российской Федерации

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Кандидат медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

Член-корр РАМН,

доктор медицинских наук, профессор ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет

Доктор медицинских наук, профессор ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России

Козлов Иван Генрихович Дмитриева Наталья Борисовна

Шимановский Николай Львович

Ярилин Александр Александрович

Ведущая организация:

ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН

Защита диссертации состоится » 200$ года в У/

часов на заседании диссертационного совета Д 2Ó8 072 01 при Российском государственном медицинском университете, по адресу 117997, г Москва, ул Островитянова, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета Автореферат разослан « »^2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, д м н, профессор

ПХ Джанашия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

К настоящему времени накоплено множество данных о роли иммунной системы в патогенезе многих заболеваний Иммунные нарушения приводят к утяжелению течения заболевания, его хронизации, резистентности к традиционной симптоматической терапии В связи с этим поиск новых лекарственных средств, способных корригировать иммунные нарушения приобретает на современном этапе все большую актуальность

Одним из перспективных направлений терапии иммунных нарушений является использование в качестве лекарственных препаратов имму-норегуляторных пептидов Большой интерес в этом плане представляют фрагменты гликопротеидов экстраклеточного матрикса (ЭКМ)

Коллагеновые пептиды (КП) являются низкомолекулярными продуктами ограниченного протеолиза коллагеновых белков - обязятельных компонентов ЭКМ По имеющимся в литературе данным они способны оказывать существенное влияние на функции различных видов клеток [Золотарев И А , 2006, Davis G Е , Bayless К J , 2000, Коо L Y , 2002, Luzak В , 2003, Maeshima Y , 2001, Simeon А , 2000] Что же касается влияния КП на клетки иммунной системы, то в литературе такая информация встречается редко Однако целый ряд косвенных данных позволяет предполагать наличие у КП значительного регуляторного потенциала Благодаря эндогенному происхождению, низкой видоспецифичности, малому размеру и наличию высокоспецифичных рецепторов на клетках, КП являются перспективными веществами для создания новых иммунотропных препаратов

Кроме прикладного значения, исследование свойств КП имеет и важный теоретический аспект Изучение биологических эффектов этого нового класса регуляторных агентов является актуальным для более глубокого и всестороннего понимания механизмов развития различных физиологических и патологических процессов, протекающих в организме в целом и в иммунной системе в частности

Поэтому целью данной работы явилось изучение иммунотропных и других фармакодинамических эффектов низкомолекулярных пептидов коллагена

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи

1 Получить фракцию низкомолекулярных пептидов коллагена I типа

2 Оценить действие КП на спонтанную и индуцированную различными агентами пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови человека

3 Изучить эффекты КП в отношении нейтрофилов и макрофагов миграционную активность, фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода и апоптоз

4 Исследовать влияние КП на течение острой генерализованной инфекции у мышей

5 Изучить влияние КП на плазменно-коагуляционный гемостаз

6 Исследовать действие КП на пролиферацию фибробластов человека

Научная новизна работы

В ходе работы был модернизирован метод получения препарата низкомолекулярных пептидов, являющихся аналогами продуктов воспалительной деградации коллагена Впервые было проведено комплексное тестирование фармакодинамических эффектов КП на иммунокомпе-тентных клетках человека Было выявлено, что основной мишенью для КП в иммунной системе являются макрофаги и нейтрофилы В отношении этих клеток КП оказывают провоспалительное действие, которое выражается в активации миграционных, фагоцитарных и синтетических функций лейкоцитов

Впервые было показано, что действие КП на лимфоциты человека носит модулирующий характер, зависящий от степени активации клеток Данный эффект КП проявляется только в отношении Т-лимфоцитов и не наблюдается в случае В-клеток

Впервые выявлено, что введение КП при экспериментальном перитоните у мышей увеличивает среднюю продолжительность жизни и количество выживших животных, а также снижает интенсивность процесса спайкообразования

Впервые было исследовано влияние КП на плазменно-коагуля-ционный гемостаз человека Было выявлено, что, в зависимости от концентрации, КП способны оказывать как прокоагулянтное, так и антикоагу-лянтное действие

Также было продемонстрировано, что в широком диапазоне концентраций КП вызывают усиление пролиферации фибробластов

Практическая значимость

В процессе работы был модернизирован метод получения фракции КП, позволяющий сократить время выделения и увеличить выход активных пептидов Совокупность данных, полученных о влиянии КП на иммунокомпе-тентные клетки, открывает большие возможности для их применения в качестве иммуностимулирующих препаратов Так, возможно их использование, как при острых, так и при хронических вялотекущих инфекционных заболеваниях Не исключено их применение в качестве адъювантов при вакцинации Такой эффект КП, как усиление пролиферации фибробластов, может быть использован для ускорения репаративных процессов

Данные, полученные в ходе исследования, представляют также фундаментальный интерес и позволяют начать полномасштабные исследования регуляторного влияния КП в отношении клеток, участвующих в воспалении и иммунном ответе

Основные положения, выносимые на защиту:

1 КП оказывают выраженное стимулирующее действие на все функции нейтрофилов и макрофагов периферической крови человека усиливают поглотительную и переваривающую способность фагоцитов, активиру-

ют в них продукцию свободных радикалов и увеличивают миграционную активность клеток

2 КП обладают модулирующим действием на пролиферацию активированных Т-лимфоцитов человека и не действуют на В-клетки

3 КП значительно повышают резистентность животных к стафилококковой инфекции

Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены на V Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (С -Петербург, 2003), II Международной конференции «Современные аспекты реабилитации в медицине» (Ереван, 2005), II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии (Москва, 2005), IV конференции иммунологов Урала «Актуальные проблемы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии» (Уфа, 2005), Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых «Иммунитет и аллергия от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006), VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007)

Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии, кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре фармакологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии ФНКЦ Детской гематологии, онкочогии и иммунологии Росздрава

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками, содержит 4 таблицы Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы Библиографический указатель включает 155 ссылок на литературу, из них 46 отечественных и 109 зарубежных источника

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

При проведении большинства исследований руководствовались методиками, рекомендованными для доклинических исследований новых фармакологических веществ [Хабриев Р У и др , 2005]

Объекты исследования. Для экспериментальных исследований использовали венозную кровь здоровых добровольцев, не имеющих инфекционных и аллергических заболеваний Добавление в кровь антикоагулянта осуществляли в зависимости от изучаемого объекта при оценке функций лейкоцитов использовали гепарин (50 ЕД — на 1 мл крови), при изучении активности лимфоцитов - 2,7% раствор натриевой соли ЭДТА, при исследовании действия смеси пептидов на гемостаз в качестве стабилизатора применяли 3,8% раствор цитрата натрия Объектом исследований служила как цельная кровь, так и выделенные из нее на градиенте плотности популяции клеток мононуклеарные клетки (МНК) и нейтрофилы

В работе также использовали фибробласты линии М-19 (человеческие эмбриональные диплоидные клетки) Данная линия была получена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН Культуру фибробластов поддерживали пассированием в стандартных условиях

Исследования также проводили на экспериментальных животных Эксперименты поставлены на 480 мышах-самцах линии СВА массой 20-22 г 8-10-недельного возраста В опытах использовали животных, прошедших

карантинный режим вивария РГМУ и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний Все животные содержались в одинаковых условиях на стандартном рационе вивария РГМУ Экспериментальные группы животных формировали рандомизированно по 10 мышей в каждой В контрольные и опытные группы входили мыши одного возраста, полученные из питомника одновременно, разброс по исходной массе животных составлял не более 10% Все исследования на животных проводили не менее чем в трех повторных сериях опытов, в первой половине дня Для проведения иммунологических исследований мышей выводили из опыта методом цер-викальной дислокации

Тестируемая смесь коллагеновых пептидов В настоящей работе исследовали эффекты смеси низкомолекулярных (<10 кДа) коллагеновых пептидов (КП) КП получали самостоятельно методом ферментативной деградации коллагена I типа Методика получения КП. Коллаген I типа выделяли из хвостовых сухожилий лабораторных крыс методом уксуснокислой экстракции с последующим высаливанием в градиенте хлорида натрия Затем из полученного уксуснокислого раствора формировали трехмерный экстраклеточный матрикс, путем повышения рН и ионной силы раствора Далее коллагеновый матрикс подвергали ферментативному гидролизу, используя бактериальную коллагеназу CI hystohticum, очищенную от примесей неспецифических протеаз методом гель-фильтрации на Sephadex G-100 На последнем этапе получали низкомолекулярную фракцию путем ультрафильтрации коллагенового лизата через мембраны с диаметром пор <10 кДа Определение концентрации коллагена и КП проводили спектрофото-метрически при длине волны 558 нм с помощью специфического окрашивания оксипролина реактивом Эрлиха [Light N D, 1985]

Действие КП изучали в трех диапазонах концентраций низкой (1 мкг/ мл), средних (10-100 мкг/мл) и высокой (1000 мкг/мл) При постановке всех экспериментов параллельно с опытными, вели контрольные пробы, в

которые вместо КП добавляли полный гидролизат коллагена I типа в эквивалентных объемах

Методы исследования

1 Выделение клеток из периферической крови человека Клетки выделяли в стерильных условиях градиентным методом Для получения фракции МНК использовали раствор фиколл-урографина плотностью 1,077 г/см3 [Boyum А, 1968] Выделение нейтрофилов проводили на двойном градиенте фиколл-урографина, применяя растворы плотностью 1,077 г/см3и 1,119 г/см3 [Подосинников И С и др , 1981] Для проведения опытов т vitro клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной коровьей сыворотки, 10 мМ Хепес-буфера (рН 7,2) и антибиотиков 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина

2 Определение спонтанной и индуцированной различными активаторами пролиферации лимфоцитов Оценку пролиферации клеток производили радиоизотопным методом, подсчитывая включение 3Н-тимидина в ДНК делящихся клеток Была использована концентрация МНК 0,2x106 кл/лунку Для оценки индуцированной пролиферации МНК использовали митогены — фитогемагглютинин (ФГА) и поквид (ПВ), а также моноклональные анти-CD3 антитела 1со-90 в дозах, вызывающих максимальный и субмаксимальный пролиферативный ответ лимфоцитов Для ФГА эти концентрации были 10 и 2,5 мкг/мл, для ПВ - 5 и 1 мкг/мл, а для анти-СБЗ-Ат - 2,5 и 1 мкг/мл, соответственно При определении уровня спонтанной пролиферации вместо активаторов добавляли раствор Хенкса в эквивалентном объеме

3 Определение продукции активных форм кислорода нейтрофилами и моноцитами Продукцию активных форм кислорода проводили методом люминол-зависимой хемилюминесценции (XJI) В работе оценивали спонтанную и индуцированную зимозаном XJI

4 Изучение фагоцитарной активности клеток периферической крови Количественную поглотительную активность фагоцитов изучали в цельной крови методом проточной лазерной цитометрии [Пинегин Б В , 2001],

используя в качестве агента для фагоцитоза стафилококк, меченный зеленым флуоресцентным красителем - флуоресцеин-5-изотиоционатом (ФИТЦ) Оценку поглотительной и переваривающей способности фагоцитов проводили в цельной крови, используя модификацию классического микробиологического метода [Карпищенко АИ, 1999] с последующей микроскопией мазков Исследовали такие показатели как фагоцитарный индекс, фагоцитарное число и показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ)

5 Оценка апоптоза в клетках Исследование апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов проводилось методом цитофлуориметрического определения количества ДНК с использованием дифференциального флуоресцентного красителя пропидиум йодида

6 Исследование миграции нейтрофилов и макрофагов Миграцию фагоцитов оценивали в модели in vivo на мышах по выходу клеток в брюшную полость С целью стимуляции выхода нейтрофилов и макрофагов, в брюшную полость мышей вводили КП в концентрации 1-1000 мкг/мышь Животным контрольной группы 1 вводили раствор Хенкса, контрольной группы 2 -2% раствор пептона Далее через 24 или 72 часа животных забивали, брюшную полость тщательно промывали раствором ФСБ, промывочную жидкость собирали и подсчитывали в ней количество клеток

7 Изучение влияния КП на течение острой генерализованной инфекции проводили в модели экспериментального перитонита Заболевание воспроизводили путем внутрибрюшинного введения мышам суточной культуры Staphylococcus aureus КП вводили животным однократно за 24 часа до инфицирования стафилококком (профилактическое назначение КП) или спустя 16 часов после инфицирования (лечебное назначение КП) Животным контрольных групп вводили раствор Хенкса Действие КП оценивали по разнице в показателях средней продолжительности жизни (СПЖ) и выживаемости мышей в контрольной и опытных группах на десятые сутки после инфицирования Ряд животных выводили из опыта методом цервикальной дислокации, вскрывали брюшную полость и проводили осмотр и фотосъемку

8 Исследование плазменного гемостаза Оценку плазменно-коагуля-ционного звена гемостаза проводили общепринятыми в лабораторной практике методами на автоматическом коагулометре, используя фотометрический режим измерения В работе использовали готовые наборы реактивов (Instrumentation Laboratory) В бестромбоцитарной плазме определяли показатели активированное частичное тромбопластиновое время, про-тромбиновое время, тромбиновое время, концентрацию фибриногена

9 Определение пролиферативной активности фибробластов линии М-19 Пролиферацию фибробластов оценивали радиоизотопным методом с применением 3Н-тимидина Была использована концентрация фибробластов 5х 103 кл/лунку

10 Статистическая обработка полученных результатов При постановке всех экспериментов параллельно с опытными вели контрольные пробы Характер вариабельности результатов экспериментов подчинялся законам нормального распределения Статистическую обработку результатов экспериментальных данных проводили с помощью пакета анализа данных программного обеспечения «Microsoft Excel ХР» путем расчета средней арифметической (М) и средней ошибки средней арифметической (m) Для оценки достоверности выявленных различий средних арифметических в группах использовали t-критерий Стьюдента, разницу считали достоверной при Р<0,05 Для сравнения динамики гибели животных в разных группах использовали статистический комплекс программ GraphPad-Prism for Windows (5 версия) Для оценки достоверности различий кривых выживаемости использовали log-rank тест

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Действие КП на спонтанную и активированную различными агентами пролиферацию лимфоцитов периферической крови человека.

Влияние КП на пролиферативную активность лимфоцитов изучали с помощью радиоизотопного метода, для чего выделенные из периферической кро-

ви МНК культивировали в течение 72 ч в присутствие 1-1000 мкг/мл КП, а затем сравнивали значения включений 3Н-тимидина в клетки, обработанные пептидами, и в контроле. При исследовании активированной пролиферации лимфоцитов, кроме КП в культуры добавляли стимулирующие вещества (ФГА, ПВ и моноклональные анти-СБЗ-Ат) в дозах, вызывающих максимальный и субмаксимальный пролиферативный ответ лимфоцитов. Эффект КП оценивали, сравнивая уровень пролиферации клеток в культурах, обработанных пептидами и в контроле (только активирующие агенты).

Было выявлено, что эффект КП зависит от вида активирующего агента, от концентрации пептидов, а также от уровня пролиферативной активности клеток (рис. 1.).

Рисунок 1. Влияние КП на спонтанную и индуцированную пролиферацию МНК

нестмул. ФГА макс. ФГА субмакс. Анти-CDi макс. Акта-CDi ПВмакс ПВвс'.'бмакс. клетки субмакс. концентрации

ВI мкг/мл 0 10 мкг/мл вЮОмкг/мл 01000 мкг/мл

В соответствии с полученными результатами, КП обладали следующими эффектами в отношении лимфоцитов:

1. Индуцировали дополнительное увеличение пролиферации слабости-мулированных клеток (активированных субмаксимальными дозами ФГА и анти-СБЗ-Ат). Наиболее эффективными оказались средние концентрации КП (10-100 мкг/мл): 212,0±15,3% (Р<0,05) - для ФГА-

активированных лимфоцитов и 213,2±16,8% (Р<0,05) - для анти-СОЗ-стимулированных клеток Аналогичные закономерности были получены в нестимулированных культурах МНК (149,1±9,2%, Р<0,05)

2 В случае максимальной активации лимфоцитов, эффект КП не зависел от дозы и выражался в незначительном усилении пролиферации анти-СОЗ-стимулированных (в среднем, 120,5±9,6%) и ингибировании ФГА-активированных лимфоцитов (около 77%)

3 На поквид-активированные лимфоциты КП ни в одной из исследуемых концентраций не действовали (табл 1 )

Учитывая специфичность использованных митогенов в отношении клеток иммунной системы, можно сделать вывод, что КП влияют на активацию Т-лимфоцитов (ФГА- и анти-СОЗ-стимуляция) и не действуют на В-лимфоциты (поквид-стимуляция) В связи с этим, дальнейшего исследования действия КП на гуморальный иммунный ответ мы не проводили

Таблица 1. Влияние КП на индуцированную ПВ пролиферацию МНК

Концентрация КП (мкг/мл) Эффект КП (% от контроля)

субмакс дозаПВ макс дозаПВ

1 111,8±5,8 100,8±4,3

10 95,7±3,4 97,9±5,9

100 100,3±7,8 96,3±2,8

1000 99,3±5,1 103,0±4,5

Выявленная способность КП оказывать ингибируюшее действие на пролиферативную активность Т-лимфоцитов человека (максимальные дозы ФГА) могла быть связана с индукцией апоптоза в этих клетках

Действие КП на апоптоз лимфоцитов периферической крови человека. Для изучения влияния КП на апоптоз нестимулированных лимфоцитов, выделенные из периферической крови МНК инкубировали в течение 12 ч в присутствие 1-1000 мкг/мл КП Для изучения влияния КП на

апоптоз активированных лимфоцитов, помимо КП (1 и 100 мкг/мл) в клеточные культуры вносили анти-СОЗ-Ат в дозах, вызывающих субмаксимальный и максимальный пролиферативный ответ (2,5 и 1 мкг/мл, соответственно). а инкубацию клеток проводили в течение 24 и 72 ч. Затем образцы окрашивали пропидиум-йодидом и цитофлуориметрически определяли количество суб-, ди- и тетраплоидных клеток.

Как видно из данных, представленных на рис. 2, в нестимулированных контрольных культурах (без добавления КП) через 12 ч количество апопто-зирующих клеток составило 7,8±0,6%. КП ни в одной из исследуемых концентраций не только не увеличивали число апоптозирующих клеток, но и даже незначительно, но достоверно снижали этот показатель (Р<0,05).

Рисунок 2. Уровень апоптоза в нестимулированных МНК под действием КП

н

] контроль 1 10 100 1000

(

Концентрация КП (мкг^ш)

В культурах активированных лимфоцитов КП в исследуемых концентрациях также не вызывали апоптоза даже при длительном культивировании клеток. Более того, наблюдалась некая тенденция к снижению развития апоптоза в культурах, обработанных низкими дозами КП (табл. 2.). Таким образом, можно сделать вывод, что подавление пролиферации активированных Т-лимфоцитов под действием КП не происходит в результате индукции в клетках апоптоза.

Таблица 2. Уровень апоптоза в культурах МНК, стимулированных анти-CD3-At и КП

Ahth-CD3-At

Субмаксимальные дозы Максимальные дозы

время культивирования КП (мкг/мл) % апоптоза время культивирования КП (мкг/мл) % апоптоза

0 14,2±1,8 0 10,8±1,7

24 часа 1 15,3±2,5 24 часа 1 9,9±2,8

100 14,0±1,5 100 13,2±2,5

0 28,3±2,3 0 32,4±0,7

72 часа 1 21,8±1,4* 72 часа 1 24,8±2,3*

100 31,0±0,8 100 33,1±1,2

*Р<0,05 по отношению к контролю

Усиление пролиферации слабостичулированных лимфоцитов под действием КП могло быть опосредовано непрямой стимуляцией клеток, а именно через воздействие пептидов на антигенпрезентирующие клетки С целью проверки данного предположения была проведена серия экспериментов по изучению действия КП на функциональную активность фагоцитов периферической крови

Влияние КП на фагоцитарную реакцию нейтрофилов и моноцитов периферической крови человека. В работе изучали действие КП на поглотительную и переваривающую способность фагоцитов периферической крови Количественную оценку поглотительной активности клеток исследовали методом проточной лазерной цитометрии, для чего цельную кровь инкубировали в течение 30 мин с ФИТЦ-меченными Staphylococcus aureus в присутствие КП в диапазоне концентраций 1-1000 мкг/мл, а затем определяли фагоцитарный индекс - количество флуоресцирующих (т е фагоцитировавших) клеток к общему числу нейтрофилов или моноцитов

Результаты опытов свидетельствовали о том, что КП не изменяли количества фагоцитирующих клеток (нейтрофилов и моноцитов) И в кон-

трольных (вместо КП добавляли раствор Хенкса) и в опытных образцах процент флуоресцирующих клеток составлял 80,0±4,0% - в гейте нейтро-филов и 74,3±3,6% - в гейте моноцитов Увеличение времени инкубации крови с бактериями до 3 ч в присутствие КП также не изменяло поглотительной активности лейкоцитов по сравнению с контролем (около 87,6±5,2% - в гейте нейтрофилов и 78,1±4,2% - в гейте моноцитов) Отсутствие эффекта КП на число фагоцитов, во многом, могло быть связано с несовершенством использованной методики, т к она скорее ориентирована на выявление ингибирующих воздействий, чем на обнаружение эффекта стимуляторов Поэтому далее исследование действия КП на фагоцитоз проводили классическим микроскопическим методом

Цельную гепаринизированную кровь инкубировали в течение 30 и 60 мин со Staphylococcus aureus в присутствие разных концентраций КП (1-1000 мкг/мл) или раствора Хенкса (контроль), после чего готовили мазки Мазки фиксировали, окрашивали по Романовскому-Гимзе и исследовали микроскопией в иммерсионной системе, подсчитывая фагоцитарный индекс, фагоцитарное число и показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) Данные об отсутствии влияния КП на количество фагоцитов крови, полученные при микроскопии мазков, подтвердили результаты цитофлуориметрии КП ни в одной из концентраций не изменяли фагоцитарный индекс Однако КП продемонстрировали выраженный эффект на качественные параметры фагоцитоза (рис 3) Было выявлено, что наиболее эффективной является концентрация пептидов 100 мкг/мл, при которой в несколько раз увеличивалась как поглотительная, так и переваривающая способность лейкоцитов (фагоцитарное число составляло 160,8±8,6%, Р<0,05, ПЗФ - 74,8±1,8%, Р<0,05)

Влияние КП на продукцию активных форм кислорода нейтрофи-лами и моноцитами периферической крови Одной из причин усиления бактерицидной функции фагоцитов под действием КП могла быть активация в этих клетках продукции свободных радикалов Для проверки данного предположения цельную кровь инкубировали в течение 1 ч в присутствии КП, а

Рисунок 3. Изменение фагоцитоза и

А. Действие КП на поглотительную активность клеток

профилов под действием КП

В. Действие КП на бактерицидную активность клеток

контроль! 10 1001000 Концентрация КГ! (мкг/мл)

Рисунок 4. Усиление зимозан-индуцированной хемилюминесценции лейкоцитов под действием КП

Активация ХЛ (% от контроля)

1 10 100 1000 Концентрация КП (мкг/мл)

затем измеряли спонтанную и индуцированную зимозаном хемилюминесцен-цию. В соответствии с полученными данными, эффект КП зависел от исходного состояния клеток: пептиды не влияли на нестимулированные фагоциты, но увеличивали ХЛ-ответ у предактивированных клеток (рис.4). Данный эффект КП также проявлялся только в средних концентрациях (10-100 мкг/мл),

составляя 135,7±7,1% и 124,0±6,0%, соответственно (Р<0,05) Результаты нашего исследования об активирующем действии КП на лейкоциты сопоставимы с литературными данными Отдельные исследователи продемонстрировали способность некоторых низкомолекулярных КП вызывать «оксидатив-ный взрыв» в нейтрофилах и моноцитах/макрофагах, а также индуцировать синтез протеолитических ферментов [Laskin D L, 1994]

Действие КП на развитие апоптоза нейтрофилов. Далее мы исследовали влияние КП на запрограммированную клеточную гибель нейтрофилов Оценку апоптоза проводили методом цитофлуориметрического определения количества ДНК в нейтрофилах, выделенных из периферической крови человека, используя дифференциальный краситель пропидиум йодид В соответствии с полученными результатами, ни в одной из исследованных концентраций КП не изменяли апоптоз интактных нейтрофилов (данные не показаны)

Исследование миграционной активности лейкоцитов под действием КП в модели in vivo. На следующем этапе работы, для подтверждения полученного in vitro активирующего действия КП на функции фагоцитов были выполнены исследования in vivo на мышиной модели В этих экспериментах изучалась способность КП при внутрибрюшинном введении вызывать хемотаксис нейтрофилов и макрофагов Хемотаксическую активность клеток при введении пептона или КП оценивали по индексу стимуляции (ИС), который рассчитывали по формуле ИС = А/В, где А - количество клеток при введении пептона или КП, а В - количество клеток при введении раствора Хенкса (контроль) Для оценки эффекта КП сравнивали ИС при обработке КП и при введении стандартного индуктора миграции фагоцитов - пептона

Как видно из результатов, представленных на рис 5, КП в широком диапазоне концентраций (10-1000 мкг/мышь) являются хемотаксинами для нейтрофилов и макрофагов, причем для миграции нейтрофилов оптимальной является концентрация КП 100 мкг/мышь (ИС составлял 2,4±0,2%,

Р<0,05), а для макрофагов - 1000 мкг/мышь (ИС был 2,6±0,2; Р<0,05). Следует отметить, что эффект КП на миграцию фагоцитов в брюшную полость был сравним с действием пептона, который использовался в концентрации (4 мг/мышь) в несколько раз превышающей максимальную дозу КП.

Рисунок 5. Влияние KII на миграцию фагоцитов in vivo А. Миграция нейтрофилов В. Миграция макрофагов

ИС

1жж11

пептон 1 10 100 1000

Концентрация КП (мкг/мышь)

ríl

Jü_ÜL

r^i

пептон 1 10 100 1000

Концентрация КП (мкг/мышь)

Вторым важным результатом этого фрагмента исследований явилось отсутствие изменений в выживаемости животных (3 суток) или их поведенческих реакциях даже после введения КП в самой высокой концентрации (1000 мкг/мышь).

Таким образом, можно заключить, что КП обладают преимущественной направленностью действия в отношении фагоцитирующих клеток, которая выражается в усилении всех основных их функций. Следующей нашей задачей являлось изучение эффективности КП в условиях моделирования инфекционного процесса in vivo.

Влияние КП на развитие острой генерализованной инфекции. Исследование противоинфекционного эффекта КП проводили на модели острой генерализованной инфекции - перитонита мышей, индуцированного внутрибрюшинным введением S. aureus. КП вводили в брюшную полость мышей однократно в дозе 100 мг/кг, которая наиболее эффективно активировала функции фагоцитов in vitro.

Опыты показали, что КП значительно повышали резистентность организма к инфекции. Динамика гибели мышей, построенная в виде кривых выживаемости по методу Kaplan-Meier (рис. 6.), представляет достоверность различий (Р; log-rank тест) в увеличении СПЖ и проценте выживаемости животных при использовании КП в дозе 100 мг/кг по сравнению с контролем. При однократном введении КП в лечебном режиме (через 16 часов после заражения стафилококком) выживаемость мышей повысилась до 80,0±12,6% (Р=0,0048). Введение КП в той же дозе в профилактическом режиме (за 24 часа до инфицирования) давало наибольший абсолютный процент выживаемости, равный 90,0±9,5% (Р=0,0023).

Рисунок 6. Динамика гибели мышей с перитонитом при профилактическом и лечебном назачении КП в дозе 100 мг/кг

О 2 4 в 8 10 продолжительности жизни, сутки

—контроль (раствор Хенкса)

КП за 24 часа до инфицирования

10080

40-

го-

Б:

О 2 4 6 8 10 продолжительность жизни, сутки

контроль (раствор Хенкса)

—*— КП через 16 часов после инфицирования

Таким образом, можно сделать вывод, что назначение КП как в профилактическом, так и в лечебном режиме, приводит к снижению смертности и увеличению средней продолжительности жизни мышей.

Кроме того, при вскрытии выживших животных было сделано интересное наблюдение - у мышей, получавших КП, отмечалось снижение интенсивности процесса спайкообразования. Причем лучшие показатели вы-

живаемости и уменьшения спаечного процесса были получены при профилактическом применении КП (данные не показаны)

Так как реакция воспаления всегда сопровождается изменениями в системе свертывания крови и функционировании клеток соединительной ткани, мы провели серию экспериментов, посвященных изучению влияния КП на гемостаз и пролиферацию фибробластов

Действие КП на систему гемостаза. Для исследования влияния КП на плазченно-коагуляционный гемостаз цитратную кровь инкубировали в течение 15 мин при 37°С в присутствие КП (1-1000 мкг/мл) и затем центрифугированием отделяли бестромбоцитарную плазму, в которой спек-трофотометрически определяли показатели АЧТВ, протромбиновое время, тромбиновое время, концентрацию фибриногена

Полученные результаты свидетельствуют о том, что действие КП на функционирование системы гемостаза изменялось в зависимости от их концентрации (рис 7) В низких и средних концентрациях (1-100 мкг/мл) пептиды обладали слабыми прокоагулянтными свойствами изменение параметров составляло в среднем 10% по сравнению с контролем, но было достоверным Напротив, КП в высоких дозах (1000 мкг/мл), оказывали выраженный антикоагулянтный эффект (Р<0,05) Следует, однако, отметить, что все изменения показателей плазменного гемостаза при воздействии КП колебались в пределах клинической нормы

Полученные результаты, несмотря на использование только ориентировочных методов оценки свертывания крови (АЧТВ, протромбиновое и тромбиновое время), позволяют предположить следующий механизм действия КП Одновременное и однонаправленное изменение показателей во всех трех тестах указывает на то, что КП действует на заключительный этап свертывания - превращение фибриногена в фибрин Измерение концентрации фибриногена также свидетельствует об этом В литературе встречаются данные, подтверждающие это предположение В одном из исследований было показано ингибирование полимеризации фибрина под

действием некоторых коротких фрагментов коллагена I типа [Магйпег-Ьетиз Ь А, 2003] Следует также отметить, что дозозависимый модулирующий эффект КП в отношении гемостаза хорошо укладывается в рамки известных данных о развития воспалительной реакции

Рисунок 7. Влияние КП на параметры гемостаза

Б

£ 100

■еЯ 90

10 100 Концентрация КП (мг/мл)

1000

-АЧТВ •

-Лротромбиновое время ■

-Тромбиновое время---контроль

Действие КП на пролиферативную активность фибробластов линии М-19. Не только целые коллагеновые молекулы, но и их фрагменты способны регулировать функции фибробластов [Золотарев И А , 2006; Коо L.Y , 2003, Simeon А , 2000] В данной работе мы исследовали действие суммарной фракции КП на пролиферативную активность фибробластов человека линии М-19 Для этого клетки линии М-19 засевали в низких концентрациях и после периода адаптации к ним одновременно добавляли КП в концентрациях от 1 до 1000 мкг/мл и 3Н-тимидин По окончании культивирования анализировали включение радиоактивной метки в ДНК делящихся клеток В контрольные культуры вместо КП добавляли полный гидролизат коллагена I типа Как было обнаружено, КП

во всех исследованных концентрациях ускоряют деление фибробластов (рис. 8). При этом наиболее эффективными являлись средние (10-100 мкг/мл) концентрации пептидов (132±10,1% и 150±5,3%, соответственно) (Р<0,05).

Рисунок 8. Влияние КП на пролиферацию фибробластов линии М-19

180

— 160 1

I::; м ■ _

u±tt

1 10 100 1000 Концентрация КП (мкг/мл)

Подводя итог проделанной работы можно сделать два основных заключения.

Во-первых, КП являются мощными регуляторами функций клеток, являющихся основными участниками воспалительной реакции. По широте и степени выраженности эффектов их безусловно можно отнести к группе физиологически активных пептидов и включить в подгруппу регуляторных пептидов с преимущественно иммунотропной и провоспалительной активностью.

Во-вторых, выявленные в моделях, рекомендованных для экспериментального доклинического испытания лекарственных веществ, фарма-кодинамические эффекты КП, создают предпосылки для разработки новых препаратов, предположительно иммуномодулирующего действия.

выводы

1 Коллагеновые пептиды в концентрациях 10-100 мкг/мл значительно усиливают поглотительную и бактерицидную активность лейкоцитов периферической крови человека, а также стимулированную зимозаном продукцию свободных радикалов этими клетками

2 На модели in vivo (линейные мыши) коллагеновые пептиды в широком диапазоне концентраций индуцируют хемотаксис нейтрофилов и макрофагов По степени выраженности данный эффект пептидов сравним с эффектом стандартного активатора миграции фагоцитов - пептона

3 Коллагеновые пептиды в концентрациях 1-100 мкг/мл усиливают пролиферацию МНК человека, стимулированных субмаксимальными дозами ФГА или аити-СОЗ антител (Т-лимфоциты) При максимальной стимуляции пролиферации МНК эффект пептидов зависит от природы используемого митогена Во всех исследованных концентрациях коллагеновые пептиды не оказывают влияния на пролиферацию МНК человека, стимулированных поквид-митогеном (В-лимфоциты)

4 Однократное введение КП увеличивает выживаемость и среднюю продолжительность жизни животных в модели острой генерализованной инфекции (стафилококковый перитонит мышей)

5 Коллагеновые пептиды в концентрациях 1-100 мкг/мл проявляют про-коагулянтные свойства, а в высокой концентрации (1000 мкг/мл), наоборот, оказывают антикоагулянтный эффект Все изменения показателей плазменного гемостаза при воздействии коллагеновых пептидов изменяются в пределах клинической нормы

6 Во всех исследованных концентрациях коллагеновые пептиды активируют пролиферацию эмбриональных фибробластов человека

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Davidova N V , Gorhna N К , Sharova S.E. (Mileshina SE), Cheredeev A N , Kozlov I G Method to evaluate the prolifération of activated lymphocytes in a three-dimensional collagen matrix // Russian Journal of Immunology, 2002, Vol 7 (Suppl 4), P 335-342

2 Козлов И Г , Давыдова H В , Шарова С.Е. (Милешина СЕ), Горлина H К, Чередеев А H Взаимодействие лимфомных и лейкозных клеток с коллагеновым матриксом // Аллергология и иммунология, Москва, 2003, том 4, № 2, С 133 Материалы V Юбилейного съезда иммунологов и аллергологов СНГ Санкт-Петербург, 8-11 июля 2003 г

3 Давыдова H В , Шарова С.Е. (Милешина СЕ), Жукова И Б , Дмитриева H Б , Дибирова Г О , Козлов И Г Пролиферативная активность лимфоцитов при взаимодействии с фибриллярным коллагеном 1 типа // Russian Journal of Immunology, 2004, Vol 8 (Suppl 1), P 11 Тезисы докладов Объединенного иммунологического форума Екатеринбург, 31 мая - 4 июня 2004 г

4 Шарова С.Е. (Милешина СЕ), Козлов И Г, Дмитриева H Б , Давыдова H В , Жукова И Б , Дибирова Г О , Логинова О В Миграция и пролиферация активированных лимфоцитов в трехмерном коллагеновом матриксе при различных путях активации // Аллергология и иммунология, Москва, 2005, том 6, №2, С 160 Тезисы II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии Москва, 1-3 февраля 2005 г

5 Шарова С.Е. (Милешина СЕ), Козлов И Г , Дмитриева H Б , Давыдова Н.В , Жукова И Б , Дибирова Г О , Логинова О В Фибриллярный коллаген ингибирует пролиферацию лимфоцитов, предактивированных различными агентами // Материалы II Международной конференции «Современные аспекты реабилитации в медицине» Ереван, 29 сентября - 1 октября 2005 г Труды конференции, С 256

6 Шарова С.Е. (Милешина СЕ), Козлов И Г, Дмитриева Н Б , Емельянов А Ю , Давыдова Н В , Жукова И Б Влияние коллагеновых пептидов на пролиферативную активность фибробластов // Иммунология Урала, Уфа, 2005, №1(4), С 30-31 Материалы IV конференции иммунологов Урала «Актуальные проблемы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии» Уфа, 17-19 октября, 2005 г

7 Шарова С.Е. (Милешина СЕ), Дмитриева НБ, Давыдова НВ, Емельянов А Ю , Козлов И Г Модулирующий эффект коллагеновых матрикинов на пролиферацию мононуклеарных клеток человека // Russian Journal of Immunology, 2006, Vol 9 (Suppl 3), P 131 Материалы Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии иммунодиагностика и иммунотерапия» Курск, 16-18 мая, 2006 г

8 Милешина С.Е., Дмитриева Н Б , Давыдова Н В , Козлов И Г Модулирующее влияние коллагеновых пептидов на пролиферацию лимфоцитов человека // Вестник уральской медицинской академической науки, Екатеринбург, 2006, №3-1(14), С 152-155

9 Милешина С.Е., Дмитриева Н Б , Дибирова Г О , Козлов И Г Низкомолекулярные пептиды коллагена активируют продукцию свободных радикалов лейкоцитами периферической крови человека // Российский аллергологический журнал, Москва, 2007, №3, приложение 1, С 30 Труды VIII Конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» Москва, 27 - 29 июня 2007 г

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ис - индекс стимуляции

КП - коллагеновые пептиды

мнк - мононуклеарные клетки

пв - поквид

ПЗФ — показатель завершенности фагоцитоза

спж - средняя продолжительность жизни

ФГА - фитогемагглютинин

ФИТЦ - флуоресцеин -5-изотиоционат

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

хл - хемилюминесценция

экм - экстраклеточный матрикс

Подписано в печать 30 11 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 1026 Тираж 70экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

К настоящему времени накоплено множество данных о роли иммунной системы в патогенезе многих заболеваний. Иммунные нарушения, являясь причиной или следствием патологического состояния, приводят к утяжелению течения заболевания, его хронизации, резистентности к традиционной симптоматической терапии и повышенному риску возникновения осложнений. В связи с этим поиск новых лекарственных средств, способных корригировать иммунные нарушения приобретает на современном этапе все большую актуальность.

Одним из перспективных направлений в этой области является изучение иммунорегуляторных пептидов. В медицинском арсенале уже имеются фармакологические препараты, созданные чна основе биологически активных пептидов [4, 14, 18, 22, 26, 33, 52]. Главное преимущество регу-ляторных пептидов перед химическими препаратами состоит в том, что, являясь аналогами эндогенных соединений, они реже вызывают побочные реакции, и в большинстве случаев проявляют выраженный терапевтический эффект в сравнительно небольших дозах.

Выявление регуляторного потенциала у фрагментов белков экстраклеточного матрикса (ЭКМ) - матрикинов, послужило толчком для разработки новых подходов в создании оригинальных высокоэффективных лекарственных препаратов, в частности, обладающих иммунотропным действием. В этом плане большой интерес для исследования представляют коллагеновые пептиды (КП), так как по имеющимся в литературе отрывочным данным они способны оказывать существенное влияние на функции различных видов клеток, в том числе и иммунокомпетентных [9, 63, 82, 93, 100, 112, 130]. Благодаря эндогенному происхождению, низкой ви-доспецифичности, малому размеру и наличию высокоспецифичных рецепторов на клетках, КП являются перспективными веществами для терапевтического использования.

Проблема исследования эффектов КП, кроме прикладного значения, имеет и важный теоретический аспект. Изучение биологических эффектов этого нового класса регуляторных агентов является актуальным для более глубокого и всестороннего понимания механизмов развития различных физиологических и патологических процессов, протекающих в организме в целом и в иммунной системе в частности.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования явилось изучение иммунотропных и других фармакодинамических эффектов низкомолекулярных пептидов коллагена. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Получить фракцию низкомолекулярных (<10 кДа) пептидов коллагена I типа.

2. Оценить действие КП на спонтанную и индуцированную различными агентами пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови человека.

3. Изучить эффекты КП в отношении нейтрофилов и макрофагов: миграционную активность, фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода и апоптоз.

4. Исследовать влияние КП на течение острой генерализованной инфекции у мышей.

5. Изучить влияние КП на плазменно-коагуляционный гемостаз.

6. Исследовать действие КП на пролиферацию фибробластов человека.

Научная новизна

В ходе работы был модернизирован метод получения препарата низкомолекулярных пептидов, являющихся аналогами продуктов воспалительной деградации коллагена. Впервые было проведено комплексное тестирование фармакодинамических эффектов КП на иммунокомпетентных клетках человека. Было выявлено, что основной мишенью для КП в иммунной системе являются макрофаги и нейтрофилы. В отношении этих клеток КП оказывают провоспалительное действие, которое выражается в активации миграционных, фагоцитарных и синтетических функций лейкоцитов.

Впервые было показано, что действие КП на лимфоциты человека носит модулирующий характер, зависящий от степени активации клеток. Данный эффект КП проявлялся только в отношении Т-лимфоцитов и не наблюдался в случае В-клеток.

Впервые выявлено, что введение КП при экспериментальном перитоните у мышей увеличивает среднюю продолжительность жизни и количество выживших животных, а также снижает интенсивность процесса спайко о бр аз о в ания.

Впервые было исследовано влияние КП на плазменно-коагуля-ционный гемостаз человека. Было выявлено, что, в зависимости от концентрации, КП способны оказывать как прокоагулянтное, так и антикоагу-лянтное действие.

Также было продемонстрировано, что в широком диапазоне концентраций КП вызывают усиление пролиферации фибробластов.

Практическая значимость

В процессе работы был модернизирован метод получения препарата КП, позволяющий сократить время выделения и увеличить выход активных пептидов. Совокупность данных, полученных о влиянии КП на иммуноком-петентные клетки, открывает большие возможности для их применения в качестве иммуностимулирующих препаратов. Так, возможно их использование, как при острых, так и при хронических вялотекущих инфекционных заболеваниях. Не исключено их применение в качестве адъювантов при вакцинации. Такой эффект КП, как усиление пролиферации фибробластов, может быть использован для ускорения репаративных процессов.

Данные, полученные в ходе исследования, представляют также фундаментальный интерес и позволяют начать полномасштабные исследования регуляторного влияния КП в отношении клеток, участвующих в воспалении и иммунном ответе.

Публикация и апробация работы

Материалы диссертации были доложены на V Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003), II Международной конференции «Современные аспекты реабилитации в медицине» (Ереван, 2005), II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии (Москва, 2005), IV конференции иммунологов Урала «Актуальные проблемы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии» (Уфа, 2005), Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006), VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и имму но фармакологии» (Москва, 2007).

Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии, кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре фармакологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии ФНКЦ Детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава.

выводы

1. Коллагеновые пептиды в концентрациях 10-100 мкг/мл значительно усиливают поглотительную и бактерицидную активность лейкоцитов периферической крови человека, а также стимулированную зимозаном продукцию свободных радикалов этими клетками.

2. На модели in vivo (линейные мыши) коллагеновые пептиды в широком диапазоне концентраций индуцируют хемотаксис нейтрофилов и макрофагов. По степени выраженности данный эффект пептидов сравним с эффектом стандартного активатора миграции фагоцитов - пептона.

3. Во всех исследованных концентрациях коллагеновые пептиды не оказывают влияния на пролиферацию МНК человека, стимулированных поквид-митогеном (В-лимфоциты).

4. Коллагеновые пептиды в концентрациях 1-100 мкг/мл усиливают пролиферацию МНК человека, стимулированных субмаксимальными дозами ФГА или анти-СОЗ антител (Т-лимфоциты). При максимальной стимуляции пролиферации МНК эффект пептидов зависит от природы используемого митогена.

5. Однократное введение КП увеличивает выживаемость и среднюю продолжительность жизни животных в модели острой генерализованной инфекции (стафилококковый перитонит мышей).

6. Коллагеновые пептиды в концентрациях 1-100 мкг/мл проявляют про-коагулянтные свойства, а в высокой концентрации (1000 мкг/мл), наоборот, оказывают антикоагулянтный эффект. Все изменения показателей плазменного гемостаза при воздействии коллагеновых пептидов изменяются в пределах клинической нормы.

7. Во всех исследованных концентрациях коллагеновые пептиды активируют пролиферацию эмбриональных фибробластов человека.