Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Препараты на основе иммуноактивного дипептида и его координационных соединений с ионом цинка

На правах рукописи

005048982

Бобиев Гуломкодир Муккамолович

ПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ ИММУНОАКТИВНОГО ДИПЕПТИДА И ЕГО КООРДИНАЦИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ИОНОМ ЦИНКА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

31 ЯНВ 2013

Москва, 2013 г.

005048982

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России и в Таджикском государственном педагогическом университете имени С. Айни Республики Таджикистан

Научные консультанты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Бунятян Наталья Дмитриевна

доктор медицинских наук,

профессор Меркулов Вадим Анатольевич

Официальные оппоненты:

Багирова Валерия Леонидовна - доктор фармацевтических наук, профессор, директор по науке и развитию ОАО «Новосибхимфарм»,

Чистяков Виктор Владимирович - доктор фармацевтических наук, профессор кафедры аналитической токсикологии, фармацевтической химии и фармакогнозии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Каленикова Елена Игоревна - доктор фармацевтических наук, доцент, заведующая кафедрой фармации ГУНУ факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова.

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита состоится 2013 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова» Минздравсоцразвития России по адресу: 121019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России по адресу; 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор

Н.П. Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время установлено, что нарушение функции иммунной системы организма зачастую приводит к возникновению широкого круга заболеваний. С целью профилактики таких патологий успешно используются иммуномодулирующие препараты, нередко полученные синтетическим путем. Однако, являясь чужеродными для живого организма, они могут провоцировать возникновение неблагоприятных побочных реакций (НПР). Альтернативой синтетическим средствам могут стать препараты, созданные на основе эндогенных иммуномодулирующих пептидов. В 70-х годах XX века из тимуса были получены экстракты, обладающие иммуномодулирующими свойствами (В.Г. Морозов и соавт., 2000). На основе этих экстрактов разработано несколько препаратов - тималин, тактивин и др., представляющих собой смесь большого количества пептидов, из которых были выделены индивидуальные пептиды и изучены их биологические свойства. При этом установлено, что некоторые триптофансодержащие дипептиды обладают иммуномодулирующими свойствами, в том числе Н-Ие-Тгр-ОН и Н-С1и-Тгр-ОН, на основе которого создан препарат тимоген (Яковлев Г.М. и соавт., 1990). В отличие от тимогена, дипептид Н-11е-Тгр-ОН оказывал влияние как на Т-хелперные (СБ4+), так и на Т-супрессорные (СБ8+) клетки, что позволило сделать предположение о том, что лекарственные средства, изготовленные на его основе должны обладать более широким спектром иммунологической активности. Преимущество таких препаратов состоит в том, что они не являются чужеродными организму, вследствие чего не обладают токсичностью и не оказывают НПР. Опыт применения тимогена, вилона, иммунофана и других препаратов, являющихся синтетическими пептидами, соответствующими по аминокислотной последовательности природным, подтвердил справедливость данного утверждения. Все вышеизложенное показывает актуальность разработки новых

иммуномодулирующих препаратов на основе синтетических пептидов эндогенного происхождения, обладающих иммунотропной активностью.

Малое содержание этих пептидов в организме и сложность выделения их из тимуса в чистом виде обуславливают особую актуальность разработки оптимальных методов их химического синтеза.

Известно, что в функционировании иммунной системы важную роль играют некоторые микроэлементы, наиболее значимым из которых с этой точки зрения является цинк. Роль его в клеточном и гуморальном иммунитете уже ни у кого не вызывает сомнений (Кудрин A.B. и соавт., 2000, 2007; Takahashi К., 1999; Tran C.D., 1999; Segurado М., 1999).

Установлено, что при комплексообразовании ионов различных металлов с биологически активными соединениями, в том числе иммуноактивными, происходит увеличение специфической и расширение спектра биологической активности последних. Однако до настоящего времени не был разработан ни один лекарственный препарат на основе биокоординационных соединений иммунологически активных микроэлементов и низкомолекулярных пептидов. В связи с этим, представляется актуальным изучение путей комплексообразования низкомолекулярных иммуноактивных пептидов с ионами биологически активных металлов, таких как цинк; создание на их основе иммуномодулирующих препаратов; разработка методов стандартизации и технологических схем производства.

Цель и задачи исследования: разработка методов получения иммуноактивных пептидов и их координационных соединений с ионом цинка и создание на их основе новых иммуномодулирующих препаратов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Оптимизировать пути синтеза тимопентина и его гексапептидного аналога, синтезировать потенциально иммуноактивные лизин-, серин- и тирозинсодержащие дипептиды и тирозинсодержащие тетрапептиды, изучить применимость N-карбоксиангидридного метода для синтеза дипептида изолейцил-триптофан.

2. Определить параметры стандартизации и методики анализа субстанции, стандартного образца и препарата на основе дипептида изолейцил-триптофан (тимогар) с использованием

методов спектрофотометрии, тонкослойной и

высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3. Изучить взаимодействие лизинсодержащих и триптофансодержащих дипептидов с ионом цинка с использованием методов рН-метрического и окс-редметрического титрования.

4. Изучить влияние соле- и комплексообразования на хроматографическую подвижность триптофансодержащих дипептидов.

5. Разработать условия хроматографирования методом ВЭЖХ дипептида изолейцил-триптофан и его координационных соединений с ионом цинка.

6. Изучить стабильность препаратов тимогар и тимоцин в условиях длительного хранения согласно требованияям разработанных фармакопейных статей.

7. Разработать нормативную документацию на препараты тимогар и тимоцин.

8. Провести сравнительноые фармакологические исследования тимогара и его натриевой соли, завешить доклинические и клинические исследования препаратов тимогар и тимоцин.

Научная новнзна работы. Впервые разработаны методы стандартизации иммуномодулирующих препаратов тимогар -0,01% водный раствор дипептида и тимоцин - 0,0157% водный раствор координационных соединений дипептида изолейцил-триптофан с ионом цинка; исходных фармацевтических субстанций и их стандартных образцов.

Впервые изучена возможность использования ПСА-метода для синтеза аналогов тимопентина и Ы-карбоксиангидридного метода для синтеза дипептида Н-Ие-Тгр-ОН. Экспериментально подтверждено преимущество использования активированных (пентафторфениловых) эфиров при получении

низкомолекулярных тимусных пептидов.

Получены координационные соединения лизинсодержащих и триптофансодержащих дипептидов Н-С1у-Тгр-ОН и Н-11е-Тгр-ОН с ионом Zn2+. Использование окислительной функции позволило установить состав координационных соединений + и дипептида Н-11е-Тгр-ОН. Разработаны методы стандартизации

триптофансодержащего дипептида и его координационных соединений с ионом цинка, основанные на использовании современных физико-химических методов анализа.

Установлено, что препарат тимогар является высокоэффективным при лечении нефрологических, ревматологических и пульмонологических заболеваний человека. Показана эффективность монотерапии тимогаром при лечении псориаза. Впервые показано, что тимоцин (157 мкг/мл) не обладает аллергизирующими, эмбриотоксическими и тератогенными свойствами. Отмечено сокращение срока и увеличение эффективности лечения заболеваний человека, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний при совместном применении тимоцина (157 мкг/мл) с химиотерапевтическими лекарственными средствами.

Практическая значимость результатов исследования.

Разработаны методы стандартизации новых

иммуномодулирующих препаратов тимогар, тимоцин, включенные в 5 Фармакопейных статей (ФСП 42 Tj-00001-08, 42 Tj-00002-08, ФСП 42-Tj-0001-08, ФС 42-Tj-0002-08, 42-Tj-0003-08), утвержденных Министерством Здравоохранения Республики Таджикистан. Разработанные препараты тимогар и тимоцин зарегистрированы в Республике Таджикистан (per. № 000084Т и 000085Т), препарат тимоцин также зарегистрирован в Туркмении (per. №006371) и Кыргызской Республике (КР № 7137). Препараты тимогар и тимоцин внедрены в медицинскую и ветеринарную практику. Получен 1 патент Республики Таджикистан (№ TJ 453, приоритет от 19.10.2006 г.).

Связь задач исследований с проблемным планом.

Диссертационная работа осуществлялась в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора по теме: «Разработка принципов и методов контроля различных групп биотехнологических препаратов» и планами исследований кафедры органической и биологической химии Таджикского государственного педагогического университета имени С. Айни Республики Таджикистан по теме: «Исследование низкомолекулярных иммуноактивных пептидов и их координационных соединений с биометаллами».

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» (Душанбе, 2003), третьей республиканской научной конференции биохимиков РТ «Вклад биохимиков в развитие биологической науки» (Душанбе, 2003), научно-практической конференции «Аналитик кимё ва экологиянинг долзарб муаммолари» (Самарканд, 2006), научной конференции «Проблемы клинической онкологии» (Душанбе, 2008), совместной республиканской научно-практической конференции «Перспективы развития фундаментальных медицинских наук в Таджикистане и 56-ой годичной конференции ТГМУ им. Абуали ибни Сино «Перспективы развития семейной медицины в Таджикистане» (Душанбе, 2008), международной конференции «Вакцинология-2008» (Москва, 2008), международной конференции «Состояние и перспективы развития биохимии в Таджикистане» (Душанбе, 2009), VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Душанбе, 2010), республиканской конференции «Проблемы современной координационной химии» (Душанбе, 2011), международной конференции «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств биологически активных соединений» (Душанбе, 2011), международной научно-практической конференции «Ислохоти сохаи маориф ва шаклгирии муносибатхои бозаргони» (Душанбе, 2011), на совместном заседании секции №1 и секции №2 Ученого совета Федерального государственного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России.

Личный вклад автора. Автором осуществлен выбор научного направления, сформулированы цель и задачи исследования, обоснован выбор адекватных путей их решения. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах научно-практического исследования. Автором предложены схемы синтеза изучаемых пептидов, разработана технологическая схема их производства. Автором разработана технологическая схема производства препарата тимогар, методы контроля качества препарата, изучена стабильность тимоцина в процессе длительного хранения и

установлен срок его годности. При личном участии автора проведены клинические испытания тимоцина и тимогара, подтвердившие его высокую эффективность.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 51 научная работа, в том числе одна монография и 1 патент Республики Таджикистан. 23 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимальные методы синтеза тимопентина и его гексапептидного аналога, гистидинсодержащего аналога дипептида изолейцил-триптофан, серин- и лизинсодержащих дипептидов, тирозинсодержащих тетрапептидов.

2. Результаты исследований координационных соединений лизинсодержащих и триптофансодержащих дипептидов с ионом цинка.

3. Результаты разработки методик анализа и стандартизация стандартных образцов, субстанций и лекарственных форм на основе дипептида H-Ue-Trp-OH и его координационного соединения с ионом цинка.

4. Результаты фармакологических и клинических испытаний разработанных препаратов тимогар и тимоцин, а также натриевой соли тимогара.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 345 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, списка литературы, включающего 264 источника, в том числе 87 на иностранных языках, приложения. Работа включает 37 рисунков и 49 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. В работе использовали аминокислоты L-ряда и производные аминокислот («Reanal», Венгрия) или производные аминокислот, полученные по стандартным методикам (Гершкович A.A. и соавт., 1992). Индивидуальность и степень чистоты полученных соединений проверяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на

пластинках «Silufol UV-254» («Chemapol», Чехия) и «Merck» (Германия») в следующих системах растворителей: СНС13-СН3ОН-СН3СООН, 18:2:1 (А), н-бутанол-пиридин-СН3СООН-Н20, 5:5:1:4 (Б), СНС13-СН3ОН-СН3СООН, 60:45:20 (В), этилацетат-С6Н6, 3:2 (Г), СНС13-этилацетат-СН3ОН-СН3СООН, 9:3:1:0,3 (Д), СНС13-СН3ОН-СН3СООН, 32:2:1 (Е), н-бутанол-СН3С00Н-Н20, 3:1:1 (Ж), н-бутан0л-пиридин-СН3СООН-Н2О, 30:20:6:24 (3), СН3С00Н-Н20-СН30Н-СНС13, 7:3:1:1 (И). Проявление хроматограмм проводили последовательной обработкой С12 и насыщенным раствором бензидина в 2% СН3СООН.

При каталитическом гидрировании использовали 10% палладий на активированном угле фирмы «Fluka» (Германия).

Удельное оптическое вращение определяли в СН3ОН на автоматическом цифровом поляриметре «Perkin-Elmer-241» (США), длина кюветы 1 дм.

рН-метрические и потенциометрические исследования проводили на рН-иономере MS-20 (Чехия).

Температуру плавления (не скорректирована) определяли на нагревательном столике «Boetius» (Германия).

Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре СФ-46 в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 мм.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на приборе Shimadzu LC-20 (Япония); элюирование проводили на колонке Discovery С18 (250x4,6 мм, размер частиц 5 мкм), в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и фосфатного буфера с pH 7,4 (40:60), скорость потока составляла 1 мл/мин, детектирование проводили при длинах волн 254 и 280 нм и времени элюирования 30 мин.

Для колоночной хроматографии использовали силикагель L-100/160 («Chemapol», Чехия) и сефадекс G-25 («Merck», Германия).

Аминокислотный анализ свободных пептидов (после 24-часового гидролиза в 6 н HCl при 105°С в запаянных под вакуумом ампулах) проводили на аминокислотном анализаторе «JLC-GAN» («JEOL», Япония). Гидролиз триптофансодержащих пептидов осуществляли 3 М раствором п-толуолсульфокислоты в течение 48 ч при 110°С.

Растворы веществ упаривали под вакуумом при температуре не выше 40°С.

При стандартизации препаратов использовали методы и методики, включенные в соответствующие статьи Государственной фармакопеи РФ XI и XII изданий.

Фармакологические исследования полученных соединений и разработанных препаратов изучали на белых мышах, кроликах, овцах, телятах 2-6-месячного возраста и взрослом крупном рогатом скоте согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (под редакцией Р.У. Хабриева. М., 2005 г.)

Препараты тимоген, тимогар, тимоцин вводили внутримышечно или подкожно в зависимости от поставленного опыта.

В опытах использовали ассоциированную вакцину против рота-, коронавирусных энтеритов и колибактериоза телят, изготовленную Всероссийским НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ), в дозе 5 мл на голову, живую культуральную противотейлериозную вакцину ВИЭВ в дозе 1 мл (0,1 млн живых клеток). Для обнаружения антител к рота-, коронавирусу и E.coli применяли, соответственно, иммуноферментный анализ (ИФА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и агглютинации (РА) (Соколова H.J1. и соавт., 1987), противотейлерийных антител - реакцию длительного связывания комплемента (РДСК) и ИФА.

Бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови животных определяли согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (под редакцией Р.У. Хабриева. М., 2005 г.), биохимические показатели крови - «Методическим указаниям по применению унифицированных биохимических методов исследований крови, мочи и молока в ветеринарных лабораториях» (Москва, 1991).

Получение низкомолекулярных тимусных пептидов Оптимизация условий синтеза аналогов тимонентина

Ранее (Бобиев Г.М., 2000) при синтезе тимопентина путем ступенчатого наращивания пептидной цепи методом

активированных (1\Г-оксисукцинимидных и п-нитрофениловых) эфиров общий выход свободного пентапептида составил 30,8%. Для повышения общего выхода тимопентина был проведен его новый синтез аналогичным путем, но с использованием в качестве активированных пентафторфениловых эфиров, получаемых с помощью дипентафторфенилкарбоната. Общий выход тимопентина, полученного по этой схеме, составил 39,8%.

При синтезе гексапептидного аналога тимопентина Н-А^-Ьуз-Азр-Уа1-Туг-А^-ОН методом активированных эфиров путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-конца, общий выход гексапептида составил 28,2% (Бобиев Г.М., 2000).

Для повышения общего выхода гексапептида был использован ПСА-метод, заключающийся в последовательном наращивании пептидной цепи методом смешанных ангидридов без промежуточного выделения и очистки пептида при использовании на каждой стадии конденсации избытка ацилирующего агента - смешанного ангидрида Ы-защищенной аминокислоты. В качестве временной КГ-защитной группы использовали трет-бутилоксикарбонильную группу, которую удаляли обработкой НС1 в этилацетате. Эта замена позволила избежать механических потерь целевого продукта при отфильтровывании катализатора на каждой стадии конденсации, что отмечалось при синтезе методом активированных эфиров.

При синтезе с использованием ПСА-метода общий выход составил 25,3%. В этом случае применение ПСА-метода и изменение выбора защитных групп не привело к повышению общего выхода гексапептида. Это, вероятно, связано с использованием нитрогруппы для защиты гуанидиновой группы. Вследствие этого, для синтеза гексапептидного аналога тимопентина оптимальным является ступенчатое наращивание пептидной цепи методом активированных эфиров.

После этого по аналогичной схеме ПСА-методом был синтезирован тимопентин с общим выходом 48,3%, тогда как при синтезе методом активированных эфиров - 39,8%. В этом случае применение ПСА-метода оказалось более выгодным.

Следовательно, оптимальными методами для синтеза тимопентина и его аналогов является ступенчатое наращивание пептидной цепи методами активированных эфиров и смешанных ангидридов.

Синтез трипептидного аналога дипептида изолейцил-триптофан

Известно, что гистидин способствует защите мембранных рецепторов и клеточных мембран от неблагоприятных факторов окружающей среды путем нейтрализации избыточных концентраций протонов, ионов металлов переменной валентности и свободных радикалов (Морозов В.Г. и др., 2000). Поэтому было предположено, что введение остатка гистидина на 1^-конец иммунологически активного дипептида изолейцил-триптофан будет способствовать повышению его специфической активности.

Для проверки этого предположения нами был синтезирован гистидинсодержащий аналог иммуноактивного триптофан-содержащего дипептида - трипептид гистидил-изолейцил-триптофан.

Синтез проводили ступенчатым наращиванием пептидной цепи начиная с С-конца методом активированных эфиров с использованием в качестве последних п-нитрофениловых, полученных карбодиимидным методом с использованием в качестве конденсирующего реагента дициклогексилкарбоди-имида.

Общий выход конечного трипептида гистидил-изолейцил-триптофан составил 44%, что позволяет считать метод активированных эфиров одним из оптимальных для синтеза гистидин- и триптофансодержащих пептидов.

Также была изучена возможность применения М-карбоксиангидридного метода для синтеза дипептида изолейцил-триптофан. При этом в реакцию образования М-карбоксиангидрида вводили свободный изолейцин. Свободный дипептид очищали перекристаллизацией из воды. Общий выход свободного дипептида составил 54,7%. Полученный дипептид был охарактеризован данными ТСХ, ВЭЖХ, аминокислотного анализа и масс-спектроскопии (рис.1).

Синтез тирозинсодержащих тетрапептидов

Установлено, что некоторые низкомолекулярные иммуноактивные пептиды, являющиеся по биологическим функциям тимомиметиками, обладают также и нейротропной активностью (Ветлугина Т.П., 2000; Найденова Н. и др., 2001; Козловская Г.В. и др., 2005, 189).

Display Report

«"Иг»»« «OUHviD» ШЙЯ12 1 22 Л

Наг* D °<4г.»'4'.>! MS I o( )U_ 'Mj "»

fc r-4 i S.a.?% Ti Cw»<a im»«

Рис.1. Масс-спектр дипептида изолейцил-триптофан.

Поэтому весьма вероятным является наличие иммунотропной активности у низкомолекулярный нейротропных пептидов. Одним из таких нейропептидов является дерморфин, представляющий собой амид гексапептида с последовательностью D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2

(Коршунова Г. А., Сумбатян Н.В., 1989). Сообщалось о применении аналога дерморфина при лечении хронических воспалительных заболеваниях легких (Гусева O.E., 2010). Установлено, что наиболее важными аминокислотными остатками в молекуле дерморфина являются Туг и Phe (Kreil G., 1994). Также известно, что тирозин входит в состав многих биологически активных пептидов, в том числе и обладающих нейро- и иммунотропной активностью (Мясоедов Н.Ф., 2005). Поэтому было решено синтезировать тирозинсодержащие пептиды H-Tyr-Lys-Phe-Gly-OH и H-Tyr-Tyr-Pro-Ser-NH2, являющиеся модифицированными фрагментами дерморфина с целью изучения их иммуностимулирующей активности.

Тетрапептид H-Tyr-Lys-Phe-Gly-OH был синтезирован методом активированных эфиров путем ступенчатого

наращивания пептидной цепи начиная с С-конца. Общий выход тетрапептида в этом случае составил 59%.

Синтез потенциально иммуноактивных дипептидов

Поскольку лизин входит в состав активного центра тимопоэтина, дипептид Н-Ьуэ-01и-0Н стимулирует экспрессию рецепторов тимоцитов, обработанных трипсином и оказывает выраженное стимулирующее воздействие на экспрессию С04+ рецепторов лимфоцитов крови (Морозов В.Г. и др., 2000), аргинин обладает иммунологической активностью был синтезирован ряд лизинсодержащих дипептидов с целью изучения их иммунологической активности.

Дипептиды Н-Рго-Ьуэ-ОН, Н-Ьуз-Ъуэ-ОН, Н-Ьуэ-^у-ОН, Н-А1а-Ьуз-ОН, Н-А1а-8ег-ОН были синтезированы методом смешанных ангидридов с использованием в качестве конденсирующего реагента изобутилхлорформиата.

В качестве временной №-защитной группы использовали трет-бутилоксикарбонильную группу, только при синтезе дипептида Н-А1а-8ег-ОН для этой цели была использована бензилоксикарбонильная группа.

е-Аминогруппу лизина защищали бензилоксикарбонильной группой, карбоксильную группу С-концевой аминокислоты -сложноэфирной метальной группой. Трет-бутилоксикарбонильную группу снимали действием НС1 в этилацетате, сложноэфирную метальную группу снимали действием гидроксида натрия, карбобензоксигруппу - каталитическим гидрированием в присутствии 5%-ного палладия на активированном угле. Дипептиды Н-Авп-Туг-ОН и Н-А^-Ьуэ-ОН синтезировали методом активированных (п-нитрофениловых) эфиров. Выбор защитных групп и методов удаления был таким же, как и в предыдущем случае. Отличительным являлось использование нитрогруппы для защиты гуанидиновой группы аргинина и использование солеобразования для защиты карбоксильной группы остатка лизина. Нитрогруппу в конце синтеза удаляли каталитическим гидрированием. При синтезе трипептида Н-Ак-Ьув-Ьуз-ОН использовали такие же защитные группы и методы их удаления, что и при синтезе дипептидов. Трипептид синтезировали методом смешанных ангидридов путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-конца.

Резюмируя проведенные исследования по синтезу низкомолекулярных иммуноактивных пептидов можно заключить, что из всех изученных методов синтеза пептидов, применение метода активированных эфиров является оптимальным при использовании тактики максимальной защиты, что позволяет повысить выход пептидов на стадиях конденсации и снизить механические потери при очистке конечного продукта. Однако синтез каждого пептида требует индивидуального подхода к выбору защитных групп и активированных эфиров.

Химико-фармацевтическое исследование синтезированных пептидов Изучение параметров стандартизации

Перед проведением биологических исследований стояла задача проведения химико-фармацевтическох исследований синтезированных пептидов. Физико-химические константы синтезированных свободных пептидов приведены в таблице 1.

Таблица 1

Физико-химические константы синтезированных свободных пептидов

№ Пептид Т.пл. Яг

А Е Ж 3 И

1 Н-ШБ-Пе-Тгр-ОН аморфн 0,17 0,37 0,34 -21,3

2 Н-Туг-ЬуБ-РЬе-ау-ОН аморфн 0,06 0,59 0,71 -34,5

3 Н-Туг-Туг-Рго-Зег-ИНг аморфн 0,04 0,52 0,63 0,52 -14,5

4 Н-11е-Тгр-ОН аморфн 0,55 0,88 -21,4

5 Н-Рго-Ьуэ-ОН аморфн 0,05 0,64 0,57 0,69 0,53 -5,9

6 Н-Ьуз-Ьуэ-ОН аморфн 0,07 0,72 0,49 0,54 0,43 -18,6

7 П-Ьув-СЯу-ОП аморфн 0,1 0,76 0,71 0,81 0,67 -9,3

8 Н-Авп-Туг-ОН аморфн 0,06 0,61 0,55 0,7 0,64 -16,1

9 Н-Агй-Ьуз-ОН аморфн 0,04 0,74 0,66 0,81 0,77 -27,3

10 Н-Ак-ЬуБ-ОН аморфн 0,08 0,84 0,78 0,77 0,69 -20,1

11 Н-А1а-8ег-ОН аморфн 0,12 0,88 0,75 0,81 0,71 -19,4

12 Н-А1а-Ьу5-Ьуз-ОН аморфн 0,06 0,74 0,63 0,73 0,67 -22,4

По описанию все синтезированные пептиды, кроме триптофансодержащих, являются белыми порошкообразными веществами. Триптофансодержащие пептиды являются белыми или имеют желтоватый оттенок.

Часто в качестве одного из параметров подлинности препаратов органического происхождения используют

температуру плавления. Анализ некоторых фармакопейных статей пептидных препаратов (ФСП 42-4076-08. Тимоген натрий. Субстанция; ФС 42-0001-07. Тимодепрессин. Образец стандартный; ФСП 42-0011007. Тимодепрессин, субстанция) показал, что в них температура плавления не используется как фармацевтический показатель.

В нашем случае температурный интервал плавления пептидов являлся высоким и растянутым на несколько градусов, что свидетельствовало об их аморфном характере. Кроме того, некоторые пептиды плавились с разложением. Поэтому было решено не использовать температуру плавления при стандартизации полученных пептидов.

С точки зрения применения УФ-спектрофотометрии для стандартизации пептидов по показателям подлинность и количественное содержание, полученные пептиды разделяются на две группы - пептиды, содержащие ароматические аминокислоты (Н-Шэ-Не-Тгр-ОН, Н-Туг-Ьуз-РЬе-01у-0Н, Н-Туг-Туг-Рго-Бег-КНг, Н-Ие-Тгр-ОН, Н-Авп-Туг-ОН) и пептиды - их не содержащие (Н-Рго-Ьуз-ОН, Н-Ьуз-Ьуэ-ОН, Н-Ьуз-Иу-ОН, Н-Агд-Ьув-ОН, Н-Ак-Ьув-ОН, Н-Ак-Бег-ОН, Н-А^-Ьув-Ьув-ОН). В первом случае УФ-спектрофотометрию можно использовать при их стандартизации, во втором — нет, так как составляющие их аминокислоты не обладают поглощением в УФ-области.

Анализ УФ-спектров ароматических аминокислот и содержащих их пептидов показал, что спектр поглощения пептида определяется спектром поглощения входящей в состав пептида ароматической аминокислоты. Для примера на рис.2 приведены УФ-спектры ароматических аминокислот триптофана и тирозина и дипептидов изолейцил-триптофан и аспарагинил-тирозин. Как видно из рис.2, максимумы поглощения аминокислот и содержащих их дипептидов отличаются на 1-2 нм, что соответствует ОФС 42-0042-07 «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» (ГФ РФ XII издание) согласно которой отклонение в длинах волн максимума поглощения не должно превышать ±2 нм. Наблюдается отличие только по величине удельного показателя поглощения, который для аминокислот выше, чем для содержащих их дипептидов. Для примера в таблице 2 приведены полученные значения удельного

показателя поглощения для некоторых синтезированных дипептидов.

1.2 1.1 1

0.9 0.3 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 О

220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 .....Тгр -Н-Н<-Тгр-ОН

1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 О

220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 ----Туг -Н-А5П-Туг-ОН

Рис.2. УФ-спектры: А - триптофана и дипептида изолейцил-триптофан и Б - тирозина и дипептида аспарагинил-тирозин

Таблица 2

Величина показателя удельного поглощения для ароматических аминокислот и некоторых

Соединение р1см 111%

Триптофан 254,9 при 278±2 нм

Изолейцил-триптофана 100 при 278±2 нм

Гамма-глутамил-триптофан (ФС 42-0001-07) 142 при 279±2 нм

Тирозин 74,03 при 275±2 нм

Аспарагинил-тирозин 45,9 при 275±2 нм

Таким образом, положение максимума поглощения на УФ-спектре и величину оптической плотности можно использовать для идентификации пептидов, содержащих ароматические

аминокислоты, а по величине оптической плотности при одинаковой процентной концентрации веществ, можно отличить аминокислоты от пептидов. Также по величине оптической плотности можно проводить количественное определение пептидов.

При идентификации и определении подлинности часто используется тонкослойная хроматография. Как видно из таблицы 1, все пептиды отличаются по значениям в различных системах растворителей. Поэтому в нашем случае можно использовать тонкослойную хроматографию при определении подлинности пептидов.

Поскольку хроматографические пластинки различных производителей отличаются по своим характеристикам, необходимо использовать сравнение со стандартным образцом.

На примере полученных дипептидов изучили возможность использования их кислотно-основных свойств для их качественного определения. Для этих целей методом рН-метрического титрования определили константы кислотной диссоциации синтезированных дипептидов. Полученные значения приведены в таблице 3.

Таблица 3

рК констант кислотной диссоциации

синтезированных дипептидов _

Дипептид рК, рК2 рК3

Н-Рго-Ьув-ОН 2,24 9,2 10,63

Н-Ьуз-Ьуэ-ОН 2,17 9,17 10,67

Н-ЬуБ-ОІу-ОН 2,38 9,21 10,59

Н-АІа-Ьуз-ОН 2,27 9,19 10,71

Н-Аэл-Туг-ОН 2,02 10,28

Н-Агё-Ьув-ОН 2,21 10,53

Н-А1а-8ег-ОН 2,21 9,09

Н-Ие-Тгр-ОН 5,13 10,84

Н-вІу-Тф-ОН 3,21 9,08

Для примера на рис.3 приведены кривые титрования дипептида изолейцил-триптофан.

Рис.3. Кривые тирования дипептида изолейцил-триптофан 0,1 н раствором НС1 (А) и 0,1 н раствором ЫаОН (Б).

Как видно из таблицы 3, отмечаются незначительные различия в значениях рК функциональных групп пептидов. Это объясняется близостью значений рК функциональных групп аминокислот, входящих в состав пептида. Вследствие этого эти величины нельзя использовать для идентификации синтезированных дипептидов, а для характеристики пептидов можно также использовать величину рН водного раствора.

Поскольку все пептиды являются слабыми кислотами и слабыми основаниями, в растворе находятся в цвиттер-ионной форме и значения р1 находятся в пределах, допускаемых для дистиллированной воды (5,0-6,8), а при использовании пептидов в виде растворов для инъекций концентрация в большинстве случаев составляет менее 0,1%, влияние диссоциации функциональных групп пептидов на рН воды является минимальным, в качестве одного из параметров стандартизации можно использовать значение рН водного раствора. В нашем случае при концентрации пептидов 0,01% оно находилось в пределах 5,5-6,8.

Таким образом, проведенное химико-фармацевтическое исследование синтезированных пептидов позволило выбрать показатели описание, поглощение в УФ-области, значение при использовании ТСХ и рН водного раствора как базовые для стандартизации пептидов при использовании их в качестве лекарственных препаратов.

Изучение реакций разложения

Еще одним важным аспектом фармацевтических исследований является изучение их стабильности. По мнению многих авторов (Aboofazeli R., 2003; Ezzat К. et al., 2012; Jorgensen L. et al., 2009; Ruzza P., 2010) пептидные препараты отличаются от обычных большим количеством реакций, приводящих к разложению пептида и, как следствие этого, потере биологической активности. К таким реакциям относятся окисление, гидролиз, деамидирование, р-элиминация, рацемизация и реакция дисульфидного обмена.

Деамидированию подвергаются остатки аспарагина и глутамина, спонтанной фрагментации - аспарагин-содержащие пептиды, наиболее чувствительными к металл-катализируемому окислению, являются His, Arg, Lys, Pro, Met, и Cys, к фотоокислению - His, Trp, Met, и Cys, аминокислотами, наиболее часто подвергающимися реакциям Р-элиминации, являются Cys, Ser, Thr, Phe и Lys (Frokjaer S., Hovgaard L., 2000).

Вследствие вышеизложенного перед разработкой фармацевтической композиции был проведен анализ синтезированных пептидов с точки зрения возможного протекания реакций разложения. В таблице 4 приведены возможные реакции разложения, в которых могут участвовать синтезированные пептиды.

Наименее подверженным различным превращениям является дипептид H-Pro-Lys-OH по следующим причинам: во-первых, остаток пролина находится в первом положении, что не допускает разрушения этого дипептида через образование дикетопиперазинов (этой реакции подвергаются остатки пролина, находящиеся во втором положении от N-конца цепи, во-вторых, остаток лизина, находясь во втором положении, не может вступать в реакцию Р-элиминирования, поскольку отсутствует третья аминокислота, а прохождение этой реакции по пептидной связи исключено вследствие того, что N-концевым остатком является пролин, в-третьих, в составе дипептида отсутствуют аминокислоты, способные подвергаться реакциям окисления.

Таблица 4

Возможные реакции разложения с участием синтезированных пептидов_

Пептид Реакции разложения

Н-Ие-Тгр-ОН металл-катализируемое окисление, фотоокисление

Н-ШБ-Ие-Тгр-ОН металл-катализируемое окисление, фотоокисление

Н-Рго-Ьув-ОН

Н-Ьув-Ьуя-ОН Р-элиминирование

н-ьув-ау-он Р-элиминирование

Н-АЬ-Ьув-ОН Р-элиминирование

Н-Ак-Бег-ОН Р-элиминирование

Н-Авп-Туг-ОН деамидирование

Н-А^-Ьув-ОН металл-катализируемое окисление, Р-элиминирование

Н-Ак-Ьув-Ьув-ОН Р-элиминирование

Н-Туг-Ьуз-РЬе-^у-ОН металл-катализируемое окисление, фотоокисление

Н-Тут-Туг-Рго- Б ег-МН2 металл-катализируемое окисление, фотоокисление

Результатом реакций Р-элиминирования может являться рацемизация пептида, которую можно оценить по потере им оптической активности или образование на месте аминокислоты, вступившей в эту реакцию остатка дегидроаланина и выхода в раствор остатка боковой функциональной группы в случае других аминокислот, что можно обнаружить с помощью хроматографических методов. Поскольку реакция Р-элиминирования начинается с атаки а-углеродного атома гидроксид-ионом, то снижение количества последних путем поддержания рН в пределах 5-7 максимально снизит возможность протекания этой реакции. Поэтому для изучения возможного протекания реакций разложения в синтезированных пептидах использовали водные растворы.

Пептиды содержащие аминокислоты, чувствительные к процессам окисления, Н-11е-Тгр-ОН, Н-Шэ-Пе-Тгр-ОН, Н-Туг-Ьуз-РЬе-С1у-ОН, Н-Туг-Туг-Рго-Зег-ЫНг, могут вступать в реакции окисления. Поскольку металл-катализируемое окисление протекает при наличии в растворе ионов переходных металлов, то растворение пептидов в воде для инъекций исключит

возможность протекания этих реакций. Реакции фотоокисления происходят только после поглощения молекулой пептида кванта энергии. Все пептиды и белки поглощают только в УФ-области. Поэтому предохраняя водные растворы пептидов от УФ-облучения можно свести к минимуму возможность протекания реакций фотоокисления. Продукты фотоокисления можно определить в растворе по изменению УФ-спектра пептида. Например, остаток триптофана при фотоокислении переходит в кинуренин (Frokjaer S., Hovgaard L., 2000), максимумы поглощения которого находятся при 230 нм (е = 18900), 257 нм (s = 7500) и 360 нм (е = 4500) и отличаются от максимумов поглощения триптофана (при 218 нм (е = 33500), 278 нм (в = 5550) и 287,5 нм (е = 4550)) (Досон Р. И др., 1991). Остаток тирозина поглощает при 295 нм (s = 4160) в 0,04 М НС1, при 227 нм (е = 48560) и 325 нм (е = 6210) в разбавленном NaOH (Досон Р. И др., 1991).

При изучении возможности протекания побочных реакций 0,01 М растворы пептидов в воде для инъекций хранили при 25 °С и 80°С в стеклянных герметически закрытых флаконах в течение 10 суток. Через 10 суток определяли удельное оптическое вращение пептидов и снимали их УФ-спектры. Результаты исследования приведены в таблице 5.

Таким образом, пептиды в водных растворах при хранении в стеклянных флаконах практически не подвергаются реакциям Р-элиминирования и фотоокисления. Исключение составили глицин- и серинсодержащие дипептиды. Предложить объяснение этого факта можно исходя из закономерности, обнаруженной (Patel К., Borchardt R.T., 1990; Stephenson R.C, Clarke S., 1989) для реакции деамидирования аспарагинсодержащих пептидов. При определение скорости деамидирования серий Val-Tyr-Pro-Asn-Z-Ala, в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.4) при 37°С было показано следующее: период полуреакции при Z=Gly составил 1.5 дня, при Z=Ser - 6.8 дней, при Z=Ala - 20.2 дней, при Z=Leu - 70 дней и при Z=Val - 106 дней. Увеличение пространственного объема С-концевого остатка у Asn понижает скорость деамидирования. Вероятно, и в нашем случае, это связано с тем, что вторые аминокислотные остатки не содержат объемных боковых радикалов, не создающих стерических затруднений для атаки гидроксил-ионом.

Таблица 5

Изменение физико-химических характеристик пептидов при хранении при различных температурах

Пептид

Хранение при 25°С

снижение [аЬ20 в % от

исходного

Снижение оптической плотности в % от исходной*

Хранение при 80°С

снижение [а]и2° в % от

исходного

Снижение оптической плотности в % от исходной*

Н-11е-Тгр-ОН

о

о

0,01

Н-НІ5-І1е-Тгр-ОН

0,02

Н-Рго-ЬуБ-ОН

_**

Н-Ьув-Ьуз-ОН

_**

Н-Ьу5-01у-0Н

1,0

_**

20

_**

Н-АІа-Ьуз-ОН

_**

Н-А1а-8ег-ОН

0,2

_**

Н-Аяп-Туг-ОН

_**

Н-Аг|-Ьу5-ОН

_**

_**

11-АІа-Ьув-Ьуя-ОН

_**

Н-Туг-Ьу8-РЬе-С1у-

ОН_

Н-Туг-Туг-Рго- Б ег-ИН2

0,02 0,02

* - определялось при 278 нм для триптофансодержащих пептидов и при 325 нм в щелочной среде для тирозинсодержащих пептидов.

** _ УФ-спектр не снимался, так как пептид не обладает собственным поглощением в УФ-области.

Несмотря на то, что при хранении в стеклянных флаконах триптофансодержащие пептиды оказались достаточно стабильными была изучена стабильность дипептида изолейцил-триптофан при хранении в стеклянных ампулах светлого и темного стекла в условиях длительного хранения в течение 2 лет. Результаты изучения показали, что при хранении в ампулах светлого стекла снижение концентрации дипептида, оцениваемой по поглощению при 278±2 нм составило 2%, при хранении в ампулах темного стекла - 0,6%.

Таким образом, проведенные исследования позволили определить оптимальные компоненты для фармацевтических композиций на основе синтезированных дипептидов:

использование водных растворов и хранение в стеклянной первичной упаковке темного стекла.

Иммуностимулирующая активность синтезированных пептидов Активность синтезированных пептидов была изучена in vivo, по усилению антителообразования при совместном применении с противотейлериозной вакциной. Полученные результаты приведены в таблице 6.

Таблица 6

Иммунологическая активность синтезированных пептидов

Формула дипептида Титр Активность

противотеилерииных относительно

антител тимогара

Н-11е-Тгр-ОН 1 1600 100,0

H-His-Ile-Trp-OH 1 1200 50,0

H-Pro-Lys-OH 1 800 0

H-Lys-Lys-OH 1 800 0

H-Lys-Gly-OH 1 800 0

H-Ala-Lys-OH, 1 800 0

H-Ala-Ser-OH 1 800 0

H-Asn-Tyr-OH 1 800 0

H-Arg-Lys-OH 1 1000 25

H-Ala-Lys-Lys-OH 1 800 0

H-Tyr-Lys-Phe-Gly-OH 1 800 0

H-Tyr-Tyr-Pro-Ser-NH2 1 800 0

Как показывают полученные результаты, наиболее активным является дипептид изолейцил-триптофан, вследствие чего он является наиболее перспективным для разработки на его основе иммуностимулирующих лекарственных препаратов.

Стандартизация стандартного образца и субстанции дипептида Н-11е-Тгр-ОН

Выбраны параметры стандартизации и методики анализа стандартного образца и фармацевтической субстанции дипептида Н-11е-Тгр-ОН. Общие параметры стандартизации приведены в таблице 7. Отличительными параметрами для стандартного образца были такие как подлинность и удельный показатель поглощения.

Таблица 7

Общие параметры стандартизации стандартного образца и фармацевтической субстанции

дипептида изоле 1цил-триптофана

Параметр Требования по НД

Описание Порошок белого, желтоватого или кремового цвета без запаха

Растворимость (ГФ XII, ОФС 42-0049-07) Растворим в воде, очень мало растворим в спирте 95%, практически нерастворим в хлороформе

Прозрачность раствора (ГФ XII, ОФС 42-0051-07) 0,01%-ный раствор препарата должен быть прозрачным

Цветность раствора (ГФ XII, ОФС 42-0048-07) 0,01%-ный раствор препарата должен быть бесцветным

рН (ГФ XII, ОФС 42-0048-07) 5,0-6,8 для 0,01%-ного раствора

Посторонние примеси (ВЭЖХ) Содержание любой единичной примеси не более 0,9%, суммарное содержание примесей не более 2,0%

Потеря в массе при высушивании (ГФ XI, вып.1, с.176) Не более 6,0%

Подлинность стандартного образца дипептида предложено устанавливать по УФ-спектру 0,01%-ного раствора в воде, имеющего в области 220-350 нм максимум поглощения при 280±2 нм и плечо при 286±2 нм (рис.4). Удельный показатель поглощения при 280±2 нм должен быть в пределах 96-104.

Для подтверждения подлинности дипептида изолейцил-триптофан как фармацевтической субстанции использовали УФ-спектрофотометрию, тонкослойную и высокоэффективную жидкостную хроматографию.

УФ-спектры поглощения испытуемого раствора и раствора стандартного образца изолейцил-триптофана, приготовленные для количественного определения, в области длин волн от 220 до 350 нм должны совпадать и иметь максимумы при одной и той же длине волны (рис.4).

Длина волны, нм

Рис.4. УФ-спектр дипептида Н-Ие-Тф-ОН (0,01% раствор в воде)

Для установления подлинности субстанции дипептида Н-11е-Тф-ОН методом ТСХ (при сравнении со стандартным образцом) были изучены две хроматографические системы, в которых пептид обладает хорошей хроматографической подвижностью: А - н-бутан0л-пиридин-СН3С00Н-Н20 (30:20:6:24) и Б -CH3COOH-H2O-CH3OH-CHCI3 (7:3:1:1). На хроматограмме пятно субстанции должно соответствовать пятну стандартного образца.

Также для установления подлинности дипептида Н-11е-Тф-ОН использовали обращенно-фазовую ВЭЖХ на колонках Cjg для сравнения времен удерживания дипептида и стандартного образца (должны соответствовать друг другу). ВЭЖХ-хроматограмма дипептида Н-11е-Тф-ОН приведена на рис.5.

Параметры пирогенность, микробиологическая чистота и количественное содержание дипептида характеризуют качество фармацевтической субстанции.

Пирогенность (ГФ XII, ОФС 42-0061-07). Препарат должен быть апирогенным.

Микробиологическая чистота (ГФ XII, ОФС 42-0067-07). В 1 г препарата допускается наличие не более 100 аэробных бактерий и грибов суммарно, не допускается наличие энтеробактерий, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

mV

Detector A Ch1:280nm

— /V! .1- .:,

1 " ■ t

o'o 2! 5 iO 75 10.0 12.5 15.0min

Рис.5. ВЭЖХ-хроматограмма дипептида H-Ile-Trp-OH (колонка Discovery C)8 (250 x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм), подвижная фаза - смесь ацетонитрила и фосфатного буфера (40:60), скорость потока - 1 мл/мин, детектирование - при 254 и 280 нм, время элюирования -30 минут.

Количественное содержание дипептида изолейцил-гриптофан (C17H22N303): не менее 98% и не более 102% в пересчете на сухое вещество.

Количественное содержание дипептида определяли :пектрофотометрически по величине оптической плотности 3,01% раствора при длине волны 280 нм в кварцевой кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению со стандартным образцом дипептида (растворитель-Н20).

Методика количественного определения тимогара была валидирована по параметрам линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность.

При определении линейности (рис.6) коэффициент корреляции составил 0,999. При расчете методом наименьших квадратов регрессионной прямой Yj = bXj + а были получены следующие значения а - свободного члена для рассчитанной регрессионной прямой (отрезок, отсекаемый на оси ординат), b -угла наклона рассчитанной регрессионной прямой: b = 0,01, а = 0,058. В нашем случае критерий статистической незначимости должен составлять ДА = 2,13-0,05 = 0,1065, рассчитанное значение свободного члена а = 0,0058, что ниже ДА, следовательно соблюдается критерий статистической незначимости.

1,3 -

D

1,2 " 1,1

1 -

0,9 0,8 -0,7 -0,6 -

70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130

С, мкг/мл

Рис.6. Линейность метода количественного определения тимогара.

Повторяемость методики определяли путем количественного определения одного образца препарата в 10 повторностях. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 2% и составило 0,66%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.

Определение воспроизводимости методики проводили 2 аналитика в 5 повторностях на 5 образцах препарата. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 10%. Полученное значение находилось в пределах 0,41-0,59%, что указывает на прецизионность методики в условиях воспроизводимости. Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания тимогара в растворах, полученных путем добавления необходимого количества стандарта к исследуемому раствору до получения концентрации 100 мкг/мл. Критерий приемлемости - средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, должен находиться в пределах 100±5%. В нашем случае средний процент восстановления находился в пределах от -101,71 до +101,39, среднее его значение составляет 100,0%.

Таким образом, разработанная методика количественного определения тимогара спектрофотометрическим методом соответствует необходимым требованиям и была включена в ФСП 42 Т]'-00001 -08 «Тимогар».

Стабильность тимогара в условиях длительного хранения

На основе дипептида Н-11е-Тгр-ОН разработан иммуномодулирующий препарат тимогар, представляющий собой 0,01% водный раствор дипептида.

Для определения срока годности препарат хранили при 4 и 35°С в течение 2 лет. Через определенные промежутки времени проверяли на соответствие требованиям ФСП 42 Т]-00001-08 «Тимогар» по параметрам: описание (прозрачная бесцветная жидкость без вкуса и запаха), прозрачность (должен быть прозрачным), цветность (должен быть бесцветным), рН (5,5-6,8), механические включения (не должно быть), посторонние примеси (ТСХ, на хроматограмме должно быть два пятна с совпадающими содержание дипептида (0,09-0,11 мг/мл), стерильность (должен быть стерильным), пирогенность (должен быть апирогенным), токсичность (должен быть нетоксичным).

Проведенные исследования показали, что концентрация дипептида за это время снизилась на 2% от начальной, что находится в пределах, допускаемых Государственной фармакопеей для препаратов с такой концентрацией действующего вещества, остальные показатели также соответствовали требованиям ФСП 42 Т]'-00001-08 «Тимогар». Исходя из этого, срок годности тимогара был установлен равным 2 годам.

Сравнительные фармакологические исследования тимогара и его натриевой соли

При проведении сравнительных фармакологических исследований тимогара и его натриевой соли изучались острая и хроническая токсичность, аллергизирующие и

иммуностимулирующие свойства. При этом было установлено, что достоверных отличий в изученных показателях у дипептида изолейцил-триптофан и его натриевой соли отмечено не было.

Сравнительные исследования эффективности применения тимогара и его натриевой соли при лечении бронхопневмонии

телят и тейлериоза крупного рогатого скота в комплексе с традиционными препаратами показали, что оба препарата не отличаются по клинической эффективности, не обнаруживают достоверных отличий при оценке их влияния на биохимические показатели сыворотки крови и факторы неспецифической инфекционной резистентности.

Таким образом, натриевая соль тимогара не отличается по биологической активности от тимогара и также может быть использована при лечении и вакцинации животных для улучшения деятельности иммунной системы.

Технологическая схема производства лекарственной формы - тимогар

На основании результатов исследований синтеза и физико-химических свойств дипептида Н-Ие-Тгр-ОН разработана технологическая схема производства тимогара, включающая следующие стадии:

I. Синтез дипептида Н-11е-Тгр-ОН (осуществляется в специальной лаборатории).

II. Приготовление 0,01%-го водного раствора дипептида Н-11е-Тгр-ОН.

III. Контроль препарата тимогар.

В результате проведенных исследований разработаны технологическая схема производства тимогара, определены условия стандартизации, показатели качества, требования и методики анализа, включенные в ФСП 42 ^'-0001-08 «Изолейцил-триптофан. Субстанция» и ФСП 42 Т)'-00001-08 «Тимогар».

Разработка препаратов на основе координационных

соединений Н-11е-Тгр-ОН с ионом Zn2+ Изучение взаимодействия дипентидов с ионом Zn2+

При проведении химико-фармацевтических исследований были определены константы кислотной диссоциации синтезированных дипептидов. По полученным значениям были построены диаграммы распределения дипептидов. Для примера на рис.7 приведена диаграмма распределения дипептида изолейцил-триптофан, из которой видно, что при

физиологических значениях рН в водном растворе дипептид присутствует в катионной, анионной и цвиттер-ионной формах.

-ХП21Л--ХН1.+- XI,- рН

Рис.7. Диаграммы распределения дипептида Н-11е-Тгр-ОН

Координационные соединения получали непосредственным взаимодействием дипептидов и гп(СН3СОО)2 в водном растворе с выдерживанием при 60°С в течение 30 минут.

Методом рН-метрического титрования был определен состав и константы образования образующихся в растворе комплексных форм. Для примера на рис. 8 приведены кривые титрования дипептида глицил-триптофан и его координационных соединений С ИОНОМ гп2+

-Н-в^-Тф-ОН.......Н-И^-Тф-ОН + 7л \№ОН

Рис. 8. Кривые титрования дипептида глицил-триптофан и его координационных соединений с ионом Ъ^.

Расположение кривой титрования координационных соединений ниже кривой титрования дипептида свидетельствует об образовании в системе протонированных комплексов. Следовательно, в данном случае необходимо учитывать протекание как ступенчатого комплексообразования, гп2+ + ь~ <->

гпь+ + ь~ <-> гпь2° так и образование координационных соединений с протонированным лигандом и образование гидроксокомплексов: гп2+ + НЬ* <-> гп(НЬ)2+

гп(нь)2+ + нь* <-» гп(нь)22+

гп2+ + Ь~ + Н20 о гпЦОН)0 + н+

гп2+ + нь1 + н2о гп(нь)(он)+ + н+

Состав образующихся комплексных форм зучали методом Бьеррума, использующего расчет по экспериментальным данным функции образования - среднего числа лигандов, связанных с ионом металла-комплексообразователя и рассчитываемой по уравнению:

- Сь-[Ь] См

где Сь - общая концентрация лиганда, [Ь] - равновесная концентрация лиганда, См - общая концентрация иона металла-комплексообразователя.

Равновесную концентрацию лиганда определяли по выведенной формуле:

п - П _ (С^он - [ОН- ]+[Н+]) ([Щг + К, (К2 + [Н* ]) (К,(К, +[Н+]) (1 + [Н+]/К2 +[Н+]2/К, К2)

9

Для определения состава равновесной смеси использовали программу КешОЛЬБРЕК, в файл исходных данных которой подставляли рассчитанные значения [Ь~].

При расчете учитывались следующие комплексные формы:

[2пЬ]+, [гпЬ2]°, [гп(нь)]2+, ^п(нц2]2\ [гпцон)]°, [2п2цон)]2+,

[2п2Ь]3+, [гп2НЦ4+, [Еп2(НЬ)(ОН)2]°. О правильности выбранной модели равновесной системы судили по совпадению рассчитанной кривой титрования с экспериментальной. Результаты исследований показали, что для всех пептидов в растворе одновременно присутствует несколько комплексных форм (таблица 9).

Таблица 9

Десятичные логарифмы констант образования комплексных форм дипептндов с ионом цинка_

Пептид Комплексная форма

[Хп Ь]+ [гпЬ2]и

Н-Рго-Ьуэ-ОН 6,75 12,88 12,6 21,ОЪ 6,6

Н-ЬуБ-Ьуз-ОН 7,34 13,03 10,5 24,11 5,4

Н-І^-вІу-ОН 5,94 11,76 11,23 22,45 6,1

Н-АІа-Ьув-ОН 6,02 12,01 12,2 26,3 4,98

Н-Авп-Туг-ОН 6,15 12,5 11,9 23,43 6,03

Н-Агй-Ьуя-ОН 7,88 13,11 12,7 25,8 7,1

Н-АІа-Бег-ОН 6,17 10,56 10,87 22,3 5,87

Отличие кривой титрования дипептида от кривой титрования его смеси с ацетатом цинка (рис.9) свидетельствует об образовании координационных соединений.

-Н-11е-Тгр-ОН.......Н-1Ы1Р-ОН + 2л

Рис.9. Кривая титрования дипептида Н-11е-Тгр-ОН с ионом

Определение их состава с использованием окислительной функции (Юсупов З.Н., 2001) показало, что при взаимодействии дипептида и иона цинка в области рН 3,5-5,0, наряду с моноядерными комплексными формами, образуется и биядерная со следующими десятичными логарифмами констант образования комплексных форм: [¿пНЬ]2+ - 3,71, [7пТ,(НТ,)]+ -6,6, [2п(НЬ)2]2+ - 0,279, [2п2(НЬ)2]4+ - 18,8, [гп(ОН)НЬ]+ - 0,256. Кривая распределения комплексных форм приведена на рис. 10.

— гпнь гп2(нц2 — адонхнц

Рис.10. Диаграмма распределения комплексных форм

Таким образом, при взаимодействии цинка и дипептида изолейцил-триптофан в водном растворе происходит образование координационных соединений с преимущественным образованием комплексных форм [2пНЬ±]2+, [2п2(НЬ±)2]2+,

[^(ОНХНи*)]*".

Препарат на основе координационных соединений Н-Ие-Тгр-

ОН с гп2+

Стандартизация лекарственной формы

При создании лекарственной формы выбрано эквимолярное соотношение дипептида и иона металла при концентрации дипептида, как и в случае тимогена и тимогара, 100 мкг/мл. Лекарственная форма тимоцина представляет собой 0,0157% водный раствор координационных соединений дипептида изолейцил-триптофан с ионом цинка.

В связи с образованием координационных соединений образуются в водном растворе (в процессе получения тимоцина) без выделения в свободном виде, для разработки стандартного образца тимоцина и методов его стандартизации, было изучено влияние комплексообразования на интенсивность поглощения дипептида и на хроматографическую подвижность координационных соединений по сравнению с дипептидом.

Результаты спектрофотометрических исследований показали, что взаимодействие дипептида с ионом цинка не влияет на интенсивность поглощения дипептида при длине волны 280±2 нм, используемой для его количественного определения.

Сложность выбора оптимальных условий хроматографирования пептидов обусловлена существованием в растворе катионной, цвиттер-ионной и анионной форм, отличных по времени удерживания - в результате хроматографический пик соединения уширяется, что неприемлемо при анализе препарата. Тимоцин представляет собой раствор координационных соединений дипептида Н-11е-Тгр-ОН с Ъ^, существующих одновременно в нескольких комплексных формах, обусловленных ступенчатой диссоциацией дипептида.

Данных о влиянии соле- и комплексообразования на хроматографические свойства пептидов практически не имеется. Только В.С.Смирнов (2003) сообщал, что мононатриевая соль Ь-глутамил-Ь-триптофана по данным ТСХ и ВЭЖХ идентична дипептиду в выбранных условиях хроматографирования.

Первоначально методом ТСХ изучили влияние солеобразования на хроматографические свойства Н-Ие-Тгр-ОН. При этом использовали свободный дипептид Н-11е-Тгр-ОН, хлоргидрат, ацетат, трифторацетат, натриевую соль дипептида и его координационные соединения с цинком. Для смещения ионного равновесия дипептида в сторону образования одной ионной формы применили системы растворителей, содержащие как основные (пиридин), так и кислые реагенты (уксусная кислота): н-бутан0л-пиридин-СН3С00Н-Н20 (30:20:6:24) (А), СН3С00Н-Н20-СН30Н-СНС13 (7:3:1:1) (Б). Значения Ыг вышеуказанных соединений в данных системах были одинаковы и равны 0,55 (А) и 0,88 (Б), свидетельствуя о существовании либо анионной (система А), либо катионной (система Б) формы дипептида.

При хроматографировании методом ВЭЖХ, для смещения равновесия в сторону одной ионной формы использовали элюент состава: ацетонитрил - фосфатный буфер с рН 7,4 (40:60). Фосфатный буфер должен обеспечить присутствие пептида в одной ионной форме. Результаты хроматографирования свободного дипептида и его солянокислой, ацетатной и натриевой солей, а также координационных соединений с ионом цинка показали, что в выбранных условиях все ионные формы пептида имели одинаковое время удерживания - 5,21±0,15 минуты. Для примера на рис.11 приведены ВЭЖХ

хроматограммы дипептида H-Ile-Trp-OH и его координационных соединений с цинком.

mV 20015010050-

(Ъ 0

150 10050

<У

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 min

Рис.11. ВЭЖХ хроматограммы дипептида изолейцил-триптофан (а) и его координационных соединений с цинком (б). Колонка Discovery С18 (25 см х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм), подвижная фаза: смесь ацетонитрила и фосфатного буфера (pH 7,4) (40:60), скорость потока составляла 1 мл/мин, детектирование проводили при длинах волн 254 и 280 нм и времени элюирования 30 минут

Таким образом, применение кислых и основных систем при хроматографировании пептидов, их солей и координационных соединений методом ТСХ, а также применение фосфатного буфера (pH 7,4) при использовании ВЭЖХ позволяют получать хроматограммы исследуемых соединений в одной ионной форме. Проведенные исследования позволили разработать фармакопейные статьи на стандартный образец тимоцина и его лекарственную форму. Параметры стандартизации стандартного образца и препарата приведены в таблице 10.

Detector A Ch1:280nm А. . -i-

-t .i

1 1 1 ' i.............. ...........

.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0min

Detector A Chi :280nm

'i- T 1'

Таблица 10

Параметры стандартизации стандартного образца и лекарственной формы - тимоцин

Стандартный образец Лекарственная форма

Параметр Метод определения и характеристика Параметр Метод определения и характеристика

Описание Белый или слегка желтоватый кристаллический порошок без запаха Описание Прозрачный бесцветный водный раствор без запаха

Растворимость (ГФ XII, ОФС 42-0049-07) Растворим в воде, очень мало растворим в спирте 95%, практически нерастворим в хлороформе Подлинность Спектр поглощения препарата имеет максимум при 278±2 нм и плечи при 273-275±2 нм и 287-288+2 нм

Подлинность Тимоцин Ацетат-ион (ГФ XI, вып.1, стр. 159) Цинк (ГФ XI. вып.1, стр. 165) Спектр поглощения имеет максимум при 278±2 нм и плечи при 273-275±2 нм и 287-288+2 нм Раствор дает качественную реакцию на ацетат-ион Раствор препарата дает качественную реакцию на ион цинка с раствором калия ферроцианида Прозрачность (ГФ XI, вып. 1, стр. 198) Препарат должен быть прозрачным

рН (потенциометрически, ГФ XII, ОФС 42-0048-07) От 5,5 до 6,8 для 0,016924%-ного раствора Цветность (ГФ XI, вып. 1, стр.194) Препарат должен быть бесцветным

Прозрачность раствора (ГФ XII, ОФС 42-0051-07) Раствор должен быть прозрачным Посторонние примеси (ТСХ) На хроматографических пластинках должны появиться только два темно синих пятна с совпадающими

Цветность раствора (ГФ XII, ОФС 42-0050-07) Раствор должен быть бесцветным Механические включения не должно быть

Посторонние примеси (ВЭЖХ) Содержание любой единичной примеси не более 0,9%, суммарное содержание примесей не более 2,0% Стерильность (ГФ XI, вып.2, стр.187-193) Препарат должен быть стерильным

Потеря в массе при высушивании (ГФ XI, вып.1, с.176) Не более 6% Пирогенность (ГФ XI, вып.2, стр.183-185) Препарат должен быть апирогенным

Удельный показатель поглощения 163,1-176,7 Токсичность (ГФ XI, вып.2, стр. 182-183) Препарат должен быть нетоксичным

Количественное содержание: Тимоцин (спектрофотометрия) Цинк (спектрофотометрия) от 90 до 110% от 90 до 110%

Для определения количественного содержания цинка в тимоцине (после его экстракции из препарата) был разработан метод, основанный на образовании окрашенного соединения цинка с дитизоном, интенсивность окраски которого зависит от содержания цинка. Фотометрирование проводили при 538 нм. Содержание цинка определяли по калибровочной кривой.

Методики количественного определения тимоцина и содержания цинка в тимоцине спектрофотометрическим методом были валидированы по параметрам линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность.

График линейности количественного определения тимоцина показан на рис.12. В этом случае коэффициент корреляции составил 0,999, параметры линейной зависимости Y¡ = bX¡ + а были равны b = 0,00607, а = -0,0172.

U 1

D

1.1

1 -0,9 ■ 0,8 0,7 -0,6

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

С, м кг/мл

Рис.12. График линейности метода количественного определения тимоцина

При изучении повторяемости величина относительного стандартного отклонения не должна превышать 2% и составила в нашем случае 0,58%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.

Воспроизводимость методики изучали 2 аналитика в 5 повторностях, критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 10%. Среднее его значение составило 1,14%, что указывает на прецизионность методики в условиях воспроизводимости.

При изучении правильности методики путем измерения количественного содержания тимоцина в растворах, полученных путем добавления к исследуемому раствору необходимого количества стандарта с концентрациями 20, 40, 50, 60, 80, 100, 110 мкг/мл до получения окончательной концентрации 157 мкг/мл, средний процент восстановления находится в пределах от -101,08 до +101,72, среднее его значение составляет 100,15%, что соответствует необходимым требованиям.

Таким образом установлено, что методика легко воспроизводима, доступна, занимает минимум рабочего времени, не требует дорогостоящих реактивов. Она позволяет объективно оценивать качество тимоцина. Полученные результаты включены в ФСП 42 13-00002-08.

В методику количественного определения цинка в тимоцине входит стадия экстракции цинка раствором дитизона в четыреххлористом углероде или хлороформе. Поэтому было необходимо провести валидацию стадии экстракции. Изучение влияния времени экстракции и растворителя на результат определения показало, что оптимальным временем экстракции является 2 мин. Растворитель не оказывает влияния на результат определения.

Затем были проверены остальные характеристики методики: линейность, сходимость и правильность.

График линейности методики количественного определения содержания цинка приведен на рис.13.

Параметры линейной зависимости = ЬХ1 + а составляли Ь = 0,01, а = 0,021 и коэффициент корреляции составлял 0,999.

При определении сходимости методики величина относительного стандартного отклонения находилась в пределах 0,584-0,869%, что указывает на прецизионность методики в условиях воспроизводимости.

При изучении правильности методики было показано что средний процент восстановления находится в пределах от -101,08 до +101,72, среднее его значение составляет 100,15%.

Таким образом, разработанная методика количественного определения содержания цинка в тимоцине по всем параметрам пригодна для практического применения.

0,3

0,15 ................- -,.............................,...............................,— -г-.....................,.....................-......, ..............................I..............................,---------------- >

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Концентрация цинка в "пгмщцгнл. мкг/мт

Рис. 13. График линейности метода количественного определения тимоцина

Стабильность тимоцина

Для определения срока годности образцы тимоцина хранили в течение 2 лет при 4 и 35°С и через определенные промежутки времени проверяли на соответствие требованиям ФСП 42 Т]-00002-08 следующих параметров: описание (прозрачный бесцветный водный раствор без запаха), подлинность (спектр поглощения препарата в области 220-350 нм имеет максимум поглощения при 278+2 нм и плечи при 273-275±2 нм и 287-288+2 нм), прозрачность (должен быть прозрачным), цветность (должен быть бесцветным), посторонние примеси (ТСХ в 2 системах растворителей, на хроматограмме должно быть два пятна с совпадающими механические включения (не должно быть), стерильность (должен быть стерильным), пирогенность (должен быть апирогенным), токсичность (должен быть нетоксичным), содержание тимоцина в препарате (должно составлять от 90 до 110%), содержание цинка (18-22 мкг/мл).

Проведенные исследования показали, что концентрация тимоцина за 2 года снизилась на 1,27%, но находится в пределах, допускаемых ФСП 42 Т)'-00002-08; другие параметры находились в пределах нормы. На основании результатов исследований установлен срок годности тимоцина - 2 годам.

Фармакологические свойства тимоцина

Ранее (Бобиев Г.М., 2000) было показано, что тимоцин, концентрацией действующего вещества 0,04% (400 мкг/мл) является практически нетоксичным для лабораторных и сельскохозяйственных животных. Вследствие этого изучение общетоксических свойств тимоцина (157 мкг/мл) не проводилось.

Исследование аллергизирующих свойств тимоцина (157 мкг/мл) проведенное на кроликах, показало, что препарат не обладает аллергизирующими свойствами.

При изучении эмбриотоксичности и тератогенности тимоцина в сравнении с циклофосфамидом было показано что тимоцин в дозах 392,5 мкг/кг (терапевтическая доза для животных превышена в 1250 раз) и 200 мкг/кг (терапевтическая доза для животных превышена в 637 раз) не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием.

Первичная и вторичная фармакодинамика тимоцина (157 мкг/мл)

Иммуностимулирующую активность тимоцина (157 мкг/мл) определяли по увеличению титра антител у телят, иммунизированных противотейлериозной вакциной и ассоциированной вакциной против рота-, коронавирусных энтеритов и колибактериоза телят. Наибольшее увеличение титра антител к каждому вакцинному антигену отмечалось при применении его в дозах 314 и 471 мкг на 100 кг веса животного в течение 3-5 дней. Применение тимоцина способствовало увеличению титра противотейлерийных антител в 2-8 раз, антител к рота-, коронавирусу и эшерихии коли в 2,7, 3,5 и 1,8 раза соответственно. Сравнение с данными, полученными для тимоцина с содержанием действующего вещества 400 мкг/мл (Бобиев Г.М., 2000) не выявило между ними статистически значимых различий.

Таким образом, изучение тимоцина показало, что изменение содержания действующего вещества с 400 до 157 мкг/мл не оказало статистически значимого влияния на иммуностимулирующую активность препарата.

Результаты клинических испытаний тимогара и тимоцина

На основании решения Фармакологического Комитета Республики Таджикистан от 06.09.1994 года, протокол №2, были

проведены клинические испытания тимогара при использовании в комплексном лечении нефрологических (гломерулонефриты), ревматологических (ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева и др.), пульманологических (бронхиальная астма, хронический бронхит, ринофарингит и СКВ) заболеваний, алопеции, осложненной сердечно-сосудистой патологии, сопровождающейся иммунозависимыми воспалительными заболеваниями, сердечнососудистой патологии, осложненной вторичными иммунодефицитными состояниями. Тимогар способствовал ярко выраженной положительной динамике показателей крови, особенно лейкоцитов, уровня СОЭ, иммуноглобулинов, белковых фракций и общего анализа мочи. Назначение тимогара сокращает курс лечения больных по сравнению с контрольной группой.

Решением Фармакологического Комитета Республики Таджикистан за № 3 от 4.09.2007 года были проведены клинические испытания тимоцина при лечении хронических диффузных вирусных заболеваний печени (вирусные гепатиты В, С, В+С, В+Б, В+С+Б, фиброз печени, абдоминальный туберкулез), злокачественных новообразований (рак молочной железы, пищевода, носоглотки, шейки матки, вульвы, гортани, верхней челюсти, почечно-клеточный рак, опухоль яичников, мезателиома плевры, лимфосаркома периферических лимфоузлов, лейомисаркома правой почки), псориаза, нейродермита, аллергических состояний (бронхиальная астма, бронхиты, аллергические риносинусит и фарингит), туберкулеза, алопеции. Применение тимоцина приводило к положительной динамике как клинических показателей, так и биохимических показателей крови.

Нормативные документы на препараты тимогар и тимоцин

1. Тимогар. Фармакопейная статья предприятия ФСП 42 Т^

00001-08. Срок действия установлен с 2008 по 2013 гг.

2. Тимоцин. Фармакопейная статья предприятия ФСП 42 Т^

00002-08. Срок действия установлен с 2008 по 2013 гг.

3. Изолейцил-триптофан образец стандартный. Фармакопейная статья ФС 42-^-0002-08. Срок действия установлен с 2008 по 2013 гг.

4. Тимоцин образец стандартный. Фармакопейная статья ФС 42-^-0003-08. Срок действия установлен с 2008 по 2013 гг.

5. Изолейцил-триптофан субстанция. Фармакопейная статья предприятия ФСП 42-^-0001-08. Срок действия установлен с 2008 по 2013 гг.

Выводы

1. Методом активированных эфиров, смешанных ангидридов синтезированы тимопентин и его гексапептидный аналог Н-Агя-Ьу8-Азр-Уа1-Туг-Ащ-ОН, гистидинсодержащий аналог тимогара Н-Шз-Не-Тгр-ОН, лизин-, серин- и тирозинсодержащие дипептиды, а также тирозинсодержащие тетрапептиды Н-Туг-Ьу.ч-РЬе-С1у-ОН и Н-Туг-Туг-Рго-8ег-1ЧН2.

2. Экспериментально доказано, что наиболее технологичным является использование активированных (пентафторфениловых) эфиров при получении низкомолекулярных тимусных пептидов.

3. Определены параметры стандартизации, разработаны методики анализа субстанции, стандартного образца и препарата на основе дипептида изолейцил-триптофан (тимогар) с использованием методов спектрофотометрии, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разработана технологическая схема производства тимогара.

4. Методами рН-метрического и окс-редметрического титрования показано, что при взаимодействии лизин-, серин-, тирозин- и триптофансодержащих дипептидов и ионов цинка образуются координационные соединения, иммуностимулирующая активность которых превышает активность исходных дипептидов. Установлен состав координационных соединений.

5. Установлено, что хроматографирование методом ТСХ в кислых и основных хроматографических системах пептидов, их солей и координационных соединений позволяет избежать влияния соле- и комплексообразования на их хроматографическую подвижность.

6. Разработаны параметры и методы стандартизации препарата на основе дипептида Н-Ие-Тгр-ОН и его координационных соединений с ионом цинка (тимоцин 157 мкг/мл). Разработанные методики стандартизации дипептида и его координационных соединений с ионом цинка основаны на

использовании спектрофотометрического метода и методоь тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

7. Установлено, что новые лекарственные препараты тимогар и тимоцин не изменяют своих физико-химических свойств и не теряют иммунологической активности в течение 2 лет. Срок годности препаратов составляет 2 года.

8. На основании проведенных исследований разработано 5 Фармакопейных статей на новые иммуномодулирующие препараты тимогар и тимоцин, их субстанции и стандартные образцы, утвержденные Министерством здравоохранения Республики Таджикистан.

9. Показано, что натриевая соль тимогара и тимоцин (157 мкг/мл) являются практически нетоксичными, не обладают аллергенными, эмбриотоксическими и тератогенными свойствами.

10. Доказана высокая иммуномодулирующая активность препаратов тимогар и тимоцин при лечении нефрологических, ревматологических, пульманологических, сердечно-сосудистых, кожных, почечных, онкологических заболеваний, сопровождающихся вторичными иммунодефицитными состояниями, разработанных препаратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Гулов А.Х., Нораев Р.Х., Бобиев Г.М. Способ стимуляции поствакцинального противотейлериозного иммунитета у крупного рогатого скота с помощью иммуностимулятора тимофера // Вестник ветеринарии.-2002 -Т.24 - № 3. - С. 49.

2. Зоирова Н.П., Хусайнов A.A., Расулов М.М., Файзуллоева М.М., Бобиев Г.М. Применение тимогара и 1-(хлорметил)силатрана при лечении гнездной алопеции // Новости дерматологии и венерологии.-Ташкент, 2002 - № 2.-С.37-38.

3. Бобиев Г.М., Чориева С.А., Шахматов А.Н., Бандаев С.Г. Синтез дипептидного тимомиметика и его гистидинсодержащего аналога // Мат. межд. научн.-практ. конф., поев. 60-летию ТаджНИВИ «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях».-Душанбе, 2003.- С. 64-67.

4. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Хайдаров К.Х. О механизме действия тимогара // Вклад биохимиков в развитие биологической

науки. Тр. третьей респ. научн. конф. биохимиков РТ.-Душанбе.-2003.-С. 84-86.

5. Садыков Д., Али Фрджани Хамис, Шахматов А.Н., Юсупов Т.Ю., Бобиев Г.М. Определение констант ионизации некоторых биологически активных аминокислот в водных растворах // Вестник Таджикского государственного национального университета. Серия естственных наук.-2004.-№ 4.-С. 153-156.

6. Зоирова Н.П., Бобиев Г.М., Хусайнов A.A., Расулов М.М., Файзуллоева М.М. Лечение гнездной алопеции 1-(хлорметил)-силатраном и тимогаром // Здравоохранение Таджикистана.-2005.-№ 4.-С. 125-130.

7. Салимов Д.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Токсические свойства натриевой соли дипептида изолейцил-триптофан // Вестник педагогического университета.-2005.-№ 4.-.-С.71-73.

8. Салимов Д.М., Хакимов Ф.Х., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Перспективы применения иммуномодулятора тимогара и его натриевой соли при лечении сердечно-сосудистых заболеваний // Мат. научн.-практ. конф. «Аналитик кимиё ва экологиянинг долзарб муаммолари».-Самарканд,-2006.-С. 276-279.

9. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Касирова А.Н. Способ получения тимопентина. Патент Республики Таджикистан № TJ 453, приоритет от 19.10.2006 г.

10. Чориева С.А., Шахматов А.Н., Юсупов З.Н., Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х. О комплексообразовании иона цинка с дипептидом глицил-триптофан // Докл. АН Республики Таджикистан.-2006.-Т.49,-№ 2.-С.154-157.

11. Чориева С.А., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Юсупов З.Н., Хайдаров К.Х. Расчет равновесий комплексообразования в системе цинк(П)-дипентид глицил-триптофан-вода // Вестник Таджикского государственного национального университета.-Душанбе.-2006.-№ 2.-С .110-115.

12. Чориева С.А., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Юсупов З.Н., Хайдаров К.Х. Комплексообразование цинка в растворах глицил-триптофана // Вестник Таджикского государственного национального университета.-Душанбе.-Душанбе.-2006.-№ 2.-.-С. 121-126.

13. Джаборов K.M., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х. Экспериментальное изучение фармакодинамики тимоцина

// Вестник Таджикского государственного национального университета.-Дуи1анбе.-2007.-№ З.-С. 193-198.

14. Салимов Д.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Некоторые вопросы синтеза триптофансодержащих иммуноактивных дипептидов // Вестник Таджикского государственного национального университета.-Душанбе.-2007.-№ З.-.-С. 221-226.

15. Джаборов К.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х. Экспериментальное изучение токсических свойств тимоцина // Изв. АН Республики Таджикистан. Отд. физ-мат., хим. и геол. наук.-2007,-№ 1(126)- С. 90-93.

16. Салимов Д.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Антиаллергизирующие свойства натриевой соли изолейцил-триптофана (тимогара) // Изв. АН Республики Таджикистан. Отд. физ-мат., хим. и геол. наук.-2007,-№ 1(126)- С. 94-97.

17. Салимов Д.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Изучение иммуностимулирующей активности натриевой соли дипептида изолейцил-триптофан (тимогара) // Кишоварз, 2007.-№2.-С. 14-15.

18. Салимов Д.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Эффективность применения натриевой соли дипептида изолейцин-триптофан (тимогара) при неспецефическнх заболеваниях легких // Доклады Академии сельхознаук РТ, № 4 (14), 2007, С.52-55

19. Закиряходжаев Д.З., Мирзоева Д.С., Бобиев Г.М., Хусейнов З.Х., Хамидов А.К., Ашурова М.Д., Бакиев С.А. Применение тимоцина при лечении злокачественных новообразований различной локализации // Проблемы клинической онкологии. Сборник статей, посвященный 75-летию профессора Ахмедова Б.П. Т. 1 .-Душанбе, 2008 - С. 71-77.

20. Шахматов А.Н., Лангариева Дж.С., Талбов Ф.Ш.. Бобиев Г.М. О возможной причине повышения иммунологической активности триптофансодержащих дипептидов при образовании солей и комплексообразовании // Вестник Авиценны. Паеми Сино. -2008.-№ 3.- С. 119-121.

21. Валиев А.Х., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Влияние солеобразования на хроматографическую подвижность дипептида изолейцил-триптофан // Сб. научн. тезисов совместной респ. научн.-прак. конф. «Перспективы развития фундаментальных медицинских наук в Таджикистане» и 56-ой годичной научно-практической конференции ТГМУ им. Абуали ибни Сино

«Перспективы развития семейной медицины в Таджикистане».-Душанбе, 2008.-С. 24-25.

22. Валиев А.Х., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Оптимизация условий определения дипептида изолейцил-триптофан методом ВЭЖХ // Там же. -С. 25-26.

23. Бобиев Г.М. Результаты клинических испытаний нового иммуномодулирующего препарата тимоцин // Вакцинология-2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней. Тезисы Всероссийской научно-практической конференции.-М., 2008.- С.25.

24. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Мансурова Ф.Х., Лангариева Г. Иммуномодулирующее действие нового препарата тимоцин // Там же.-С.26

25. Джаборов K.M., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х. Влияние препарата на основе координационных соединений иммуноактивного дипептида с цинком на гуморальный иммунный ответ // Там же -С.48.

26. Лангариева Д., Шахматов А.Н., Талбов Ф.Ш., Бобиев Г.М. Результаты клинических исследований нового иммуномодулирующего препарата тимогар // Там же - С. 70.

27. Мирзоева Д.С., Бобиев Г.М., Шахматов А.Н. Опыт применения тимоцина при лечении злокачественных новообразований различной локализации // Там же -С.80

28. Мироджов Г.К., Бобиев Г.М., Мансурова Ф.Х., Джаборов К.М Хайдаров К.Х. Тимоцин при лечении хронического гепатита вирусной этиологии // Там же -С.80

29. Салимов Д., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Результаты сравнительного изучения иммуностимулирующей активности нового иммуномодулирующего препарата «Тимогар» и его натриевой соли // Там же -С. 106

30. Валиев А.Х., Холназаров Б.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Разработка условий определения иммуномодулирующего препарата тимоцин методом ВЭЖХ // Вестник педагогического университета.-2008.-№ 3(31).-С. 57-62.

31. Салимов Д.М., Холназаров Б.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х. Опыт применения тпмогара при лечении осложненной сердечно-сосудистой патологии, сопровождающейся иммунозависимыми воспалительными

заболеваниями // Изв. АН Республики Таджикистан. Отд. физмат., хим., геол. и техн. наук -2008.-№4(133).-С. 57-61.

32. Шокиров М.Н., Холназаров Б.М., Бобиев Г.М., ШокироЕ М.М., Хушвактов Д.И., Ходжаева А.М., Мирзоев М.Ш. Акбаров М.М., Латипов С.Д. Применение отечественногс иммуномодулятора тимогар при проведении дентальное имплантации у больных сахарным диабетом // Известия АН Республики Таджикистан.-2009.-№ 1(134).-С. 72-77.

33. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Юсупов З.Н. Изучение состава координационных соединений цинка и дипептида изолейцил-триптофан методом окислительного потенциала // Мат. межд. конф. «Состояние и перспективы развития биохимии а Таджикистане».-Душанбе, 2009.-С.38-44.

34. Чариева С.А., Шахматов А.Н., Бандаев С.Г. Бобиев Г.М. Синтез тирозинсодержащих пептидов потенциальных иммунотропных препаратов // Там же - С. 180-185.

35. Бобиев Г.М. Бунятян Н.Д., Саядян Х.С., Саповскш М.М. Иммуноактивные пептиды и их координационные соединения в медицине.-М.: Издательский дом «Русский врач» 2009.-228 с.

36. Бобиев Г.М., Бунятян Н.Д., Шахматов А.Н., Валиев А.Х Разработка условий хроматографического определения дипептида изолейцил-триптофан и его координационные соединений // Фармация.-2009.-№ 7.-С. 17-18.

37. Холназаров Б.М., Саидов С.С., Чариева С.А., ШахматоЕ А.Н., Бобиев Г.М. Применение тактики максимальной защиты для синтеза тирозинсодержащих тетранептидов // Вестник-Таджикского государственного национального университета.-20Ю.-№ 3(59).-С. 228-231.

38. Мансуров Х.Х., Мироджов Г.К., Мансурова Ф.Х., Бобиев Г.М., Холназаров Б.М. Тимоцин в терапии хронических диффузных заболеваний печени // Проблемы гастроэнтерологии.-2010.-№ 1-2.- С. 40-49

39. Холназаров Б.М., Джаборов K.M., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х. Механизм действия тимоцина // Здравоохранение Таджикистана.-2010.-№ 3.- С. 23-27.

40. Мирзоева Д.С., Бобиев Г.М., Анохина И.В. Применение тимоцина при лечении рака молочной железы // VI съезд онкологов

и радиологов стран СНГ. Материалы съезда: Душанбе, 1-4 октября 2010 г. -Душанбе, 2010.- С. 150.

41. Бобиев Г.М., Холназаров Б.М., Шахматов А.Н., Рахимова Т.П. Иммуноактивные пептиды и их координационные соединения в медицине // Материалы респ. научн. конф. «Проблемы современной координационной химии», поев. 60-летию чл.-корр. АН РТ, д.х.н., проф. Аминджанова A.A. (13-14 января 2011 г.).-Душанбе, 2011.-С. 144-145.

42. Бобиев Г.М., Бунятян Н.Д., Шахматов А.Н., Юсупов З.Н., Рахимова Т.П. Изучение состава координационных соединений цинка и дипептида изолейцил-триптофан методом окислительного потенциала//Там же - С. 149-150.

43. Зоирова Н.П., Бобиев Г.М., Хусайнов А., Шахматов А.Н. Сравнительная оценка эффективности применения тимогара и тнмоцина при лечении алопеции // Здравоохранение Таджики стана.-2011.-№3.-С.52-58.

44. Бобиев Г.М., Холназаров Б.М., Шахматов А.Н. Опыт применения иммуноактивных пептидов и их координационных соединений в медицине // Материалы международной конференции «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств биологически активных соединений», посвященной 50-летию кафедры органической химии и 70-летнему юбилею доктора химических наук, профессора Халикова Ш.Х. (3-4 октября 2011 г.).-Душанбе, 2011 .-С.24-31.

45. Холназаров Б.М., Бунятян Н.Д., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Результаты применения низкомолекулярного иммуноактивного пептида при лечении туберкулеза // Там же.-С.44-48.

46. Бобоев М., Шахматов А.Н., Суяров К.Д., Бобиев Г.М., Саидахмадов С.С. Изучение взаимодействия цинка и изолейцина в водном растворе // Материалы международной научно-теоретической конференции «Ислохоти сохаи маориф ва шаклгирии муносибатхои бозаргони».-Душанбе, 2011.-С.178-180.

47. Бобиев Г.М., Холназаров Б.М., Бунятян Н.Д., Шахматов А.Н., Юсупов З.Н. Изучение состава координационных соединений цинка и дипептида изолейцил-триптофан методом окислительного потенциала // Вестник педагогического университета.-2011.-№ 2 (38).-С.29-36.

48. Бобиев Г.М., Бунятян Н.Д. Валидация методика количественного определения иммуномодулирующего препарата тимогар // Вестник педагогического университета.-2012.-№ 2 (45).-С.126-130.

49. Бобиев Г.М., Бунятян Н.Д. Валидация методики количественного определения тимоцина // Вестник педагогического университета.-2012.-№ 2 (45).-С.130-134.

50. Бобиев Г.М., Бунятян Н.Д. Валидация методики количественного определения содержания цинка в тимоцине / ТГПУ им. С. Айни, - Душанбе, 2012 - 19с. - Библиограф.: 4 назв. -Рус. - Деп. В НПИЦентре 2 апреля 2012 г., № 05(1868).

51. Бобиев Г.М., Бунятян Н.Д. Синтез и химико-фармацевтическое исследование низкомолекулярных пептидов I ТГПУ им. С. Айни, - Душанбе, 2012 - 26 с. - Библиограф.: 16 назв. - Рус. - Деп. В НПИЦентре 17 августа 2012 г., № 12(1875).

Список использованных сокращений

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГФ - Государственная фармакопея

ИФА - иммуноферментный анализ

ПСА - вариант метода смешанных ангидридов

РА - реакция агглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФСП - Фармакопейная статья предприятия

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

БСС - дициклогексилкарбодиимид

БСНи - дициклогексилмочевина

БМБ - диметилфорамид

Е13Ы - триэтиламин

НОВ1-1-гидроксибензотриазол

НОБи - 1Ч-гидроксисукцинимид

NMM - 1Ч-метилморфолин

-ОВг1 - сложноэфирная бензильная группа

-ОМе - сложноэфирная метальная группа

-ОРср - сложноэфирная пентахлорфенильная группа

Ъ- - карбобензоксигруппа