Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ЭФФЕКТОВ ТИАЗОЛИДИНДИОНОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

>

На правах рукописи

КРИШТОПА Айна Викторовна

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ЭФФЕКТОВ ТИАЗОЛИДИНДИОНОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 О ЯИВ 2011

МОСКВА 2011

004619620

Работа выполнена в ГОУ ВПО "Ростовский государственный медицинский университет" Росздрава и Учреждении РАМН "Научный центр биомедицинских технологий"

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук, профессор Каркшценко Владислав Николаевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Яворский Александр Николаевич доктор медицинских наук Сычев Дмитрий Алексеевич

Ведущая организация: Кубанский государственный медицинский университет член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Галенко-Ярошевский Павел Александрович.

Защита диссертации состоится " 25" января 2011г.

В 14.00 часов на заседании диссертационного Совета Д 208.040.13 в ГОУ ВПО Первом Московском государственном медицинском университете (119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2)

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49).

Автореферат разослан " С^йЗрА 2011

года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Архипов Владимир Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время 146,8 млн. жителей планеты (2,1%) страдают СД 2 типа. По прогнозам Международного института СД, к 2010 г. их число может составить более 200 млн. человек (3%). По данным ЭНЦ РАМН, в России 8 млн. человек (5% всего населения), страдают СД, из них 90% СД 2 типа (Шестакова М.В., 2001 ; Дедов И.И., 2003).

В научной медицинской литературе представлены данные о различной эффективности и безопасности применения сахароснижающих лекарственных средств, относящихся к различным группам по химическому строению и механизму действия (Chen N., 1992; Brunmair В. 2004). Данные о новых фармакологических эффектах, в том числе, побочных эффектах, получены в экспериментальных и клинических исследованиях эффективности и безопасности лекарственных средств из группы тиазолидиндионов (Artwohl M., 2005; Chou, F., 2007).

Поиск причин новых доказательных фактов о различной эффективности и безопасности применения тиазолидиндионов, полученных в клинике, возможен только на основе стандартного протокола экспериментального фармакологического исследования и новых методов молекулярного тестирования лекарственных средств данной фармакотерапевтической группы, в том числе, с помощью инновационных систем для высокопроизводительного скрининга новых молекул-мишеней в диабетологии, а также на основе новых методов биомоделирования в экспериментальной фармакологии.

Известно, что в основе развития СД 2 типа лежит несколько генетических дефектов, представленных в эксперименте на основе биомоделирования: дефект в гене инсулина, проявляющийся снижением чувствительности рецепторов к инсулину периферических тканей, нарушением внутриклеточной передачи сигнала на пострецепторном уровне, а также генетически обусловленная экспрессия адипоцитокинов и антител к рецепторам инсулина.

Известно, что тиазолидиндионы повышают чувствительность к инсулину и улучшают функцию р-клеток поджелудочной железы. Механизм действия

тиазолидиндионов связан с фармакологической активацией рецепторов PPARy, вызывающей экспрессию нескольких генов и возникновение целой палитры молекулярных эффектов, которые лежат в основе как необходимых терапевтических эффектов, так и НПР. Сегодня отсутствует информация о влиянии этой группы лекарственных средств на экспрессию и взаимодействие ключевых молекул патогенеза СД 2 типа, которые определяют эффективность и безопасность применения тиазолидиндионов.

В связи с этим исследование, направленное на изучение молекулярных паттернов биологических жидкостей и тканей при применении тиазолидиндионов в условиях СД 2 типа на основе биомоделирования, единой технологии регистрации и экспериментального скрининга молекул - мишеней для разработки новых лекарственных препаратов, представляется крайне перспективным.

Цель работы: исследование молекулярных эффектов розиглитазона и пиоглитазона в эксперименте на основе биомоделирования СД 2 типа.

Задачи исследования:

1. Разработать модель аллоксанового СД 2 типа на основе аутбредной линии крыс Wistar и инбредной линии крыс AUG.

2. Провести исследование интегральных показателей жизнедеятельности, показателей шкалы изменений внешних признаков, шкалы изменения активности и гематологических параметров крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG с аллоксановой моделью СД 2 типа на фоне введения тиазолидиндионов.

3. Провести исследование гормонально-метаболической составляющей ФД - эффектов тиазолидиндионов в эксперименте.

4. Выполнить поиск фармакопротеомных профилей биологических жидкостей и тканей (кровь, моча, поджелудочная железа) крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG с аллоксановым СД 2 типа при введении розиглитазона и пиоглитазона.

5. Провести исследование ФК - параметров и разработку ФК/ФД - модели тиазолидиндионов на биомоделях СД 2 типа.

6. Разработать интегральные схемы межмолекулярных взаимодействий в биологических жидкостях и тканях на фоне введения тиазолидиндионов.

Научная новизна

Впервые выполнено исследование гормонально - метаболической составляющей ФД - эффектов тиазолидиндионов на модели аллоксанового СД 2 типа у крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG.

Впервые в исследовании представлены сравнительный анализ особенностей ФК тиазолидиндионов и разработка ФК/ФД - модели для розиглитазона и пиоглитазона в условиях биомоделирования СД 2 типа.

Впервые выполнена сравнительная оценка молекулярных эффектов пиоглитазона и розиглитазона с помощью биоаналитических методов исследования.

Впервые представлены схемы молекулярного механизма реализации ФД-эффектов тиазолидиндионов при СД 2 типа в условиях эксперимента, выделены новые молекулы для разработки перспективных сахароснижающих лекарственных средств (PXR, TLL2, СРВ1, AMY2a, ELA3B) и молекулы, отвечающие за развитие НПР данной группы лекарственных средств (UMOD, PXR, KNG1).

Впервые в работе выполнен анализ молекулярных причин возникновения НПР розиглитазона и пиоглитазона.

Практическая значимость работы

1. Экспериментальное исследование доказало наличие молекулярных маркеров эффективности и безопасности применения тиазолидиндионов в условиях экспериментального СД 2 типа.

2. Результаты фармакопротеомного анализа тиазолидиндионов и сравнительной оценки их ФК являются доказательной основой для разработки новых лекарственных средств и проведения качественных клинических испытаний сахароснижающих лекарственных средств в области диабетологии.

3. Предложены биомодели аллоксанового СД 2 типа на основе аутбредной линии крыс Wistar и инбредной линии крыс AUG для проведения доклинического тестирования новых сахароснижающих лекарственных средств.

4. В работе представлены новая система эффективных биоаналитических методов и технологий для проведения высокопроизводительного скрининга новых молекул-мишеней при создании перспективных лекарственных препаратов в диабетологии, а также новые технологии оценки эффективности и безопасности сахароснижающих лекарственных средств, рекомендуемые к внедрению в экспериментальную фармакологию.

5. Создана база данных новых молекул-мишеней для разработки современных средств лечения СД 2 типа и база данных молекул, отвечающих за развитие НПР тиазолидиндионов.

Практическое применение результатов диссертационной работы

Полученные результаты работы включены в материалы лекций и семинаров для студентов, интернов и ординаторов на кафедре фармакологии и клинической фармакологии ГОУ ВПО «РостГМУ» Росздрава. Новые методы оценки эффективности и безопасности тиазолидиндионов внедрены в практику выполнения работ по экспериментальной фармакологии на кафедре фармакологии и клинической фармакологии ГОУ ВПО «РостГМУ» Росздрава.

Положения, выносимые на защиту:

1. Динамика интегральных показателей жизнедеятельности, показателей шкалы изменений внешних признаков, шкалы изменения активности и гематологических параметров лабораторных крыс аутбредной линии Wistar и инбред-ной линии AUG свидетельствует о высокой эффективности и безопасности ро-зиглитазона по сравнению с пиоглитазоном.

2. Восстановление гормонально-метаболического профиля крови лабораторных крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG происходит наиболее выражено на фоне введения розиглитазона.

3. Сравнительная оценка ФК тиазолидиндионов в эксперименте свидетельствует о формировании физиологической ФК/ФД - модели при введении розиглитазона.

4. Динамика функциональных групп белков плазмы крови, мочи и поджелудочной железы у лабораторных крыс аутбредной линии Wistar и инбредной

линии AUG на фоне введения пиоглитазона и розиглитазона отражает молекулярный механизм формирования различной эффективности и безопасности тиа-золидиндионов.

5. Биоинформационный анализ спектра молекул белков плазмы крови, мочи и под желудочной железы, обнаруженных в экспериментальном исследовании эффективности и безопасности тиазолидиндионов, позволяет выделить новые молекулярные мишени для разработки сахароснижающих лекарственных средств.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе, 3 статьи в рецензируемых журналах. Работа выполнена на базе кафедры фармакологии и клинической фармакологии ГОУ ВПО «РостГМУ» (г. Ростов-на-Дону), ГУ «Научный центр биомедицинских технологий» РАМН (г. Москва).

Апробация работы

Основные положения диссертации обсуждены на конференции кафедры фармакологии и клинической фармакологии РостГМУ. Материалы диссертации были доложены на 4-м Международном симпозиуме «Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие Интернет-ресурсы» (г. Москва, 2007 г.), научно-практической конференции «Рациональная фармакотерапия: теория и практика применения лекарств» (г. Хабаровск, 2007 г.), III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2008 г.).

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 192 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения, заключения, практических рекомендаций, выводов и списка литературы, включающего 110 источников (из них отечественных - 9 источников, иностранных - 101 источник). Работа иллюстрирована 32 таблицами и 20 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

In vivo исследование выполнено на 116 лабораторных крысах - самцах аутбредной линии Wistar (56) и инбредной линии крыс AUG (60) одинакового возраста, сравнимого веса. Содержание крыс предполагало соблюдение требований GLP. Правила проведения экспериментального исследования учитывало директивы Европейского сообщества (86/609 ЕС). Сформированы 2 контрольные группы крыс: I контрольная группа (п=10) - интактные крысы аутбредной линии Wistar без СД, II контрольная группа (п=10) - интактные крысы инбредной линии AUG без СД. Крысам контрольной группы вводили перорально изотонический раствор NaCI. Через 2 недели акклиматизации крысам линии Wistar (п=46) и AUG (п=50) вводился аллоксана тетрагидрат (Merk, США) внутривенно однократно в дозе 50 мг/кг в течение 2 недель.

В контрольных и исследуемых группах крыс через 5 дней после введения изотонического раствора NaCI и аллоксана тетрагидрата оценивали интегральные показатели - внешний вид, активность, симптомы интоксикации, прирост массы тела, потребление пищи и воды за сутки, диурез, гематологические показатели, параметры метаболического и электролитного профиля крови - глюкоза, мочевина, креатинин, ХС, мочевая кислота, ТГ, белок, альбумин, глобулин, билирубин, ACT, АЛТ, ГГТ, ЛДГ, Ca2", Na+, фосфор, К+, Cl", показатели СРО (МДА) и активности АОС (СОД, каталаза, ГР, ГПО, глутатиона), уровень гормонов (кортизол и инсулин) и пептидов (С-пептид, лептин), компонентов ЦТК (пируват, лактат, 2,3-ДФГ) и цепи дыхательных ферментов (ЦХО) в крови и эритроцитах, спектр белков плазмы крови и мочи. Условием включения биомоделей в эксперимент явилось увеличение уровня глюкозы до 18 ± 4 ммоль/л по отношению к исходному уровню. Крысы рандомизированы на 4 группы: I группа (п=24) - крысы линии Wistar с СД, которым вводили розиглитазон в дозе 10 мг/кг в течение 15 дней; II группа (п=25) - крысы линии AUG с СД, которым вводили розиглитазон в дозе 10 мг/кг в течение 15 дней; III группа (п=22) -крысы линии Wistar с СД, которым вводили пиоглитазон в дозе 3 мг/кг в тече-

ние 15 дней; IV группа (п=25) - крысы линии AUG с СД, которым вводили пи-оглитазон в дозе 3 мг/кг в течение 15 дней.

В течение 24 часов после введения пиоглитазона и розиглитазона в исследуемых группах крыс осуществляли забор крови, регистрировались ФК-параметры тиазолидиндионов (Cmax, Ттах, Vd, AUC 0-:4, Т1/2). В спектре белков плазмы крови выполнялся анализ экспрессии CYP2C8, CYP2C9 и CYP3A4. Через 8 суток после введения пиоглитазона и розиглитазона крысам исследуемых групп и изотонического раствора NaCl крысам контрольных групп выполнялась оценка интегральных и гематологических показателей, параметров метаболического и электролитного профиля крови, показателей СРО и активности АОС, уровня гормонов и пептидов, компонентов ЦТК и цепи дыхательных ферментов в крови и эритроцитах, спектра белков плазмы крови и мочи. На «19» день эксперимента крысам контрольных групп осуществляли введение розиглитазона и пиоглитазона по схеме, применявшейся в исследуемых группах. Через 24 часа на «20» день эксперимента выполняли оценку интегральных показателей крыс, осуществляли забор крови и мочи, биоптатов поджелудочной железы крыс контрольных и исследуемых групп методом секционной биопсии для последующего фармакопротеомного анализа. Усыпление лабораторных животных осуществлялось этиловым эфиром. Биоптаты поджелудочной железы, образцы крови и мочи крыс перед процедурой пробоподготовки к фармако-протеомному анализу хранили в жидком азоте при температуре -80°С.

На «21» день исследования выполнялись оценка гематологических показателей, параметров метаболического и электролитного профиля крови, показателей СРО и активности АОС, уровня гормонов и пептидов, компонентов ЦТК, цепи дыхательных ферментов в крови и эритроцитах, фармакопротеомный анализ плазмы крови, мочи, биоптатов поджелудочной железы. Выполняли исследование ФК - параметров и построение ФК/ФД - моделей тиазолидиндионов.

Методы оценки гематологических показателей и эксперименте. Забор крови у крыс осуществляли из хвостовой вены. Анализ гематологических показателей выполнялся на гематологическом анализаторе «Human» (Германия).

Методы исследования метаболического профиля крови крыс. Исследование метаболического профиля крови крыс в эксперименте проводили в плазме крови, используя стандартные наборы "DiaSys" (Германия). Определяли активность ACT, AJ1T, ГГТ, ЛДГ, концентрацию глюкозы, ХС, ТГ, креатинина, мочевины, мочевой кислоты, общего белка, альбумина и глобулина. Общий билирубин измеряли наборами фирмы "Cormay" (Польша) на автоматическом биохимическом анализаторе "Targa ВТ 3000" (Италия).

Методы исследования электролитного профиля крови крыс. Исследование электролитного состава сыворотки крови (Na+, К+, Са2+) крыс контрольных и исследуемых групп проводили с помощью метода пламенной спек-трофотометрии в модификации Г.П. Гусева. Концентрацию СГ в крови определяли меркуриметрическим методом с индикатором дифенилкарбазоном.

Контроль концентрации продуктов систем СРО - АОС. Концентрацию МДА в крови крыс определяли методом К. Yagi, активность каталазы - методом М.А. Королюк и соавт. на спектрофотометре «Thermo Electron Evolution» (США). Определение активности СОД проводили по способности фермента подавлять реакцию восстановления НСТ супероксидным анион - радикалом, генерированным in vitro в системе ксантин:ксантиноксидаза.

Определение содержания ГР, ГПО и глутатиона в крови и эритроцитах. Концентрацию глутатиона в крови определяли микрометодом И.А.Шевчука и соавт. Исследование активности ГР в крови больных проводили по методу Hosoda и Nakamura, активности ГПО в эритроцитах проводили по методу В.М. Моина. Регистрацию концентрации компонентов системы глутатиона проводили на спектрофотометре «Thermo Electron Evolution» (США).

Определение уровня продуктов гликолиза в крови крыс. ПВК определяли по Фридеману и Хаугену в модификации П.М. Бабаскина. Для определения лактата в крови крыс использовали ферментативный метод его определения со спектрофотометрической регистрацией количества образовавшегося НАД*Н. Для определения активности СДГ в лимфоцитах крыс применялся ко-

личественный цитохимический метод (анализатор Pentra 60, США). Для определения уровня 2,3 - ДФГ в эритроцитах использовался метод Grisolia с соавт.

Определение активности цитохромоксидазы в эритроцитах крови крыс. Активность ЦХО в эритроцитах определяли спектрофотометрическим методом («Thermo Electron Evolution», США).

Исследования гормонального и пептидного профиля крови крыс. Для определения концентрации кортизола, ИРИ в сыворотке крови крыс применялся РИА на основе стандартных наборов РИА (В/О "Изотоп", Россия). Определение концентрации С-пептида, лептина проводилось методом конкурентного ИФА с помощью коммерческих наборов C-Peptide I, II (Rat) Е1А (ALPCO Diagnostics, США) и Rat Leptin ELISA Kit (Cosmo Bio Co., LTD, Япония).

Фармакопротеомный анализ биообразцов крыс. Для разделения белков плазмы крови, мочи и поджелудочной железы применялись технологии SDS-PAGE и разделения белков с помощью стандартных наборов, включающих 3 вида хроматографического разделения (MB-HIC С8 Kit, MB-IMAC Си, MB-Wax Kit, Bruker, США). Получение масс-спектрограмм белков, полипептидных цепей и пептидов выполняли на основе MALDI-TOF-TOF-MC (прибор Ultraflex II, Bruker, США). Идентификацию пептидного фингерпринта белков проводили в базе данных Mascot Search (Лондон, Великобритания).

Методы исследования фармакокинетики и построения ФК/ФД - модели тиазолидиндионов в эксперименте. Концентрации тиазолидиндионов в плазме крови крыс определялись с помощью ВЭЖХ/МС/МС-анализа (SURVEYORLC/SURVEYOR MSQ/LCQ DEÇA ХР Max, «Thermo Finnigan», США) с применением внутренних стандартов Pioglitazone-d4 и Roziglitazone-d4 (BDG Synthesis Со, Великобритания). Регистрировались и рассчитывались ФК-параметры тиазолидиндионов (Сmax, Tmax, Vd, AUCo.24, T|/2). ФК/ФД - модели разработаны на основе физиологической модели.

Методы биоинформационного анализа результатов эксперимента. Исследование механизмов функционирования молекул биологических жидкостей и тканей крыс с СД 2 типа, выявление молекул - мишеней для действия

новых лекарств выполнялись в базах данных: InterPro, Entrez, SWISS-PROT, OWL, NRDB, PROSITE, PR1NTS, PDB. Данные о взаимодействиях и функции белков получены с помощью компьютерных программ STRING 8.1, STITCH.

Методы статистической обработки результатов эксперимента. Статистическую обработку материала исследования проводили на основе пакета статистических программ для биомедицинских исследований "Statistica 6.0" (StatSoft Inc., США). Результаты корреляционного анализа представлены коэффициентом ранговой корреляции Спирмена (г).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика интегральных показателей жизнедеятельности крыс на

фоне введения тиазолидиндионов

Анализ динамики интегральных показателей жизнедеятельности крыс линий Wistar и AUG с СД 2 типа на «20» день эксперимента показал, что восстановление показателей объема потребления пищи и воды, прироста массы тела и диуреза, шкалы изменений внешних признаков и активности крыс происходило наиболее выражено на фоне приема розиглитазона и пиоглитазона. Зарегистрированы достоверные различия в средних значениях показателей потребления пищи (р<0,05) и воды (р<0,01) крысами II группы и контрольной группы линии AUG. Отмечены достоверно высокие средние значения показателя потребления воды во II (р<0,001) и IV группах (р<0,001) крыс по сравнению со средними его значениями в контрольных группах крыс обеих линий. Обнаружены более высокие средние значения показателя диуреза у крыс 11 и IV групп (И группа - р<0,01, IV группа - р<0,001) по сравнению со средними значениями показателя у крыс контрольной группы. Наблюдались межгрупповые различия в значениях показателей жизнедеятельности крыс 1 и III групп, доказавшие высокую эффективность розиглитазона по сравнению с пиоглитазоном.

Динамика гематологических показателей крыс на фоне введения тиазолндиндионов

Анализ динамики гематологических показателей крыс линий Wistar и AUG с СД 2 типа на «21» день эксперимента на фоне введения тиазолидиндио-

нов показал, что достоверная реставрация показателей клеточного состава крови крыс до уровня показателей контрольных групп крыс происходила в 1 и III группах на фоне приема розиглитазона и пиоглитазона. Средние значения гематологических показателей в I группе крыс не отличались от средних значений данных показателей в контрольной группе крыс, за исключением показателей количества эритроцитов (р<0,01), концентрации гемоглобина (р<0,01), средней концентрации гемоглобина в эритроците (р<0,05). Средние значения гематологических показателей во II группе крыс не отличались, от средних значений данных показателей в контрольной группе крыс линии AUG, за исключением средних значений среднего объема эритроцитов (р<0,01), количества лейкоцитов (р<0,01), тромбоцитов (р<0,001), моноцитов (р<0,001), эозинофилов (р<0,001). Средние значения гематологических показателей в III группе крыс не отличались от средних значений показателей в контрольной группе крыс линии Wistar, за исключением средних значений количества эритроцитов (р<0,001), концентрации гемоглобина (р<0,001), гематокрита (р<(),05), среднего объема эритроцитов (р<0,05), среднего содержания гемоглобина в эритроците (р<0,01), количества тромбоцитов (р<0,001), моноцитов (р<0,05), нейтрофилов (р<0,01), эозинофилов (р<0,01). Средние значения гематологических показателей в IV группе крыс достоверно отличались от средних значений показателей в контрольной группе крыс линии AUG, за исключением средних значений показателей концентрации гемоглобина, гематокрита, среднего объема эритроцитов, количества лимфоцитов. Наблюдались межгрупповые различия в значениях гематологических показателей крыс I и III групп, показавшие более высокую эффективность и безопасность при введении крысам розиглитазона по сравнению с пиоглитазоном.

Динамика параметров метаболического и электролитного профиля крови крыс на фоне введения тиазолидиндионов.

Анализ динамики биохимических показателей крыс линий Wistar и AUG с СД 2 типа на «21» день эксперимента на фоне введения тиазолидиндионов показал, что достоверное восстановление показателей биохимического профиля

крови крыс до уровня показателей контрольных групп происходила в I и III группах крыс линии Wistar с СД на фоне приема розиглитазона и пиоглитазона. Средние значения всех биохимических показателей в I группе крыс не отличались от средних значений данных показателей в контрольной группе крыс линии Wistar, за исключением концентрации мочевины в крови (р<0,05). Средние значения биохимических показателей во II группе крыс не отличались от средних значений этих показателей в контрольной группе крыс линии AUG, за исключением, средних значений концентрации общего белка (р<0,01), концентрации глюкозы (р<0,01), мочевины (р<0,01), креатинина (р<0,05); достоверные различия в средних значениях биохимических показателей в III группе крыс и крыс контрольной группы обнаружены по показателям концентрации ХС (р<0,05), СГ(р<0,05), глюкозы (р<0,05), мочевины (р<0,01), билирубина (р<0,01) и Са:+ (р<0,01) в крови крыс; обнаружены достоверные различия в средних значениях всех биохимических показателей в IV группе крыс и крыс контрольной группы, за исключением концентрации ХС, глобулина, ЛДГ, ACT, концентрации фосфора. Na+. Выявлены межгрупповые различия в значениях биохимических показателей крыс I и III групп, показавшие более высокую эффективность и безопасность при введении розиглитазона по сравнению с пиоглитазоном.

Динамика показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов к систем СРО-АОС у крыс на фоне введения тиазолидиндионов

Показано, что на «21» день исследования достоверное восстановление показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов и систем СРО-АОС крови до уровня данных показателей контрольных групп крыс происходила в I и III группах крыс линии Wistar на фоне приема розиглитазона и пиоглитазона. Средние значения показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов и систем СРО-АОС во II группе крыс не отличались от средних значений аналогичных показателей в контрольной группе крыс, за исключением показателей концентрации ПВК (р<0,01), лактата (р<0,05). Достоверные различия в средних значениях биохимических показателей в 111 группе крыс и крыс контрольной группы обнаружены по показателям концентрации каталазы,

СОД, ГР, глутатиона, лактата в крови крыс, средние значения остальных показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов и систем СРО-АОС в III группе крыс не отличались от средних значений данных показателей в контрольной группе крыс. Обнаружены достоверные различия в средних значениях показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов и систем СРО-АОС в IV группе крыс и крыс контрольной группы, за исключением показателя концентрации ГПО в крови. Наблюдались межгрупповые различия в значениях показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов и систем СРО-АОС крыс 1 и III групп, показавшие более высокую эффективность розиглитазона по сравнению с пиоглитазоном в отношении реставрации ключевых звеньев гликолиза и окислительно - восстановительных процессов.

Динамика показателей уровня гормонов и пептидов в крови крыс на фоне введения тиазолидиндионов

Результаты оценки динамики средних значений уровня гормонов и пептидов в крови крыс линий Wistar и AUG контрольных и исследуемых групп в условиях СД 2 типа при введении тиазолидиндионов представлены на рис. 1,2.

20 10

-10 -20 -30 -40 --50 --60

%

14,3"

-8,9*

2,8'

0,2'

-13,7*

-22,3'

ш

-29,3*

-1,1'

ни

-8,7'

-11,1*

-26*

5,1'

-5,3'

-39,1*

-47,8*

1 группа, «5» день

I группа, «21» день

□ Кортизол

III группа, «5»день

ШИРИ

□ С-пептид

-26,1'

III группа, «21» день

ЕЗ Лептин

Примечания. ' - недостоверные различия; * -р<0,05; ** - р<0,01.

Достоверная реставрация работы гормональных осей и параметров резервных возможностей поджелудочной железы крыс до уровня показателей контрольных групп происходила у крыс линии \Vistar с СД 2 типа, получавших розиглитазон и пиоглитазон.

Рисунок 1. Динамики показателей содержания гормонов и пептидов в крови

крыс исследуемых групп на фоне введения тиазолидиндионов: линия \Vistar. о

-10 -20 -30 -40 -50

-20,9*

■9,3

-32,9*"

"Тгвп -1'8 -0,6'

-4,6*

-20'

-22,4"

рг

•48*

-14,2*'

-19,4'

-9,1

-27'

II группа, «5» день

II группа, «21» ден ь

-37,1**

IV группа, «5» день

-36'

IV группа, «21» день

□ Кортизон ШИРИ ПС-пептид ШЛептин

Примечания. ' - недостоверные различия; * -р<0,05; ** - р<0,01.

Рисунок 2. Динамика показателей содержания гормонов и пептидов в крови крыс исследуемых групп на фоне введения тиазолидиндионов: линия А¿7(7.

Наблюдались межгрупповые различия в значениях показателей работы гормональных и пептидных звеньев патогенеза СД у крыс I и III групп, показавшие более высокую эффективность розиглитазона по сравнению с пиоглита-зоном в отношении регуляции уровня инсулина в крови.

Фармакопротеомный профиль биообразцов крыс на фоне введения тиазолидиндионов

Для оценки молекулярных эффектов тиазолидиндионов выполнен биоинформационный анализ профиля белков крови, мочи и поджелудочной железы. Данные белки, согласно современным представлениям, принимают участие в патогенезе СД 2 типа и отражают эффективность и безопасность тиазолидиндионов на молекулярном уровне: 1) сыворотка крови - белки, регулирующие окислительно-восстановительные реакции (СУРЗА4, СУР2С8, СУР2С9, РХЯ, ОБТР!, 08ТМ1, СОД); белки, регулирующие процессы гидролиза (РАН, НОНРЯ); белки - участники ЦТК (РВР1, ТКТ, РК); белки - участники пентозо-фосфатного цикла Кальвина (ТК); белки, регулирующие клеточный рост, функцию нуклеосом, протоокогены, апоптотические белки (РР1А, р42 МАРК, вБТР!, СОД, 08ТМ1, САБР-З, САБР-9, Н18Т4Н2АА); нейросекреторные белки (СНСВ, РУСЬ); сократительные белки (ТРМ1, РРШ, ТУВВ 5); белки - пере-

носчики СЖК (FABP1); белки, предупреждающие нейродегенеративные процессы (PIN1, PPIA); белки, участвующие в передаче сигнала в иммунной системе (CTLA4, р42 МАРК, CASP-3, CASP-9); 2) моча - белки, регулирующие тонус сосудов и активность свертывающей и противосвертывающей систем крови (KNG 1, MUG 2, AIAT, K.LK); белки, регулирующие коллоидно - осмотическое давление крови, связывающие биологически активные вещества крови и ксенобиотики, участники систем детоксикации (ALB, ТВРА, CES-1); белки, регулирующие углеводный и липидный виды обмена, метаболизм костной ткани (PMF1); белки, регулирующие клеточный рост, участники реакций протеолиза в клетке, процессинга нейрогормональных факторов (TLL 2, MUG2, Al AT, INHBC); белки, участвующие в передаче сигнала в иммунной системе, белки клеточной адгезии, иммунного воспаления, супрессоры роста опухолевой ткани (UMOD, MUG2, lg к, CDH1, AIAT, ОВРЗ); 3) биоптаты поджелудочной железы - амилоидогенные белки, белки свертывающей и противосвертывающей системы (PDIA 1, СРВ1, РЕВР, ENOla, GRP 78); белки, регулирующие липидный обмен (PNLIP); белки прооксидантных и антиоксидантных систем (СОД, KRT8, PRDX6); белки, регулирующие углеводный и водно-электролитный виды обмена, процессинг гормонов, фолдинг белков (AMY2a, GRP 78, GRP 58, ATP6V1 А, РСК.2, PDIA 6); белки, регулирующие гидролиз в клетке (ELA3B, СРВ1, СРА1, РЕВР); белки, участвующие в передаче сигнала в иммунной системе, белки клеточной адгезии, иммунного воспаления, онкомаркеры (KRT8, TRA1); сократительные белки (TUBB 5, SCGN, TUBA I, ACT).

Результаты корреляционного анализа

Закономерности динамики коэффициентов корреляции между показателями молекулярного профиля крови и мочи крыс в условиях биомоделирования СД 2 типа и на фоне приема тиазолидиндионов, характеризующиеся трансформацией вида корреляционной зависимости, зарегистрированы на «21» день эксперимента и представлены в таблицах 1,2.

Таблица I. Коэффициенты корреляции между показателями молекулярного профиля сыворотки крови крыс аутбредной линии Wisiar и инбредной линии AUG контрольной и исследуемых групп на «21» день эксперимента_

Показатель г, коэффициент корреляции

CYP3A4, интенсивность эксп рессии, усл.ед.

КГ Wistar AUG I группа II группа III группа IV группа

PXR, усл.ед. - - - -0,47* - -0,53**

GSTP1, усл.ед. -0,37* -0,34* -0,15' 0,52** -0,24' 0,58**

GSTM1, усл.ед. - - 0,34* 0,41* -0,27' -0,39*

CYP2C8, интенсивность экспрессии, усл.ед.

PXR, усл.ед. - - - -0,38* - -0,44*

GSTP1, усл.ед. -0,44* -0,45* 0,3 Г 0,41* 0,34' 0,50**

GSTM1, усл.ед. - - -0,28' 1 -0,42* 0,22' 0,3 Г

CYP2C9, интенсивность экспрессии, усл.ед.

PXR, усл.ед. - - - -0,45* - -0,51**

GSTP1, усл.ед. -0,45* -0,48* 0,39* 0,55** 0,42* 0,59**

GSTM1, усл.ед. - - -0,23' -0,63** 0,26' 0,45*

СОД, усл.ед./мг белка 0,49** 0,47** -0,44* -0,28' -0,47* -0,25'

FBP1, интенсивность экспрессии, усл.ед.

ТКТ, усл.ед. 0,35* 0,38* 0,34' 0,35* 0,41* 0,39*

РК, усл.ед. 0,28' 0,26' 0,25' 0,39* 0,3 Г 0,43*

Лактат, усл.ед. -0,16' -0,18' -0,18' -0,25' -0,37* -0,46*

PPIA, интенсивность экспрессии, усл.ед.

HIST4H2AA, усл.ед. - - 0,22' 0,35* 0,42* 0,54**

р42 МАРК, усл.ед. - - -0,28' - -0,45* -

GSTP1, усл.ед. 0,28' 0,29' 0,19' 0,43* 0,28' 0,48**

CASP-3, усл.ед. - - - 0,27' - 0,38*

С ASP-9, усл.ед. - - - 0,45* - 0,27'

PIN 1, усл.ед. -0,18' -0,22' -0,20' -0,27' -0,3 Г -0,39*

ТРМ1, интенсивность экспрессии, усл.ед.экспрессии, усл.ед.

TUBB 5, усл.ед. - - 0,34' 0,42* 0,40* 0,43*

PFN1, усл.ед. 0,19' 0,2 Г 0,15' 0,33' 0,17' 0,37*

Глюкоза, ммоль/л -0,16' -0,17' -0,23' -0,19' -0,19' -0,17'

ИРИ, мкЕД/мл -0,24' -0,27' 0,22' 0,18' 0,35* 0,20'

С-пептид, нг/мл -0,15' -0,17' 0,28' 0,17' 0,32' 0,2 Г

CTLA4, интенсивность экспрессии, усл.ед.

CASP-3, усл.ед. - - - -0,56** - -0,3 Г

CASP-9, усл.ед. - - - -0,43* - -0,27'

Примечание. ' - недостоверные различия; * - достоверность связи при р<0,05, ** - достоверность связи при р <0,01.

Таблица 2. Коэффициенты корреляции между показателями молекулярного профиля мочи крыс аутбредной линии IVislar и инбреднон линии AUG контрольной и исследуемых групп на «21» день эксперимента_

Показатель г, коэффициент корреляции

KNG 1, интенсивность экспрессии, усл.ед.

КГ 1 группа 11 группа 111 группа IV группа

MUG 2, усл.ед. 0,22' 0,22' 0,28' 0,43* 0,3 Г 0.49**

А1АТ, усл.ед. 0,18' 0,18' 0,31' 0,37* 0,42* 0,49**

KLK, усл.ед. 0,27' 0,27' 0,39* 0,44* 0,30' 0,49**

ALB, интенсивность экспрессии, усл.ед.

ТВРА, усл.ед. 0,14' 0,16' 0,23' 0,32' -0,20' -0,25'

ОВРЗ, усл.ед. -0,22' -0,20' -0,29' -0,32' 0,17' 0.27"

CES-1, усл.ед. 0,24' 0,26' 0,23' 0,26' | -0,24' -0,32'

TLL 2, интенсивность экспрессии, усл.ед.

MUG2, усл.ед. 0,25' 0,26' 0,19' 0,25' 0,28' 0,34'

Al AT, усл.ед. 0,21' 0,20' 0,23' 0,27' 0,11' 0,32'

INHBC, усл.ед. 0,14' 0,16' -0,29' -0,3 Г -0,14' -0,38*

UMOD, интенсивность экспрессии, усл.ед.

MUG2, усл.ед. 0,22' 0,24' 0,24' 0,26' 0,27' 0,32'

Ig к, усл.ед. -0,19' -0,23' -0,3 Г -0,25' -0,35* -0,29'

CDH1, усл.ед. 0,2 Г 0,24' 0,29' 0,30' 0,32' 0,34'

Al AT, усл.ед. 0.15' 0,17' 0,20' 0,24' 0,22' 0.26'

ОВРЗ, усл.ед. -0,17' -0,18' -0,3 Г -0,36* -0,34' -0,38*

Примечание. ' - недостоверные различия; * - достоверность связи при р<0,05, ** - достоверность связи при р <0,01.

Наиболее выраженные изменения в значениях коэффициента корреляции зарегистрированы в группе крыс линии Wistar с СД 2 типа на фоне введения розиглитазона, что свидетельствовало о различиях в эффективности тиазоли-диндионов на уровне молекул.

Результаты исследования фармакокинетики тиазолидннднонов в условиях биомоделирования СД 2 типа

Сравнительный анализ ФК параметров розиглитазона и пиоглитазона продемонстрировал достоверное снижение средних значений показателей AUC0.24 и Т|/2 при значимом увеличении средних значений показателей Tinax, Cmax, Vd/F, CL/F во II и IV группах крыс линии AUG при введении розиглитазона и пиоглитазона по сравнению с аналогичными показателями в контрольных, I и

III группах крыс. Средние значения показателя AUC0.34 имели достоверно более низкие значения в III и IV группах крыс обеих линий при введении пиоглитазо-на по сравнению со средними значениями аналогичных показателей в I и II группах крыс, которым вводился розиглитазон. Средние значения показателей Tmax, Т|/2, Сшах, Vd/F, CL/F в 111 и IV группах крыс обеих линий при введении пиоглитазона оказались достоверно выше средних значений данных показателей в I и II группах крыс, которым вводился розиглитазон. Разработана схема для создания ФК/ФД моделей розиглитазона и пиоглитазона в эксперименте. Результаты исследования ФК розиглитазона и пиоглитазона в эксперименте свидетельствуют о наличии лучших показателей ФК для розиглитазона в связи с существованием различий в активности ферментных (CYP3A4, CYP2C8, CYP2C9, PXR) и транспортных систем (ALB, ТВРА), отвечающих за распределение и метаболизм тиазолидиндионов.

ВЫВОДЫ

1. На аплоксановой модели СД 2 типа в группах крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG показаны молекулярные пути возникновения заболевания: ЦТК, пентозо-фосфатный цикл, активация белков клеточного роста и протоонкогенов, апоптоз, активация нейросекреторных и сократительных белков, иммуногенез и амилоидогенез, тромбогенез и фибринолиз, активация системы СРО-АОС, гидролиза в крови, моче и ткани поджелудочной железы.

2. Доказано, что создание аплоксановой модели СД 2 типа у крыс линии AUG сопровождалось появлением новых белков в молекулярном профиле сыворотки крови, которые не обнаружены у крыс линии Wistar: белки PXR, CASP-3, CASP-9, CTLA отражали активацию аутоиммунных процессов на молекулярном уровне и участие ядерного механизма передачи сигнала в клетке, доказали соответствие биомоделирования СД 2 типа задачам исследования.

3. Показано, что в группе крыс линии AUG с аллоксановым СД 2 типа на фоне введения розиглитазона на «20» день эксперимента наблюдались достоверные различия по показателям объема потребления воды (р<0,001) и активности (р<0,05) по сравнению с контрольной группой крыс.

4. Выявлено достоверное восстановление гематологических показателей у крыс линии Wistar по сравнению с крысами линии AUG в условиях аллоксанового СД 2 типа на фоне приема розиглитазона: увеличение количества эритроцитов (на 6,8%), концентрации гемоглобина (на 6%), средней концентрации гемоглобина в эритроците (на 1,2%), среднего объема эритроцитов (на 4,7%), количества тромбоцитов (на 0,9%), снижение количества нейтрофилов (на 7,7%) как результирующая динамики межмолекулярных взаимодействий белков системы СРО-АОС (GSTP1, GSTM1, СОД), иммунной системы и апоптоза (PPIA, H1ST4H2AA, р42МАРК).

5. Показано гиполипидемическое действие тиазолидиндионов на основе достоверного уменьшения выраженности обратных корреляций между показателями концентрации глюкозы и интенсивностью экспрессии белка ТМР1, показателями концентрации ХС и интенсивностью экспрессии белка FABP1 в сыворотке крови при биомоделировании СД 2 типа, что свидетельствует об активации экспрессии транспортного белка для липидов Podn, белка адипоцитов, связывающего ЖК, белка, связанного с рецептором ЛПНП.

6. Доказано отсутствие эффекта пиоглитазона в отношении усиления высвобождения инсулина и С-пептида из гранул Р-клеток островков поджелудочной железы крыс линии AUG на основе выявленного перехода прямой корреляции в обратную между показателями концентрации ИРИ и С-пептида, с одной стороны, и интенсивностью экспрессии белка CHGB, а также противоположной динамики корреляционной связи с интенсивностью экспрессии белка ТРМ1.

7. Показано формирование иммунного тромбо-геморрагического синдрома на уровне почек и эффективное его устранение при введении розиглитазона на основе динамики корреляции значений интенсивности экспрессии белков иммунной системы (UMOD, IgK, ОВРЗ, CDH1) и белков, регулирующих функцию свертывающей и противосвертывающей систем (MUG2, А1АТ), в моче крыс обеих линий с аплоксановым СД 2 типа на фоне приема тиазолидиндионов.

8. Доказано, что различия в перфузионных ФК/ФД - моделях розиглитазона и пиоглитазона обусловлены влиянием различной интенсивности экспрессии

белков транспортных систем (ALB, ТВРА) и систем метаболизма (CYP3A4, CYP2C8, CYP2C9, PXR, GSTP1, GSTM1) на процессы всасывания, распределения и элиминации тиазолидиндионов у крыс линий Wistar и AUG в условиях аллоксановой модели СД 2 типа: сниженная интенсивность экспрессии всех белков в группе крыс AUG до введения тиазолидиндионов и на фоне приема пиоглитазона обусловила достоверное снижение средних значений показателей AUC0-24 (р<0,05) и Т1/2 (р<0,05) при значимом увеличении средних значений показателей Tmax (р<0,05), Cmax (р<0,05), Vd/F (р<0,05), CL/F (р<0,05) для пиоглитазона по сравнению с аналогичными показателями для розиглитазона.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. На основании полученных результатов экспериментального исследования молекулярных эффектов тиазолидиндионов рекомендуется к применению база данных, содержащая молекулы - мишени для разработки инновационных сахароснижающих лекарственных средств (PXR, TLL2, СРВ1, AMY2a, ELA3B).

2. Показана необходимость проведения молекулярного тестирования НПР сахароснижающих лекарственных средств разного химического строения на основе токсикопротеомного анализа в экспериментальном фармакологическом исследовании с выявлением молекулярного профиля, определяющего возникновение НПР (UMOD, PXR, KNG1 ).

3. Для исследования механизма действия, молекулярных эффектов и фармакокинетики новых сахароснижающих лекарственных средств в фармакологическом эксперименте рекомендуются к применению новые методы фарма-копротеомного и биоинформационного видов анализа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сарвилина И.В., Грушко И.В., Криштопа A.B., Макляков Ю.С. Разработка хронофармакологического подхода в режимах лекарственной профилактики сахарного диабета 1 типа // Владикавказский медико-биологический вестник. -2007 г. - Т.7. - № 14. - С. 235-238.

2. Сарвилина И.В., Макляков Ю.С., Криштопа A.B., Каркищенко В.Н. По-

иск новых мишеней для разработки сахароснижаюицих лекарственных средств на основе биомоделирования сахарного диабета 2 типа и протеомных технологий // Биомедицина. - 2008. - № 1. - С.5-13.

3. Sarvilina I., Krislitopa A., Maklyakov Yu., Gordienko D. AIDA: software for modeling of glucose-insulin interactions in patients vvitli diabetes mellitus type 1 // Материалы 4-го Международного симпозиума «Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие Интернет-ресурсы «(CMTPI-2007)». -Москва. - 2007 г. - С. 143.

4. Сарвилина И.В., Елисеева О.И., Криштопа A.B., Грушко И.В., Макляков Ю.С. Новая молекула-мишень для разработки инновационных противодиабе-тических лекарственных средств // Психофармакология и биологическая фармакология. - - 2007 г. -Т.7. - С. 1938.

5. Грушко И.М., Сарвилина И.В., Макляков Ю.С., Криштопа A.B. Динамика молекулярного паттерна плазмы крови при медленно прогрессирующем аутоиммунном сахарном диабете у взрослых на фоне инсулинотерапии // Сборник материалов научно-практической конференции "Рациональная фармакотерапия: теория и практика применения лекарств". - Хабаровск. - 2007 г. - С. 59-62.

6. . Сарвилина И.В., Макляков Ю.С., Лынник J1.B., Криштопа A.B. Внедрение методов оценки результатов клинико-экономического анализа генериче-ских лекарственных препаратов в лечебно-профилактических учреждениях г. Ростова-на-Дону // Проблемы стандартизации в здравоохранении. - 2007 г. - № 11.-С.74.

7. Криштопа А.В, Сарвилина И.В., Макляков Ю.С., Горшкова Ю.В. Токси-копротеомика производных тиазолидиндионов // Материалы XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва. - 2008 г. - С.322.

8. Грушко И.М., Криштопа A.B., Гиляновский М.Ю., Сарвилина И.В. Ток-сикопротеомика 3-(2, 2, 2-триметилгидразиния) пропионата // Токсикологический вестник. - 2009. - № 6. - С 12 - 16.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2,3 -ДФГ 2,3 -дифосфоглицерат бЬР Правила качественной лабора-

АЛТ аланинаминотрансфераза торной практики

АОС антиоксидантная система СЯР58 белок, регулируемый глюкозой

АСТ аспартатаминотрансфераза С5ТМ1 глутатион - Б-трансферазаМи 1

ВЭЖХ высокоэффективная вБТР! глутатион-Б-трансфераза Р1

жидкостная хроматография НОНРЯ дигидроптеридин-редуктаза

ГГТ гам ма- глутам илтранспептидаза Н18Т4Н2АА гистоновый белок Н2А, тип 4

ГПО глутатион-пероксидаза 'В к иммуноглобулин каппа-цепь

ГР глутатион-редуктаза ЮТШС С-цепь ингибина р

ИРИ иммунореактивный инсулин КЬК. калликреин

КГ контрольная группа КЛМС 1 Т-кининоген 1

лдг лактатдегидрогеназа К.ЯТ8 кератин, тип II, форма 8

МДА малоновый диальдегид МАЬШ-ТОР время-пролетная масс-

МС масс-спектрометрия спектрометрия с лазерной де-

НПР неблагоприятная побочная сорбцией и ионизацией

реакция М1Ю2 ингибитор 3 а-1-протеиназы

нет нитросиний тетразолий ОВРЗ альфа2и-глобулин

пол перекисное окисление липидов р42 МАРК митоген-активируемая

РИА радиоиммунологический анализ протеинкиназа р42

сд сахарный диабет РСК.2 конвертаза прогормона 2

едг сукцинатдегидрогеназа Р01А дисульфид-изомераза

сод супероксиддисмутаза РЕВР фосфотидилэтаноламин-

СРО свободнорадикальное окисление связанный белок

тг триглицериды РРЖ профилин 1

ФД фармакодинамика РПМ1 пептидил-пролилизомераза А

ФК фармакокинетика РК пируваткиназа

хс холестерин РМП остеокальцин

цтк цикл трикарбоновых кислот РГШР триацилглицерол-липаза

цхо цитохромоксидаза РРАЯу рецепторы, активирующие

А1АТ а-1-антитрипсин пролиферацию пероксисом.

АСТ актин подтип гамма

АЬВ сывороточный альбумин РР1А пептидилпролилизомераза А

АМУ2а а-амилаза Р1ШХ6 пероксиредоксин 6

АТР6У1А АТРаза, Н+ транспортная РХЯ ядерный рецептор, группа 1

лис площадь под кривой «концентра- РУйЬ изофермент гликоген-

ция-время» фосфорилазы печени

САБР каспаза БСвЫ секретоагогин

СОН1 Е-кадгерин ЗЭЗ-РАСЕ гель-форез с натрия додецил-

СЕБ-1 карбоксиэстераза фосфатом

стов хромогранин-р Т„2 период полувыведения

сь клиренс ТВРА транстиретин -преапьбумин

СР карбоксипептидаза ТЫ 2 толлоидоподобный белок 2

СТЬА4 белок 4 цитотоксических Т- Тгпах время достижения максимальной

лимфоцитов концентрации вещества

СУР цитохром ТРМ1 тропомиозин, изоформа 1

ЕЬАЗВ эластаза 3 В Т11А1 эндоплазмин

Е1М01а а-энолаза ТиВА 1 тубулин - альфа 1

Р биодоступность ТиВВ 5 тубулин - бета 5

РАВР1 белок, связывающий жирные ки- имоо уромодулин

слоты Ус) объем распределения

РАН фумарилацетоацетатгидролаза Сшах максимальная концентрация

РВР1 фруктозо-1,6-дифосфатаза 1 ТКТ транскетолаза

КРИШТОПА Анна Викторовна

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ЭФФЕКТОВ ТИАЗОЛИДИНДИОНОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 22 декабря 2010 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл.-печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 2212. Гарнитура Times.

Отпечатано с оригинал-макета заказчика В типографии «БЭСТ» , т. (863) 256-75-79, www.print61.ru

Актуальность темы. В настоящее время 146,8 млн. жителей планеты (2,1%) страдают СД 2 типа. По прогнозам Международного института СД, к 2010 г. их число может составить более 200 млн. человек (3%). По данным ЭНЦ РАМН, в России 8 млн. человек (5% всего населения), страдают СД, из них 90% СД 2 типа (Шестакова М.В., 2001; Дедов И.И., 2003). Смертность больных СД 2 типа в 2,3 раза выше, чем смертность в общей популяции.

В научной медицинской литературе представлены многочисленные данные о различной эффективности и безопасности применения сахаросни-жающих лекарственных средств, относящихся к различным классификационным группам по химическому строению и механизму действия (Chen N., 1992; Brunmair В. 2004). Наиболее интересные данные о новых фармакологических эффектах, в том числе, побочных эффектах, получены в ходе экспериментальных и клинических исследований эффективности и безопасности сахароснижающих лекарственных средств из группы тиазолидиндионов (Artwohl M., 2005; Chou, F., 2007).

Поиск причин новых доказательных фактов о различной эффективности и безопасности применения тиазолидиндионов, полученных в клинике, возможен только на основе стандартного протокола экспериментального фармакологического исследования и новых методов молекулярного тестирования лекарственных средств данной фармакотерапевтической группы, в том числе, с помощью инновационных систем для высокопроизводительного скрининга новых молекул-мишеней в диабетологии, а также на основе новых методов биомоделирования в экспериментальной фармакологии.

Известно, что в основе развития СД 2 типа лежит несколько генетических дефектов, представленных в эксперименте на основе биомоделирования: дефект в гене инсулина, проявляющийся снижением чувствительности рецепторов к инсулину периферических тканей, нарушением внутриклеточной передачи сигнала на пострецепторном уровне, а также генетически обусловленная экспрессия адипоцитокинов и антител к рецепторам инсулина.

Сахароснижающие лекарственные средства из группы тиазолидиндио-нов рассматриваются как препараты, повышающие чувствительность к инсулину и улучшающие функцию [3-клеток поджелудочной железы. В механизме действия тиазолидиндионов рассматривается фармакологическая активация рецепторов PPARy, вызывающая экспрессию нескольких генов и приводящая к возникновению целой палитры молекулярных эффектов, которые лежат в основе как необходимых терапевтических эффектов этих препаратов, так и НПР. Сегодня отсутствует информация о влиянии этой группы са-хароснижающих лекарственных средств на экспрессию и взаимодействие ключевых молекул патогенеза СД 2 типа, которые определяют эффективность и безопасность применения тиазолидиндионов.

В связи с этим исследование, направленное на изучение молекулярных паттернов биологических жидкостей и тканей при применении тиазолидиндионов в условиях СД 2 типа на основе биомоделирования, единой технологии регистрации и экспериментального скрининга новых молекул - мишеней для разработки инновационных лекарственных препаратов, представляется крайне перспективным.

Цель работы: исследование молекулярных эффектов розиглитазона и пиоглитазона в эксперименте на основе биомоделирования СД 2 типа.

Для достижения указанной цели необходимым является решение следующих задач:

- разработать модель аллоксанового СД 2 типа на основе аутбредной линии крыс Wistar и инбредной линии крыс AUG;

- провести исследование интегральных показателей жизнедеятельности, показателей шкалы изменений внешних признаков, шкалы изменения активности и гематологических параметров крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG с аллоксановой моделью СД 2 типа на фоне введения тиазолидиндионов;

- провести исследование гормонально-метаболической составляющей ФД эффектов тиазолидиндионов в эксперименте;

- выполнить поиск фармакопротеомных профилей биологических жидкостей и тканей (кровь, моча, поджелудочная железа) крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG с аллоксановым СД 2 типа при введении розиглита-зона и пиоглитазона;

- провести исследование ФК - параметров и разработку ФК/ФД - модели для тиазолидиндионов на биомоделях СД 2 типа;

- разработать интегральные схемы межмолекулярных взаимодействий в биологических жидкостях и тканях на фоне введения тиазолидиндионов.

Научная новизна.

Впервые выполнено исследование гормонально - метаболической составляющей ФД - эффектов тиазолидиндионов на модели аллоксанового СД 2 типа у крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG.

Впервые в исследовании представлены сравнительный анализ особенностей ФК тиазолидиндионов и разработка ФК/ФД - модели для розиглита-зона и пиоглитазона в условиях биомоделирования СД 2 типа.

В работе впервые выполнена сравнительная оценка молекулярных эффектов пиоглитазона и розиглитазона с помощью системы высокотехнологических биоаналитических методов исследования.

Впервые представлены схемы молекулярного механизма реализации ФД-эффектов тиазолидиндионов при СД 2 типа в условиях эксперимента, выделены новые молекулы для разработки перспективных сахароснижаю-щих лекарственных средств (PXR, TLL2, СРВ1, AMY2a, ELA3B) и молекулы, отвечающие за развитие НИР данной группы лекарственных средств (UMOD, PXR, KNG1).

Впервые в работе выполнен анализ молекулярных причин возникновения H1JLP розиглитазона и пиоглитазона. Практическая значимость.

1. Экспериментальное исследование доказало наличие молекулярных маркеров эффективности и безопасности применения тиазолидиндионов в условиях экспериментального СД 2 типа.

2. Результаты фармакопротеомного анализа тиазолидиндионов и сравнительной оценки их ФК являются доказательной основой для разработки новых лекарственных средств и проведения качественных клинических испытаний сахароснижающих лекарственных средств в области диабетологии.

3. Предложены биомодели аллоксанового СД 2 типа на основе аут-бредной линии крыс Wistar и инбредной линии крыс AUG для проведения доклинического тестирования новых сахароснижающих лекарственных средств.

4. В работе представлены новая система эффективных биоаналитических методов и технологий для проведения высокопроизводительного скрининга новых молекул-мишеней при создании перспективных лекарственных препаратов в диабетологии, а также новые технологии оценки эффективности и безопасности сахароснижающих лекарственных средств, рекомендуемые к внедрению в экспериментальную фармакологию.

5. Создана база данных новых молекул-мишеней для разработки современных средств лечения СД 2 типа и база данных молекул, отвечающих за развитие НПР тиазолидиндионов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Динамика интегральных показателей жизнедеятельности, показателей шкалы изменений внешних признаков, шкалы изменения активности и гематологических параметров лабораторных крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG свидетельствует о высокой эффективности и безопасности розиглитазона по сравнению с пиоглитазоном.

2. Восстановление гормонально-метаболического профиля крови лабораторных крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG происходит наиболее выражено на фоне введения розиглитазона.

3. Сравнительная оценка ФК тиазолидиндионов в эксперименте свидетельствует о формировании физиологической ФК/ФД — модели при введении розиглитазона.

4. Динамика функциональных групп белков плазмы крови,, мочи и поджелудочной железы у лабораторных крыс аутбредной линии Wistar и ин-бредной линии AUG на фоне введения пиоглитазона и розиглитазона отражает молекулярный механизм формирования различной эффективности; и безопасности тиазолидиндионов.

5. Биоинформационный анализ спектра молекул белков плазмы крови,, мочи и поджелудочной железы, обнаруженных в.экспериментальном исследовании эффективности и безопасности тиазолидиндиожщ позволяет выделить новые молекулярные мишени для>разработки сахароснижающих лекарственных средств.

Внедрение результатов работы. Полученные; результаты работы включены в материалы лекций и семинаров для студентов, интернов и ординаторов на кафедре фармакологии и клинической фармакологии РостГМУ. \ ' .

Новые: методы оценки эффективности и безопасности тиазолидиндионов внедрены в практику выполнения, работ, по экспериментальной фармакологии на кафедре фармакологии и клинической фармакологии РостГМУ.

Апробация результатов исследования; Основные положения диссертации обсуждены на конференции кафедры, фармакологии и клинической фармакологии РостГМУ. Материалы диссертации были доложены на 4-м Международном симпозиуме; «Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие Интернет-ресурсы», (г. Москва, 2007 г.), научно-практической конференции "Рациональная фармакотерапия: теория и практика: применения лекарств" (г. Хабаровск, 2007 г.); III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (г. Санкт-Петербург, 2007, г.), XV Российском национальном*конгрессе:«Человеки^ лекарство» (г. Москва, 2008г.).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 195 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 110 источников (из них отечественных - 9 источников, иностранных - 101 источник). Работа иллюстрирована 32 таблицами и 20 рисунками.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе, 3 статьи в рецензируемых журналах. Работа выполнена на базе кафедры фармакологии и клинической фармакологии РостГМУ (г.Ростов-на-Дону), Государственного учреждения «Институт биомедицинских технологий» РАМН (г. Москва), Центра протеомных исследований Института биомедицинской химии РАМН (г. Москва).

ВЫВОДЫ

1. На аллоксановой модели СД 2 типа в группах крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG показаны молекулярные патологические пути возникновения заболевания: ЦТК, пентозо-фосфатный цикл, активация белков клеточного роста и протоонкогенов, апоптоз, активация нейросекреторных и сократительных белков, иммуногенез и амилоидогенез, тромбогенез и фибринолиз, активация системы СРО-АОС, гидролиза в крови, моче и ткани поджелудочной железы.

2. Доказано, что создание аллоксановой модели СД 2 типа у крыс линии AUG сопровождалось появлением новых белков в молекулярном профиле сыворотки крови, которые не обнаружены у крыс линии Wistar: белки PXR, CASP-3, CASP-9, CTLA отражали активацию аутоиммунных процессов на молекулярном уровне и участие ядерного механизма передачи сигнала в клетке, доказали соответствие биомоделирования СД 2 типа задачам экспериментального исследования.

3. Показано, что в группе крыс линии AUG с аллоксановым СД 2 типа на фоне введения розиглитазона на «20» день эксперимента наблюдались достоверные различия по показателям объема потребления воды (р<0,001) и активности (р<0,05) по сравнению с контрольной группой крыс.

4. Выявлено достоверное восстановление гематологических показателей у крыс линии Wistar по сравнению с крысами линии AUG в условиях аллоксанового СД 2 типа на фоне приема розиглитазона: увеличение количества эритроцитов (на 6,8%), концентрации гемоглобина (на 6%), средней концентрации гемоглобина в эритроците (на 1,2%), среднего объема эритроцитов (на 4,7%), количества тромбоцитов (на 0,9%), снижение количества нейтрофилов (на 7,7%) как результирующая динамики межмолекулярных взаимодействий белков системы СРО-АОС (GSTP1, GSTM1, СОД), иммунной системы и апоптоза (PPIA, HIST4H2AA, р42МАРК).

5. Показано гиполипидемическое действие тиазолидиндионов на основе достоверного уменьшения выраженности обратных корреляций между показателями концентрации глюкозы и интенсивностью экспрессии белка ТМР1, показателями концентрации ХС и интенсивностью экспрессии белка FABP1 в сыворотке крови при биомоделировании СД 2 типа, что свидетельствует об активации экспрессии транспортного белка для липидов Podn, белка адипоцитов, связывающего ЖК, белка, связанного с рецептором ЛПНП.

6. Доказано отсутствие молекулярного эффекта пиоглитазона в отношении усиления высвобождения инсулина и С-пептида из гранул ß-клеток островков поджелудочной железы крыс линии AUG на основе выявленного перехода прямой корреляции в обратную между показателями концентрации ИРИ и С-пептида, с одной стороны, и интенсивностью экспрессии белка CHGB, а также противоположной динамики корреляционной связи с интенсивностью экспрессии белка ТРМ1.

7. Показано формирование сложного иммунного тромбо-геморрагического синдрома на уровне почек и эффективное его устранение при введении розиглитазона на основе динамики корреляции значений интенсивности экспрессии белков иммунной системы (UMOD, IgK, ОВРЗ, CDH1) и белков, регулирующих функцию свертывающей и противосвертывающей систем (MUG2, AI AT), в моче крыс обеих линий с аллоксановым СД 2 типа на фоне приема тиазолидиндионов.

8. Доказано, что различия в перфузионных ФК/ФД - моделях розиглитазона и пиоглитазона обусловлены влиянием различной интенсивности экспрессии белков транспортных систем (ALB, ТВРА) и систем метаболизма (CYP3A4, CYP2C8, CYP2C9, PXR, GSTP1, GSTM1) на процессы всасывания, распределения и элиминации тиазолидиндионов у крыс линий Wistar и AUG в условиях аллоксановой модели СД 2 типа: сниженная интенсивность экспрессии всех белков в группе крыс AUG до введения тиазолидиндионов и на фоне приема пиоглитазона обусловила достоверное снижение средних значений показателей AUC0-24 (р<0,05) и Tj/2 (р<0,05) при значимом увеличении средних значений показателей Ттах (р<0,05), Стах (р<0,05), Vd/F (р<0,05), CL/F (р<0,05) для пиоглитазона по сравнению с аналогичными показателями для розиглитазона.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. На основании полученных результатов экспериментального исследования молекулярных эффектов тиазолидиндионов рекомендуется к применению база данных, содержащая молекулы - мишени для разработки инновационных сахароснижающих лекарственных средств (РХЯ, Т1Х2, СРВ1, АМУ2а, ЕЬАЗВ).

2. Показана необходимость проведения молекулярного тестирования НПР сахароснижающих лекарственных средств разного химического строения на основе токсикопротеомного анализа в экспериментальном фармакологическом исследовании с выявлением молекулярного профиля, определяющего возникновение НПР (ИМСЮ, РХЯ, Ю\Ю1).

3. Для исследования механизма действия, молекулярных эффектов и фармакокинетики новых сахароснижающих лекарственных средств в фармакологическом эксперименте рекомендуются к применению новые методы фармакопротеомного и биоинформационного видов анализа.

183