Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Молекулярно-биологическая диагностика и мониторинг минимальной остаточной болезни в лечении острых лейкозов у детей первого года жизни

На правах рукописи

/

у/

ЦАУР Григорий Анатольевич

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА И МОНИТОРИНГ МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ В ЛЕЧЕНИИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗОВ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ

14.01.21 - Гематология и переливание крови

1I ИЮЛ 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2015 005570795

005570795

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Государственном автономном учреждении здравоохранения Свердловской области «Центр специализированных видов медицинской помощи «Институт медицинских клеточных технологий» Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Румянцев Сергей Александрович

заместитель директора по научной и учебной работу ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Доктор медицинских наук, профессор Цворепко Сергей Васильевич

заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики и бактериологии ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Голенков Анатолий Константинович

руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО Московского областного научно-исследовательского клинического института им. Н.Ф.Владимирского доктор медицинских наук, профессор Майкова Светлана Александровна

главный научный сотрудник НИИ детской онкологии и гематологии ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН

доктор медицинских наук, профессор Луговская Светлана Алексеевна

кафедра клинической лабораторной диагностики ФГБОУ РМАПО Минздрава России Ведущая организация:

Институт детской гематологии и трансплантологии им. P.M. Горбачевой ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П.Павлова Минздрава России

Защита состоится «__»_2015 года в_часов на заседании диссертационного

совета Д 208.050.01 Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ГСП-7 117997, г. Москва, ул. Саморы Машела, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава Российской Федерации www.fiikc.ru

Автореферат разослан «_»июня 2015 года

Ученый секретарь днссертационного совета:

Доктор медицинских тук, профессор В.М. Чернов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

Среди всех онкологических заболеваний у детей первого года жизни острые лейкозы (OJI) находятся на втором месте по частоте встречаемости: заболеваемость в разных странах мира колеблется в пределах 30,0-32,0 на 1 млн. детского населения соответствующего возраста (Савва Н.Н., 2008; Gurney J., 1999; Coebergh J., 2006). Острый лимфобластный лейкоз (OJIJI) у детей первого года жизни составляет от 2,5 до 5% всех случаев OJIJI у детей (Pui С.-Н., 1995; Greaves М., 1996; Reaman G. 1985: Derdelmann М, 1999). На долю острого миелоидного лейкоза (OMJ1) у детей первого года жизни приходится 7-13% от общего числа случаев ОМЛ у детей (Pui С.-Н., 1988; Stevens R.,1998; Webb D,. 2001; Creutzig U„ 2012; Pession A., 2013).

В настоящее время в Российской Федерации (РФ) достигнуты значительные успехи в лечении ОЛЛ и ОМЛ у детей старше 1 года, неуклонно повышается бессобытийная (БСВ) и общая выживаемость (ОВ) пациентов, снижается частота развил« рецидивов (Самочатова Е.В., 2007, Шнейдер М.М., 2008, Румянцева Ю.В., 2010, Карачунский А.И., 2011). В то же время, результаты терапии ОЛЛ у детей первого года жизни остаются неудовлетворительными: БСВ редко превышает 45%, а основной причиной неудачи терапии являются рецидивы (Шориков Е.В., 2005; Ferster А., 1994; Frankel L., 1997; Silverman L., 1997; Reaman G., 1999; DOrdelmaim M., 1999; Chessells J., 2002; Hilden J., 2006; Biondi A., 2006; Pieters R., 2007; Tomizawa D., 2007). На сегодняшний день наиболее эффективным способом прогнозировать развитие рецидивов считается определение минимальной остаточной болезни (МОБ). Для этой цели применяются такие высокочувствительные методы клинической лабораторной диагностики как многоцветная проточная цптометрия и различные варианты полпмеразной цепной реакции (ПЦР). Однако биологические особенности ОЛ у детей первого года жизни требуют создания специальных методов выявления МОБ с последующим сравнительным анализом полученных результатов между собой и оценкой вероятности развития рецидивов.

Актуальность создания системы мониторинга МОБ при ОЛ у детей этой возрастной группы обусловлена еще и тем, что в РФ Л.Г. Фечиной разработан оригинальный отечественный протокол MLL-Baby для терапии ОЛЛ у детей первого года жизни (Fechina L., 2007), который предусматривает многократное определение МОБ. Это, в свою очередь, обуславливает необходимость установления роли наличия и величины МОБ в различные точки наблюдения (ТН) для прогнозирования исходов терапии.

Определение МОБ невозможно без всесторонней оценки инициальных характеристик лейкозных клеток, включая наличие и тал перестройки гена MLL (myeloid-lymphoid leukemia, mixed-lineage leukemia), расположенного в хромосомном районе llq23 (Ziemin-van der Poel S.,

1991; Cimino G., 1991; Tkachuk D., 1992), других молекулярно-генетических и цитогенетических характеристик ОД а также иммунофенотипа опухолевых бластов с использованием стандартного цигогенегаческого исследования, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), ПЦР, проточной цигометрии. Более того, считается, что целый ряд объективных факторов затрудняют диагностику ОЛ у детей первого года жизни: критические варишпы транслокаций, большое разнообразие перестроек 1 XcßVMLL, существование различных типов химерных транскрипгов с участием гена MLL, нестабильность иммунофенотипа опухолевых бластов, однако изучению этих аспектов посвящены лишь единичные работы (Borkhardt А., 2002; Pieters R., 2003; Reaman G.,2003; Meyer С., 2009).

Показано, что клинические особенности OJI и чувствительность к терапии зависят не только от наличия перестройки гена MLL, но и от его гена-партнера (Pui С-Н., 2002; Balgobind В., 2009), которых на сегодняшний день известно 79 (Meyer С., 2013). Наиболее частыми партнерами MLL являются гены AF4, MLLT1MLLT3, MLLTI0, MLLT4, ELL. на долю которых суммарно приходится около 85% всех случаев ^¿¿-позитивных OJI, как у детей, так и у взрослых (Meyer С., 2009). В то же время, за счет оставшихся 15% и достигается большое разнообразие химерных генов с участием MLL, и именно их биологические особенности и клинические характеристики OJI, ассоциированных с редкими перестройками гена MLL, являются наименее изученными. Традиционно считается, что наиболее неблагоприятной при ОЛЛ является транслокация l(A\\X)IMLL-AF4, в то время как прогноз для пациентов с \{\\\\9)!MLL-MLLT¡ и t(9,U)/MLL-MLLT3 несколько лучше (Pui С-Н., 2002). С другой стороны, в рамках проспективного исследования Interfant-99 пациенты с любой из вышеперечисленных транслокаций имели сходную величину БСВ (Pieters R., 2007). Наиболее неблагоприятными транслокациями при ОМЛ у детей считаются t(I0;I l)(pl2-q23yMLL-MLLTI0 и t(6;l I)(q27;q23)/MLL-MLLT4 (Balgobind В., 2009).

Ранее изучение ОЛ у детей первого года жизни часто сводилось к исследованию характеристик пациентов, имеющих перестройки Ilq23/M,L, и не уделялось должного внимания группе пациентов без данных перестроек. Вместе с тем, помимо перестроек I lq23IMLL в исследуемой возрастной группе могут выявляться и другие цитогенетические и молекулярно-генетические аберрации, среди которых особый интерес представляет транслокация t(7;12)(q36;pl3) (Tosi S., 1998), которая специфична для ОМЛ у детей первого года жизни, ассоциирована с неблагоприятным прогнозом заболевания и во многих случаях является критической.

Таким образом, оценка МОБ, базирующаяся на основе анализа инициальных цитогенетических, молекулярно-генетических и иммунофенотипических свойств опухолевых бластов при ОЛ у детей первого года жизни является актуальным вопросом детской гематологии/онкологии.

Цель исследования

Разработать и внедрить в практику систему определения минимальной остаточной болезни для мониторинга лечения острых лейкозов у детей первого года жизни на основе инициальных молекулярно-генетических и иммунологических характеристик бластных клеток.

Задачи исследования

1. Изучить кариотип опухолевых бластов, а также спектр и частоту перестроек 1Ц23/МЫ при ОЛ у детей первого года жизни.

2. Найти взаимосвязь между возрастом и выявлением перестроек 1Ц231МЫ при ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни.

3. Установить взаимосвязь между структурой химерных генов с участием МЫ и клинико-лабораторными характеристиками ОЛ у детей первого года жизни.

4. Разработать методический подход для выявления транслокации 1(7; 1;р 13).

5. Дать характеристику иммунофенотипу опухолевых бластов при ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни в зависимости от наличия перестроек 11ц23/МЬЬ.

6. Оценить возможность использования антигена N02 для мониторинга МОБ при ОЛЛ из В-линейных предшественников.

7. Провести сравнительный анализ двух методов определения МОБ при ОЛЛ у детей первого года жизни - проточной цитометрии и обратно-транскриптазной полимер азной цепной реакции с детекцией химерных транскрштгов с участием МЫ.

8. Оценить связь МОБ в костном мозге с бессобытийной выживаемостью и развитием рецидивов при терапии ОЛЛ у детей первого года жизни по протоколу МЬЬ-ВаЬу.

9. Оценить роль использования периферической крови для определешм МОБ у детей первого года жизни с ОЛЛ, получающих лечение по протоколу МЬЬ-ВаЬу.

Научная новизна исследования

Впервые в РФ в группе пациентов первого года жизни с ОЛ определены частота и спектр перестроек 11ц23/МЫ при ОЛЛ и ОМЛ, а также описаны различные механизмы формирования химерных генов с участием МЫ, включая реципрокные транслокации (73,6%), транс-сплайсинг (15,3%) и инсерции (11,1%).

Были выявлены закономерности в локализации точек разрыва в ДНК гена МЫ в зависимости от типа ОЛ у детей первого года жизни. При ОЛЛ наиболее частой зоной разрыва в ДНК гена МЫ является 11-й ннгрон, а при ОМЛ — 9-й интрон.

Впервые в кашей стране были описаны различные типы химерных транскриптов в зависимости от зоны слияния в МЫ и генах-партнерах. У пациентов с ОЛЛ выявлено 9 транскриптных вариантов химерного гена МЫ-АР4, 5 транскриптных вариантов МЫ-

MLLT3, 3 — MLL-MLLT1, 2 — MLL-EPS15. Среди различных транскригггов MLL-AF4 наиболее часто был обнаружен вариант со слиянием 11-го экзона гена MLL и 4-го экзона AF4 (el 1е4) - в 8 случаях из 26 (30,8%). Среди 5 транскриптных вариантов химерного гена MLL-MLLT3 преобладал elleö. Из 14 пациентов с наличием химерного гена MLL-MLLT1 7 имели вариант с местами слияния в 11-м экзоне гена MLL и 2-м экзоне MLLTI, 6 — вариант е10е2 и двое — е9е2. При ОМЛ оценка структуры химерных транскриптов выявила по 4 транскриптных варианта MLL-MLLT3 и MLL-MLLT10 и 1 — MLL-MLLT11. У пациентов с MLL-MLLT3 преобладал вариант elleö, также обнаруженный в 4 из 7 случаев. Среди пациентов с наличием MLL-MLLT10 было выявлено по 2 случая химерных транскриптов е8е15, е9е9, е9е10 и 1 случай е9е4. Среди генов-партнеров MLL наиболее разнообразна была локализация зон слияния в генах AF4 (при ОЛЛ) и MLLT10 (при ОМЛ)

Впервые определена частота встречаемости перестроек гена MLL с одновременной делецией З'-конца гена MLL при ОЛ у детей первого года жизни, которая составляет 7,6%.

Охарактеризован иммунофенотип опухолевых бластов у детей первого года жизни с ОЛЛ и ОМЛ, который ассоциирован с наличием перестроек 11 q23IMLL.

Впервые установлена негативная прогностическая роль сохранения МОБ в костном мозге при ОЛЛ у детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-Baby.

Теоретическая и практическая значимость

Разработан алгоритм диагностики и определения МОБ, позволяющий выявлять любую перестройку 1Ц23/Ж£, а также проводить оценку МОБ при острых лейкозах у детей первого года жизни.

Показано, что длительное сохранение МОБ в костном мозге при ОЛЛ у детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-Baby, связано с высокой вероятностью развития рецидива.

Детально охарактеризованы частые и редкие перестройки llq23/MX. При ОЛЛ установлена взаимосвязь возраста пациентов с выявлением перестроек 1 Iq23/Mi..

Разработана комбинация праймеров и флуоресцентных зондов для выявления химерных транскриптов MLL-EPS15, MLL-MLLT10, MLL-MLLT11, MLL-MYO ! F методом ПЦР в режиме реального времени.

Показана возможность выявления транслокации t(7;12)(q36;pl3) методом FISH с использованием трехцветного флуоресцентного зонда.

Описаны аберрации иммунофенотипа, выявление которых дает возможность предположить наличие перестроек llq23/MZ и требует их верификации с использованием всех доступных молекулярно-генетических методов.

Использование предложенного алгоритма мониторинга МОБ при OJI у детей первого года жизни на основании инициальных характеристик опухолевых бластоз дает возможность надежно выявлять перестройки 1 \q23/AiLL, в том числе редкие, ранее неописанные, что позволяет развивать знания о биологии опухолевого процесса и, тем самым, совершенствовать терапию.

Эффективность разработанного диагностического метода у детей первого года жизни позволяет считать перспективным его использование для улучшения результатов лечения ОЛ у пациентов различных возрастных групп.

Положения, выносимые на защиту

1. С целью поиска маркеров для последующего мониторинга МОБ необходимо использование комплекса методов клинической лабораторной диагностики, включая проточную цитометрию, стандартное щггогенетическое исследование, флуоресцентную гибридизацию in situ и различные варианты полимеразной цепной реакции.

2. Предложенный комплексный подход к определению МОБ показал высокую качественную сопоставимость между результатами проточной цитометрии и обраггно-транскриптазной полимеразной цепной реакции.

3. Использование данных определения МОБ позволило прогнозировать результаты лечения детей первого года жизни с ОЛЛ по протоколу MLL-Baby.

Степень достоверности и апробация результатов

Степень достоверности полученных результатов основана на достаточном количестве выполненных исследований с использованием современных методов клинической лабораторной диагностики, применении коммерчески доступных калибраторов и контрольных материалов, участии в международных системах контроля качества, а также на использовании адекватных сформулированным задачам методов статистической обработки данных с применением специального программного обеспечения.

Материалы работы были представлены на V-IX Российских симпозиумах «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, 2007, 2009, 2011, 2013, 2015), Совещании мультиценгровой группы «Москва-Берлин» по изучению острых лейкозов у детей (Москва, 2007), X Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии» (Минск, 2007), 4" съезде Детских онкологов России (Москва, 2008), I Всероссийском конгрессе «Генетика опухолей кроветворной системы» (Ростов-на-Дону, 2010), Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010), Национальных днях Лабораторной медицины России

(Москва, 2011), Научной конференции «Актуальные вопросы онкогенетики» (Москва, 2011), XV и XVII Российских онкологических конгрессах, (Москва, 2011, 2013), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2011), I и П Конгрессах гематологов России (Москва, 2012, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярно-генетические и иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога» (Санкт-Петербург, 2013), IV Межрегиональном совещании Национального общества детских гематологов и онкологов (Москва,2014), 12-19м конгрессах Европейской гематологической ассоциации (Вена, 2007; Берлин, 2008; Копенгаген, 2009; Барселона, 2010; Лондон, 2011; Амстердам, 2012; Стокгольм, 2013; Милан, 2014), 49-5бв ежегодных конференциях Американского общества гематологов (Атланта, 2007; Сан-Франциско, 2008; Новый Орлеан, 2009; Орландо, 2010; Сан Диего, 2011; Атланта, 2012; Новый Орлеан, 2013, Сан-Франциско, 2014), 39-42м и 44-46" конгрессах Международного общества детской онкологии (Мумбай, 2007, Берлин, 2008, Сан-Паулу, 2009, Бостон, 2010, Лондон, 2012, Гонконг 2013, Торонто, 2014).

По теме диссертации опубликовано 17 статей, в том числе 15 — в изданиях, рекомендованных в перечне Высшей Аттестационной Комиссии Министерства образования и науки РФ, а также 1 статья в зарубежном журнале.

Личный вклад автора

Личный вклад состоит в детальном планировании научной работы, тщательном анализе научной литературы, посвященной проблеме ОЛ у детей первого года жизни. Автор принимал непосредственное участие подборе, отработке условий проведения молекулярно-генетических исследований методом ПЦР в режиме реального времени. Автором были сформированы базы данных по каждому га направлений диссертационной работы, проведены статистическая обработка полученных данных, обобщение и интерпретация полученных результатов, сформулированы научно обоснованные выводы, а также положения, выносимые на защиту, и практические рекомендации, написаны текст диссертации и автореферата, основные публикации.

Внедрение результатов работы в практику

Разработаны методические рекомендации «Мониторинг минимальной остаточной болезни при острых лейкозах у детей первого года жизни», которые утверждены ФГБУ «Федеральный научно-клинический цешр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФ (выписка из протокола заседания ученого совета №7 от 23.09.2014) и ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства

здравоохранения РФ (Выписка из протокола №1 заседания цикловой методической комиссии по педиатрии от 13.10.2014).

Результаты исследования внедрены в работу Областной детской клинической больницы №1 (г. Екатеринбург), Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онколога! и иммунологии им. Дмитрия Рогачева, Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова, Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и иммунологии Министерства Здравоохранения Республики Беларусь, НИИ канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина.

Основные положения и выводы диссертации используются в курсе лекции и семинаров при подготовке врачей клинической лабораторной диагностики на кафедре клинической лабораторной диагностики и бактериологии Уральского государственного медицинского университета.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 299 страницах машинописного текста, содержит 42 таблицы и 50 рисунков. Библиография включает 15 источников отечественной и 458 источников иностранной литературы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 4 главы результатов с обсуждением, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе проанализированы данные 254 пациентов в возрасте от 1 до 365 дней с установленным диагнозом OJI в период с 08.06.1999 по 24.03.2013гг., получавших лечение в 31 клинике Российской Федерации и Республики Беларусь. Всего в исследование было включено 109 (42,9%) мальчиков и 145 (57,1%) девочек; медиана возраста составила 6,8 мес. (диапазон 0,1-11,9). ОЛЛ был выявлен у 172 пациентов, ОМЛ — у 75, острый недифференцированный лейкоз (ОНдЛ) — у 4, острый билинейный лейкоз (ОБлЛ) — у 2, острый бифенотипический лейкоз (ОБфЛ) — у 1. Последние три варианта ОЛ были отнесены нами в группу «другие варианты ОЛ» и в дальнейшем рассматривались совместно. Количество пациентов первого года жизни с ОЛ, обследовашшх разными методами приведено в табл. 1.

При исследовании иммунофенотипа опухолевых клеток результаты, полученные у детей первого года жизни, сравнивались с 427 пациентами старше 1 года, включая 371 пациента с ОЛЛ, 49 с ОМЛ, 1 с ОБлЛ, 4 с ОБфЛ, 2 с.ОНдЛ. Морфологический вариант по

FAB-классификации был ювесген у 68 пациентов с OMJI. Пациенш с синдромом Дауна (п=3) в анализ не включались.

Таблица 1. Количество пациентов первого года жизни с ОЛ, обследованных разными методами

Диагностический метод Количество пациентов (обследованных образцов)

ОЛЛ (п=172) ОМЛ (п=75) Другие ОЛ (п=7) Всего (п=254)

Инициальная диагностика

Цитогенетика 107 63 6 176

FISH 78 44 4 126

ОТ-ПЦР 153 51 5 209

Иммунофенотипирование 169 75 7 251

Секвенирование 51 17 — 68

ДИ-ПЦР 52 19 1 72

Мониторинг МОБ

ПЦР-РВ КМ 74(491) 10/43 — 84 (554)

ПЦР-РВПК 53/(142) —■ — 53 (142)

Проточная цитометрия 71/(458) — 3(13) 74(471)

В исследование по выявлению транслокации t(7;12)(q36;pl2) методом FISH было включено 8 пациентов с ЛЛ. ¿-негативны м ОМЛ, а также 1 пациент с ОБфЛ. Медиана возраста составила 8,7 мес. (диапазон 5,2-11,7). В исследуемой группе было 2 мальчика и 6 девочек.

Сопоставимость результатов определения МОБ методами проточной цитометрии и ОТ-ПЦР оценивали в 401 образце костного мозга, взятых от 61 пациента с ОЛЛ из В-линейных предшественников и различными перестройками гена MLL.

В исследование по оценке прогностической значимости МОБ в костном мозге (КМ) было включено 39 пациентов с ОЛЛ и установленным типом перестроек гена MLL, включенных в протокол MLL-Baby с сентября 2003 г. по июнь 2011 г. В исследуемой группе было 12 мальчиков (31%) и 27 девочек (69%), медиана возраста составила 4,4 мес (диапазон 0,1-11,8). Для оценки прогностической роли выявления МОБ в периферической крови (ПК) было проведено исследование 142 парных образцов (КМ и ПК) от 53 пациентов с различными перестройками гена MLL, получавших терапию по протоколу MLL-Baby. Схема протокола с указанием точек наблюдения (ТН), в которые проводилась оценка МОБ, приведены на рис. 1.

Диагноз ОЛЛ устанавливался на основании стандартных морфологических показателей (Bennett J., 1976) и данных иммунофенотипирования согласно критериям группы EGIL (Bene М.С., 1995; Bene М.С., 2011), ОМЛ - на основании морфологических

критериев Франко-Американо-Британской (FAB) классификации (Bennett J., 1976), а ОНдЛ, ОБфЛ и ОБлЛ — по данным иммунофенотипирования.

ТНЗ ТНЗ TW 111

1 UiUUil

Протокол ÏVILL-Baby

\tW.11Xa21:« UlL-aF-*, Дйю 36/43

i HR

1;ч23)>

36/43 попге® order

/ 12 Gy для гациешое, Г доммшмн 2 uec. с > hHMV (яшрол emíojom

f t

flt^tttl1

TH2 ТНЗ TH4 TMS TH6 TH7 TH8 TH9

Set» О Кем ( Я«» « 1ч* Я Дг<л ! J

Рисунок 1. Схема протокола MLL-Baby с указанием ТН определения МОБ.

Иммунофенотипирование опухолевых клеток в костном мозге производилось методом 4-10-цветной проточной цитометрии на приборах «FACS Canto», «FACS Canto II» и «FACS Aria» (Becton & Dickinson (BD), США). Для иммунофенотипирования применялись первичномеченные моноклональные антитела. Результаты иммунофенотипирования оценивались при помощи программного обеспечения FACS Diva 4.0-6.1 (BD, США). Популяцию считали позитивной по тому или иному маркеру, если 20% и более клеток экспрессировали исследуемый антиген. Результат определения МОБ рассчитывали в виде процентного содержания опухолевых клеток среди всех ядросодержащих клеток костного мозга. Для определения экспрессии NG2 применяли антитело 7.1-РЕ (Beckman Coulter, США). Для сравнений экспрессии NG2 на разных этапах терапии использовали значения средней интенсивности флюоресценции (Mean Fluorescence Intensity, MFI). Для сравнения данных экспрессии, полученных на разных приборах, MFI пересчитывали в количество молекул эквивалентного растворимого флюорохрома (MESF) при помощи калибровочных частиц "Quanti Brite" (BD, США), содержащих известное количество молекул РЕ.

При проведении цитогенетического исследования применялась техника приготовления «прямых препаратов» или краткосрочное культивирование клеток (24, 48 часов). Дифференциальную окраску хромосом на G-полосы проводили красителем Гимзы после предварительной обработки препаратов трипсином. В большинстве случаев анализировали не менее 20 метафазных пластинок. Анализ хромосом выполняли в

соответствии с международной номенклатурой хромосом человека (ISCN), принятой на момент выполнения стандартного цитогенетического исследования (ISCN 1995, 2005, 2009). В ходе данной работы все кариотшты были повторно оценены с учетом рекомендаций ISCN 2013 (Schaffer L., 2013). Дополнительными хромосомными аберрациями (ДХА) считали все клональные аномалии, сочетавшиеся с перестройками llq23/AflZ (Coenen Б., 2011). Кариотип считали комплексным, если у пациентов с OMJI каждая клетка лейкозного клона содержала не менее трех хромосомных изменений, включая перестройки района Uq23 (Betts D., 2007; Swerdlow S., 2008).

Для выявления перестроек гена MLL методом FISH был использован двухцветный ДНК-зонд Vysis LSI MLL Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe (Abbott Molecular, США). В случае стандартной (типичной) перестройки гена MLL выявляются 1 красный, 1 зеленый и 1 желтый совмещенный (сливной) сигналы (1R1G1F). В ряде случаев наряду с перестройкой гена MLL одновременно могут наблюдаться делении данного гена, располагающиеся дисгальнее (3') по отношению к зоне перекрытия двух частей зонда, что приводит к исчезновению красного сигнала (1G1F).

Для выявления транслокации t(7;12)(q36;pl2) методом FISH по нашему заказу компанией «Metasystems» (Германия) был специально разработан трехцветный флуоресцентный зонд, состоящий из (1) зонда на точку разрыва в хромосомном районе 12р13 ценгромерная часть которого, меченная оранжевым флуоресцентным красителем, расположена проксимальнее гена ЕТУ6, а теломерная, меченная зеленым флуоресцентным красителем, — дистальнее гена ETV6 с небольшой зоной перекрытия самого гена; (2) двух последовательностей, меченных голубым флуоресцентным красителем (Aqua), фланкирующих нуклеотидную последовательность гена HLXB9 (MNX1) в хромосомном районе 7q36 (рис. 2).

Рисунок 2. Схема трехцветного флуоресцентного зонда для выявления 1(7; 12)№б;р 12).

■« '«ж

При использовании зонда нормальное распределение флуоресцентных сигналов, соответствующее отсутствию транслокации t(7;I2)(q36;pl2) будет следующим: на каждой 12-й хромосоме должен располагаться 1 оранжевый сигнал (О) от центромерной и 1 зеленый (G) от теломерной частей зонда, комплементарных хромосомному району 12р13; на каждой 7 хромосоме — по 2 голубых сигнала (В), гибридизующихся по обе стороны от гена HLXB9 (MNX1) в 7q36.

ОТ-ПЦР проводилась в двух модификациях: либо с детекцией методом гель-элекгрофореза (п=147), либо при помощи наборов «JIK-Биочип» (п=62) (Биочип-ИМБ, Москва). Полученные в ходе ОТ-ПЦР ампликоны очищали при помощи набора «Wizard SV Gel and PCR Clcan-Up System» (Promega, Германия). Секвенирующую реакцию проводили с применением праймеров, использовавшихся во втором раунде гнездной ОТ-ПЦР и набора «BigDye Terminator 3.1» (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя. Секвенирование поводили в двух направлениях на генетическом анализаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США).

При наличии перестроек гена ЛÍLL в диагностическом материале, выявленных методом ОТ-ПЦР, проводили ПЦР-РВ для количественной оценки химерного транскрипта как в диагностическом образце, так и во всех доступных образцах, полученных в ходе терапии. ПЦР-РВ проведена 84 пациентам. Для выявления химерных транскриптов MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3 нуклеотидная последовательность праймеров и флуоресцентных зондов была взята из работы (Jansen М„ 2007). Для большинства других химерных транскриптов — MLL-EPS15, MLL-ULLTU, MLL-ULLT10, MLL-MY01F — использовались комбинации праймеров и зондов к гену MLL, взятых из работы (Jansen М., 2007), с праймерами комплементарными основным зонам разрыва исследуемых генов-партнеров, которые были подобраны с использованием программного обеспечения «Clone Manager Suite 7.0» (Scientific & Educational Software, США). В ему вариабельности зон слияния в химерных транскриптах MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT10 при их выявлении методом ПЦР-РВ использовался мультиплексный вариант. Чувств1ггельность ПЦР-РВ, оценивавшаяся методом лимитирующих разведений клеточных культур RS4;11, MV4-11 и ТНР-1, составила 1x10"*. В качестве калибраторов для ПЦР-РВ использовались плазмцды, несущие фрагменты генов KÍLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT10, MLL-MLLT4, ABL (все Ipsogen, Франция), MLL-EPS15 (Лаборатория генной инженерии ГНЦ РАМН). В дальнейший анализ брались образцы, в которых экспрессия контрольного гена ABL, превышала 104 копий. Для количественной оценки величины МОБ на основании данных, полученных в ПЦР-РВ, использовалась методика расчета, рекомендованная консорциумом «Европа против рака» (Формула 1), основанная на отношении величин экспрессии химерного (ХГ) и нормального генов (НГ) в кошеретной ТН и на момент

установления диагноза (DS) (Beillard Е., 2003):

(Число копий транскрипта ХГ/ Число копий транскрипта НГ) тн МОБ =-—--х юо%

(Число копий транскрипта ХГ / Число копий транскрипта НГ) DS

Для проведения длинной инвертированной ПЦР (ДИ-ПЦР) в качестве исходного материала использовали геномную ДНК в количестве 1 мкг, выделенную из смеси лейкоцитов и властных клеток костного мозга, взятого в момент установления диагноза.

Для мониторирования МОБ с использованием геномной ДНК комбинацию праймеров и зондов подбирали с использованием программного обеспечения «Clone Manager Suite 7.0» (Scientific & Educational Software, США), исходя из структуры зоны слияния генов ULL и EPS 15, индивидуальной для каждого пациента. Условия проведения ПЦР и интерпретация результатов ПЦР-РВ соответствовали рекомендациям Европейской рабочей группы по изучению МОБ при ОЛЛ ESG-MRD-ALL (Ve)den van der V., 2007) с дополнениями (Burmeister Т., 2006).

Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение «SPSS 17.0», «STATISTICA 8.0», «R-statistics» и «Analyse-it». В зависимости от величины групп пациентов при сравнении по качественным признакам использовался точный критерий Фишера, либо критерий х2 с поправкой Йегса. При сравнении двух групп пациентов по количественным признакам использовали критерий Макна-Уитни, при одновременном сравнении нескольких групп - критерий Крускала-Уоллиса. Для выявления порогового значения с наибольшей диагностической эффективностью разделяющей образцы пациентов был использован метод характеристических кривых (receiver operator characteristic, ROC-кривых) (Zweig M., 1993; Obuchovski N.. 2005).

С целью прогнозирования наличия перестроек гена MLL для каждого иммунологического маркера рассчитывали диагностическую чувствительность, специфичность, прогностическую ценность положительного и отрицательного результатов, а также общую диагностическую эффективность теста (Weinstein S., 2005). Результаты терапии оценивались по кривым БСВ, построенным по методу Каплана-Майера (Kaplan Е., 1958), а также по кумулятивной вероятности развития рецидива. Для сравнения кривых использовались непараметрические log-rank критерий и критерий Грея, соответственно. Расчет отношения опасности с 95% доверительным интервалом (ДИ) был проведен по методу Кокса (Сох D., 1972) в однофакторной и многофакторной моделях. Различия считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Цнтогенетическая характеристика ОЛЛ у детей первого года жизни Цитогенетический анализ был проведен у 107 из 172 пациентов с ОЛЛ. Среди этого числа наиболее часто встречались перестройки хромосомного района 1Ц23, а аберрации, типичные для детей старше 1 года, обнаружены лишь в единичных случаях. Нормальный кариотип зафиксирован у четверти пациентов (24,3%) (табл. 2).

Таблица 2. Цитогенетические подгруппы ОЛЛ у детей первого года жизни

Цитогенетическая аберрация Количество пациентов %

Проведено цитогенетическое исследование 107 100

Нормальный кариотип 26 24,3

Высокая гипердиплоидия (п=51-65) 2 1,9

Гиподиплоидия (п<44) 1 0,9

t(1;19)(q23;pl3)/7C/^-.m7 1 0,9

t(9;22)(q34;ql \)IBCR-ABLI 1 0,9

t( 12;21 )(p 13 ;q22)/ETV6-RUNXJ — —

Транслокации с вовлечением 1 lq23 64' 59,8

Сложный кариотип 7 6,5

de!(l)(p)/S77£-7Vi/./ 1 0,9

Другие 4 3,7

Примечания:

1 - Количество и доля пациентов даны без учета данных ОТ-ПЦР и FISH

Перестройки \ lqlHMLL у детей первого года жизни с ОЛЛ

Перестройки хромосомного района 1Ц23 с вовлечением гена МП выявлены у 113 нз 172 обследованных пациентов с ОЛЛ, что составило 65,7%. Исследование относительной частоты перестроек \ \qlilMLL показало, что наиболее частыми были 1(4; 11)^21 ;ч23УАЯХ-ЛР4, К11;19)(я23;р13)/М.£-МХ77 и 1(9;11)(р22д23УМН-МШЗ. Важно подчеркнуть, что наряду с ними были обнаружены и относительно редкие химерные гены, такие как МП-ЕРЬ'15 и МП-у\РРЗ, которые были обнаружены методом ДИ-ПЦР (табл. 3).

Для исследования взаимосвязи между перестройками 1 \q22ZMLL и возрастом пациентов все случаи ОЛЛ у детей первого года жизни были разделены на 2 возрастные группы - старше и младше 6 мес. Выявлено, что в возрасте младше 6 мес. перестройки \lq23IMLL были обнаружены достоверно чаще (86,1% случаев) по сравнению с пациентами в возрасте от 6 до 12 месяцев (48,4% случаев) (р<0,001). Статистически значимые различия сохранялись для 1)(я21д23)/МХ-/1^ (51,9% и 26,9%, соответственно, р=0,001), и 1;19)(я23;р13)/ЛЛХ-ЛЯХ77 (24,1% и 3,2%, соответственно, р<0,001).

Таблица 3 Относительная частота выявления перестроек \\ql3IMLL при ОЛЛ у детей первого года жизни (п=172)

Тип перестройки 1 \cp.3IMLL Количество пациентов %

Всего выявлено перестроек 1 lq23/A/¿¿ 113 100

t(4;l 1 )(q21 ;q23) / MLL-AF4 66 58,4

t(l I;19)(q23;pl3) / MLL-MLLTI 22 19,5

t(9;l I)(p22;q23) / MLL-MLLT3 12 10,6

t( 10; 11 )(p 12;q23) / MLL-MLL TIO 5 4,4

t(l;l I)(p32;q23) / MLL-EPS15 6 5,3

t(2;l I)(ql2;q23) / MLL-AFF3 1 0,9

Неизвестный ген-партнер MLL 1 0,9

При исследовании структуры химерных транскриптов было выявлено 9 транскриптных вариантов химерного гена MLL-AF4 (п=26), 5 транскриптных вариантов — MLL-MLLT3 (п=7), 3 — MLL-MLLT1 (п=14), 2 — MLL-EPS15 (п=4). Среди различных транскриптов MLL-AF4 наиболее часто был обнаружен вариант со слиянием 11-го зкзона гена MLL и 4-го экзона гена AF4 (elle4) - в 8 случаях из 26 (30,8%). Реже выявлялись химерные транскрипгы е10е4 - 6 случаев, е9е4 — 5 случаев, el 1е5 — 2 случая. Остальные варианты химерных транскриптов — е9е5, е9е6, е10е5, elle6, е12еб - были найдены однократно. Среди 5 транскриптных вариантов химерного гена MLL-MLLT3 преобладал elle6, обнаруженный в 3 га 7 случаев, еще 4 варианта — е9е6, е10е5, еЮеб и elle5 — были выявлены по 1 разу. Меньшим разнообразием отличались химерные транскрипгы MLL-MLLT1 и MLL-EPS15. Из 14 пациентов с MLL-MLLT1 7 имели вариант с местами слияния в 11-м экзоне гена MLL и 2-м экзоне MLLT1, 6 — вариант е10е2 и двое — е9е2. Поровну распределись пациенты с наличием химерного транскрипта с MLL-EPS15: у 2 был выявлен вариант е10е2, еще у двоих - el 1е2. Суммарно наиболее частой зоной слияния в гене MLL являлся 11-й экзон, на долю которого приходилось 24 случая (47,0%), 10-й экзон участвовал в образовании химерных транскриптов в 16 случаях (31,4%), 9-й — в 10 (19,6%).

Цитогенетические характеристики OJVJJI у детей первого года жнзии При ОМЛ цигогенетический анализ был проведен у 63 из 75 пациентов (табл. 4). При этом было выявлено 3 случая (4,8%) invl6(pl3q22), в то время как другие маркеры благоприятного прогноза — t(15;17)(q22;q21) и t(8;21)(q22;q22) — не были обнаружены. Комплексный кариотип выявлен нами у 10 пациентов (15,9%), включая 5 случаев с наличием перестроек llq23/A/ZZ. Нормальный кариотип клеток лейкозного клона имели 9,5% пациентов.

Таблица 4. Цитогенетические подгруппы ОМЛ у детей первого года жизни

Цитогенетическая аберрация Количество пациентов %

Проведено цитогенетическое исследование 63 100

Нормальный кариотип 6 9,5

1(8;21)№2^22) — —

1(15;17)(я22;чИ) — —

шу(16)(р^22) 3 4,8

Транслокации с вовлечением 11 я23 28' 44,4

1(1;22)(р13;Ч13) 5 7,9

1(7;12)(я36;р12)^ 3 -

Комплексный кариотип (1 Ц23(+)У 10 15,9

Комплексный кариотип (1 ^23(-))4 5 7,9

Другие 8 12,7

Примечания:

1 - Количество пациентов дано без учета данных ОТ-ПЦР и FISH;

2 - Выявлена при помощи FISH;

3 - Клоны клеток с тремя и более хромосомными аномалиями, включая перестройки 1 lq23/A/££ без маркеров благоприятного прогноза;

4 - Классический вариант комплексного кариотипа

Для АЯХ-негативных ОМЛ (п=35) характерными являлись транслокации t(7;12)(q36;pl2) и t(l;22)(pl3;ql3), выявленные нами в 3 и 5 случаях, соответственно. Последняя была обнаружена только среди пациентов с ОМЛ М7; во всех случаях t(l ;22) была единственной аномалией кариотипа. В 12 случаях лейкозные клетки содержали клональные хромосомные нарушения, не затрагивающие район Uq23, среди которых были как редкие аномалии, так и характерные для ОМЛ, такие как de!(3)(q26), add(5q), -7, add(7q), del(7q), del(20q),+21.

Выявление транслокации t(7;12)(q36;pl2) методом FISH Использование нового трехцветного зонда для FISH позволило выявить транслокацшо t(7;12) в 4 случаях, включая три случая АДХ-негагивного ОМЛ, и один случай ОБфЛ, когда клетки лейкозного клона содержали делеции del(7)(qll) и del(12)(pl3). Интересно отметить, что все позитивные случаи выявлены у девочек, и в трех из четырех случаев цитогенетически определялась трисомия 19 хромосомы. Взаимосвязи с FAB-вариантом не прослеживалось (табл. 5).

Таблица 5. Результаты использования флуоресцентного зонда для выявления транслокации 1(7; 12)

№ FAB Кариотип начальный Распределение флуоресцентных сигналов на хромосомах Данные FISH Уточненный кариотип с учетом результатов FISH

1 М5 48,XX,+19,+22, inv(16)(pl3;q22), del(12)(pl2-13?) 7 (Ы)-В der(7)-B+G 12(М)-0+0 Оег(12) - О+в+В t(7;12) + 48.ХХ.+19+22, t(7;12)(q36;pl3), inv(16)(pl3q22)

2 М7 47,XX,+19 [14] /idem, add(7q) [4] 7 (Ы) -В с!ег(7) - В+в 12(Ы)-0+0 Эег(12)-0+0+В t(7;12) + 47,XX,+19/idem, t(7;12) (q36;pl3),+mar

3 МО 47,XX,+19 [20] 7(1Ч)-В deг(7)-B+G 12 (Ы)-0+0 0ег(12)-0+В t(7;12) + 48.XX.+19, t(7;12)(q36;pl3)

4 ОБ фЛ 46,XX,del(7)(ql l),del(l 2) (pl3) ish ETV6 mv 7(И)-В der(7)-G 12(Ы)-0+С 0ег(12)-0+С+В t(7;12) + del(7)(q) 46,XX,der(7)t(7; 12)(q 11; pl3)del(7)(qllq36)

5 Мх 47,XY,+6 [11] 7 (И) - В 7 (Ы) - В 12 (N5- 1(ЖЗ Ое1(12)(р13) t(7;12) -del(12)(pl3) 47,XY,+6

6 М7 47,XY,+6,-10,-21, add(10p),del(3q), del(6q),der(19), der(19),+2 mar 7 (N1) - В 7 (Ы) - В 12 (К) - Ю+в Ое1(12)(р13) t(7;12) -del(12)(pl3) 47,XY,+6,-10,-21, add(10p),del(3q), del(6q),der(19), der(19),+2 mar

7 М5 46,XX 7 (Ы) - В 7(Ы)-В 12 (Ы) - Ю+в 12(Ы)- Ю+в t(7;12) - 46,XX

8 Мх 46,XX 7(>0-В 7 (Ы) - В 12 (Ы) - 1(ЖЗ 12 (>1) - Ю+в t(7;12) - 46,XX

9 М1 46,XX,t(5;6)(q31;ql5-16) 7(Ы)-В 7 (IV)-В 12 (Ы) - Ю+в 12 (Ы) - 10МЗ t(7;12) - 46,XX,t(5;6)(q31 ;q 15-16)

Для оценки специфичности флуоресцентного зонда были использованы цигогенетические препараты 5 пациентов с ОМЛ исследуемой возрастной группы, включая 2 случая с нормальным кариотипом, и 3 — со случайными онтогенетическим аберрациями.

Всего в исследуемой группе нами выявлено 4 различных комбинации флуоресцентных сигналов, две из которых соответствуют отсутствию транслокации (20-КЗ/2В и Ю+0/2В), две другие — различным вариантам транслокации 1{1\ 12)(^36'р 12) но ключевым в этих случаях является совместное расположение голубого сигнала с

комбинацией зеленого и оранжевого. У двух пациентов (№№ 5 и 6 в табл. 5) нами было выявлено только по одному красному и зеленому сигналу при наличии двух голубых. Так как по данным цигогенетического исследования у данных пациентов присутствовали обе хромосомы 12, и они были неизмененные, то это было расценено как внутрихромосомная деления 12р13 с возможным вовлечешгем гена ETV6.

Основываясь на результатах исследования методом FISH, была показана гетерогенность точек разрыва в хромосомном районе 7q36. В трех случаях (№№ 1-3 в табл. 5) точка разрыва располагалась непосредственно в гене HLXB9. При этом голубой сигнал был найден на трех хромосомах — на неизмененной 7 хромосоме, деривате 7 и деривате 12. У одного пациента (№4 в табл. 5) точка разрыва в хромосомном районе 7q36 локализовалась проксимальнее гена HLXB9. Это привело к тому, что зеленый сигнал находился на деривате 7 хромосомы, а голубой — дистальнее комбинации зеленого и оранжевого — на деривате 12 хромосомы. Также в этом случае была выявлена делеция длинного плеча 7 хромосомы del(7)(qllq36). В регионе 12р13 точки разрыва локализовались внутри зоны, окрашенной зеленой флуоресцентным красителем, и это мог быть как фрагмент гена ETV6, так и рядом расположенные участки хромосомы. При этом в двух случаях (№№ 1-2 в табл. 5) было отмечено расщепление зеленого флуоресцентного сигнала, который в этих случаях был расположен на трех хромосомах — на интактной 12-й хромосоме, деривате 12 хромосомы и деривате 7 хромосомы. При отсутствии расщепления сигналов визуализировалось два зеленых сигнала, расположенных на деривате 7-й хромосомы, и неизмененной 12-и.

Мы также оценили экспрессию CD34 и CD117 у пациентов с транслокацией t(7;12). Для сравнения была использована группа из 31 пациента с ОМЛ в возрасте младше 12 мес, включая 15 пациентов с перестройками гена MLL и 16 без таковых. Было показано, что экспрессия CD34, но не CD 117, достоверно чаще выявлялась у пациентов при наличии t(7;12) (табл. 6). Различия для CD34 становились более значимыми в том случае, когда группа пациентов с t(7;12) сравнивалась с АЛ. ¿-позитивным ОМЛ (р=0,009).

Таблица 6. Экспрессия антигенов CD34 и CD117 опухолевыми бластами

Показатель t(7;12) обнаружена (п=4) t(7;12) не обнаружена (п=31) Р

Количество пациентов, опухолевые бласты которых экспрессируют С034 4 10 р=0,019

Количество пациентов, опухолевые бласты которых экспрессируют СО! 17 4 14 р=0,104

Таким образом, нами показана возможность выявления критической транслокации 1(7; 12)(я36;р 13) путем использования трехцветного флуоресцентного зонда. Выявлена гетерогенность точек разрыва в хромосомных районах 12р13 и 7q36, что ведет в различным механизмам образования химерного гена Н1ХВ9(МЫХ1)-ЕТУ6. У пациентов с наличием транслокации 1(7; 12) опухолевые бласты достоверно чаще имеют менее зрелый иммунофенотип по сравнению по сравнению со случаями ОМЛ без данной транслокации.

Перестройки \lq23IMLL у детей первого года жизни с ОМЛ В исследованной группе перестройки 1Ц23/Л/££ выявлены у 42 из 75 пациентов (56,0%). Самыми частыми перестройками были t(9■,l\)(p22■,q23yMLL-MLLTЗ и 1(1О;11)(р12;я23)/ЛЯ,£-М£Л770. Кроме этого были обнаружены редкие и нетипичные для данной возрастной группы перестройки 11ц23/АЯХ. К первым следует отнести 1( 11; 19)(я23;р 1 3)/Л/££-МГО//% 1(\\М)(Я23А25)/Ми-8ЕРТ9,1(Х;11)(Ч24д23)/Л/££-Ж/>Гб, ко вторым —1(6; 11 ){ц21\(\22)1МЫ-МаТ4 и МЫ-РТО (табл. 7).

Таблица 7. Относительная частота выявления перестроек 1Ц23/М,£ при ОМЛ у детей первого года жизни (п=75)

Тип перестройки 1 lq23IMLL Количество пациентов %

Всего выявлено перестроек 1 Iq23/Aft£ 42 100

t(9; 11 ){p22;q23)/MLL-MLLT3 12 28,6

t(l0;ll){pl2,q23)/MLL-MLLTI0 12 28,6

t( 1; 11 )(q21 \q23)/MLL-MLLTJ1 2 4,8

t(4-\\)(q2\;q22)/MLL-AF4 2 4,8

t( 11; 19)(q23 ;p 13 )IMLL-MY01F 2 4,8

t(l l;19)(q23;pl3.1)/A/££-£¿£ 1 2,4

t(l 1; 19)(q23 ;p 13.3 )!MLL-MLLT1 1 2,4

t(6; 11 )(q2T,q23)/MLL-MLLT4 1 2,4

t(l 1; 17)(q23 ;q25 )/MLL-SEP T9 1 2,4

t(X;l\){q2¡>,q22)!K{LL-SEPT6 1 2,4

MLL-PTD 1 2,4

Неизвестный ген-партнер MLL 5 11,9

Также как и при ОЛЛ, мы оценили взаимосвязь между типом перестроек 1 \ql3IMLL и возрастом пациентов с ОМЛ. Перестройки \\q23IMLL встречались приблизительно с равной частой у детей младше и старше 6 мес. (56,2% и 55,8%, соответственно, р=0,843).

Цигоморфологическое исследование костного мозга было выполнено у 68 пациентов (89,3%), в том числе у 40 с перестройками 1 \q23IMLL и у 28 - без них (табл. 8).

Таблица 8. Количество пациентов с ОМЛ и различными перестройками \[(\2Ъ!МП в зависимости от БАВ-варианта

Тип перестройки 1Ц23!МП Морфологические варианты ОМЛ

МО М1 М2 М4 М5 М7 Мх1

Всего 1 \q2VMLL (+) п=42 1 (33,3)2 1 (25,0) 4 (66,7) 7 (70,0) 26 (81,3) 1 (7,7) 2 (28,6)

Перестройки 1 \<\1ИМП не выявлены (п=33) 2 (66,7) 3 (75,0) 2 (33,3) 3 (30,0) 6 (18,7) 12 (93,2) 5 (71,4)

Итого 3 (100) 4 (100) 6 (100) 10 (100) 32 (100) 13 (100) 7 (100)

Примечание (здесь и далее в таблицах):

1- «Мх» - РАВ-вариант неизвестен

2- указаны абсолютные величины, и в скобках — проценты

Ни в одном случае не были диагностированы морфологические варианты ОМЛ МЗ или ОМЛ Мб. У большинства Щ23МЯХ-позитивных пациентов был выявлен ОМЛ М5 по РАВ-классификации (26 человек, 61,9%). Суммарно на долю М4 и М5 вариантов приходилось 78,5% всех случаев Л/И-позитивного ОМЛ в исследуемой группе. В группе без перестроек 1Ц23/АЯХ преобладающим морфологическим вариантом был М7 (12 пациентов, 36,4%), М5 был выявлен у 6 человек (18,2%), М1 и М4 - по 3 пациента (9,1%), М2 и МО - по 2 (6,1%). У пациентов с наличием перестроек 110,23!МП ОМЛ М5 диагностировался достоверно чаще (р<0,001), а М7 - значительно реже (р<0,001), по сравнению с группой пациентов, у которых перестройки \\<\2Ъ!МП не были обнаружены. Существенных различий в частоте встречаемости других цитоморфологических вариантов ОМЛ между сравниваемыми группами не обнаружено.

ДХА выявлены у 10 из 34 пациентов (29,4%) с наличием перестроек \\q2HMLL и информативным цигогенетическим исследованием, в том числе комплексный кариотип — у 5 (14,7%). В трех случаях обнаружены только количественные ДХА, в двух — только структурные; в 5 случаях — сочетание количественных и структурных. Наиболее частыми количественными ДХА являлись дополнительные хромосомы 8 (3 случая), 6 и 19 (по 2 случая), а также моносомия 10 (2 случая).

Оценка структуры химерных транскриптов выявила по 4 транскриптных варианта МП-МПТЗ и МП-МИТЮ и 1 — МП-МПТ11. У единственного пациента с наличием МП-АР4 химерный транскрипт образовался при слиянии 11-го экзона гена МП с 5 экзоном АР4 (е9е5). Этот же тип химерного транскрипта МП-АР4 был выявлен лишь у 2 из 26 пациентов с ОЛЛ. У пациентов с МП-МПТЗ преобладал вариант е 11 еб, обнаруженный в 4

из 7 случаев. Выявлено также по 1 случаю транскриптаых вариантов е9е5, е9е6, еЮеб, Все они, за исключением еЮеб, встречались и в группе пациентов с М.£-ЛЯ.£Г5-позигивным OJIJI, а доминирующий вариант е11еб был самым частым и среди пациентов с OJIJI. Среди пациентов с наличием MLL-MLLT10 было выявлено по 2 случая химерных транскршттов е8е15, е9е9, е9е!0 и 1 случай е9е4. Оба пациента, у которых был найден MLL-MLLT11, имели транскриптный вариант е9е2. Суммарно, наиболее частой зоной слияния был 9 экзон гена MLL, что было выявлено в 10 случаях (59%), реже — экзоны 11 и 8 (24% и 12%, соответственно). А среди генов-партнеров МП наиболее разнообразна была локализация зон слияния в гене MLLT10.

Цитогенетическая характеристика других вариантов OJI

Выявлено 3 пациента с ОНдЛ и нормальным кариотипом, причем в одном из этих случаев методом ОТ-ПЦР был выявлен химерный транскрштг MLL-MLLT3. Лейкозные клетки одной пациентки с ОБфЛ содержали делеции del(7)(ql 1) и del(12)(pl3), что позволило предположить нам наличие t(7;I2)(q36;pl2), которая была верифицирована методом FISH.

Перестройки WqlUMLL у детей первого года жизни с другими вариантами OJI

В этой группе перестройки 11 q23/MLL были выявлены у 4 из 7 пациентов. В одном случае у пациента с ОНдЛ и нормальным кариотипом лейкозных клеток методом ОТ-ПЦР был выявлен химерный транскрипт MLL-MLLT3. В другом, также у пациента с ОНдЛ при отсутствии метафаз был выявлен химерный транскрипт MLL-MLLT10. Кроме того, транслокации с участием 1 lq23 наблюдались еще у двух пациентов с ОБлЛ: t(4;l I)(q21;q23) и t(ll;15)(q23;q22).

Использование метода флуоресцентной гибридизации in situ для выявления перестроек гена MLL

При использовании метода FISH перестройки гена MLL были выявлены у 92 из 126 обследованных пациентов (73,0%), в том числе, в 57 из 78 случаев ОЛЛ (73,1%) и в 33 из 44 случаев ОМЛ (75,0%), а также у 2-х пациентов с другими вариантами ОЛ. Одновременно с этим информативное цигогенетическое исследование проведено у 96 из 126 пациентов (76,2%), при этом транслокации с вовлечением хромосомного района llq23 выявлены у 60 (62,5%). Несмотря на более частое обнаружение перестроек гена MLL методом FISH, по сравнению с транслокациями хромосомного района llq23, выявляемыми цитогенетически, достоверных различий в эффективности этих методов не найдено (р=0,127).

При исследовании методом FISH в 85 случаях (92,4%) было выявлено стандартное распределение флуоресцентных сигналов, типичное для перестройки гена MLL (1RIG1F). В 7 случаях (7,6%) дополнительно была обнаружена делеция З'-конца данного гена (1G1F), в том числе 1 случай - с дупликацией и 1 случай - с трипликацией 5'-конца гена MLL (2G1F и 3G1F, соответственно). 3' делеция гена MIL примерно с равной частотой выявлялась у

пациентов с ОЛЛ — 7,0% (4 случая из 57) и ОМЛ — 6,1% (2 из 33) (р=0,639). Седьмой пациент имел ОНдЛ. У всех 7 пациентов с нестандартным распределением флуоресцентных сигналов был определен тип химерного гена, а также локализация точки разрыва в ДНК гена МЫ. Было выявлено 3 случая МЫ-МЫТЗ и по 2 случая МЫ-АР4 и МЫ-МЫТ10. Ни в одном случае у пациентов с 3' делецией гена МЫ нам не удалось обнаружить реципрокный ген методом ДИ-ПЦР. Нами не найдено взаимосвязи между наличием 3' делении МЫ и локализацией точки разрыва в гене МЫ (табл. 9).

Таблица 9. Локализация точек разрыва в ДНК гена МЫ в зависимости от типа распределения флуоресцентных сигналов

Локализация Количество пациентов

точки разрыва в Стандартное распределение 3' делеция гена МЫ р

гене МЫ флуоресцентных сигналов (п=64) (п=7)

Интрон 8 1 1 0,189

Интрон 9 12 1 1,000

Интрон 10 16 0 0,337

Экзон 10 1 1 0,189

Интрон 11 27 3 1,000

Экзон 11 3 1 0,346

Другие 4 0 1,000

Интересно, что ни у одного in 7 пациентов с делецией 3' коша гена MLL не выявлена точка разрыва в интроне 10, который находится на втором по частоте месте у пациентов со стандартным распределением флуоресцентных сигналов. Нами проведена оценка кумулятивной вероятности развития рецидивов внутри группы с наличием перестроек гена МЫ — у 7 пациентов с наличием перестройки гена МЫ и 3' делеции по сравнению с 64 пациентами со стандартным распределением флуоресцентных сигналов. Достоверных различий между группами не найдено (0,48±0,05 и 0,57±0,01 соответственно, р=0,489). Медиана наблюдения составила 20 мес. (диапазон 3-84).

Структура химерных генов с участием MLL и ее взаимосвязь с клиннко-лабораторными характеристиками острых лейкозов При ОЛЛ у детей первого года жизни наиболее часто точка разрыва в ДНК гена MLL локализовалась в 11-м интроне — 25 го 52 случаев (48,1%). Кроме частых локализаций точек разрыва (ингроны 9, 10, 11), на долю которых приходилось 85,6% случаев, нами были выявлены и более редкие. При ОЛЛ наибольшей вариабельностью обладал химерный ген

MLL-AF4: только в 11 из 28 (39,3%) случаев место разрыва в ДНК гена МЫ было расположено в интроне 11, в 6 (21,4%) — в 9-м интроне, по 4 (14,3%) случая приходилось на 10-й интрон и 11-й экзон. Наиболее стабильно точки разрыва локализовались при образовании химерного гена MLL-MLLT1: в 8 из 12 (66,7%) случаев местом слияния выступал 11-й интрон гена МЫ. При OMJI самым частым местом, в котором происходили разрывы в ДНК гена МЫ, являлся 9-й интрон — 8 случаев из 19 (42,1%). При этом наиболее стабильную локализацию имели точки разрыва при образовании химерного гена MLL-MLLT10: 4 случая из 5 (80,0%) — в 9-м интроне, а наиболее гетерогенную — при наличии химерного гена MLL-MLLT3. В последнем случае примерно равное количество приходилось на 9 и 11 интроны.

Пациенты с ОЛЛ, у которых точка разрыва располагалась в 11-м интроне гена МЫ, были достоверно младше по сравнению со всеми остальными (р=0,025), а также теми, у кого точка разрыва находилось в интроне 9 (р=0,017). Для ОМЛ подобной ассоциации возраста и локализации точек разрыва не выявлено (табл.10). В то же время, нами не было выявлено взаимосвязи между локализацией точки разрыва в гене MLL и типом гена-партнера, а также полом пациентов и инициальным лейкоцитозом (р>0,05).

Таблица 10. Связь возраста с локализацией точек разрыва в ДНК гена MLL у пациентов с ОЛ

Локализация точек разрыва в ДНК гена МЫ Острый лимфобластный лейкоз Острый миелоидный лейкоз

Медиана Диапазон р' Медиана Диапазон

Все пациенты 3,6 0,03-11,9 8,0 0,8-11,9

Интрон 11 3,0 0,03-11,6 — 10,8 6,1-11,0 0,109

Все остальные кроме интрона 11 (ОЛЛ) 5,6 0,7-11,9 0,025 — — —

Интрон 9 6,6 3,1-11,9 0,017 5,8 0,8-11,2 —

Интрон 10 4,2 0,7-9,2 0,324 6,8 2,2-11,9 0,570

Все остальные, кроме интрона 9 (ОМЛ) — — — 9,3 2,2-11,9 0,114

Примечание:

1 - р рассчитано по отношению к пациентам с ОЛЛ, у которых точка разрыва в ДНК гена МЫ располагалась в интроне 11;

2 - р рассчитано по отношению к пациентам с ОМЛ, у которых точка разрыва в ДНК гена МЫ располагалась в интроне 9.

Необходимо отметить, что такие редкие химерные гены как МЫ-АРРЗ, МЫ-Ш01Р, МЫ-5ЕРТб, МЫ-ЯЕРТЯ не были обнаружены на этапе первичной диагностики, а впервые были выявлены только после проведения ДИ-ПЦР. Также ДИ-ПЦР помогла в двух случаях

верифицировать наличие нетипичных вариантов химерного гена МП-АР4. В первом случае точка разрыва локализовалась в 7-м интроне гена МИ, в то время как использовавшиеся праймеры для гена МИ в ОТ-ПЦР комплементарны 8-му экзону, во втором случае точка разрыва в гене АР4 лежала в 10-м интроне, находящимся за пределами покрыли использовавшихся праймеров, которые комплементарны 8-му экзону.

В ходе работы мы описали различные механизмы образования химерных генов с участием МП, наиболее частым из которых были реципрокные транслокации (73,6%), реже — транс-сплайсинг (15,3%) и инсерции (11,1%) (табл. 11).

Таблица 11. Механизмы образования химерных генов в исследуемой группе пациентов

Химерный ген (количество случаев) Реципрокная транслокация Инсерция Транс-сплайсикг !

МП-АР4 (п=29) 29 — —

ЛЯХ 77 (п=12) 3 — 9

МПТЗ (п=14) 14 — —

Ml.LT 10 (п=6) — 5 —

ЕРБ15 (п=4) 3 — 1

МПТ11 (п=2) 2 — —

МУ01Р(п=2) 1 — 1

АРРЗ( п=1) — 1 —

ЗЕРТ6 (п=1) — 1 —

БЕРТ9 (п=1) 1 — —

ИТОГО 53 8 11

При транс-сплайсинге точки разрыва в ДНК располагались за пределам! гена-партнера МП (на расстоянии от 0,7 до 25,4 тыс. п.н. от 1 экзона). Тем не менее, на уровне кДНК это приводило к образованию химерных транскриптов, выявленных в ходе ОТ-ПЦР и/ми ПЦР-РВ, и верифицированных методом секвенирования. В этих случаях зона слияния в химерных транскрипт ах состояла из экзона предшествующего шггрону, в котором произошел разрыв геномной ДНК гена МП, и второго экзона гена-партнера.

Мы также оценили расположение точек разрыва в генах-партнерах МП. Зоны разрыва в генах-партнерах МП чаще всего затрагивают один или два ннтрона, за исключением генов АР4 и МПТ10, в которых основные зоны разрывов более протяженные. Так, в гене АР4 основная зона разрывов включала в себя 3-й интрон (19 случаев, 65%), 4-й (6 случаев, 21%) и 5-й (2 случая, 7%). Также нами выявлено по 1 случаю локализации точки

разрыва в интронах 6 и 10. В гене MLLT10 нами было обнаружено три зоны разрывов: 3-й интрон (1 случай), 8-й интрон (3 случая) и 9-й тггрон (1 случай).

Иммунофевотипнческая характеристика OJUI у детей первого года жизви

У детей первого года жизни ОЛЛ был выявлен реже по сравнению с пациентами старше 1 года (67,3% и 86,9% соответственно, р<0,001). Распределение иммунологических вариантов ОЛЛ у пациентов первого года жизни (п=169) и более старших детей (п=371) также было различно. В исследуемой группе доминировал BI-ОЛЛ, который был выявлен чаще, чем у пациентов старше 1 года (53,8% и 3,2% соответственно, р<0,001), в то время как BII-ОЛЛ у детей первого года жизни встречался значительно реже (28,4% и 77,9%, соответственно, р<0,001). Иммунологический вариант BIII-ОЛЛ был обнаружен у 14,2%, что было достоверно чаще чем в возрастной категории старше 1 года — 1,3% (р<0,001). Для Т-линейных ОЛЛ зафиксирована противоположная картина: у детей первого года жизни они были найдены реже (3,0% и 14,6%, соответственно, р<0,001). Для BIV-ОЛЛ значимых различий обнаружено не было (р=0,156). Детальные результаты иммунофенотипирования опухолевых клеток пациентов с ОЛЛ первого года жизни представлены в табл. 12.

Иммунофенотипы ОЛЛ из В-линейных предшественников существенно отличались у детей первого года жизни в зависимости от наличия перестроек 1 lq23/A/££. У пациентов с наличием перестроек Ilq23/A41£ варианты BI-ОЛЛ и BIII-ОЛЛ встречались достоверно чаще, по сравнению с BII-ОЛЛ (р<0,001 в обоих случаях). Кроме того, при BII-ОЛЛ у пациентов с наличием перестроек llq2VMLL опухолевая популяция чаще всего была гетерогенна по экспрессии CD 10, в то время как у АЯХ-негативных пациентов данный антиген экспрессировался преимущественно гомогенно (медиана доли позитивных клеток 49,4%, диапазон 20,4-99,9%; и медиана 96,7%, диапазон 54,2-99,9% соответственно, р<0,001). Были выявлены также различия в количестве АА£-позитивных и М££-негативных пациентов, опухолевые клетки которых экспрессировали CD10, CD20, CD45, CD133, CD15, CD65, NG2. Кроме того, доля С022-позитивных клеток была ниже у детей с перестройками UqlVMLL (медиана 86,1%, диапазон 20,2-99,9% и медиана 99,9%, диапазон 63,4-99,9% соответственно, р=0,004).

Отсутствие экспрессии CD10 и CD20, а также высокая экспрессия CD45, CD 15, CD65, CD 133 и NG2 характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток при наличии перестроек llq23/A/££. Диагностическая эффективность выявления экспрессии NG2 для прогнозирования наличия перестроек 1 Iq23/Aft£ оказалась наиболее высокой (90,6%), в то время как для остальных маркеров она была значительно ниже. CD 10, предлагаемый некоторыми авторами для разграничения пациентов с наличием и отсутствием перестроек llq23/A/££, показал диагностическую эффективность ниже (76,4%), чем у N02, CD45

(81,9%) и CD20 (81,2%). Еще ниже диагностическая эффективность была у экспрессии CD 133 (76,5%), CD 15 (67,7%), CD65 (53,7%).

Таблица 12. Иммунологические варианты ОЛЛ в исследуемой группе пациентов

Tim перестройки 11 q23 IMLL Иммунофенотип |

BI- ОЛЛ BII- олл BIII-ОЛЛ BIV-ОЛЛ Т- ОЛЛ Нет данных

t(4; 11 )(q21 ;q23) 1 MLL-AF4 (n=66) 57 5 4 — — —

t(ll;19)(q23;pl3) / MLL-MLLT1 (n=22) 11 4 6 — — 1

t(9; 11 )(p22;q23) / MLL-MLLT3 (n=12) 5 3 4 — — —

t(10;l I)(pl2;q23) / MLL-MLLT10 (n=5) 2 — 3 — — —

t(l;ll)(p32;q23) / MLL-EPS15 (n=6) 6

t(2;ll)(ql2;q23) / MLL-AFF3 (n=l) 1 — — — — —

Неизвестный ген-партнер MLL (n=l) 1

Всего \\q2VMLL (+) (n=113) 83 (91,2) 12 (25,5) 17 (70,8) — — 1 (33,3)

Перестройки 1 lq23IMLL не выявлены (п=59) 8 (8,8%) 35 (74,5%) 7 (29,2%) 2 (100%) 5 (28,0%) 2 (66,7%)

Итого 91 (100%) 47 (100%) 24 (100%) 2 (100%) 5 (100%) 3 (100%)

Пммунофенотипическая характеристика OMJI у детей первого года жизни У детей первого года жизни OMJI бы выявлен чаще (29,9% и 11,5% соответственно, р<0,001) по сравнению с пациентами старше 1 года. Для ОБфЛ, ОБлЛ и ОНдЛ значимых различий обнаружено не было (р=0,744, р=0,644, р=0,277, соответственно). Иммунофенотипы ОМЛ существенно различались в зависимости от наличия/отсутствия перестроек llq23IMLL.

Отсутствие экспрессии CD61, а также высокая экспрессия CD1 lb, CD99, CD15, CD65, CD4, CD 133 и NG2 характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток при наличии перестроек гена MLL. Диагностическая эффективность выявления экспрессии CDllb для прогнозирования наличия перестроек гена MLL оказалась наиболее высокой (95,0%), в то время как диагностическая эффективность остальных маркеров была ниже, включая NG2 (89,7%), CD65 (83,3%), CD15 (80,6%), CD99 (78,3%), CD133 и CD4 (по 75,0%), отсутствие экспрессии CD61 (71,9%). Так как экспрессия CD15, CD65, CD133 и NG2 характерна для наличия перестроек Ilq23/Att£ и при ОЛЛ, можно утверждать, что ОЛЛ и ОМЛ у детей

первого года жизни- с наличием перестроек гена MLL имеют ряд общих особенностей иммунофенотипа.

Среди пациентов с ОМЛ без перестроек 1 \q2ZIMLL наиболее часто встречался острый мегакариобластный лейкоз с характерной экспрессией CD61. Интересно отметить, что среди пациентов с наличием перестроек llq23IMLL группы был выявлен один случай ОМЛ М7. Этот случай является нетипичным, поскольку при данном варианте ОМЛ перестройки гена MLL обнаруживаются относительно редко. Однако и при ОМЛ М7 эффективность CD IIb и NG2 для прогнозирования наличия перестроек гена MLL оказалась очень высока.

Высокая эффективность прогнозирования наличия любых перестроек llq23/A/ZX с помощью определения экспрессии NG2 (при ОЛЛ) и NG2 и/или CDllb (при ОМЛ) обусловливает необходимость применения данных антигенов при первичном иммунофенотипировании ОЛ у детей первого года жизни. При обнаружении экспрессии опухолевыми клетками этих маркеров следует проводить углубленный поиск перестроек llq23/MX при помощи мультиплексной ОТ-ПЦР, ДИ-ПЦР и FISH, а не ограничиваться стандартным определением нескольких наиболее частых химерных генов.

Возможность использования экспрессии NG2 для мониторинга МОБ

Показано, что NG2 является специфическим маркером, ассоциированным с перестройками гена MLL. Однако в большинстве исследованных нами случаев отмечалась гетерогенная экспрессия данного антигена с наличием значительной популяции NG2-негативных клеток. Кроме того, как экспрессия NG2, так и доля Ж}2-положительных клеток существенно снижались во время лечения, а при рецидиве у части пациентов все опухолевые клетки были NG2-негативны (рис. 3).

Определенное на разных этапах терапии количество CD19(+)NG2(+)-raeTOK, оказалось достоверно ниже (р<0,001) величин МОБ, выявленных в тех же образцах при помощи 6-8-цветной проточной щгтометрии. Несмотря на то, что во время индукционной терапии экспрессия NG2 не отличалась от инициальной, даже на 15-й и 36-й дни терапии количество остаточных бластов, определенное только при помощи NG2 оказалось также достоверно ниже (р=0,001).

Таким образом, NG2 нельзя использовать как единственный маркер для выделения опухолевых клеток при мониторинге МОБ методом проточной цитометрии. Тем не менее, в комбинации с другими антигенами NG2 может использоваться для определения МОБ, но не для выделения популяции опухолевых клеток, а для дополнительной характеристики популяций, выделенных по другим маркерам.

Рисунок. 3 Экспрессия Ыв2 (а) и доля Ы02-позитивных клеток (6) в образцах костного мозга у пациентов исследуемой группы (п=15), взятых на момент диагностики (Д) (п=12), во время индукционной терапии (ИТ) (п=15), консолидации/интенсификации (К/И) (п=18), при рецидиве(Р) (п=6), при лечении рецидива(ТР) (п=14). На графиках для каждого этапа терапии показаны медиана (■), межквартильный интервал (1), а также 1-й (-1-) и 99-й (т) процентам.

Определение минимальной остаточной болезни методом ПЦР в режиме реального времени у пациентов с наличием химерных гена и транскрипта \ILL-EPS15

Клинико-лабораторные характеристики пациентов с наличием транслокации 1(1;11)(р32;ч23)/МХ-ЯР5/5, приведены в табл. 13.

Для проведения количественного определения МОБ с целью оценки эффективности лечения нами была создана комбинация флуоресцентных зондов, праймеров и плазмиды, несушей фрагмент химерного транскрипта МЫ-ЕР815. На основании 10-кратных разведений плазмиды была получена калибровочная кривая, использовавшаяся для расчетов количества химерного транскрипта МП-ЕРВ15 для пациентов с наличием химерного гена МЫ-ЕРЯ15 (табл. 14).

Специфичность комбинации зондов и праймеров была проверена исследованием 15 пациентов с ОЛ и нормальным кариотипом и 15 пациентов с ОЛ и другими химерными транскриптами с участием МП. Ни в одном случае неспецифических реакций не выявлено. При разведении РНК, выделенной из исходного образца костного мозга пациента Ха 3 из табл. 13, смесью РНК 10 пациентов без онкогематологических заболеваний была определена чувствительность системы для выявления химерного транскрипта МЫ-ЕР515 методом ПЦР-РВ. Она составила 1х10"5. Аналитические характеристики полученной калибровочной кривой для химерного транскрипта МЫ-ЕР815 приведены в табл. 14. Мониторинг МОБ путем качественного и количественного определения химерного транскрипта МЫ-ЕР815

проведен 5 пациентам. Для пациентов №№ 3,4 и 5 из табл. 13 проведено также определение МОБ путем количественной оценхи химерного гена в геномной ДНК. Параметры калибровочных кривых, полученные при использовании индивидуально подобранных комбинаций зондов и праймеров приведены в табл. 14.

Таблица 13. Клинико-лабораторная характеристика пациентов с ОЛЛ и наличием t(l;l l)(p32;q23)/M.£-£/>S7J

№ Пол Возраст Кариотип клеток лейкознош клона Химерны! ген Химерный транскрипт Исход терапии

1 ж 5 мес. 46,XX,t(l;ll) (P32;q23)[ll] — Пациент жив в ППР со сроком наблюдения 39 мес.

2 м 7 мес. 46,XX,í(l;ll) (p32;q23),+8[l 1] — Отсутствие ответа на терапию, смерть через 2 мес. от начала лечения

3 ж 9 мес. 46,XX,t(l;ll) (P32;q23)[H] нитрон Ю -шпрон1 экзон 10-экзон 2 Пациент жив в ППР со сроком наблюдения 64 мес.

4 м 1 день 46,XY,t(l;l 1) (P32;q23)[13]/ 46,XY[1] интрон 11 -интрон 1 экзон 11 -экзон 2 Рецидив в сроке 18 мес., смерть от рецидива через 28 мес. от начала терапии

5 ж 3 мес. — шпрон 11 -шпрон 1 экзон 11 -экзон 2 Рецидив в сроке 7 мес., смерть от рецидива через 9 мес. от начала терапии

6 ж 4 мес. 46,XX,t(l;l 1) (P32;q23)[ll] интрон 10 - 1р32 экзон 10 -экзон 2 Пациент жив в ППР со сроком наблюдения 20 мес.

Таблица 14. Аналитические характеристики полученных калибровочных кривых

Пациенты

№№1, 3-6

Пациент № 3

Пациент № 4

Пациент № 5

Коэффициент корреляции (RJ)

Угол наклона кривой (Slope)

ПЦР-РВ химерного транскрипта

Точка пересечения с осью ординат (Y-intercept)

0,999

-3,356

ПЦР-РВ химерного гена в ДНК

38,790

0,990

0,992

0,996

-3,323

-2,987

-3,244

25,602

21,987

21,491

Примечание. Нумерация пациентов дана в соответствии с их порядковыми номерами в табл. 13.

Сравнение результатов качественного определения МОБ в кДНК и геномной ДНК у пациентов с наличием МИ-ЕР815 проведено в 23 образцах, полученных от пациентов №№ 3-5 из табл. 13. В 21 из них (91,3%) были получены идентичные результаты. В двух случаях МОБ была выявлена только в кДНК, но не геномной ДНК, что, скорее всего, связано с более высокой чувствительностью методики по определению химерного транскрипта. Несмотря на различные величины МОБ, получаемые при использовании разных способов монигорирования МП-ЕР515, нами была выявлена сходная кинетика МОБ при исследовании геномной ДНК и кДНК (рис. 4).

Рисунок 4. Кинетика МОБ, определенной в ДНК (верхняя кривая) и кДНК (нижняя кривая) у пациента № 5. Жирными горизонтальными линиями указаны пределы чувствительности в ДНК и кДНК соответственно.

На примере MLL-EPS15 был отработан механизм подбора условий для успешного выявления МОБ при наличии редких вариантов химерных транскриттгов с участием гена MLL, который в последующем был использован для MLL-MLLT10, MLL-MLLT11 и MLL-MYOIF. Единственное отличие состояло в том, что из-за потенциальных различий в структуре химерного транскрипта MLL-MLLT10 был использован мультиплексный вариант ПЦР-РВ, при котором использовалось два праймера и два зонда, комлементарные 8-му и 10-му экзонам гена MLL, вместе с тремя праймерами, комплементарными 7-му, 10-му и 18-му экзонам гена МИТЮ. В гене МНТП последовательность праймеров была локализована в

начале 2-го экзона. Таким образом мы смогли провести мониторинг МОБ у 8 пациентов с наличием химерного транскрипта MLL-MLLT10 и 2 с MLL-MLLT11. У двух пациентов с ОМЛ и наличием химерного транскрипта MLL-MLLT11 было показано, что химерный транскрипт сохранялся длительное время, а молекулярная ремиссия, достигнутая одним из пациентов, была кратковременной (менее 5 мес.) (рис. 5), что в дальнейшем привело к развитию гематологического рецидива.

1 Í

Отмена терапии Рецидив Рисунок 5. Мониторинг МОБ у пациента с наличием химерного транскрипта МП-МЫТ]I. Верхняя кривая - динамика МОБ, нижняя - чувствительность. В тех местах, где кривые сходятся, пациент становился МОБ-негативен.

На основании результатов мониторинга МОБ в кДНК была проведена оценка прогностического значения МОБ, определенной методами ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ при ОЛЛ у детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу МХХ-ВаЬу.

Сравнительный анализ результатов диагностики минимальной остаточной болезни методами проточной цитометрии и обратно-траискриптазной ПЦР у детей первого года жизни с ОЛЛ и перестройками 1 \x\lilMLL Качественная сопоставимость результатов проточной цитометрии и ОТ-ПЦР в 401 образце КМ составила 87,0%. При этом в 50 образцах МОБ была обнаружена только в ходе

ПЦР, и лишь в 2 - только проточной цитометриеи. Сопоставимость результатов была достоверно ниже в образцах, взятых на этапе индукционной терапии (78,6%; п=131) по сравнению с образцами этапов консолидации/интенсификации (п=209; 90,4%) и терапии рецидива (п=61; 93,4%) (р=0,002). В то же время не выявлено значимых различий между тремя ТН (день 15, день 36, день 43) во время индукционной терапии (р=0,098). Образцы пациентов с наличием химерного транскрштга MLL-MLLT3 имели наименьшие показатели сопоставимости данных проточной цитометрии и ОТ-ПЦР по сравнению с теми, у которых выявлялись MLL-AF4, MLL-MLLTl, MLL-EPS15 (р<0,001). Наличие в образце нормальных В-линейных предшественников не влияло на сопоставимость результатов (р=0,838).

Несмотря на то, что прямое количественное сопоставление результатов определения МОБ двумя данными методами невозможно, кинетика величины МОБ во время терапии сходна для проточной цитометрии и ПЦР-РВ. Вследствие этого, у пациентов, у которых определяется химерный транскрипт, возможно одновременное применение данных методов. Во время индукционной терапии и в начале консолидации/интенсификации, когда необходимо количественное определение МОБ, предпочтительнее использовать данные проточной цитометрии. В то же время, в последующие ТН достаточно только качественного определения МОБ, поэтому целесообразнее использовать результаты определения химерных транскриптов методом ОТ-ПЦР вследствие более высокой чувствительности метода Прогностическое значение минимальной остаточной болезни в костном мозге, выявленной методами обратно-транскриптазной ПЦР и ПЦР в режиме реального времени, прп остром лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни, получающих лечение по протоколу MLL-Baby Методами гнёздной ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ МОБ была обнаружена в 120 из 182 исследованных образцов, в то время как негативный результат при использовании как ОТ-ПЦР, так и ПЦР-РВ был зафиксирован в 57 случаях. В 4 образцах МОБ была выявлена только методом ОТ-ПЦР, в 1 - только ПЦР-РВ. Общая сходимость двух методов составила 97,3%. Во всех 5 дискордантных образцах экспрессия гена ABL, используемого для нормализации, была выше порогового значения 1,00x104 копий; медиана составила 7,38><104 копий (диапазон 3,12><104 - 1,18><105), что исключает низкое качество исходного материала как причину расхождений. Тем не менее, образцы с дискордантными результатами не были взяты в дальнейший анализ.

Мы оценили количество МОБ-позигивных и МОБ-негативных пациентов в различных ТН. Все пациенты были МОБ-позитивны в ТН1. Затем происходило постепенно нарастание доли МОБ-негативных пациентов: с 8% в ТН2 до 67% в ТН5. При разделении пациентов на группы высокого и промежуточного риска согласно критериям протокола MLL-Baby, выявленная тенденция сохранялась, за исключением того, что в ТН5 ни у одного из

пациентов группы промежуточного риска МОБ не была выявлена. Результаты сравнения величин БСВ и кумулятивной вероятности развития рецидива, полученные при разделении пациентов на группы в зависимости от выявления МОБ в ТН2, ТНЗ, ТН4, ТН5 приведены в табл. 15.

Таблица 15. Прогностическое значение выявления МОБ в различные Ш протокола MLL-Baby

Точка Количество Бессобытийная выживаемость Кумулятивная вероятность

наблюдения пациентов развития рецидива (КВР)

БСВ СО Р КВР СО Р

ТН2

МОБ(+) 35 0,48 0,08 0,092 0,46 0,01 0,152

МОБ(-) 3 1,0 — 0,0

ТНЗ

МОБ(+) 24 0,44 0,01 0,054 0,55 0.01 0,071

МОБ(-) 12 0,83 0,10 0,16 0,01

ТН4

МОБ(+) 12 0,13 0,11 0,001 0,85 0,03 0,001

МОБ(-) 21 0,79 0,09 0,20 0,01

ТН5

МОБ(+) 10 0,14 0,12 0,006 0,86 0,02 0,005

МОБ(-) 21 0,80 0,08 0,19 0,01

Наиболее ршшей ТН, для которой были получены достоверные различия в результатах терапии между группами МОБ-позигивных и МОБ-негативных пациентов, являлась ТН4. Выявление МОБ в следующей ТН - ТН5 также было связано с неблагоприятным прогнозом.

На следующем этапе мы оценили прогностическое значение последовательного качественного выявления МОБ в ТН4 и ТН5, однако наличие МОБ в ТН5 не дает дополнительных данных по сравнению с ТН4 (рис. б). Исходя из этого ТН4 была выбрана нами в качестве основной ТН для качественного определения МОБ с целью прогнозирования исходов терапии при лечении по протоколу MLL-Baby.

Группы пациентов МОБ-позитивных и МОБ-негативных в ТН4 статистически значимо не отличались между собой по возрасту, полу, инициальным характеристикам ОЛЛ (величина инициального лейкоцитоза, наличие поражения ЦНС, иммунофеногип, тип перестройки llq23/MX), показателям ответа на терапию (количество бласгов на 8-й день

терапии дексаметазоном, количество бластиых клеток в костном мозге на 15-й день индукции ремиссии, достижение клинико-гематологической ремиссии на 36-й индукционной фазы терапии по протоколу МХХ-ВаЬу), а также распределению пациентов по группам риска протокола М1Х-ВаЬу.

ТНЗ ТН4 ТН5

Точка наблюдения при терапий по протоколу МИ-ВаЬу

Рисунок 6. Оценка прогностического значения последовательного качественного выявления МОБ в ТНЗ, ТН4 и ТН5. р указывает на различия между кумулятивными вероятностями развития рецидива (КВР) у МОБ-позитивных и МОБ-негативных пациентов в ТН4 и ТН5.

Оценка влияния различных факторов на развитие рецидивов приведена в табл. 16. Было показано, что прогностически неблагоприятными факторами в исследуемой группе пациентов, являлись сохранение МОБ-позитивности в ТН4 (р=0,003) и возраст младше 6 мес. (р=0,001). При сравнении этих параметров в многофакторной модели единственным независимым прогностическим фактором осталось сохранение МОБ в ТН4 (р=0,044).

Нами также проанализирована возможность использования данных количественного анализа МОБ методом ПЦР-РВ в ТН2 и ТНЗ. Известно, что в большинстве протоколов терапии, использующих величину МОБ для стратификации пациентов по группам риска, принята шкала оценки МОБ кратная 10. Принимая это во внимание, а также то, что методом анализа характеристических кривых (ИОС-кривых) было выявлено, что пороговым значением МОБ в ТНЗ, наиболее эффективно разделяющим группы пациентов с различным исходом заболевания, является величина равная 0,332%, которая близка к значению 0,1%, нами было принято решение использовать именно величину 0,1% в качестве пороговой, и по отношению к ней разделить пациентов с разным значением МОБ в ТНЗ.

Таблица 16. Анализ прогностических показателей, влияющих на возникновение рецидивов у пациентов первого года жизни с ОЛЛ, получающих терапию по протоколу МЬЬ-ВаЬу с учетом МОБ в ТН4

Показатель Пациенты События Однофакгорный анализ Многофакторный анализ

ОО 95% ДИ Р ОО 95% ДИ Р

Возраст

Старше 6 мес. 14 1 1 — 0,001 1 — 0,095

Младше 6 мес. 19 11 10,559 1,361-81,903 6,171 0,728-52,277

Иммунофенотип

СШ0(-/+)су1ц(-) 7 5 1 — 0,560

СОЮ(-)су1р(-) 21 7 0,792 0,359-1,745

СОЮ(-)су1р(+) 5 0 — —

Наличие химерного гена МП-ЛР4

Нет 15 4 I — 0,302 -

Есть 18 8 1,899 0,571-6,316

Инициальный лейкоцитоз, * 107Л

<100 20 7 1 — 0,704 —

>100 13 5 1,252 0,396-3,960

Инициальное поражение ЦНС

Нет 24 7 1 — 0,193 —

Есть 7 4 2,316 0,669-8,018

Количество бластов < 1000/мкл на 8-й день терапии

Хороший 29 9 1 0,268 —

Плохой 4 3 2,087 0.563-7,734

Выявление МОБ в ТН4

Отсутствие 21 4 1 — 0 003 1 — 0,044

Наличие 12 8 6,761 1,934-23,638 3,771 1,033-13,674

Данная диагностическая модель позволила с высокой долей достоверности прогнозировать исходы терапии по протоколу МЬЬ-ВаЬу. Пациенты, имевшие величину МОБ в ТНЗ более 0,1% (п=7) имели достоверно более низкую БСВ и более высокую кумулятивную вероятность развития рецидива по сравнению с пациентами, у которых МОБ была ниже 0,1% (п=21) (р=0,011 и р=0,017 соответственно) (рис. 7). Также как и для ТН4, мы

провели одно- и многофакгорный анализ в данной группе пациентов с целью поиска факторов, влияющих на развитие рецидивов (табл. 17).

Таблица 17. Анализ прогностических показателей, влияющих на возникновение рецидивов у пациентов первого года жизни с ОЛЛ, получающих терапию по протоколу ШХ-ВаЬу с учетом величины МОБ в ТНЗ

Показатель 2 Ё а> С д Однофакторный анализ Многофакторный анализ

н ю о и ОО 95% ДИ Р ОО 95% ДИ Р

Возраст

Старше 6 мес. 13 1 1 — 0,041 1 — 0,114

Младше 6 мес. 15 9 8,606 1,088-68,073 5,614 0,661-47,657

Иммунофенотип

СОЮ(-/+)су1р(-) 6 4 1 — 0,435 —

СШ0(-)су1р(-) 18 6 0,435 0,118-1,599

СОЮ(-)су1р(+) 4 0 — —

Наличие МИ-АР4

Нет 14 3 1 — 0,217 —

Есть 14 7 2,347 0,606-9,093

Инициальный лейкоцитоз Х107/Л

<100 19 6 1 — 0,300 —

>100 9 4 1,961 0,549-7,006

Инициальное поражение ЦНС

Нет 20 6 1 — 0,257 —

Есть 6 3 2,260 0,552-9,248

Количество бластов < 1000/мкл на 8-й день терапии

Да 26 9 1 — 0,605

Нет 2 1 1,726 0,218-13,695

Величина МОБ в ТНЗ

Менее 0,1% 21 5 1 — 1 —

Более 0,1% 7 5 7,059 1,976-25,225 4,250 1,159-15,585 0,029

Возраст младше 6 мес. и величина МОБ в ТНЗ выше 0,1% были двумя статистически значимыми прогностически неблагоприятными факторами (р=0,041 и р=0,003,

соответственно), однако в многофакторной модели только величина МОБ в ТНЗ выше 0,1% сохранила свою значимость (р=0,029).

ч

МОБ < 0,1%

п-21, в ПНР 16; БСВ 0,7410,09

МОБ >0,1%

п=7, 8 ППР 2: БСВ 0,281:0,17

р=0.011

12

24 36 48 60 72 Бремя иесииъ;

84 96

1.0

ч

| 0,9

I 0,8

4

I °'7

I 0,6

| 0,5

I 0.4 £

5 0,3

I 0,2

х:

0.0

МОБ >0,1% 0,65±0,05

МОБ < 0,1% 0,25±0,01

р=0,017

¿0 60 Время ма5пвдан*я, нкяш

МО

Рисунок 7. БСВ и кумулятивная вероятность развития рецидива пациентов с величиной МОБ в ТНЗ более и менее 0,1%.

Для определения какой из параметров вносит наибольший вклад в неблагоприятный прогноз заболевания было проведено сравнение степени влияния наличия МОБ в ТН4 и величины МОБ выше 0,1% в ТНЗ на риск развития рецидива.

Основываясь на величине отношения опасности, было показано, что ни один из этих факторов не имеет преимущества перед другим (р=0,099 и 0,332, соответственно), а выделяемые по ним группы пациентов приблизительно одинаковы. Отчасти это может быть связано с небольшим размером исследуемых групп, отчасти — возможной взаимной компенсацией сравниваемых параметров. Все 7 пациентов, имевших в ТНЗ величину МОБ более 0,1% были также МОБ-позигивны в ТН4, и наоборот, из 21 пациента, имевших величину ТНЗ величину МОБ менее 0,1% 18 были МОБ-негагивны в ТН4 (табл.18).

Таблица 18. Связь величины МОБ в ТНЗ с выявлением МОБ в ТН4 (в скобках приведено количество рецидивов)

Результат определения МОБ ТНЗ Результат определения МОБ в ТН4

МОБ (+) МОБ (-) Всего

МОБ <0,1% 3(2) 18(3) 21(5)

МОБ >0,1% 7(5) 0 7(5)

Всего Ю(7) 18(3) 28 (10)

Прогностическое значение минимальной остаточной болезни в периферической крови, выявленной методом ПЦР в режиме реального времени, при остром лнмфобластном лейкозе у детей первого года жизни, получающих лечение по протоколу М1Х-ВаЬу

На первом этапе мы сравнили выявление МОБ в 142 образцах ПК по сравнению с парными образцами КМ, взятыми в идентичные ТН протокола МЬЬ-ВаЬу. Общая сопоставимость результатов качественного выявления МОБ двумя методами составила 84,5% (рис. 8). Во всех 22 (15,5%) дискордантных образцах МОБ была выявлена в КМ, но не в ПК. Минимальная сопоставимость зафиксировала в ТНЗ и ТН5 (77,3% и 76,2%, соответственно), максимальная - в ТН4 и ТН7 (92,5% и 100%, соответственно) (табл. 19). 100

г? Ю

!■ о,1

Л «

С

аз

§ 0,01 г

0,001

0.001 0.01 0.1 1 10 100 МОБ а костном мопс. %

Рисунок 8. Сопоставимость результатов определения МОБ в КМ и ПК.

Таблица 19. Сопоставимость выявления МОБ в КМ и ПК в различные ТН протокола М1Х-ВаЬу

Точка наблюдения Число образцов Сопоставимость, %

ТН1 19 89,5

ТН2 31 80,6

ТНЗ 22 77,3

ТН4 26 92,3

ТН5 21 76,2

ТН6 16 87,5

ТН7 7 100

- 0 / о 77 о

- 00 о °о ° л ° ° „ О О 'С о О о о о " а о ° о о о о о

о сю

43 оооосэосос о 22

Величина абсолютной экспрессии гена ABL, использованного для нормализации, достоверно не различалась в образцах ПК и КМ; в ПК медиана числа копий ABL составила 4.95Ч04 (диапазон 1,30»103 - 1,40*10®), в КМ — 4,85*10" копий (диапазон 1,08*103 -3,45*106) (р=0,760).

Затем была проведена оценка прогностической значимости выявления МОБ в ПК в различные ТН (табл. 20).

Таблица 20. Прогностическое значение наличия МОБ в ПК в различные ТН

ТН Бессобытийная выживаемость (стандартная ошибка) Р Кумулятивная вероятность рецидива (стандартная ошибка) Р

МОБ(+) МОБ (-) МОБ(+) МОБ (-)

ТН2 0,15 (0,12) 0,50 (0,25) 0,433 0,70 (0,09) 0,51 (0.02) 0,460

ТНЗ 0,16(0,15) 0,42(0,10) 0,467 0,83 (0,04) 0,62 (0.04) 0,502

ТН4 0,20(0,17) 0,51 (0,18) 0,499 0,80 (0,05) 0,50 (0,03) 0,481

ТН5 0 0,57 (0,24) 0,098 0,66(0,13) 0,42 (0,09) 0,091

ТН6 0 0,44(0,14) 0,056 0,88(0,11) 0,25 (0,13) 0,030

Примечание:

ТН1 и ТН7 были исключены из анализа по следующим причинам: в ТН1 все образцы были МОБ-позитивны; в ТН7 было 7 образцов

Единственной ТН, для которой были выявлены различия в исходах терапии между МОБ-позитнвными и МОБ-негативными пациентами в ПК была ТН6.

Мы оценили прогностическое значение наличия МОБ в ТН6 в ПК по сравнению с МОБ, определенной в ТН4 в КМ на группе из 14 пациентов, которых обследовали в обеих ТН. Все 10 пациентов, достигших МОБ-негативности к ТН4 в КМ, продолжали сохранять этот статус и в ТН6 в ПК. В этой группе зарегистрирован только 1 рецидив. Из 4-х пациентов с наличием МОБ в ТН4 в КМ трое продолжали оставаться МОБ-позитивными в ТН6 в ПК. Среди этой группы пациежов зарегистрировано 2 рецидива Еще один МОБ-позитивный пациент в ТН4 в КМ достиг МОБ-негативности в ТН6 в ПК, но позднее рецидивировал. Следовательно, использование ПК в ТН6 не дает дополнительных преимуществ, так как исходы терапии определенные по данным этой ТН, практически полностью дублируют результаты, полученные в КМ в ТН4.

Исходя из этого, был сделан вывод, что наличие МОБ в ПК на различных этапах терапии не показало самостоятельной прогностической значимости. Таким образом, использование ПК вместо КМ для моииторирования МОБ при ОЛЛ у детей первого года жизни нецелесообразно.

Подводя итог всей проведенной работе, нами был сформулирован алгоритм комплексной лабораторной диагностики и мониторинга МОБ при ОЛ у детей первого года жизни на основании сочетанного применения различных методов клинической лабораторной диагностики (рис. 9).

Рисунок 9. Алгоритм комплексной лабораторной диагностики и мониторинга МОБ при ОЛ у детей первого года жизни на основании инициальных характеристик опухолевых бластов.

* ОТ-ПЦР проводится в два этапа, в зависимости от частоты встречаемости отдельных перестроек гена MIL. У пациентов с ОЛЛ 1-й этап: MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3; 2-й этап: MLL-EPS15, MLL-MLLT10. У пациентов с ОМЛ 1-й этап: MLL-MLLT3, MLL-MLLT10, MLL-MLLTll, MLL-ELL; 2-й этап: MLL-AF4. MLL-MLLT4, MLL-MYOIF, MLL-F0X04, MLL-SEPT6, MLL-SEPT9; ** FISH t(7;12) проводится пациентам с ОМЛ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложенная нами система определения МОБ на основании инициальных характеристик опухолевых бластов показала свою эффективность для прогнозирования исходов лечения детей первого года жизни с ОЛЛ, включенных в российское мультицентровое исследование MLL-Baby. На основании полученных результатов представляется целесообразным рестратифицировать пациентов, исходя из сохранения МОБ

в точке наблюдения 4 протокола MLL-Baby: для пациентов промежуточной группы риска -перевод на рукав высокого риска протокола, для пациентов высокой группы риска - поиск альтернативных способов достижения молекулярной ремиссии с последующим проведением трансплантации костного мозга.

Кроме того, разработанный алгоритм комплексной диагностики и мониторинга МОБ позволяет выявлять подавляющее большинство генетических аберраций при OJI у детей первого года жизни, избегать диагностических ошибок, корректно интерпретировать получаемые результаты. Это, в свою очередь, дает возможность оценить инициальные факторы риска (вариант ОЛ, тип перестройки 1 Iq23/AÄX, наличие транслокации t(7;12».

Выводы

1. При ОЛ у детей первого года жизни наиболее часто выявляются перестройки Uq23IMLL (65,7% при ОЛЛ и 56,0% при ОМЛ). Аномалии кариотипа, характерные для ОЛ детей старших возрастных групп, редко встречаются у детей первого года жизни (3,7% случаев при ОЛЛ и 4,8% случаев при ОМЛ).

2. У пациентов с ОЛЛ в возрасте младше 6 месяцев перестройки lIq23/MX встречаются достоверно чаще по сравнению с пациентами в возрасте от 6 до 12 месяцев (86,1% и 48,4%, соответственно). Для ОМЛ подобной взаимосвязи не выявлено.

3. Установлена взаимосвязь между структурой химерных генов с участием MLL и видом острого лейкоза, а также возрастом пациентов. В исследованной группе пациентов с ОЛЛ наиболее частой зоной разрыва в ДНК гена MLL является 11-й интрон (48,1% случаев), а при ОМЛ — 9-й интрон (42,1% случаев). Дети с ОЛЛ, у которых точка разрыва находится в 11-м интроне гена MLL, были достоверно младше всех остальных. Для ОМЛ подобной взаимосвязи не найдено.

4. Применение метода FISH с использованием трехцветного флуоресцентного зонда позволяет верифицировать транслокацию t(7;12)(q36;pI3) и демонстрирует существование различных механизмов, ведущих к её формированию.

5. При ОЛЛ у детей первого года жизни отсутствие экспрессии CD 10 и CD20, а также высокая экспрессия CD45, CD 15, CD65 и NG2 дают возможность прогнозировать наличие перестроек llq23IMLL. При этом наибольшей диагностической эффективностью

обладает NG2 — 90,6%, для CD45 этот показатель составляет 81,9%, CD20—81,2%, CD133_

76,5%, CD15—67,7%, CD65—53,7%. При ОМЛ в данной возрастной группе с наличием перестроек llq23/MX ассоциированы экспрессия NG2, CD99, CD133, CD 15, CDllb и отсутствие экспрессии CD61. Диагностическая эффективность использования CDllb составляет 95,0%, NG2—89,7%, CD65—83,3%, CD15—80,6%, CD99—78,3%, CD133 и CD4—по 75,0%, CD61—71,9%.

6. Для определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии при ОЛЛ у детей первого года жизни NG2 необходимо использовать в комплексе с другими маркерами, так как его экспрессия, а также доля Ы02-положительных клеток достоверно снижается во время терапии.

7. Результаты определения МОБ при ОЛЛ у детей первого года жизни методами проточной цитометрии и ОТ-ПЦР нмекгг высокую качественную сопоставимость (87,0%).

8. При ОЛЛ у детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-Baby, величина минимальной остаточной болезни в КМ более 0,1% в ТНЗ и любое сохранение МОБ в КМ в ТН4 - наиболее важные параметры, связанные с развитием рецидивов.

9. Выявление МОБ в ПК на различных этапах терапии по протоколу MLL-Baby не обладает самостоятельной прогностической значимостью, несмотря на высокую качественную сопоставимость выявления МОБ в ПК и КМ (84,5%).

Практические рекомендации

1. При диагностике ОЛ у детей первого года жизни для поиска маркеров для последующего определения минимальной остаточной болезни целесообразно проведение комплекса лабораторных исследований, в который, наряду со стандартным цитогенетическим анализом и иммунофенотипированием, рекомендуется включать FISH и различные варианты ПЦР.

2. При выявлении МХ-ассоциированного иммунофенотипа рекомендуется прицельный поиск перестроек 1 lq23IMLL всеми возможными методами.

3. У детей первого года жизни с ОЛЛ и наличием перестроек 1 \q23IMLL определение минимальной остаточной болезни рекомендуется проводить методами проточной цитометрии или обратно-транскршггазной ПЦР; при отсутствии перестроек 1 lq23IMLL — только методом проточной цитометрии.

4. Учитывая неблагоприятный прогноз пациентов с ОМЛ и наличием транслокации t(7; 12)(q3б;р 13), а также высокую частоту критических вариантов этой транслокации, всем детям первого года жизни с ОМЛ при отсутствии перестроек Ilq23/AÄ,£ следует проводить выявление этой транслокации методом FISH с использованием трехцветного флуоресцентного зонда.

5. У детей первого года жизни с ОЛ при отрицательных результатах определения наиболее частых перестроек Ilq23/AÄ£: (t(4;ll)(q21;q23yMZvfF4, t(ll;19)(q23;pl3)/AÄ£-MLLT1, t(9;l l)(p22;q23)/M££-A/££n) целесообразно применять разработанные нами условия выявления и мониторинга редких перестроек гена MLL методом ПЦР в режиме реального времени.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Г.А. Цаур, Е.Р. Семенихина, Савельев Л.И., Е.В. Шориков, Л.Г. Фечина Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения перестроек гена MLL у детей раннего

возраста с острым лейкозом // Вестник Уральской медицинской академической науки._

2006, — №4, — С.151-156.

2. ГА. Цаур, Е.Р. Семенихина, Л.И. Савельев, Е.В. Шориков, Л.Г.Фечина. Использование ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для обнаружения перестроек гена MLL-ÂF4 у пациента, лечившегося по протоколу MLL-BABY 2006 // Вопросы гематологии, онкологии и иммунологии в педиатрии. — 2006. — том 5, №4. — С.25. - Материалы V симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний», Москва 0910 февраля 2007 г.

3. G. Tsaur, Е. Semenikhina, L. Saveliev, L. Fechina Consecutive detection of MLL rearrangements in infants' acute lymphoblastic leukemia during treatment with all-trans

retinoic acid in combination with conventional chemotherapy // Hematologics._ 2007._

Vol.92, Suppl. 1. — P.452-453. 12ft Congress of the European Hematology Association, Vienna, Austria, June 7-10,2007.

4. G. Tsaur, E. Semenikhina, A. Ivanova, L. Saveliev, E. Shorikov, G. Henze, L. Fechina Efficacy of new treatment protocol, contained all trans-retinoic acid, in infants leukemia / Pediatric Blood & Cancer. — 2007. — Vol. 49, Issue 4. — P. 463-464. 39ft Annual Congress of International Society of Pediatric Oncology SIOP 2007, Mumbai, India, November 1-3, 2007

5. G. Tsaur, E. Semenikhina, A. Ivanova, T. Nasedkina, A. Popov, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Achievement of Molecular Remission in MLL/AF4-Positive Infants' Leukemia Treated with All Trans-Retinoic Acid Based Protocol 'MLL-Baby' // Blood. — 2007. — Volume 110, issue 11. — pl31B. — Abstract #4254. 49th Annual Meeting of the American Society of Hematology ASH, Atlanta, USA, December 08-11, 2007

6. G. Tsaur, S. Kovalev, A. Misurin, A. Ivanova, A. Kustanovich, A. Popov, L. Saveliev, O. Aleinikova, L. Fechina. Development of quantitative Real-time PCR assay for MRD monitoring of MLL/EPS15 fusion gene in infants' leukemia // Annals of Hematology. —• 2008. — Vol.87, Suppl. 1. — P.10. International Symposium «Acute Leukemias ХП. Biology and Treatment Strategies», Munich, Germany, February 16-20, 2008.

7. Г.А. Цаур, Е.Р. Семенихина, A.C. Иванова, Ю.А. Яковлева, Т.О. Ригер, О.М.Плеханова, М.В. Стригалева, A.M. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Т.В. Наседкина, Н.А. Гусева, К.Л. Кондрагчик, Н.В. Мякова, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, А.И. Карачунский, Л.Г.Фечина. Выявление и могаггорирование перестройки MLL-AF4 у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом, лечившихся по протоколу MLL-BABY // Детская

Онкология. — 2008. — №2. — С.63-68.

8. G. Tsaur, A. Ivanova, S. Kovalev, A. Misurin, M. Suchkova, A. Kustanovich, Yu. Yakovleva, A. Popov, L. Saveliev, E. Shorikov, O. Aleinikova, L. Fechina, Detection and monitoring of minimal residual disease for rare MLL rearrangements in infant's acute leukemia using quantitative real-time PCR assay // Hematologics. — 2008. — Vol.93, Suppl. 1. — P.461-462. — Abstr. # 1182. — 13th Congress of the European Hematology Association, Copenhagen, Denmark, June 12-15,2008.

9. G. Tsaur, S. Kovalev, A. Ivanova, Y. Yakovleva, A. Popov, E. Shorikov, L. Saveliev, C. Meyer, R. Marschalek, A. von Stackelberg, L. Fechina. Real-time PCR for quantitation of MLL-MLLTIO fusion gene in an infant with acute myeloid leukemia И SIOP abstract book 2008 — P. 84-85 — 40th Annual conference of International Society of Paediatric Oncology (SIOP), Berlin, Germany, October 3-6, 2008

10. A. Popov, T.Verzhbitskaya, G. Tsaur, A. Ivanova, E. Shorikov, L. Saveliev, R. Arceci, A von Stackelberg, M. Dworzak, L. Fechina. Myeloperoxidase Expression by very early B-cell Progenitors in infants treated with All-trans retinoic acid // SIOP abstract book 2008 — P. 2627 — 40th Annual conference of International Socicty of Paediatric Oncology (SIOP), Berlin, Germany, October 3-6, 2008

11. O.M. Плеханова, Г.А. Цаур, A.C. Иванова, JI.И. Савельев, Л.Г. Фечина. Использование флюоресцентной гибридизации in situ для выявления транслокации t(6;ll)(q27;q23): описание 3 случаев // Онкогематология,—2008.—№4.—С.64-65—Материалы VI симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 29-31 января, 2009.

12. A.M. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур, А.С. Иванова, О. В. Стренева, О.П. Хлебникова, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Мониторинг минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии у детей с В-линейным ALL во время индукционной терапии по протоколам ALL-MB 2002 и MLL-Baby // Онкогематология. — 2008.—№4. — С.68—Материалы VI симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 29-31 января, 2009.

13. Г.А. Цаур, А.С. Иванова, A.M. Кустанович, С.Ю. Ковалев, A.M. Мисюрин, М.В. Сучкова, О.М. Плеханова, Ю.А.Яковлева, A.M. Попов, Л.И. Савельев, О.В. Алейникова, Л.Г. Фечина Мониторинг химерного транскрипта MLL-EPS15 методом ПЦР в реальном времени у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом // Онкогематология.—2008.—№4.—С.79-80 — Материалы VI симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 29-31 января, 2009.

14. G. Tsaur, A. Ivanova, O. Plekhanova, T. Riger, Y. Yakovleva, A. Popov, Y. Svechnikova, O. Makarova, E. Shorikov, L. Saveliev, C. Meyer, R. Marschalek, L. Fechina. MRD Monitoring in AML patients with MLL-MLLT4 by quantification of fusion gene transcripts and genomic chromosomal breakpoint sequences //Blood.—2008—Vol. 112, issue 11.—abstract # 4888

15. A. Popov, G. Tsaur, A. Ivanova, Y. Yakovleva, T. Verzhbitskaya, T. Riger. E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina. Qualitative and quantitative concordance in MRD data, assessed by flow cytometry and RT-PCR of fusion gene transcripts in infants with //¿¿-rearranged ALL // Hematologics — 2009. — Vol.93, Suppl. 2. —P.31-32. — Abstr. # 0080. — 14th Congress of the European Hematology Association, Berlin, Germany, June 4-7,2009.

16. G. Tsaur, T. Nasedkina, A. Ivanova, Y. Yakovleva, T. Riger, A. Popov, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Different molecular remission achievement time in infants with MLL-rearranged acute lymphoblastic leukemia corresponds to outcome - report from MLL-Baby study group // Hematologics — 2009. — Vol.93, Suppl. 2. —P.561. — Abstr. # 1437. — 14ft Congress of the European Hematology Association, Berlin, Germany, June 4-7, 2009.

17. G. Tsaur, T. Nasedkina, A. Ivanova, Y. Yakovleva, T. Riger, A. Popov, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Prediction of outcome in infants with AffiX-rearranged acute lymphoblastic leukemia by time to achievement of molecular remission // Pediatric Blood and Cancer.— 2009—Vol. 53, N 5,—P. 777,— 41я Annual Conference of International Society of Hematology (SIOP), Sao Paulo, Brazil, October 5-9, 2009.

18. A. Popov, T. Verzhbitskaya, G. Tsaur, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina NG2 application value in flow cytometric minimal residual disease monitoring in infants with MLL-rearranged acute lymphoblastic leukemia //Pediatric Blood and Cancer.— 2009.—Vol. 53, N 5—P. 777778.— 41st Annual Conference of International Society of Hematology (SIOP), Sao Paulo, Brazil, October 5-9, 2009.

19. A.M. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур, Е.В. Шориков, С.В. Цвиренко, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Возможности применения NG2 для мониторинга миниматьной остаточной болезни методом проточной цитометрии у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом, ассоциированным с реарранжировками гена MLL // Гематология и трансфузиология. - 2009.—№6. — С. 19-22

20. Г.А. Цаур, Т.В. Наседкина, А.М. Попов, О.В. Каленник, А.Г. Солодовников, Т.О. Ригер, Ю.А. Яковлева, А.С. Иванова, А.Е. Друй, О.М Плеханова, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Прогностическое значение времени достижения молекулярной ремиссии у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом и перестройкам гена MLL, получавших терапию по протоколу MLL-Baby // Медицинская генетика - Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков и I Всероссийского конгресса ((Генетика опухолей кроветворной системы», Ростов-на-Дону, 15-18 мая 2010 года-С. 190.

21. Г.А. Цаур, A.M. Попов, Т.В Наседкина, A.M. Кустанович, О.В. Каленник, С.Ю. Ковалев, Т.О. Ригер, Е.Р. Семенихина, А.С. Иванова, Ю.А. Яковлева, А.Е. Друй, Е.В. Шориков, О.В. Стренева, О.М. Плеханова, М.В. Стригалева, О.В. Алейникова, С. Meyer, R. Maischalek, Л.И. Савельев, Л.Г.Фечина Перестройки гена MLL у детей с острыми лейкозами // Клинико-лабораторный консилиум. - 2010. - № 4. - С.53-54. - Российский Конгресс с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины -возможное и реальное», Санкт-Петербург, 6-9 июня, 2010

22. Г.А. Цаур, Т.В. Наседкина, A.M. Попов, О.В. Каленник, А.Г. Солодовников, Т.О. Ригер, Ю.А. Яковлева, А.С. Иванова, А.Е. Друй, О.М. Плеханова, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Время достижения молекулярной ремиссии как фактор прогноза у детей первого года жизни острым лимфобластным лейкозом II Онкогематология. - 2010. - №2. - С.46-54.

23. A.M. Попов, Г.А. Цаур, Т.Ю. Вержбицкая, Т.О. Ригер, Ю.А. Яковлева, А.С. Иванова, А.Е. Друй, Е.В. Шориков, С.В. Цвиренко, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Сравнение результатов определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и выявления химерного транскрипта полимеразной цепной реакцией у детей, больных В-линейным острым лимфобластным лейкозом // Гематология и трансфузиология. - 2010. - Т55., №2. - С. 3-9.

24. G.Tsaur, A. Popov, A. Kustanovich, A. Ivanova, O.Plekhanova, Y. Yakovleva, E. Shorikov, S Kovalev, A.Misyurin, M. Suchkova, O. Aleinikova, C. Meyer, R. Marschalek, T. Burmeister, L. Saveliev, L. Fechina Minimal residual disease monitoring in infants with MLL-EPS15-positive acute lymphoblastic leukemia // Pediatric Blood and Cancer.— 2009.—Vol. 55, N 5.—p. 853-854.— 42nd Annual Conference of International Society of Paediatric Oncology (SIOP), Boston, USA, October 21-24,2010

25. G. Tsaur, A. Popov, T. Nascdkina, O. Kalennik, A. Kustanovich, O. Aleinikova, T. Riger, Y.Yakovleva, A. Ivanova, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Minimal residual disease monitoring by quantification of fusion gene transcript in infant with A/ZX-rearranged acute lymphoblastic leukemia by MLL-Baby protocol // Blood. - 2010. - Vol. 116, N 21. - P. 1126 -Abstr. 2731. - 52nd Annual meeting of American Society of Hematology, Orlando, USA December 4-7,2010.

26. A. Popov, G. Tsaur, T. Verzhbitskaya, T. Riger, Y.Yakovleva, A. Ivanova, A. Druy, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Quantitative and qualitative concordance of minimal residual disease monitoring by multicolor flow cytometry and PCR of fusion gene transcript in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia // Blood. - 2010. - Vol. 116, N 21. -P. 720 - Abstr. 1720. - 52nd Annual meeting of American Society of Hematology, Orlando, USA December 4-7, 2010.

27. A.M. Попов, Г.А. Цаур, Т.Ю. Вержбицкая, Е.В. Шорюсов, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Определение минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и выявления химерного транскрипта в ходе ПЦР у детей с острым лимфобласгным лейкозом из В-линейных предшественников: результаты сравнения методов // Онкогематология. - 2011. - №2. - С.48-49. - VII Российский симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва 1-3 июня, 2011

28. Г.А. Цаур, A.M. Попов, Т.В. Наседкина, О.В. Каленник, А.М. Кусганович, О.В. Алейникова, Т.О.Ригер, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Прогностическое значение определения минимальной остаточной болезни выявлением химерных транскриптов у детей первого года жизни, получавших терапию по протоколу MLL-Baby И Онкогематология. - 2011. - №2. - С.54-55. - VII Российский симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва 1-3 июня, 2011

29. Г.А. Цаур, Е.В. Флейшман, A.M. Попов, О.И. Сокова, О.В. Алейникова, Э.Г. Бойченко, Е.В. Волочник, А.С. Иванова, О.В Каленник, Н.П. Кирсанова, К.Л. Кондрагчик, A.M. Кусганович, Е.С. Лапотентова, Д.В. Литвинов, И.С. Мартынкевич, Н.В. Мякова, Т.В. Наседкина, В.А. Овсепян, Ю.В. Ольшанская, О.М. Плеханова, А.В. Попа, Т.О. Ригер, Л.И. Савельев, О.В. Стренева, М.В. Стригалева, Е.В. Шориков, Л.Г.Фечина Результаты цигогенетической и молекулярно-генетической диагностики острых лейкозов у детей первого года жизни // Онкогематология. - 2011. - №2. - С.55. - VII Российский симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва 1-3 июня, 2011

30. G. Tsaur, A. Popov, T. Nasedkina, О. Kalennik, A. Kustanovich. О Alienikova, T. Riger, А. Ivanova, О. Streneva, Е. Shorikov. A. Solodovnikov, L. Saveliev, L. Fechina Prognostic significance of minimal residual disease detected by PCR for fusion gene transcripts in infants

with acute lymphoblastic leukemia treated by MLL-Baby protocol // Hematologica._2011.

— Vol.238, Suppl. 2. —P.24I. — Abstr. # 0563. — 16th Congress of the European Hematology Association, London, United Kingdom, June 9-12, 2011.

31. A. Popov, T. Verzhbitskaya, G. Tsaur, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Applicability of NG2 for flow cytometric minimal residual disease monitoring in infants with MLL-reairanged

acute lymphoblastic leukemia // Hematologics — 2011. — Vol.238, Suppl. 2._P.243._

Abstr. # 0568. — 16th Congress of the European Hematology Association, London, United Kingdom, June 9-12, 2011.

32. Г.А. Цаур, А.М.Попов, Т.О.Ригер, A.C. Иванова, О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Химерные гены в диагностике и определении минимальной

остаточной болезни у детей с острым лимфобластным лейкозом // Медицинская генетика.— 2011.— №10. — С.24, «Актуальные вопросы онкогенетики», Москва, 26-27 октября 2011

33. Г.А. Цаур, Е.В. Флейшман, A.M. Попов, О.И. Сокова, О.В. Алейникова, Э.Г. Бойченко, Е.В. Волочник, A.C. Иванова, О.В Каленник, Н.П. Кирсанова, K.JI. Кондратчик, A.M. Кустанович, Е.С. Лапотентова, Д.В. Литвинов, И.С. Мартынкевич, Н.В. Мякова, Т.В. Наседкина, В.А. Овсепян, Ю.В. Ольшанская, О.М. Плеханова, A.B. Попа, Т.О. Ригер, Л.И. Савельев, О.В. Стренева, М.В. Стригалева, Е.В. Шориков, Л.Г.Фечина Цитогенетическая и молекулярно-генетическая характеристика острых лейкозов у детей первого года жизни // Клиническая онкогематология: фундаментальные исследования в клинической практике.— 2011.— Том 4, №2. — С. 134-141

34. Г.А. Цаур, A.M. Попов, О.В. Алейникова, Э.Г. Бойченко, Т.Ю. Вержбицкая, Е.В. Волочник, A.C. Иванова, О.В Каленник, С.Ю. Ковалев, К.Л. Кондратчик, A.M. Кустанович, Е.С. Лапотентова, Д.В. Литвинов, И.С. Мартынкевич, Н.В. Мякова, Т.В. Наседкина, В.А. Овсепян, Ю.В. Ольшанская, О.М. Плеханова, A.B. Попа, Т.О. Ригер, Л.И. Савельев, О.В. Стренева, М.В. Стригалева, И.В. Шмунк, Е.В. Шориков, Л.Г.Фечина Характеристика перестроек llq23 (MLL) у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом / / Онкогематология.— 2011.— №3. — С.57-64.

35. G. Tsaur, A. Popov, Т. Nasedkina, A.Kustanovich, О. Kalennik,, О. Aleinikova, T. Riger, A. Demina, E. Shorikov, O. Streneva, A. Solodovnikov, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Prognostic Significance of Fusion Gene Transcripts Assessment for Minimal Residual Disease Monitoring in MX-Rearranged Infant Acute Lymphoblastic Leukemia Within MLL-Baby Trial II Haematologica Vol. 97 e-Supplement, 2012 pp. 524-525, June, 2012

36. A.M. Попов, Г.А. Цаур, Т.Ю. Вержбицкая, О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Иммунофенотипическая характеристика острого лимфобластного лейкоза у детей первого года жизни // Онкогематология.-2012.-№ 2.- с. 14-21

37. / A.M. Попов, Г.А. Цаур, Е.В. Шориков, C.B. Цвиренко, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Сравнение результатов минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и выявления химерного транскрипта в ходе полимеразной цепной реакции при ОЛЛ у детей // Гематологий и транфузиология.-2012,- №3.- с.20

38. Г.А. Цаур, A.M. Попов, Т.В. Наседкина, О.В. Коленник, A.M. Кустанович, О.В. Алейникова, А.Г. Солодовников, Т.О. Ригер, О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Мониторинг химерных транскриптов с участием гена MLL для оценки прогностического значения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-baby П Гематолопш и трансфузиология.-2012,- №3.- с.27

39. Prognostic significance of minimal residual disease monitoring by MLL fusion gene transcripts in infant acute lymphoblastic leukemia within MLL-Baby trial / G. Tsaur, A. Popov, T. Nasedkina, A.Kustanovich, O. Kalennik, O. Aleinikova, T. Riger, A. Solodovnikov, O.

Streneva, E. Shorikov, T. Tsvirenko, L. Saveliev, L. Fechina // Clinical Chemistry. — 2012._

Vol. 58, N 10, Suppl. — А41,— Abstract #A145, American Association of Clinical Chemistry 2012 Annual Meeting, Los Angeles, USA, July 15-19, 2012

40. Г.А. Цаур, O.M. Плеханова, Т.Д. Гиндина, Ю.В. Ольшанская, А.М Попов, Е.В. Волочник, А.Н. Казакова, А.М. Кусганович, С. Mayer, R. Maischalek, КС. Мартьгнкевич, Л.С. Мартыненко, Е.Н. Матвеева, В.А. Овсепян, Т.О. Ригер, Л.И. Савельев, О.И. Соколова, О.В. Стренева, Е.В. Флейшман, Е.В. Шориков, Л.Г. Фечина Применение метода флуоресцентной гибридюаши in situ для выявления перестроек гена MLL при острых лейкозах у детей первого года жизни // Медицинская генетика.-2012.-№ 7.- С. 35-45

41. A.M. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Алгоритм применения проточной цитометрии для мониторинга минимальной остаточной болезни при CDlO-негативном остром лимфобластном лейкозе из В-линейных предшественников // Вопросы диагностики в педиатрии,- 2012.-№5.-С.31-36

42. Г.А. Цаур, А.М. Попов, Т.В. Наседкина, О.В. Каленник, A.M. Кусганович, О.В. Алейникова, А.Г. Солодовников, Т.О. Ригер, О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Прогностическое значение минимальной остаточной болезни, определенной путем выявления химерных транскриптов у детей первого года жизни, больных острым лимфобластным лейкозом, получающих терапию по протоколу MLL-Baby // Гематология и трансфузиология - 2012 - Т. 57, №4- С.12-22

43. G. Tsaur, A. Popov, Т. Nasedkina, О. Kalennik, A. Kustanovich, О. Aleinikova, Т. Riger, А. Demina, О. Streneva, A. Solodovnikov, Е. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Prognostic Significance of MLL Fusion Gene Transcripts (FGT) Monitoring As Marker of Minimal Residual Disease (MRD) in Infant Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) // Pediatric Blood & Cancer. — Volume 59, Issue 6. — P. 1026. 44th Annual conference of International Society of Paediatric Oncology (SIOP), London, United Kingdom, October 5-8,2012

44. G. Tsanr, A. Popov, E. Fleishman, O. Sokova, A. Demina, T.Gindina, O. Kalennik, A. Kustanovich, I. Martynkevich, T. Nasedkina, Y. Olshanskaya, V. Ovsepyan, O. Plekhanova, T. Riger, L. Saveliev, I. Shmunk, E. Shorikov, O.Streneva, M. Strigaleva, T. Verzhbitskaya, A. Volochnik, C. Meyer, R. Marschalek, L. Fechina MLL Gene Rearrangements in 174 Infants with Acute Leukemia // Blood- 2012. - Vol. 120, N 21. - Abstr. # 2537. - 54th ASH Annual Meeting and Exposition, Atlanta, USA, 8-11 December, 2012

45. G. Tsaur, O. Plekhanova, A. Popov, T.Gindina, Y. Olshanskaya, A. Volochnik, A. Kazakova, A.Kustanovich, I. Martynkevich, L. Martynenko, E. Matveeva, V. Ovsepyan, T. Riger, L.

Saveliev, E. Shorikov, E. Fleishman, O. Sokova, C. Meyer, R. Marschalek, L. Fechina Molecular Genetic Characterization of З'-Deletion of MLL Gene in Infant Acute Leukemia // Blood- 2012. - Vol. 120, N 21. - Abstr. # 2498. - 54th ASH Annual Meeting and Exposition, Atlanta, USA, 8-11 December, 2012

46. A. Popov, G. Tsaur, T. Verzhbitskaya, O.Streneva, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Immunophenotypic Investigation of Infant Acute Lymphoblastic Leukemia I II Blood- 2012. -Vol. 120, N 21. - Abstr. # 2457. - 54л ASH Annual Meeting and Exposition, Atlanta, USA, 811 December, 2012

47. Цаур Г.А, Флейшман E.B., Плеханова O.M., Сокова О.И., Попов A.M., Алейникова О.В., Волочник Е.В., Каленник О.В., Калинина И.И., Качалов Д.Ю., Кирсанова Н.П., Кустанович A.M., Наседкина Т.В., Ольшанская Ю.В., Попа А.В., Ригер Т.О., Савельев Л.И., Стренева О.В., Шелихова Л.Н., Meyer С., Marschalek R., Фечина Л.Г. Редкие перестройки хромосомного района 1Ц23 и гена MLL при острых лейкозах у детей первого года жизни // Вопросы диагностики в педиатрии.- 2012.-№6.-С.16-24.

48. Г.А. Цаур, Е.В. Флейшман, Т.Л. Гиндина, О.М. Плеханова, A.M. Попов, О.И. Сокова, О.В. Алейникова, Е.В. Волочник, А.С. Демина, О.В. Каленник, И.И. Калинина, Н.П. Кирсанова, К.Л. Кондратчик, A.M. Кустанович, Т.В. Наседкина, В.А. Овсепян, Ю.В. Ольшанская, А.В. Попа, Т.О. Ригер, Л.И. Савельев, О.В. Стренева, М.В. Стригалева, Е.В. Шориков, С. Meyer, R. Marschalek, Л.Г.Фечина Характеристика перестроек llq23IMLL при острых миелоидных лейкозах у детей первого года жизни //Клиническая онкогематология. — 2012. — Том 5, №4. — С.365-370.

49. G. Tsaur, Е. Fleischman, A. Popov A. Kustanovich, Y. Olshanskaya, О. Pleklianova, Т. Nasedkina, I. Maitynkevich, V. Ovsepyan, A. Volochnik, T. Gindina, T. Riger, A. Demina, O. Sokova, E. Shorikov, C. Meyer, R. Marschalek, L. Saveliev, L Fechina Distribution of MLL gene rearrangements in a large cohort of infant acute lymphoblastic leukemia and infant acute myeloid leukemia patients // Haematologica. — 2013. — Vol. 98, Supplement 1. — P. 263 — Abs # 622. 18th Congress of the European Hematology Association, Stockholm, Sweden, June 13-16, 2013.

50. G. Tsaur, O. Plekhanova, T. Gindina, A. Popov, Y. Olshanskaya, A. Volochnik, A. Kazakova, A. Kustanovich, I. Martynkevich, L. Martynenko, E. Matveeva, V. Ovsepyan, E. Fleischman, O. Sokova, T.Riger, L. Saveliev, E. Shorikov, C. Meyer, R. Marschalek, L. Fechina Incidence and prognostic significance of У-MLL deletion in infant acute leukemia // Pediatric Blood & Cancer. — Volume 60 Issue S3. — P.63-64. 45th Annual conference of International Society of Paediatric Oncology (SIOP), Hong Kong, China, September 25-28, 2013

51. A. N3iel, M. Vetter , O. Plekhanova, E. Fleischman, O. Sokova, G. Tsaur, J. Harbott, S. Tosi A Novel Three-Colour Fluorescence in Situ Hybridization Approach for the Detection of

t(7;12)(q36;pl3) in Acute Myeloid Leukaemia Reveals New Cryptic Three Way Translocation t(7;12;16) / Cancers. -2013.-N 5. - P.281-295

52. Г.А. Цаур, A.M. Попов, O.M Плеханова, A.M. Кусганович, О.В. Алейникова, Т.Л. Гивдина, А.С. Демина, А.Е. Друй, С.Ю. Ковалев, К.Л. Кондратчик, А.В. Мисюрин, Н.В. Мякова, Т.О. Ригер, Л.И. Савельев, О.И. Сокова, О.В. Стренева, М.В. Сучкова, Ю.П. Финашутина, Е.В. Флейшман, Е.В. Шориков, Р.И. Юцкевич С. Meyer, R. Marschalek, Л.Г.Фечина Транслокация t(l;ll)(p32;q23) с образованием химерного гена MLL-EPSI5 при острых лейкозах: обзор литературы и описание 6 случаев. Подходы к монигорированию минимальной остаточной болезни // Онкогемэтология.-2013.-№ 1.-С. 17-33.

53. A.M. Попов, Г.А. Цаур, Т.Ю. Вержбицкая, О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Иммунофенотипическая характеристика острого миелоидного лейкоза у детей первого года жизни // Онкогематология.-2013.-№ 1.-С.ЗЗ-40.

54. G. Tsaur, С. Meyer, A. Popov, О. Plekhanova, A. Kustanovich, A.Volochnik, Т. Riger, А. Demina, A. Dray, Е. Fleischman, О. Sokova, Y, Olshanskaya, О. Streneva, E. Shorikov, L. Saveliev, R. Marschalek, L. Fechina MIL genomic DNA Breakpoints In Infant Acute Leukemia // Annual meeting of American Society of Hematology (ASH), New Orleans, USA, December 06-10, 2013, Abstract 1350

55. Г А. Цаур, С. Meyer, A.M. Попов, O.M. Плеханова, A.M Кусганович, Е.В. Волочник, Т.О. Ригер, А.С. Демина, А.Е Друй, Е.В. Флейшман, О.И. Сокова, Ю.В. Ольшанская,

0.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, R. Marschalek, С.И. Куцев, С.В. Цвиренко, Л.Г. Фечина Исследование структуры химерных генов с участием гена MLL при острых лейкозах у детей первого года жизни / // Гематология и трансфузиология. 2014. т. 59. №

1.С. 29-37.

56. Г.А. Цаур., А.М. Попов, Т.В. Наседкина, A.M. Кусганович, ТО. Ригер., О.В. Стренева, Е.В. Шориков, А.Г. Солодовников, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина. Сравнение костного мозга и периферической крови для мониторинга минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-baby // Гематология и трансфузиология. 2014. Т. 59. № S1. С. 70, II Конгресс гематологов России, Москва, 17-19 апреля 2014

57. A. Popov, G. Tsaur, Т. Verzhbitskaya, О. Streneva, Е. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Immunophenotypic studies in infant acute leukemia // Haematologica. 2014. Vol. 99, Supplement 1. — Abstract S1313. 19th Congress of the European Hematology Association, Milan, Italy, June 12-15, 2014.

58. G. Tsaur, A. Popov, T. Riger, A. Solodovnikov, T. Nasedkina, A. Kustanovich, O. Aleinikova, E. Shorikov, O. Streneva, L. Saveliev, L. Fechina Comparison of bone marrow and peripheral

blood samples for minimal residual disease monitoring in infants with MLL-rearranged acute lymphoblastic leukemia treated by MLL-baby protocol // Haematologica. 2014. Vol. 99, Supplement 1. — Abstract P121. 19th Congress of the European Hematology Association, Milan, Italy, June 12-15, 2014.

59. Г.А. Цаур, A.M Попов, A.M. Кустанович, T.B. Наседкина, O.B. Алейникова, Т.О. Ригер, А.Г. Солодовников, O.B. Стренева, Л.И. Савельев, Е.В. Шориков, Л.Г. Фечина Использование периферической крови и костного мозга для оценки минимальной остаточной болезни у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом и наличием перестроек гена MLL при терапии по протоколу MLL-Baby / // Российский журнал детской гематологии и онкологии. 2014, №2 С.56, V Межрегиональное совещание Национального общества детских гематологов и онкологов «Достижения и перспективы детской гематологии-онкологии», Москва, 5-8 июня 2014

60. Г.А. Цаур, С. Meyer, A.M. Попов, A.M. Кустанович, Т.О. Ригер, А.С. Демина, А.Е Друй, Е.В. Флейшман, О.И. Сокова, Ю.В. Ольшанская, О.В Стренева, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, R. Marschalek, С.В. Цвирегасо, Л.Г.Фечина Изучение структуры химерных генов с участием гена MLL при острых лейкозах у детей первого года жизни // Вестник гематологии, 2014, том X, № 2, С. 96-97. Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», Санкт-Петербург, 24-25 июня 2014 г.

61. G. Tsaur, A. Popov, Т. Riger, Т. Nasedkina, A. Solodovnikov, A. Kustanovich, О. Aleinikova, О. Streneva, Е. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Application of bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) for minimal residual disease (MRD) monitoring in infants with MLL-rearranged ALL enrolled into MLL-baby protocol // Pediatric Blood and Cancer. 2014 Vol. 61, Issue S2, P. S140, Abstract 0-131, 46й Congress of the International Society of Paediatric Oncology (SIOP) 2014, Toronto, Canada 22nd-25'h October, 2014

62. G. Tsaur, A. Popov, T. Riger, A. Solodovnikov, T. Nasedkina, A. Kustanovich,, S. Tsvirenko, O. Streneva, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Concordance and prognostic significance of minimal residual disease detection in peripheral blood and bone marrow samples of infants with MLL-rearranged acute lymphoblastic leukemia treated by MLL-baby protocol // Blood, 2014 Vol. 124, Issue 21, Abstract 2404, Annual meeting of American Society of Hematology (ASH), San Francisco, USA, December 06-09, 2014

63. A. Popov, G. Tsaur, T. Verzhbitskaya, O. Stteneva, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Tumor Cells' Immunophenotype Predicts the Presence of MLL Gene Rearrangements in Infant Acute Leukemia // Annals of Hematology. - 2015. - Vol.94, Suppl.l.-S.96.; Abstract 67 -International Symposium «Acute Leukemias XV. Biology and Treatment Strategies», Munich, Germany, February 22-25, 2015.

64. G. Tsanr, A. Popov, T. Riger, A. Solodovnikov, T. Nasedkina, A.Kustanovich, O. Aleinikova, E. Shorikov, O. Streneva, L. Saveliev, L. Fechina Minimal residual disease in peripheral blood and bone marrow of infants with Л/ZZ-rearranged acute lymphoblastic leukemia, concordance and prognostic significance // Annals of Hematology. - 2015. - Vol.94, SuppLl.-S.96.; Abstract 70 - International Symposium «Acute Leukemias XV. Biology and Treatment Strategies», Munich, Germany, February 22-25, 2015.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСВ — бессобытийная выживаемость

ДИ-ПЦР —длинная инвертированная полимеразная цепная реакция ДНК—дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК — комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота КМ — костный мозг

ОБфЛ — острый бифенотипический лейкоз

ОВ — общая выживаемость

ОЛ — острый лейкоз

ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз

ОМЛ —острый миелоидный лейкоз

ОНдЛ — острый недифференцированный лейкоз

ОТ—реакция обратной транскрипции

ОТ-ПЦР — обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

п.н. — пара нуклеотидов

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени

РНК — рибонуклеиновая кислота

ПК — периферическая кровь

ТН—точка наблюдения

ЦНС — центральная нервная система

CD — кластер дифференцировки

FAB — франко-американо-бриганская классификация морфологических вариантов острых лейкозов

FISH—флуоресцентная гибридизация in situ ROC —анализ характеристических кривых

Подписано в печать 29.04.2015 г. Формат 60x84 7,6 Усл. псч. л. 3,3. Тираж 100 экз. Заказ № 277. Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России,

г. Екатеринбург, ул. Репина, 3.