Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Исследование эндотелиопротективных и кардиопротективных свойств ламотриджина и вальпроатов

09-4 2136

На правах рукописи

Лучкина Елена Вадимовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНЫХ И КАРДИОПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ ЛАМОТРИДЖИНА И ВАЛЬПРОАТОВ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Курск - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Резников Константин Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Утешев Даниил Борисович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия Росздрава».

Защита состоится « $ » СООСтЛ^ г, в ^£часов на заседании

диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (г. Курск, 305041, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан « » 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Пашин Е.Н.

РОС СИ ИСКА?! ГОСУДАР CT В ЕМ НА •••. БИБЛИОТЕКА 2 0 0 9

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы, В наетоящее время заболевания сердечнососудистой системы являются наиболее часто встречающейся причиной смерти человека. Любые подходы к их лечению сейчас весьма актуальны. Современная фармакологическая терапия сердечно-сосудистых заболеваний имеет своей мишенью главным образом либо мышечные клетки сердца (блокаторы кальциевых каналов, сердечные гликозиды, ß-блокаторы, нитраты), либо гуморальные системы регуляции сосудистого тонуса (ингибиторы ангиотензинпревра-щающего фермента, нитраты), что в целом подразумевает воздействие на основное патогенетическое звено - дисфункцию эндотелия (Зодионченко B.C., 2002; Мартынов Н.Г., 2005; Небиеридзе Д.В., 2005; Завгородняя А.Н., 2006),

Перспективным, но недостаточно разработанным направлением в данной области является поиск новых свойств хорошо известных препаратов, влияющих на центральную нервную систему, имеющих в своей основе сложноорга-низованный механизм регуляции работы и трофики сердца и периферических сосудов (Болдырев A.A., 2003; Белова Е.И., 2006).

В основе эндотелиальной дисфункции (ЭД) лежит снижение образования и биодоступности оксида азота (NO) при одновременном повышении уровня супероксид-аниона и продукции мощных вазоконстрикторов (Марков Х,М., 2005).

NO синтезируется из L-аргинина с помощью семейства АТФ-зависимых ферментов, определяемых как NO-синтазы (NOS). Известны три основные изо-формы NOS - нейрональная (nNOS), индуцибельная (iNOS) и эндотелиальная (eNOS). Иногда выделяют митохондриальную синтазу, которая по сходству аминокислотной последовательности рассматривается как подтип нейропальной (Галаган М.Е., 1991; Брошусь В.В., 2003).

Отличительной особенностью nNOS является тот факт, что при определенных условиях nNOS легко переходит к образованию супероксид-аниона и пероксинитрита вместо оксида азота. В сердце и периферических сосудах эта изоформа локализована в нервных клетках и волокнах, а также на мембранах саркоэндоплазматического ретикулума. eNOS же локализована в кавеодах внешней плазмолеммы. В большинстве нейронов, входящих в состав интраму-ральных нервньйс ганглиев сердца человека, экспрессируется nNOS, что подтверждает ведущую роль nNOS во вкладе NO-ергического влияния на сердце и коронарные сосуды. При патологии преобладают цитотоксические влияния оксида азота и его продуктов, что имеет большое значение в развитии цереброва-скулярных заболеваний (Dowson V.L., 1996; Зеленин К.Н., 1997; Саприн А.Н., 1999; Kader K.N., 2000; Chung Н.Т., 2001; Lum В., 2001; Ещенко Н.Д., 2004; Максимович Н.Е., 2004; Белова Е.И., 2006).

Роль семейства NOS представляется особенно важной в качестве мишени потенциального терапевтического воздействия..Идеальным агентом для лечения сопряженной терапевтической патологии стал бы такой препарат, который предотвращал бы появление пероксинитрита, но в то же время способствовал повышению биодоступности NO.

Современные противоэпилептические и ГАМК-ергические препараты ламотриджин и вальпроевая кислота проявляют антигипоксические, антиише-мические и антиоксидантные свойства. Помимо этого, ламотриджин стабилизирует пресинаптическую нейрональную мембрану, блокируя вольтаж-зависимые натриевые каналы. Кроме того, он ограничивает высвобождение возбуждающих нейромедиаторов - глутамата и аспартата и понижает выброс избыточной окиси азота путем ингибирования nNOS. Вальпроевая кислота повышает содержание FAMK в центральной нервной системе за счет ингибирования ГАМК-трансферазы и стимулирует eNOS в нейронах одиночного пути дорсальных моторных ядер, блуждающего нерва (Верещагин Н.В., 1993; Ferrie С., 1994; Barron'Г JF., 2000; Петру хин A.C., 2001; Власов П.Н., 2002; Зенков Л.Р., 2003; Муха Н.В., 2004; Тюренков И.Н., 2004; Marson A.G., 2007).

Перечисленные эффекты создают предпосылки для рассмотрения выбранных нами противосудорожных средств в качестве возможных корректоров эндотелиальной дисфункции.

В связи с вышеизложенным представляется интересным и значимым провести комплексную оценку эндотелиопротективных свойств ламотриджина, вальпроатов и их комбинации при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункций.

Номер государственной регистрации темы - 01.2.008 03348.

Цель исследования: провести оценку эндотелио- и кардиопротективных эффектов ламотриджина и вальпроатов в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Изучить развитие эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированном дефиците NO, а также оценить зависимость между морфологическими и функциональными показателями. •

2. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность ламотриджина при L-NAME-индуцированном дефиците NO.

.3. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность вальпроатов (натрия вальпроата, вальпроевой кислоты) при L-NAME-индуцированном де-фицитеНО. :

4. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения ламотриджина и вальпроата натрия при L-NAME-индуцированном дефиците NO.

Научная новизна исследования. В работе впервые продемонстрировано, что ламотриджин 8,5 мг/кг (однократно внутрижелудочно в течение 7 суток) оказывает эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД, Вальпроат натрия 30 и 60 мг/кг (однократно внутрижелудочно в течение 7 суток) также обладал эндотелиопротек-тивными эффектами на выбранной модели патологии. Сочетанное использование ламотриджина 4 мг/кг и вальпроата натрия 30 мг/кг оказало положительное эндотелио- и кардиотропное влияние.

Научная новизна подтверждается положительным решением на выдачу патента РФ (Заявка 2008110098/14(010904» «Способ коррекции эндотелиальной дисфункции ламотриджин ом».

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность применения ламотриджина и его сочетания с вальпроатом натрия для коррекции L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД в эксперименте, Показано, что использование ламотриджина и его сочетания с вальпроатами позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндо-телийзависимая вазодилатация) и нитропруссид натрия (эндотел ийнезавйсимая вазодилатация) с приближением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) к показателям нормы, а также добиться положительной, динамики мор-фофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр мио-кардиоцитов, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением и адре-нореактивности и т.д.).

Полученные данные говорят о расширении ареала действия противосудо-рожных средств и позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания ламотриджина и его комбинации с вальпроатом натрия при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией, при сочетанной це-реброваскулярной и сердечно-сосудистой патологии.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндотелиопротективной активности ламотриджина, вальпроатов и их комбинаций, используются в лекционных курсах БелГУ, ОГУ, КГМУ.

Апробация работы. Материалы работы доложены на Российском национальном конгрессе кардиологов, Москва, 2008, на I Международной дистанционной научной конференции, Курск, 2008, на Международной научно-практической конференции, Белгород, 2008, на III Всероссийской конференции молодых ученых, Воронеж, 2009, на 74 научной конференции КГМУ, Курск, 2009, на IV Международной конференции по иммунотерапии, Москва, 2008, на научно-практической конференции СПХФА, Санкт-Петербург, 2008, на II Международной конференции молодых ученых-медиков, Курск, 2008, на XVI Национальном конгрессе «Человек и лекарство». Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии, фармацевтической, токсикологической и аналитической химии, гистологии, анатомии человека, общественного здоровья и здравоохранения, инфекционных болезней и НИИ экологической медицины Курского Государственного медицинского университета. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендуемых ВАК.

Положения, выносимые на защиту

1. Ламотриджин в дозах 8*5 мг/кг однократно в течение 7 суток внутри-желудочно оказывает выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД, проявляющееся в снижении показателя КЭД, способности предотвращать повышение адреноре-активности на фоне снижения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования кардиомиоцитов обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов под влиянием ламотриджина.

" Также выявлена корреляционная зависимость между морфологическими и функциональными показателями.

2. Использование валытроата натрия 30 й 60 мг/кг оказывает эндотелио-протективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, Что выражается в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Морфологические исследования кардиомиоцитов обнаружили тенденцию предотвращения увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов под влиянием вальпроата натрия.

3. Комбинированное использование ламотриджина 4 мг/кг с вальпроатом натрия оказывает эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, выражающееся в снижении КЭД, в положительной динамик© результатов нагрузочных проб и морфологических исследований.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов., заключения и списка используемой литературы, включающего 311 источник, из них 102 - отечественных и 209 - зарубежных авторов. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 10, рисунков — 27, схем - 1.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г. N-нитро-Ь-аргйнин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг. На 7 день от начала эксперимента под наркозом (этаминаш-натрия 50 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей, болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную5 вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД); диастолическое артериальное дайление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы «Biopac», Функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (40 мкг/кг) (Laursen J.B. ,1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Еалаган M.E.«, 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика P23ID «Gould», США, АЦП L-154, и компьютерной программы «Biopac» регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt шах), максимальную скорость расслабления (-dp/dt шах) и частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида из расчёта 0,1 мл на 100 г) (Меерсон Ф.З., 1980). •

2. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек) (Меерсон Ф.З., 1980),

3. 3-минутная гипоксия (Пашйн E.H., 1993).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO (Ме-тельская В. Д., Туманова Н.Г., 2005).

Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу Хендриксона (Метельская В.А., Туманову Н.Г., 2002).

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий). Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использованы окраски гематоксилином Pero и Эозином для выявления ранйих повреждений миокардиоцитов по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция. При морфометрии сердца использован метод раздельного взвешивания миокарда с определением индексов, определением диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г. Автанди-лова (1994). Определялись абсолютная и относительная масса надпочечников, в почках оценивался диаметр почечных телец и их клубочков.;

Обоснование доз и дизайн эксперимента. Исследована эндотелиотроп-ная активность ламотриджина («Ламиктал» производства «Глаксо-Вэллком», Великобритания) и вальпроата натрия («Депакин-энтерик» производства «Са-нофи-Синтелабо», Франция).

Ламотриджин и вальпроат натрия вводились внутрижелудочно в средней терапевтической дозе, исходя из оптимальных схем терапии в неврологии и психиатрии. Суспензии препаратов в 1% крахмальной слизи вводились в пищевод животных через зонд один раз в сутки.

Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на крысах (Deng L.Y., 1993).

Ламотриджин в дозе 8,5 мг/кг вводили внутрижелудочно один раз в сутки в течение 7 через 30 минут после введения L-NAME. Вальпроат натрия использовали в дозах 30 мг/кг и 60 мг/кг соответственно. Комбинированное использование ламотриджина 4 мг/кг (внутрижелудочно) и вальпроата натрия 30 мг/кг (внутрижелудочно) проводилось по вышеописанному протоколу один раз в сутки в течение 7 дней на фоне введения L-NAME. Вальпроат натрия замедляет метаболизм ламотриджина и усиливает его действие. Поэтому при одновременном приеме с вальпроатом натрия дозу ламотриджина уменьшают. Это подтверждается данными доступной литературы.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в приростах от исходного уров-

ня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±ш) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Длительное, в течение 7 суток, однократное внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 25 мг/кг вызывает у лабораторных животных комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений, связанных с развитием дефицита NO, вследствие блокады ÑO-синтазы. В частности, на 7-е сутки развивалась выраженная системная эндотедиальная дисфункция, которая проявлялась стойкой артериальной гипертензией, гиперреактивностью на ад-реналовуго пробу, снижением сократительной способности миокарда при пробе на нагрузку сопротивлением, резко уменьшением уровня нитрит-ионов и экспрессии eNOS. Гистологически обнаруживалась гипертрофия миокарда (увеличение диаметра миокардиоцитов) (рис. 1).

Проведение функциональных проб с оценкой реакции на эндотелий-зависимое и эндотелийнезависимое расслабление показало существенные отличия в группе с L-NAME-индуцированной патологией от интаетных животных.

На рисунке 2а - верхняя кривая - АД систолическое, далее - АД диасто-лическое и ЧСС. Реакция на введение ацетилхолина характеризуется резким падением АД и брадикардией. После окончания миокардиального компонента (метка 2) АД восстанавливается. Треугольник над кривой восстановления АД рассматривался нами как площадь эндотелиальной реакции.

На рис. 26 представлена реакция на ацетилхолии при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции. При этом видно, что площадь эндотелийзависимой реакции в несколько раз меньше, чем у иитакт-ных животных.

'Ж

И САД ДАД

кэд

АДр 247,3*

83,6%«

- Интактные —*— Ь-К'АМЗ

ЮТ

Рис. 1, Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ИАМЕ-индуцированного дефицита N0. Здесь и далее: АД - артериальное давление, КЭД -коэффициент эндотелиальиой дисфункции, АДр - адренореактивность, НС - нагрузка сопротивлением, еЫОБ - экспрессия N0-синтазы, ТМОх-1;о1а1 N0, ДМ-сЗ клеток сердца * - р < 0,05 в сравнении с группой иитактяых животных.

- Интактные КЙЯ - Ь-ЫАМЕ

эндотелийзависимую вазодилатацию (внутривенное введение ацетилхолииа 40 мкг\кг) у интактных животных.

Треугольники над кривой артериального давления - объяснение по тексту,

Аналогично оценивали эндотелийнезависимую реакцию на нитропрус-сид. Обращает на себя внимание отсутствие принципиальной разницы в площадях эндотелийнезависимых реакций у интактных и опытных групп, несмотря на существенно более высокие цифры АД (рис. 3).

1 тп тнтн» «и* | м,а »и «тши II аяаим» изст-..... № К

¿X! НМТЛК № 1ГПК 1 1..м . . им 1 Ш.К «1 ШЛЧК» > ягм ой «мтяш н н«.ы на имт» м 4

^■¡тшшягЗП*"1"*

».« »¡»нищ, .да* ш «Г <"» > ш. и никжкгг «и<м. тнзпут » >пп 1 им*

■ ->-'---"'д''("г,у -4-- ' '><■■'—'- те . • ,...... ,: 1 ш

а) интактные животные б) животные с патологией

Рис. 3. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на эндотелийнезависимую вазодилатацию (внутривенное введение нитропруссида натрия 30 мкг\кг) у интактных животных.

Треугольники над кривой артериального давления - объяснение по тексту.

Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади среднего артериального давления на ацетилхолин.

В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1,1±0,1, при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота - в 5 раз больше:

его значение составило 5,4±0,6 (рис, 1). Ь-НАМЕ-индуцированный дефицит оксида азота привёл к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адре-нореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе нагрузки сопротивлением (рис. 1), У интактных животных ЛЖД к 25 секунде снижалось до 83,6±2Д%, а у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией значительно сильнее -до 66,0±2,3%.

Характерная динамика биохимических маркеров Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота представлена на рис. 1. Так, концентрация нитрит-ионов (>Юх) у животных, получавших ¿-КАМЕ, составила 61,2±3,6, тогда как у интактных - 114,1±4,1 мкм.

Экспрессия эндотелиальной ЫО-синтазы (е-ИОБ) сывороткой интактных животных составила 72,9±3,8 тогда как у животных, получающих ЫМАМЕ, -21,4±4,7% .

Изменения, характерные для ЫЧАМЕ-индуцированной артериальной ги-пертензии, выявлены и при морфологическом исследовании сердца, артерий почек и миокарда.

На 7-е сутки эксперимента отмечено развитие значительной гипертрофии миокарда. Это выражается в достоверном увеличении общей массы сердца и сердечного индекса на 26,6%, утолщении межжелудочковой перегородки, увеличении диаметра цитоплазмы кардиомиоцитов (КМЦ) и площади поперечного сечения их ядер (табл. 1).

Таблица 1

Параметры миокарда крыс при моделировании дефицита оксида азота

Параметр миокарда интактные ЫМАМЕ

Масса сердца, мг 836±76 1053±123*

Относительная масса сердца, мг/г 2,97±0,12 3,65±0,21*

Диаметр КМЦ, мкм 8,8±0,5 19,8±0,3*

Толщина межжелудочковой перегородки, мкм 1965±125 2618±180*

Площадь поперечного сечения ядер КМЦ, мкм2 36,0±3,0 49,3±3,6*

Примечание: * - р<0,05 - в сравнении с интактными

При микроскопии в ишемизированных почках выявлены типичные для данного состояния изменения. Наблюдались клиновидные участки некроза, атрофии паренхимы с коллапсом стромы, ее лимфоидной инфильтрацией.

Выраженные диффузные изменения почечных телец в виде сморщивания, гиалиноза и склероза, гиалиноз и склероз артерий. Эпителий канальцев уплощен, на значительных участках десквамирован. Практически все канальцы заполнены плотными гиалиновыми цилиндрами.

В контрлатеральных почках наблюдались закономерные компенсаторные изменения в виде гипертрофии почечных телец (средний диаметр 87,4±0,8; в

норме 72,6±0,8 мкм) с расширением полости капсулы, составившей 19,5% площади (в норме 14,6%), что в сочетании с диффузным полнокровием свидетельствует о развитии гиперфильтрации. Заметной реакции мезангия не отмечено: среднее количество клеток на клубочек составило 31,0±0,6 (в норме 37,8±0,9). Со стороны канальцев наблюдалось умеренное расширение, очагово-зернистая дистрофия, в просвете единичных канальцев имелись гиалиновые цилиндры, гипертрофия юкстагломерулярного аппарата (ЮГА) (рис. 4, рис. 5).

2

Рис. 4. Гипертрофия ЮГА у крысы с экспериментальной гипертонией. Окраска гематоксилином и эозином. х280.

Рис. 5. Почечный клубочек интактной крысы - гипертрофии ЮГА нет. Окраска гематоксилином и эозином. х280

В сердце отмечена гипертрофия кардиомиоцитов (КМЦ) левого желудочка до 19,8±0,3 (в норме 8,8±0,5 мкм) (рис. 6, рис. 7), сосудистые изменения в виде спастического состояния артериол, утолщения их стенок (рис. 8, рис. 9, рис.10).

Рис. 6. Кардиомиоциты интактной крысы. Окраска гематоксилином и эозином. х280.

Рис. 7. Миокард левого желудочка крысы, получавшей Ь-ЫАМЕ: видна отчетливая гипертрофия цитоплазмы КМЦ и их ядер. Окраска гематоксилином и эозином. х280.

Ри. 8. Мелкая артерия миокарда интактной крысы. Окраска гематоксилином и эозином. х280.

Рис. 9. Выраженная гипертрофия стенки артерии миокарда крысы с экспериментальной гипертонией. Окраска гематоксилином и эозином. х280

Рис. 10. Набухание и отек цитоплазмы эндотелия мелкой артерии миокарда сердца у крысы с экспериментальной гипертонией. Окраска гематоксилином и эозином, а) х280; б) хбЗО.

При окраске гематоксилином Pero выявлялись очаговые сегментарные или тотальные повреждения кардиомиоцитов контрактурного типа (рис. 11).

а

б

Рис. 11. Контрактильная дегенерация КМЦ крысы на 7-е сутки после ежедневного введения Ь-ЫАМЕ. Окраска гематоксилином и эозином. х280.

Комплекс изменений в сердце, сосудах миокарда и почках позволяет оценить их как соответствующие периоду стойкого повышения артериального давления с развитием поражения сосудов.

Таким образом, результаты гистологических исследований обнаружили, что моделирование Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0 на 7-е сутки приводит к яркой гипертрофии миокардиоцитов, утолщению мышечного слоя сосудистой стенки и спазму артериол, наиболее выраженному в почечных артериях, а также изменению эндотелия в виде разрывов, отека цитоплазмы.

Ежедневное в течение 7 суток внутрибрюшинное введение Ь-ЫАМЕ 25 мг/кг вызывает развитие эндотелиальной дисфункции, характеризующейся резким увеличением КЭД, АД, повышением адренореактивности, снижением инотропного резерва, характерными биохимическими сдвигами и гистологической картиной гипертрофии миокарда и гиперплазии сосудистого русла,

2. Исследование эндотелиопротективной активности ламотриджина на Ь^АМЕ-индуцированной модели дефицита N0 с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований

Наши исследования показали, что ламотриджин обладает выраженным эндотелиопротективным эффектом Так, КЭД у интактных животных составил -1,1±0,1, у животных с Ь-ЫАМЕ - 5,4±0,6, в группе с ЫЧАМЕ и ламотриджи-ном (8,5 мг/кг)- 1,9±0,3 (рис. 12).

Проба на адренореактивность у животных с Ь-КАМЕ-иидуцированной патологией на фоне терапии ламотриджином обнаружила тенденцию к снижению максимальных цифр левожелудочкового давления (рис. 12).

В пробе на нагрузку сопротивлением сократимость на 25 секун оде нагрузки составила у интактных животных - 83,6±2,1% к 5-й секунде, взятой за 100%. Ь-ЫАМЕ-индуцированная патология - 66,0±2,3%. У животных, получавших ламотриджин, отмечено четкое предотвращение исчерпания миокардиального резерва. Сократимость на 25 секунде составила 102,3±7,6%. Концентрация нитрит-ионов в сыворотке крови животных под влиянием ламотриджина существенно не изменялась-по сравнению с группой ЫЧАМЕ (рис. 12). Терапевтические дозы ламотриджина понижали степень развития гипертрофии миокарда (табл. 2, рис. 12).

Т1 с

-Интактные'

ЫММЕ+ламотриджин 8,5 мг/кг

Рис. 12. Влияние ламотриджина 8,5 мг\кг на функциональные, био химические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0.

* - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-ИАМЕ животных, , ** - р < 0,05 в сравнении с группой ин-тактных животных

ЕЗ Интактные

^ Ь-ЫАМЕ

ВЯ Ламотриджин 8,5 мг/кг

Рис. 13. Влияние вальпроата натрия 30 и 60 мг\кг, комбинации ламот-риджина 4 мг\кг с вальпроатом натрия 30 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0.

* - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-^МЕ животных,

** - р < 0,05 в сравнении с группой ин-тактных животных

"114,1

¡¿3 Ингактныс

Ь-ЫАМЕ

Вальпроат 30 мг/кг

Ламотриджин 4 мг/кг

Э Вальпроат 60 мг/кг В + вальпроат 30 мг/кг

3. Исследование эвдотелиопротективиой активности вальпроата натрия и его комбинации с ламотриджином на 1ЖАМЕ-ивдуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

Применение вальпроата натрия в дозе 30 и 60 мг/кг и комбинации ламот-р и джин а 4 мг/кг с вальпроатом натрия 30 мг/кг на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота, не предотвращало развитие гипертен-зии при Ь-КАМЕ-индуцированноЙ модели патологии.

Наши исследования позволили установить, что вальпроат натрия в дозе 30 и 60 мг/кг/сут проявлял эндотелиопротективное действие на модели Ь-ТМАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота, однако уступал комбинации ламотриджина с вальпроатом. Коэффициент эндотелиальной дисфункции у ин-тактных животных составил - 1,1±0,1, у Ь-ЫАМЕ - 5,4±0,6, Ь-ЫАМЕ + вальпроат натрия (30 мг/кг) - 2,4±0,3, Ь-ЫАМЕ + вальпроат натрия (60 мг/кг) -2,5±0,3, Ь-ИАМЕ + ламотриджин (4 мг/кг) + вальпроат натрия (30 мг/кг) -2,2±0,3 (рис. 13).

В экспериментах на открытом сердце проба на адренореактивность у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией на фоне терапии вальпроатом натрия в двух дозах и комбинацией ламотриджина с вальпроатом обнаружила снижение максимальных цифр левожелудочкового давления. У интактных животных - 199,2±8,3, у Ь-ЫАМЕ - 247,3±4,8, у вальпроата натрия (30 мг/кг) -201,9±16,6, у вальпроата натрия (60 мг/кг) - 210±8,7 мм рт.ст., у ламотриджина (4 мг/кг) с вальпроатом натрия (30 мг/кг) - 218,2±11,3 мм рт.ст.

Аналогичная тенденция выявлена при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. Сократимость на 25-й секунде нагрузки составила у иНтактных животных - 83,6±7,7% к 5-й секунде, взятой за 100%. Ь-КАМЕ-индуцированная патология - 66,0±5,5%, Ь-ЫАМЕ + вальпроат натрия (30 мг/кг) - 74,4± 12,9%, Ь-ИАМЕ + вальпроат натрия (60 мг/кг) ~ 73,2%±11,8%, Ь-ИАМЕ + ламотриджин (4 мг\кг) + вальпроат натрия (30 мг/кг) - 85,3±11,5% (рис. 13),

Морфометрия диаметра кардиомиоцитов также показала преимущество комбинации ламотриджина с вальпроатом натрия по сравнению с вальпроатом натрия в двух дозах (рис. 13, табл. 2).

Из данных, приведенных в таблице, видно, что масса сердца и сердечный индекс, а также толщина межжелудочковой перегородки, диаметр цитоплазмы КМЦ и площадь поперечного сечений их ядер у крыс, получавших ламотриджин и комбинацию ламотриджина с вальпроатом натрия, ниже, чем при терапии вальпроатом натрия в двух дозах.

Таким образом, по совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей, отражающих эндотелиопротективные эффекты, доказано непосредственное позитивное влияние противосудорожных препаратов на периферические сосуды и миокард при экспериментальной модели дефицита оксида азота.

Таблица 2

Параметры миокарда крыс при коррекции Ь-ОДМЕ-иидуцированного _дефицита оксида азота изучаемыми препаратами____

Параметр миокарда Ь-ИАМЕ+ Ламотриджин 8,5 мг/кг Ы*АМЕ+ Вальпроат натрия 30 мг/кг Ь-ЫАМЕ+ • Вапьпроат натрия 60 мг\кг ЬгЫАМЕ+ Ламотриджин 4 мг/кг + вальпроат 30 мг/кг

Масса сердца, мг 849±71 993±71 990±103 925±116

Относительная масса сердца, мг/г 3,14±0,47 3,54±0,12 3,52±0,28 3,30±0,18

Диаметр КМЦ, мкм 10,71±0,6 14,7=*=0,3 15,0*0,3 13,5±0,3

Толщина межжелудочковой перегородки, мкм 2007±202 2122±224 2115±213 2099±213

Площадь поперечного сечения ядер КМЦ, мкм2 39,2±0,9 42,4±0,9 42,1±1,3 40,1±1,3

ВЫВОДЫ

1. Моделирование Ь-1ч[АМЕ-индуцированного дефицита оксида азота вызывает у крыс комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений, указывающих на развитие эндотелиальной дисфункции. В частности, на 7 сутки развивалась выраженная гипертензия, гиперреактивность на адренало-вую пробу, снижалась сократительная способность миокарда при пробе на нагрузку сопротивлением. Наиболее информативным показателем оказался предложенный нами коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД), который при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции оказался в 5 раз выше, чем у интактных животных.

2. Ламотриджин в дозе 8,5 мг/кг однократно в течение 7 суток проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, приближаясь к уровню интактных животных, а также в полном предотвращении исчерпания миокардиального резерва. Ламотриджин 8,5 мг/кг предотвращал увеличение поперечного диаметра мио-кардиоцитов.

3. Вапьпроат натрия в дозах 30 и 60 мг/кг проявлял эндотелиопротективное действие на модели Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Кардиопротективное действие вальпроата натрия на выбранной нами жесткой модели артериальной гипертензии представляется менее четким и требует дальнейшего изучения.

4. Комбинация ламотриджина 4 мг/кг с вальпроатом натрия 30 мг/кг оказывала эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-

индуцированного дефицита оксида азота, выражающееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, а также в предотвращении исчерпания миокардиадьного резерва. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра миокардиоци-тов под влиянием комбинации ламотриджина с вадьпроатом натрия,, но в меньшей степени, чем при монотерапии ламотриджином,

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лучкина, Е.В. Сравнительное изучение эндотелио- и кардиопротективных свойств ламотриджина и вальпроатов при экспериментальной дисфункции эндотелйя / Е.В. Лучкина // Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании: материалы Между нар. науч.-практ. конф. -Белгород,2008.-С. 310-312. /Г

2. Лучкина, Е.В. Изучение эндотелио- и кардиопротективных свойств ламотриджина и вальпроата натрия при экспериментальной эндотелиальной дисфункции / Е.В. Лучкина // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 74-Й науч. конф; КГМУ и сес. Центр.-Чернозем. науч. центра РАЕН: в 2 т. - Курск: КГМУ, 2009. - Т. 2. - С. 300. '

3. Использование ламотриджина для коррекции эндотелиальной дисфункции в эксперименте / Е.В. Лучкина, Т.Г. Покровская, И.Н. Ершов, М.В, Покровский // Междунар. конф, «Физиология и патология иммунной системы». IV Междунар. конф. по иммунотерапии // Аллергология и иммунология. -2008.-Т. 9.-С. 328.

4. Применение ламотриджина для коррекции эндотелиальной дисфункции / Е.В. Лучкина, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова // Биомедицинская инженерия и биотехнология: сб. тр. Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 10-летию биотехнол. ф-та Курского гос. мед. ун-та. — Курск: КГМУ,

2008.-С. 175-177.

5. Ламотриджин - корректор эндотелиальной дисфункции / Е.В. Лучкина, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова // Рос. нац. конгр. кардиологов «Повышение качества и доступности кардиологической помощи»// Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008. - № 7 (6). -Прил. 1.-С. 221.

6. Эндотелиопротективные эффекты ламотриджина при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита азота в эксперименте /Е.В. Лучкина, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова // «Фармация из века в век»: тр. науч.-практ. конф. - СПб., 2008. - Ч. V: Синтез биологически активных веществ для создания фармацевтических субстанций. Фармакологические исследования. - С. 101.

7. Лучкина, Е.В. Кардиопротективные эффекты ламотриджина при экспериментальном моделировании Ь-ИАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции / Е.В. Лучкина, Т.Г. Покровская, М.В. Покровский // Материалы I Междунар. дистанционной науч. конф. «Инновации в медицине». - Курск,

2009.-С. 154-155.

8. Применение ламотриджииа и вальпроатов для коррекции эндотелиальной дисфункции / Е.В, Лучкина, Т.Г. Покровская, М.В. Покровский, И.Н. Ершов // Материалы I Междунар. дистанционной науч. конф. «Инновации в медицине». - Курск, 2009. - С. 152-153.

9. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов ламотриджииа, пикамилона и вальпроатов при экспериментальной эндотелиальной дисфункции / И.Н. Ершов, Е.В. Лучкина, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская // Кубанский науч. мед. вестн. - 2009. № 3 (108). - С. 50-53»

10. Лучкина, Е.В, Изучение эндотелиопротективных эффектов ламотриджииа и вальпроата натрия при экспериментальном моделировании Ь-КАМЕ-инду-цированного дефицита оксида азота / Е.В. Лучкина, М.В, Покровский, Т.Г, Покровская // XVI Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2009. -С.589.

11. Кардиопротективные эффекты ламотриджииа и вальпроата натрия при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте, сравнительный аспект / Е.В. Лучкина, М.В. Покровский, Т.Г, Покровская // XVI Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2009. - С. 590.

12. Эндотелио- и кардиопротективные свойства ламотриджииа и вальпроатов при экспериментальной дисфункции эндотелия / Е.В. Лучкина, Т.Г. Покровская, М.В. Покровский // Материалы III Всерос. конф. молодых ученых. -Воронеж, 2009. - Т. 2, - С. 244.

13. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов ламотриджииа и вальпроатов при экспериментальной эндотелиальной дисфункции / Е.В, Лучкина, И.Н. Ершов, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская // Рос. меди-ко-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - Рязань, 2009. - № 2. - С. 33-35.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление

АДр - адренореактивность

ДАД - диастолическое артериальное давление (мм рт. с

ДМ - диаметр кардиомиоцитов

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ЛЖД - левожелудочковое давление

НС - нагрузка сопротивлением

САД - систолическое артериальное давление (мм рт. сл

ЧСС - частота сердечных сокращений (уд./мин)

ЮГА - юкстагломерулярный аппарат

e-NOS - экспрессия синтазы оксида азота

eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота

nNOS - нейрональная синтаза оксида азота

iNOS - индуцибельная синтаза оксида азота

NOx - total NO

СТАТИСТИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

р - уровень статистической значимости * - достоверность различий, р<0,05

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 29.05.2009 г. Подписано в печать 01.06.2009 г. Формат 30x42V8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 82А. Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

, и ^ ü 4 J 4 g

2008171806

Эндотелиальная дисфункция (ЭД) является одной из ключевых проблем современной медицины. Многолетние биологические исследования свидетельствуют о вовлечении эндотелия в патогенетические и патофизиологические процессы. Основным механизмом, лежащим в основе ЭД, является снижение образования и биодоступности оксида азота (NO), при одновременном повышении уровня супероксиданиона и продукции мощных вазоконстрикторов [6, 9, 33, 46, 71, 76]. ГБ, атеросклероз, артериальная гипертензия, легочная гипертензия, сердечная недостаточность, дилатационная кардиомиопатия, ожирение, гиперлипидемия, сахарный диабет, гипергомоцистеинемия, цереброваскулярные нарушения и судорожный синдром, импотенция - все это далеко не полный перечень патологических процессов, в той или иной степени связанных с изменениями в метаболизме N0.

NO синтезируется из L-аргинина с помощью семейства ферментов, определяемых как NO-синтазы (NOS). NOS бывают эндотелиальные, макрофагальные и нейрональные. Роль NO в процессах нейротрансмиссии и развитии ишемии мозга требует детального рассмотрения. NO может легко распространяться от места его образования во все стороны, в том числе и ретроградно, легко проходя через липидную и водную фазы и взаимодействуя с нервными, глиальными и сосудистыми клетками. Гибель нейронов при недостатке кислорода связывают с нейротоксичностью глутамата. Но взаимодействие глутамата с рецепторами и последующий массивный вход ионов кальция является лишь пусковым моментом в цепи событий, приводящих к повреждению нейрона. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция приводит к активации семейства NOS и интенсивному образованию NO и пероксинитрита, являющегося непосредственной причиной гибели клеток. Это положение подтверждается тем фактом, что ингибиторы NOS в ряде случаев оказываются весьма эффективными для предотвращения ЭД при ишемии головного мозга (ГМ) [58, 133, 134, 285].

Перспективным, но недостаточно разработанным направлением в данной области является поиск новых свойств хорошо известных препаратов, влияющих на трофику сердца и сосудов путем воздействия на центральную нервную систему. Во внутрисердечных ганглиях экпрессируется нейрональная изоформа NOS. Недавние исследования подтверждают, что основной вклад NO-ергического влияния на сердце происходит через внутрисердечные нервные структуры. Изменения ЧСС под действием ингибиторов NOS происходят за счет модуляции нейротрансмиттеров из симпатических и парасимпатических окончаний [6, 7, 11, 12, 13, 24, 30, 32].

NOS-содержащие нейроны в сердце человека и животных являются холинергическими и принадлежат парасимпатическому отделу вегетативной нервной системы [3, 4, 76, 96].

Поиск возможностей целенаправленного лечения ЭД является важной клинико-экспериментальной задачей, но вместе с тем в настоящее время не существует препаратов для ее специфической коррекции. Целостность эндотелиального пласта обеспечивает его функциональные свойства. В экспериментах изучен вклад нейрональных и экстранейрональных источников оксида азота в развитие системной дисфункции эндотелия. Десквамированные эндотелиальные клетки проникают через поврежденный ГЭБ и вызывают патологические изменения в периферических сосудах.

Одной из важных точек приложения терапевтического воздействия при ЭД является восстановление биодоступности NO [62]. Роль семейства NOS представляется особенно важной в качестве мишени потенциального терапевтического воздействия. Идеальным агентом для лечения сопряженной терапевтической патологии был бы такой препарат, который предотвращал бы появление пероксинитрита, но в то же время способствовал повышению биодоступности NO.

Современные противоэпилептические и ГАМК-ергические препараты ламотриджин и вальпроевая кислота проявляют антигипоксические, антиишемические и антиоксидантные свойства. Помимо этого ламотриджин стабилизирует пресинаптическую нейрональную мембрану, блокируя вольтаж-зависимые натриевые каналы. Кроме того, он ограничивает высвобождение возбуждающих нейромедиаторов — глутамата и аспартата и понижает выброс избыточной окиси азота, путем ингибирования нейрональной ЫО-синтазы Перечисленные эффекты создают предпосылки рассмотреть выбранные нами противосудорожные средства как возможные корректоры эндотелиальной дисфункции.

В связи с вышеизложенным представляется интересным и значимым провести комплексную оценку эндотелиопротективных свойств ламотриджина, вальпроатов и их комбинации при Ь-ЫАМЕ индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Номер государственной регистрации темы - 01.2.008 03348

Цель исследования: провести оценку эндотелио- и кардиопротективных эффектов ламотриджина и вальпроатов в эксперименте.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Изучить развитие эндотелиальной дисфункции при Ь-МАМЕ-индуцированном дефиците N0, а также оценить степень корреляционной зависимости между морфологическими и функциональными показателями.

2. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность ламотриджина при Ь-МАМЕ-индуцированном дефиците N0.

3.Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность вальпроатов (натрия вальпроата, вальпроевой кислоты) при Ь-МАМЕ-индуцированном дефиците N0.

4. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения ламотриджина и вальпроата натрия при Ь-МАМЕ-индуцированном дефиците N0.

Научная новизна исследования. В работе продемонстрировано, что ламотриджин 8,5 мг/кг (однократно внутрижелудочно в течение 7 суток) оказывает эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь-ИАМЕиндуцированной МО-дефицитной ЭД. Вальпроат натрия 30 и 60 мг/кг (однократно внутрижелудочно в течение 7 суток) также обладали эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии. Сочетанное использование ламотриджина 4 мг/кг и вальпроата натрия 30 мг/кг показало положительное эндотелио- и кардиотропное влияние.

Научная новизна подтверждается положительным решением на выдачу патента РФ (Заявка 2008110098/14(010904)) «Способ коррекции эндотелиальной дисфункции ламотриджином».

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность применения ламотриджина и его сочетания с вальпроатом натрия для коррекции Ь-№АМЕ-индуцированной N0-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид натрия (эндотелийнезависимая вазодилатация) с приближениям коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) к показателям нормы, а также добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечнососудистой системы (диаметр миокардиоцитов, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением и адренореактивности и т.д.).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания ламотриджина и его комбинации с вальпроатом натрия при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией, при сочетанной цереброваскулярной и сердечно-сосудистой патологии.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндотелиопротективной активности ламотриджина, вальпроатов и их комбинации и его комбинаций, используются и в лекционных курсах БелГУ, КГМУ, ОГУ.

Апробация работы. Материалы работы доложены на Российском национальном конгрессе кардиологов, Москва, 2008, на I Международной дистанционной научной конференции, Курск, 2008, на Международной научно-практической конференции, Белгород, 2008, на III Всероссийской конференции молодых ученых, Воронеж, 2009, на 74 научной конференции КГМУ, Курск, 2009, на IV Международной конференции по иммунотерапии, Москва, 2008, на научно-практической конференции СПХФА, Санкт-Петербург, 2008, на II Международной конференции молодых ученых-медиков, Курск, 2008, на XVI национальном конгрессе «Человек и лекарство». Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 2, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Положения, выносимые на защиту:

1.Ламотриджин в дозах 8,5 мг/кг однократно в течение 7 суток внутрижелудочно оказывает выраженное эндотелио- и кардиопротективное. действие на модели Ь-НАМЕ-индуцированной ИО-дефицитной ЭД. выражающееся в снижении показателя КЭД , способности предотвращать повышение адренореактивности на фоне снижения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования кардиомиоцитов обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов под влиянием ламотриджина.

Также выявлена корреляционная зависимость между морфологическими и функциональными показателями.

2.Использование вальпроата натрия 30 и 60 мг/кг оказывает эндотелиопротективное действие на модели Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражается в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Морфологические исследования кардиомиоцитов обнаружили тенденцию предотвращения увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов под влиянием вальпроата натрия.

3.Комбинированное использование ламотриджина 4 мг/кг с вальпроатом натрия оказывает эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь-ИАМЕ-индуцированного дефицита N0, выражающееся в снижении КЭД, в положительной динамике результатов нагрузочных проб и морфологических исследований.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 311 источник, из них 102 - отечественных и 209 - зарубежных авторов. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит таблиц — 10, рисунков — 27, схем - 1.

ВЫВОДЫ

1. Моделирование Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота вызывало развитие комплекса морфофункциональных изменений сосудистой стенки и кардиомиоцитов. При этом обнаружено преобладание нарушений эндотелийзависимого расслабления, сопровождавшихся уменьшением количества стабильных метаболитов оксида азота.

2. Ламотриджин в дозе 8,5 мг/кг однократно в течение 7 суток проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-№АМЕ-индуцированного дефицита оксида азота, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, приближаясь к уровню интактных животных, а также в полном предотвращении исчерпания миокардиального резерва. Ламотриджин 8,5 мг/кг предотвращал увеличение поперечного диаметра миокардиоцитов.

3. Вальпроат натрия в дозах 30 и 60 мг/кг проявлял эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Кардиопротективное действие вальпроата натрия на выбранной нами жесткой модели артериальной гипертензии представляется сомнительным и требует дальнейшего изучения.

4. Комбинация ламотриджина 8,5 мг/кг с вальпроатом натрия 30 мг/кг оказывала эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота, выражающееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, а также в предотвращении исчерпания миокардиального резерва. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов под влиянием комбинации ламотриджина с вальпроатом натрия, но в меньшей степени, чем при монотерапии л амотриджином.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Конец 20 - начало 21 века характеризуется все возрастающей долей нозологий в патогенезе которых ведущую роль играет дисфункция эндотелия [128, 129, 180, 182]. Эндотелий контролирует сосудистый тонус, рост гладкомышечных клеток, тромбообразование, фибринолиз и многие другие процессы. Сосудистый гомеостаз регулируется посредством высвобождения клетками эндотелия ряда вазоактивных веществ, которые поддерживают базальный тонус сосудов, обладают ангиопротективными свойствами, подавляя пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов, предотвращают ремоделирование сосудистой стенки, ингибируют агрегацию и адгезию тромбоцитов, лейкоцитарные взаимодействия и миграцию моноцитов, оказывают антиоксидантное действие. В физиологических условиях преобладает освобождение релаксирующих факторов. В нормально функционирующем эндотелии низкие уровни оксида азота постоянно высвобождаются для поддержания кровеносных сосудов в состоянии дилатации. Однако в определенных кровеносных сосудах (церебральные артерии) нормальный эндотелий предрасположен к высвобождению сосудосуживающих веществ. При различных цереброваскулярных заболеваниях способность эндотелиальных клеток освобождать релаксирующие факторы уменьшается, тогда как образование сосудосуживающих факторов сохраняется или увеличивается, то есть формируется состояние, определяемое как дисфункция эндотелия [128, 133, 180, 196].

Основным механизмом, лежащим в основе ЭД является снижение образования и биодоступности оксида азота (NO), при одновременном повышении уровня супероксид-аниона и продукции мощных вазоконстрикторов [12], т.е. проявляется дисбалансом между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов [1, 12,13, 15, 16, 20, 21, 23, 24].

Методы исследования функции эндотелия периферических артерий основываются на оценке его способности продуцировать N0 в ответ на фармакологические (ацетилхолин, метахолин, брадикинин, гистамин) или физические (изменение кровотока) стимулы, а также на прямом определении уровня N0 и оценке уровня косвенных показателей эндотелиальной функции (эндотелии, фактор фон Виллебранда, тканевой активатор плазминогена, тромбомодулин) [1, 3, 129, 133, 182, 196].

Изучение ЭД, состояния сосудистой стенки артерий у больных с сердечно-сосудистыми и цереброваскулярными заболеваниями, поиск возможностей лечения ЭД являются важными клиническими задачами. Усилия ученых направлены на поиск препаратов, которые могли бы уменьшать выраженность ЭД и способствовать обратному ее развитию.

Вышеизложенное предопределило необходимость разработки и систематизации методологических подходов к оценке эндотелиальной дисфункции с одной стороны, и последующей оптимизации коррекции ЭД с учетом вклада в течение патологического процесса препаратов разных групп.

Так, в ходе проведенных нами исследований в эксперименте на белых крысах-самцах линии \Vistar был разработан комплекс методических подходов для оценки функционального состояния эндотелия, включающий физиологические, биохимические и морфологические методы.

Физиологические методы исследования включали моделирование эндотелиальной дисфункции ежедневным в/б введением Ь-ЫАМЕ в течение 7 суток. Механизм ингибирования выработки N0 в случае, использования ХЕКАМИ заключается в конкурентном ингибировании фермента е!\Ю8 аналогом Ь-аргинина — Ь-ЫЫА. Ь-ЫАМЕ фактически является пролекарством: в организме этот эфир гидролизу ется с участием специальных ферментов — эстераз, давая активный ингибитор — Ь-МЧА. В свою очередь дефицит сосудистого N0 вызывает существенные изменения функций системы кровообращения в целом. Эти нарушения включают: снижение эффектов эндотелийзависимых вазодилататоров и повышение вазоконстрикторных влияний, рост АД, нарушения системной и региональной гемодинамики, функций сердца, увеличение экспрессии адгезивных молекул эндотелия, агрегации тромбоцитов; прилипание их и лейкоцитов к сосудистой стенке; пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток с образованием неоинтимы, синтез внеклеточного матриксаи др. [66, 71, 197, 199].

Для оценки степени развития эндотелиальной дисфункции на седьмые сутки животных наркотизировали брали в эксперимент и на первом этапе оценивали реакции артериального давления на эндотелийзависимую (АХ) и эндотелийнезависимую (НП) вазодилатацию [63, 64].

Степень эндотелиальной дисфункции рассчитывали как коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) - отношение площадей треугольников над кривой восстановления артериального давления на нитропруссид и ацетилхолин.

Мы рассчитывали КЭД у каждого животного интактной группы и крыс после моделирования блокады ЫО-синтазы и получили разницу КЭД в 5 раз -соответственно 1,1 у интактных и 5,4 у животных, получавших Ь-КАМЕ. Данные результаты выявили адекватность выбранной модели патологии для исследования фармакологической активности ламотриджина, вальпроата натрия и их комбинации.

Данные факты подтвердились при определении биохимических маркеров ЭД. ЫО-продуцирующая функция эндотелия исследована на основании данных увеличения экспрессии е-МОБ (в процентах от контроля) и содержания нитрит-ионов >Юх, и обнаружено, что моделирование Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита N0 приводило к резкому снижению экспрессии е-МОБ и содержания нитрит-ионов (ЫОх), соответственно в 3,5 и 1,9 раза.

Результаты гистологических исследований обнаружили, что моделирование Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0 на 7-е сутки приводит к яркой гипертрофии миокардиоцитов, утолщению мышечного слоя сосудистой стенки и спазму артериол, наиболее выраженному в почечных артериях, а также отеку и дезорганизации расположения эндотелиоцитов.

Следует отметить, что предложенный методический комплекс, функциональных, биохимических и морфологических изменений, связанных с развитием дефицита N0, вследствие блокады ЫО-синтетазы, позволяет в достаточной степени объективно оценивать эндотелиотропное действие фармакологических агентов.

В дальнейшем с помощью вышеизложенных методологических подходов были проведены сравнительные исследования ламотриджина с вальпроатом натрия в двух дозах и с комбинацией ламотриджина и вальпроата натрия.

Эти противоэпилептические препараты давно и успешно применяются на практике для купирования судорожного синдрома, в качестве нормотимиков и для коррекции поведенческих нарушений. Препараты хорошо переносятся стариками и детьми и считаются наиболее перспективными [6, 32, 55, 105, 107, 111].

В литературе имеются косвенные данные о цитотоксических эффектах N0 и его продуктов при повреждении ЦНС на эндотелий сосудов локального и системного кровотока [30, 66, 128, 132, 165, 191, 217, 265, 270].

При острой церебральной ишемии и/или патологической судорожной активности мозга активируется глутамат-кальциевый каскад, происходит дисбаланс между тормозными и возбуждающими нейротрансмиттерами в сторону последних (глутаминовая и аспарагиновая кислоты). Вследствие этого массивное внутриклеточное поступление ионов натрия и кальция стимулирует нейрональную и индуцибельную ЫО-синтетазу [29, 32, 38, 53, 74, 87, 103, 108]. Оксид азота окисляется до пероксинитрита. Это высокотоксичное соединение, вызывающее порочный круг, в котором небольшое количество радикалов вызывает выработку большого их количества и приводит к повреждению клетки. Диффундируя к системным сосудам, супероксид-анион и пероксинитрит оказывают на них I повреждающее действие, приводят к формированию отека сосудистой стенки, повышению ее проницаемости, сгущению крови, повышению ее вязкости, а также увеличению агрегационных свойств форменных элементов.

Системный характер сосудистой патологии (дисфункции эндотелия) приводит к мгновенной или пролонгированной гипоксии всех церебральных структур [24, 25, 32, 62]. Активированные нейтрофильные лейкоциты проникают через поврежденный ГЭБ в общий кровоток и задерживаются в сосудах других органов.

Сердце млекопитающих иннервируется как афферентными нервными элементами, так и вегетативным отделом нервной системы - ветвями симпатического отдела и парасимпатическими волокнами в составе блуждающего нерва [24, 29, 35, 38, 62]. Согласно данным литературы, афферентные нервные элементы оканчиваются рецепторами различных типов на миоцитах и соединительнотканных элементах сердца. Внутрисердечные нервные клетки экспрессируют ряд ключевых ферментов, определяющих их медиаторную специализацию. Нейрональная синтаза оксида азота (пЖ)8) ассоциирована с постсинаптическим уплотнением, связанным с МУГОА-подтипом глутаматных рецепторов, обеспечивающих прямой путь ионам кальция через ЫМОА-каналы к пМЖ Открытие в кардиомиоцитах нейрональной изоформы Ж)-синтазы в дополнение к е>Ю8 легло в основу концепции о внутриклеточной компартментализации N0-синтаз и сайт-специфичности влияния N0 [35, 134, 141, 160, 261]. В нейронах сердца механизмы сайт-специфичного влияния обеспечивают N0-ергическую модуляцию пресинаптического выделения нейротрансмиттеров. Предположение об участии пЖ)8 в холинергической регуляции сердечного ритма было сделано на основе наблюдений, что оксид азота может усиливать реактивность ЧСС к стимуляции блуждающего нерва без адренергической престимуляции. Неспецифические и специфические к пЖ)8 ингибиторы ослабляют реактивность ЧСС к стимуляции блуждающего нерва. Этот эффект зависит от уровня экспрессии пКЮ8. Парасимпатическая система г / через блуждающий нерв противопоставлена проаритмогенным эффектам сильных симпатических стимулов, она является естественным природным кальциевым антагонистом. Изменения в экспрессии п>Ю8 могут приводить к нарушению симпатовагусного баланса и имеют большое патофизиологическое значение. еЖ)8 кардиомиоцитов играет незначительную роль в автономной регуляции возбудимости сердца на периферическом уровне, что подтверждает ведущую роль пМЭЭ, локализованной пресинаптически в нейронах блуждающего нерва, в холинергической модуляции деятельности сердца [147].

Ламотриджин стабилизирует пресинаптическую нейрональную мембрану, блокируя вольтаж-зависимые натриевые каналы. Кроме того, он ограничивает высвобождение возбуждающих нейромедиаторов — глутамата и аспартата, понижает выброс избыточной окиси азота, влияет на сократительную способность миокарда, путем ингибирования п>Ю8, при этом возрастает его антиконвульсантная активность [156]. Кроме того, ламотриджин способен взаимодействовать с пероксинитрит анионом, ингибировать протеинкиназу, тормозить липооксигеназу, что, в целом, отражает ингибирующее влияние препарата на оксидантный стресс и позволяет предположить у него эндотелиопротективные эффекты.

ГАМК-ергические средства способны одновременно влиять на различные патогенетические механизмы развития гипертонической болезни [65, 72, 88, 110]. Существенную роль в альтерации кардиомиоцитов и снижении насосной функции сердца при экстракардиальных повреждающих воздействиях играет совокупность факторов: выброс катехоламинов, что влечет за собой увеличение потребности миокарда в кислороде, региональную гипоксию, нарушения микроциркуляции, а также образование и накопление активных форм кислорода, интенсификация процессов перекисного окисления липидов, угнетение гликогенолиза и окислительного фосфорилирования. Это ведет к повреждению мембран кардиомиоцитов, эндотелиоцитов. Тяжелый энергетический дефицит и повреждение I

90 клеточных мембран кардиомиоцитов приводят к падению сократительной активности сердца, развитию сердечной недостаточности, снижению толерантности к действию аритмогенных факторов [129, 170, 205, 219]. Повреждение эндотелиоцитов приводит к эндотелиальной дисфункции. Накопленные к настоящему времени экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что ГАМК и ее аналоги обладают гипо- и антигипертензивными свойствами, противоаритмической и противофибрилляторной активностью, оказывают кардиопротекторное действие при ишемическом, стрессорном и других повреждениях миокарда. Реализуются данные эффекты за счет центрального и периферического симпатикотропного, прямого вазо- и кардиотропного действий, участия ГАМК в модуляции центральной ангиотензинной системы и контроля за высвобождением вазопрессина, антистрессорной, антиоксидантной, антигипоксической, антиагрегантной активности [3, 32, 55, 65, 129]. Нейрофармакологами предложен ряд соединений, способных повышать концентрацию ГАМК в мозге и оказывать противоэпилептическое действие. Среди таких соединений можно назвать вальпроат натрия. Вальпроаты повышают содержание ГАМК в центральной нервной системе за счет ингибирования ГАМК-трансферазы, а также уменьшения обратного захвата ГАМК в тканях головного мозга. При этом уменьшается возбудимость и судорожная готовность моторных зон головного мозга, улучшается психическое состояние и настроение больных [5, 6, 72, 170]. Учитывая вышеперечисленное, можно предположить у вальпроатов наличие эндотелиотропных и кардиотропных свойств

Данные факты подтвердились результатами наших исследований. Так, ламотриджин в дозе 8,5 мг/кг проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в увеличении экспрессии e-NOS и полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов Ж)х. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и развития скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием ламотриджина 8,5 мг/кг увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией.

Кардиопротективные эффекты ламотриджина, по-видимому, связаны с фундаментальной ролью натриевых каналов в образовании и проведении электрических стимулов. Блокада натриевых каналов приводит к угнетению Ыа+-К+-насоса и активизации транссарколеммной системы обмена натрия и кальция, что способствует положительному инотропному эффекту.

Ламотриджин в дозе 8,5 мг/кг проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД приближая его к интактных животных. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и развития скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием ламотриджина 8,5 мг/кг увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с Ь-КАМЕ-индуцированной патологией.

Вальпроат натрия 30 и 60 мг/кг также проявил эндотелиопротективную активность, однако уступая ламотриджину в дозе 8,5 мг/кг и комбинации ламотриджина 4 мг/кг с вальпроатом натрия 30 мг/кг.

Кардиопротективное действие вальпроата натрия на выбранной нами жесткой модели артериальной гипертензии представляется и требует дальнейшего изучения.

Комбинация ламотриджина 4 мг/кг и вальпроата натрия 30 мг/кг проявила эндотелиопротективное и кардиопротективное действие в меньшей степени, чем ламотриджин в дозе 8,5 мг/кг при монотерапии, но превосходя вальпроат натрия в дозах 30 и 60 мг/кг.

Таким образом доказано непосредственное позитивное влияние противосудорожных препаратов (ламотриджин и его комбинация с вальпроатом натрия) на периферические сосуды при экспериментальной модели дефицита азота. Расширение диапазона действия препаратов приведет к упрощению патогенетической терапии и улучшению качества жизни пациента.