Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение генетических полиморфизмов, ассоциированных с эффективностью терапии эпилепсии ламотриджином

□□3482450

на правах рукописи

крикова екатерина владимировна Изучение генетических полиморфизмов,

ассоциированных с эффективностью терапии эпилепсии ламотриджином

14.00.25. - ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ноя 2'

-москва 2009-

003482450

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете им. Н.И.Пирогова и Учреждении Российской академии медицинских наук имени В.В.Закусова РАМН

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Авакян Гагик Норайрович

Доктор медицинских наук Вальдман Елена Артуровна

Официальные оппоненты-.

Доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН

Дурнев Андрей Дмитриевич Доктор медицинских наук, профессор Сычев Дмитрий Алексеевич

Ведущая организация*. Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П.Павлова

2

Защита диссертации состоится » г^^^^ил.—2009 г. в ч. на заседании диссертационного совета Д.001.024.01 при НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН по адресу: 125315 Москва, Балтийская ул. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН по адресу: 125315 Москва, Балтийская ул. 8.

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук Вальдман Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В настоящее время фармакогенетика становится неотъемлемой частью клинической фармакологии и фармакотерапии [Evans et al., 1999, 2001; Weber, 2001]. Последние достижения молекулярной биологии и медицины привели к пониманию того, что индивидуальная вариабельность в восприимчивости к заболеванию и исход терапии обусловлены целым комплексом факторов различной природы [Кукес и соавт., 2007; Stoughton and Friend, 2005; Shastry, 2006]. При этом в реакциях конкретного индивидуума на лекарственный препарат одну из ведущих ролей играют генетические факторы [Середенин, 2004; Ferraro and Buono, 2005; Sisodiya, 2005; Depondt, 2006; Ferraro et al., 2006; Szocke et al, 2006; Mann and Pons, 2007; Tate and Sisodiya, 2007; Loscher et al., 2008]. Среди заболеваний, находящихся в фокусе фармакогенетических исследований, центральное место занимают нейропсихические расстройства, в частности, эпилепсия [Loschcr et al., 2008; Anderson, 2008; Gandelman-Marton and Neufeld, 2008; Srinivasan et al., 2009].

Эпилепсия представляет собой хроническое заболевание головного мозга, в основе патогенеза которого лежит нарушение баланса тормозных и возбуждающих нейротрансмиссий [Arzimanoglou et al., 2002]. Классификация 1989 года Международной лиги по борьбе с эпилепсией включает следующие этиологические формы заболевания: идиопатичсская - генетически детерминированная эпилепсия, симптоматическая - с известной этиологией и верифицированными структурными изменениями в головном мозге и криптогенная форма - эпилепсия с неустановленной этиологией. Однако в последнее время накапливается все больше свидетельств роли наследственных факторов в развитии не только идиопатических и доброкачественных детских фокальных эпилепсии, но и симптоматических, а также криптогенных фокальных эпилепсий [Wyllie, 1997; Choueiri et al., 2001; Mattson et al., 1985].

Углубленное изучение патогенеза эпилепсии и определение генов-кандидатов и гаплотипов, ассоциированных с различными формами заболевания, позволяют не только расширить представления о механизмах развития патологии, но также определить новые терапевтические мишени для фармакотерапии и пути

разработки новых эффективных препаратов.

3

Другим направлением поиска генов-кандидатов и подходов к оптимизации терапии является изучение генетически обусловленных вариантов фармакокинетики и фармакодинамики существующих противоэпилептических препаратов (ПЭП). Большинство исследований сегодня посвящены изучению классических ПЭП - карбамазепина, фенитоина, вальпроевой кислоты [Loscher et al., 2008; Tate et al., 2005, 2006; Simon et al., 2007; Lazarowski et al, 1999,2004, 2007, Аксенова и соавт., 2007], тогда как работ по изучению препаратов последнего поколения значительно меньше. Среди последних можно отметить исследование Аксеновой и соавт., 2007, в которой была продемонстрирована зависимость эффективной дозы топирамата от полиморфизма С802Т гена глюкуронозилтрансферазы.

ПЭП нового поколения при наличии сопоставимой с традиционными препаратами эффективности характеризуются меньшей частотой развития неблагоприятных побочных реакций и в ряде случаев позволяют преодолевать фармакорезистентность. Как и для препаратов первого поколения, для них характерна индивидуальная вариабельность доз и соответственно клинических эффектов, что позволяет считать актуальным оценку их фармакогенетических особенностей с целью определения путей оптимизации фармакотерапии [Регисса, 2001; Stefan and Feuerstein, 2007].

Ламотриджин - антиконвульсант, получивший широкое применение как в отчественной, так и в зарубежной клинической практике, относится к препаратам последнего поколения. Несмотря на многочисленные исследования его эффективности и безопасности существуют лишь единичные работы, посвященные фармакогенетическим аспектам терапии данным ПЭП [Naisbitt et al., 2003], что и обуславливает высокий интерес к ламотриджину с позиций современной фармакологии. Цели исследования

Выявление и изучение полиморфизмов генов, участвующих в процессах фармакокинетики и фармакодинамики ламотриджина. Оценка значимости отобранных полиморфизмов для эффективности терапии эпилепсии ламотриджином.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

4

1. Определить гены кандидаты, обуславливающие фармакогенетические механизмы терапии ламотриджином.

2. Оценить связь полиморфизма Р24Т гена уридиндифосфат глюкуронозилтрансферазы 1ЮТ1А4 с эффективной терапевтической дозой ламотриджина и его концентрацией в плазме крови у больных эпилепсией.

3. Установить структурный участок связывания ламотриджина с 1ЮТ1А4 ферментом.

4. Провести анализ гаплотипов по гену А7Л7 и оценить распространенность полиморфного маркера потенциал-зависимого натриевого канала ¿'СЛ^/КУА' (5С>А) в группе пациентов с эпилепсией.

5. Оценить ассоциацию полиморфизма 8СМ1У35М (50>А) с эффективной терапевтической дозой и концентрацией в плазме крови ламотриджина у больных эпилепсией.

Научная новшна работы

Впервые проведена оценка значимости генетических полиморфизмов Р24Т гена уридиндифосфат глюкуронозилтрансферазы 1ЮТ1А и потенциал-зависимого натриевого канала SCNllVS5N (5С>А) для эффективности терапии эпилепсии ламотриджином. На изученной выборке российских пациентов с различными формами эпилепсии не установлено зависимости эффективной терапевтической дозы и концентрации ламотриджина от полиморфизма Р24Т 1ЮТ1А4. Впервые определен сайт связывания иСПА4 с ламотриджином, который позволяет в отсутствие кристаллической структуры комплекса определить функционально значимые аминокислотные остатки для процесса взаимодействия субстрата с ферментом.

Установлена более высокая распространенность полиморфизма SCNJIVS5N (5й>А) среди пациентов с эпилепсией по сравнению с европейской популяцией. Выявлена ассоциация между генетическим полиморфизмом SCN1IVS5N (5С>А) потенциал-зависимого натриевого канала и эффективностью терапии эпилепсии ламотриджином. Показано возрастание терапевтической дозы для носителей генотипов Ой—>ОА—>АА по маркеру ЗС.МШЗЫ (5С>А).

Практическая ценность работы

Доказана целесообразность генотипирования больных эпилепсией по полиморфному маркеру SCN1IVS5N (5G>A) для подбора эффективной терапевтической дозы ламотриджина. Показано, что генотипирование больных эпилепсией по маркеру Р24Т гена UGT1A4 при назначении ламотриджина нецелесообразно.

Изученный генетический полиморфизм SCN1IVS5N (5G>A) дополняет сведения о генотипах, ассоциированных с данным заболеванием, и может рассматриваться как кандидат в факторы риска развития эпилепсии. Аппобаиия работы

Основные результаты доложены и обсуждены на Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008), на международном форуме неврологов, (Ереван, 2008), на международной конференции "Эпилептология в медицине XXI века", (Москва, 2009), на региональной научно-практической конференции неврологов северо-западного федерального округа Российской Федерации (Сывтывкар, 2009). Публнкапии

По материалам исследования опубликовано 6 печатных работ, в том числе 1 статья в издании, рекомендованном ВАК РФ. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 8 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы». Список литературы содержит 256 источников, в том числе 12 в отечественных рецензируемых изданиях. Материалы и методы исследования

Было обследовано 50 пацие1ггов в возрасте от 20 до 69 лет (средний возраст составил 46 лет) с различной длительностью заболевания (от 6 месяцев до 42 лет, средняя длительность составила 6 лет) и формами эпилепсии. Включенные в исследование пациенты находились на амбулаторном учете в окружных эпилептологических кабинетах г. Москвы. Симптоматическая фокальная эпилепсия (СФЭ) была диагностирована у 27 пациентов, криптогенная фокальная

эпилепсия (КФЭ) (вероятно симптоматическая) - у 22 пациентов, идиопатическая генерализованная эпилепсия (ИГЭ) - у 1 человека (рис. 1).

Рис.1. Распределение больных по формам эпилепсии.

СФЭ - симптоматическая фокальная эпилепсия, КФЭ - криптогенная фокальная эпилепсия, ИГЭ - идиопатическая генерализованная эпилепсия.

Обязательным критерием включения в исследование являлся адекватный ответ на монотеранию ламотриджином, т.е. урежение приступов не менее чем на 50%. Разброс доз ламотриджина составил от 50 до 300 мг в сутки.

В исследовании был использован препарат ламотриджина в лекарственной форме "Ламиктал" производства GlaxoSmithKline Pharmaceuticals (Польша) в таблетках 25 мг и 50 мг.

Для выделения высокомолекулярной геномной ДНК использовали фенол/хлороформный метод. Генотипирование проводили методом 1ЩР на базе института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов, руководитель Гришин Е.В. Праймеры. использованные в работе

Праймеры к геномному фрагменту из 696 пн, содержащему экзон 5N и 5А гена SCN1A Homo sapiens:

S1 5' GAT CGA ATT ССС AGA GTG АСА АСА AGG GTG Т 3' t отжига, С

S2 5' GAT CGG АТС CGG ТСА ССТ TGA ССТ САА АТТ АСА 3' 60 С

Праймеры к геномному фрагменту UGT1A4 Homo sapiens для обнаружения SNP мутации Р24Т и L48V:

U1 5' GTT GGG ССС ATA ACG AAA GGC AGT Т 3' t отжига,С

U2 5' TGG AAC ATT GAT TGG ATG AAG GCA СС 3' 62С

Электрофорез тотальной ДНК и продуктов ГТЦР проводился на горизонтальных пластинах 1% агарозного геяя, приготовленного на буфере для электрофореза (Трис-ацетатный буфер ТАЕ) с добавлением бромистого этидия. Для регистрации результатов использовали систему для гель-документирования"УИЬег Laurmat". После проведения электрофореза проводили выделение фрагментов ДНК из агарозного геля с при помощи набора реактивов Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) в соответствии с рекомендациями фирмы производителя. Секвенирование SCNIA*и UGTIA4* в составе ПЦРных фрагментов проводилось на автоматическом секвенаторе (Model 373A Applied Biosistems, США).

Концентрацию ламотриджина в биологических образцах (венозная кровь in локтевой вены) определяли с помощью ВЭЖХ с использованием метода высаливания препарата, с предварительной депротеинизацией на обращенно-фазной хроматографической колонке на оптимальной длине волны 225 нм спектрофотометрического детектора. Данный анализ проводился на базе Российского Государственного Медицинского Университета (Кафедра клинической лабораторной диагностики, руководитель Тогузов Р.Т.) по оригинальной методике, разработанной в данной лаборатории.

Моделирование сайта связывания UGT1A4 и ламотриджина проводилось на базе Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов. Молекулу фермента UGT1A4 брали из базы MODBASE и релаксировали с последующей молекулярно-динамической симуляцией подвижности в GROMACS 500 псек. Модель лиганда строили в Chem3D на основании существующих данных ЯМР по ламотриджину и его производным и релаксировали при помощи его утилит. Подвижность молекулы оценивалась в HyperChem. Взаимодействие ламотриджина и UGT1A4 было симулировано при помощи метода докинга подвижного лиганда к ограничешю подвижному рецептору по алгоритму LGA в программе AUTODOCK 4 с кластеризацией решений, заданной программой по умолчанию.

Частоту гаплотипов и показатель неравновесного сцепления оценивали с помощью программы "Haploview 4.0", использующей алгоритм максимизации ожидания.

Статистический анализ проводился с использованием пакета статистической программы Statistics v.6. Для определения статистической значимости различий часто г генотипов в исследуемой и контрольной группах применялся критерий х2 и точный критерий Фишера. Относительные риски рассчитывались вручную. Тсст на нормальность распределения проводили с использованием теста Колмогорова-Смирнова с поправкой Лилифорса. Значимость различий в дозах и концентрациях в группах пациентов определяли с помощью критерия Манна-Уитни и рангового дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса (ANOVA). Для оценки статистически значимой зависимости дозы/концентрации применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Анализ полиморфизма reua UGT1A4

Метаболизм ламотриджина почти полностью осуществляется за счет реакции глкжуронирования, катализируемой ферментом уридиндифосфат глюкуронозшггрансферазой UGT1A4 [King et al., 2000]. В этой связи для выявления зависимости фармакокинетических параметров ламотриджина от генетического полиморфизма был выбран ген, кодирующий UGT1A4.

В литературных источниках имеются данные о том, что полиморфизм Р24Т UGT1A4 влияет на профиль глкжуронирования ксенобиотиков, к которым относятся вторичные, третичные, четвертичные и ароматические амины [Ehmcr el al., 2004]. Так как ламотриджин по своей химической структуре представляет собой гетероциклический третичный амин, было выдвинуто предположение о том, что данный полиморфизм будет влиять на активность фермента при метаболизме препарата.

Анализ зависимости эффективной дозы ламотриджина от генетического полиморфизма Р24Т 1ЮТ1А4

Для подтверждения гипотезы о наличии ассоциации между генетическим полиморфизмом Р24Т гена 1ЮТ1А4 и эффективной дозой ламотриджина проводили генотипирование 50 пациентов, принимающих ламотриджин в различных терапевтически эффективных дозах (интервал доз составил от 50 до 300 мг в сутки). Частота полиморфизма Р24Т 1ЮТ1А4 в гетерозиготном состоянии составила 14% (7 пациентов). Полученное значение почти в 2 раза выше частоты гомозиготного генотипа по минорному аллелю, установленной для европейской популяции (8%) [ЕЬгаег е! а1, 2004], что согласуется с правилом "чистоты гамет". Гомозиготный генотип по минорному аллелю АА не был обнаружен ни у одного пациента в данной группе.

Исходя из ненормальности распределения, полученной в результате применения теста Колмогорова-Смирнова с поправкой Лшшфорса и учитывая размер выборки, изучение зависимости эффективной дозы ламотриджина от генетического полиморфизма Р24Т 1ЮТ1А4 проводили с помощью статистического критерия Манна-Уитни. В результате было установлено отсутствие ассоциации между эффективной дозой препарата и генотипом (р=0,66) (Таблица 1).

Таблица 1.

Зависимость эффективной дозы и концентрации ламотриджина от генотипа Р24Т гена ивТ1А4.

Доза Группа СС Группа СА Ю Я2 и Р

Ме 11(5 Ме ьо ио 1035 190 132 0,66

100 100,00 125,00 100 100,00 200,00

Сяша X Группа СС Группа СА 976 209 106 0,27

Ме ио Ме ьо ио

0,82 0,55 1,02 1,00 0,64 1,32

Сяшах - максимальная равновесная концентрация; Ме - медиана; - нижний и

верхний квартили; Ш, Й2 - сумма рангов в первой, второй группах; и - значение критерия Манна-Уитни; р - уровень значимости критерия; СС - гомозиготный генотип по мажорному аллелю, СА - гетерозиготный генотип.

Анализ зависимости максимальной равновесной концентрации ламотриджнна от генетического полиморфизма Р24Т VGT1A4

Исследуемая выборка пациентов состояла из 34 женщин и 16 мужчин, причем основной процент приходился на женщин репродуктивного возраста (16-45 лет) - 22 человека (64,7%), из которых 5 (22,7%) наряду с ПЭП терапией принимали гормональные контрацептивы. В тоже время из литературных источников известно, что при одновременном приеме стероидных контрацептивов и ламотриджнна шазменная концентрация препарата может снижаться примерно на 50%, по- видимому, за счет индуцированной активации UGTIA4 стероидами [Sabers et al., 2003]. Данное взаимодействие клинически может выражаться в снижении контроля приступов у определенного процента женщин [Sabers et al., 2001], а также повлиять на дозу принимаемого ламотриджнна. Таким образом, несмотря на линейный характер фармакокинетики ламотриджнна, во избежание возможных некорректных результатов при анализе ассоциации между генетическим полиморфизмом Р24Т UGT1A4 и эффективной терапевтической дозой ламотриджнна (также учитывая возможную низкую комплаентность больных), проводили определение максимальной равновесной концентрации ламотриджнна в плазме крови пациентов с последующей оценкой зависимости концентрации от генотипа.

Для анализа зависимости максимальной равновесной концентрации (CS!max) от генотипа был выбран непараметрический критерий Манна-Уитни, что было обусловлено в большей степени размером выборки, так как распределение, полученнное в результате применения теста Колмогорова-Смирнова с поправкой Лшшфорса, приближалось к нормальному. В результате анализа максимальной равновесной концентрации ламогриджина в группах СА и СС было показано отсутствие ассоциации между Cssmax ламотриджнна и генотипом Р24Т UGT1A4 (р=0.27) (Таблица 1).

Полученные результаты могут быть интерпретированы с нескольких позиций. Во-первых, они могут быть обусловлены перекрывающейся специфичностью ферментов семейства UGT. Ранее было показано, что в катализе реакции Ш-глюкуронирования ламотриджнна принимают участие оба фермента -UGT1A4 (мажорный компонент) и UGT2B7 (минорный компонент) [Rowland et al,

2006], причем ШТ2В7-катализируемая реакция доминирует при низких концентрациях субстрата [Rowland et al, 2006]. В связи с тем, что среднее значение концентрации препарата в плазме крови составило 0.68 ± 0.042 мкг/мл по всей выборке пациентов, и данное значение приближается к нижней терапевтической границе для ламотрижина 0.25-29.1 мкг/мл [Course #8041 - 10 СЕ CREDITS Release date:07/01/07 Expiration date:06/30/10 Seizures and Epilepsy syndromes], генетический полиморфизм фермента UGT1A4, который может значимо изменять скорость реакции ппокуронирования ламотриджина, может быть маскирован компенсаторным действием изоформы UGT2B7. Таким образом, концентрация препарата поддерживается на уровне "нормы". Во-вторых, отсутствие ассоциации между генетическим полиморфизмом и скоростью ппокуронирования ламотриджина может быть обусловлено наличием полиморфизма Р24Т UGT1A4 только в гетерозиготном состоянии в исследуемой выборке. В тоже время, нельзя отрицать гипотезу о функционально незначащем аллельном полиморфизме гена UGT1A4 для фармакокинетических процессов ламотриджина. Однако для проверки обозначенных гипотез необходимо проведение специальных исследований.

Изучение сайта связывания ламотрнлжппа с UGT1A4

Для получения более детальной картины о взаимодействии ламотриджина с UGT1 A4 была проведена попытка установления сайта связывания лиганда с учетом характеристик фармакофора. Взаимодействие ламотриджина с UGT1A4 было симулировано при помощи метода докинга подвижного лиганда к ограниченно подвижному рецептору по алгоритму LGA в программе AUTODOCK 4 (http://autodock.scripps.edu/). На основании результатов докинга и имеющихся сведений об участке связывания ламотриджина были отобраны наиболее возможные решения комплекса (Рис.2).

Рис.2 Модель сайга связывания иСПА4 и ламотриджина.

Стрелками отмечена молекула лиганда (ламотриджина) и остаток Рго40, ответственный за специфичность фермента.

Было показано, что в подобных комплексах ламотриджин локализован во внутренней части молекулы, при этом положение его ароматических колец приходится на гидрофобную часть рецептора, что соотносится со структурой фармакофора для гетероциклических аминов. Так. согласно приведенному на рисунке варианту имидазольное кольцо ламотриджина находится на уровне проекции следующих гидрофобных аминокислотных остатков: Тгр356, Тгр41, Ьеи42, П,е69. Согласно полученной модели, остаток Рго40 1ЮТ1А4 располагается внутри консервативной а-спирали молекулы в непосредственной близости от лиганда. Известно, что пролин может искажать структуру а-спирали, и, таким образом, указанный остаток может играть значительную роль в определении архитектуры активного сайта, разрешая связывание третичного шина (в данном случае ламотриджина) в каталитически предпочтительной ориентации.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии как минимум одного сайта связывания ламотриджина. При этом процесс связывания лиганда не чувствителен к наличию замены Р24Т - как следует из результатов вычислительного моделирования, данный полиморфизм располагается вне участка связывания субстрата. Данный факт подтверждает полученные экспериментальные данные о невовлеченности полиморфизма Р24Т гена 1ЮТ1Л4 в фармакокинетические процессы ламотриджина.

Анализ распространенности полиморфизма SCN1 IVS5-91 G-*A среди пациентов с эпилепсией

Нейроналъный натриевый канал SCN1 представляет собой фармакологическую мишень действия ламотриджина. Генетический полиморфизм SCN1 IVS5-91 G—»A (rs3812718 [G-+A] или SCNIIVS5N (SG>A) расположен в 5'сплайс донорном участке 5N экзона, кодирующего сенсор напряжения канала -1-S4. В организме одновременно представлены две формы альтернативного сплайсинга данного экзона - "неонатальная" (Н) и "взрослая" (В) копии, и в норме в головном мозге коэкспрессируются оба этих экзона в отношении Н>В [Tate el al., 2005]. Полиморфизм rs3812718 [G—>А] определяет включение неонатального или взрослого транскрипта в структуру канала, что, в свою очередь, обуславливает различную чувствительность натриевого канала к ПЭП.

Результаты работы свидетельствуют о достоверно более высокой распространенности полиморфизма SCN1 IVS5-91 G—>А среди российских пациентов с эпилепсией по сравнению с контрольной выборкой из европейской популяции (база данных NCBI SNP) (%2 = 12,3б>3,84). Так, для пациентов с эпилепсией частота встречаемости данного полиморфизма в гомозиготном состоянии составила 46%, тогда как в общей европейской популяции - 21,3%. Для подтверждения результатов, полученных с помощью критерия %2 использовали точный критерий Фишера. Достигнутый уровень значимости для одностороннего варианта критерия составил 0,00939, а для двустороннего - 0,01878, что в первом и во-втором случае меньше критического уровня значимости а=0.05 и свидетельствует о достоверности различий между двумя группами по исследуемому признаку.

Таким образом, наличие данной замены может свидетельствовать в пользу генетически обусловленной предрасположенности к заболеванию эпилепсией (ОШ = 4,24, доверительный интервал (1,9;9,01), р<0,05) (Таблица 2).

Таблица 2.

Различия в частотах генотипов полиморфного маркера SCN1IVS5-91 G-+A

между исследуемой и контрольной группой

Частота генотипов по SCNI IVS5-91 G—>А

АА AG GG Всего г* Р ОШ ДИ

Европейская популяция 19 48 22 89 12,36 0,00044 4,24 1,9; 9,01

Пациенты с эпилепсией 23 20 7 50

ОШ - отношение шансов, ДИ - доверительный интервал.

Гипотеза о значимом вкладе наследственных факторов в развитие идиопатических генерализованных энилепсий и детских мягких фокальных эпилепсий получила подтверждение в многочисленных клинико-генетических исследованиях [Lerche et al., 2005; Lossin et al., 2002; Steinlein 2004]. Более того, в последнее время появляются работы, указывающие на существование ассоциации между определенными гаплотипами и симптоматической фокальной, а также криптогенной эпилепсией. В обследованной выборке пациентов диагноз идиопатической эпилепсии был представлен только у одного больного (2%) с наличием гомозиготного генотипа по минорному аллелю АА по гену SCN1. В группе с криптогенной фокальной эпилепсией (27 человек, 54%) была отмечена высокая распространенность полиморфизма SCNI 1VS5-91 G—>А в гомозиготном состоянии (13 человек), а также лиц с гетерозиготным генотипом GA (10 человек). Та же тенденция прослеживалась и в группе с симптоматической фокальной эпилепсией. Из 22 (44%) пациентов с генотипом GG - было зафиксировано 3 случая, с GA - 10 и с АА - 9 человек (Рис. 3).

Таким образом, высокая представленность полиморфизма rs3812718 [G—>А] в группах симптоматической фокальной и криптогенной фокальной эпилепсий при одновременно низкой частоте данного полиморфизма в европейской популяции может свидетельствовать о его потенциальном вкладе в патогенез указанных форм эпилепсии. Можно также предположить, что полиморфизм SCNI IVS5-91 G—<А сохраняет латентность до вступления в силу стрессовых факторов, приводящих к развитию диагностированной симптоматической или криптогенной эпилепсий. Данное предположение согласуется с признанной на сегодняшний день гипотезой о

более выраженном, чем считалось ранее, вкладе генетического полиморфизма в развитие гетерогенных криптогенных и симптоматических эпилепсий [Нагкт е1 а1, 2007].

ИИГЗяСФЭпКФЭ

SS f,A ДА

МНОГИГТЫ S/.Y7

Рис. 3. Распределение форм эпилепсии в зависимости от генотипов

ИГЭ - идиопатическая генерализованная эпилепсия, СФЭ - симптоматическая фокальная эпилепсия, КФЭ - криптогенная фокальная эпилепсия, GG -гомозиготный генотип по мажорному аллелю, GA - гетерозиготный генотип, АА -гомозиготный генотип по минорному аллелю.

Анализ гаплотипов гена SCN1A у пациентов с различными формами эпилепсии

Помимо оценки распространенности генетического полиморфизма в рамках изучения его влияния на патогенез эпилепсии особое внимание отводится анализу гаплотипов с целью более полного генетического картирования заболевания и признаков определенной этнической группы. С позиции фармакогенетики актуальность данного анализа заключается в определении зависимости ответа на ПЭП терапию от генетического профита пациента.

В ходе изучения интронной области, фланкирующей неонатальную форму экзона 5

гена SCN1A, были идентифицированы 4 точечных нуклеотидных полиморфизма

(SNP), соответствующие rs3812718 [G-*A], rs2217199 [Т—С], rs2195144 [G—►А | и

rs3812719 [А—»С]. Ранее на нашей выборке было продемонстрировано, что для

полиморфизма rs3812718 [G—>А] существует статистически значимая ассоциация с

заболеванием (%2 = 12,36>3,84; р<0,05), однако функциональное значение других

SNP пока остается неизвестным.

С помощью программы "Haploview 4.0", использующей алгоритм

максимизации ожидания (Expectation Maximization) [Barrett JC et al., 2005], была

проведена оценка частоты распространенности гаплотипов по указанным SNPs и

16

определен показатель LD (linkage disequilibrium, меры неравновесного сцепления) на выборке пациентов с различными формами эпилепсии. Наблюдаемая частота распространенности для указанных выше полиморфизмов составила: ACGA - 0,576, GTAC -0,242, GTGA - 0,106, ATGA - 0,045, АТАС - 0,030. Все полиморфизмы являются сцепленными. Высокая степень неравновесного сцепления была показана для следующих пар генетических полиморфизмов rs22) 7199 - rs2195 ] 44 и rs3812718 -rs3812719 (расстояние между ними менее Ikb) (Рис.4).

№ |D'| LOD r!

rs38I27I8 rs38!2719 1.0 8.91 0.726

rs3812718 rs2217199 0.8 3.94 0.455

rs3812718 rs2l95144 0.8 3.94 0.455

rs3812719 Г&2217199 1.0 4.96 0.509

rs3812719 rs2195144 1.0 4.96 0.509

rs2217199 rs2195I44 1.0 11.38 1.0

D'< 1 D'= 1

LOD <2 Белый Голубой

LOD >2 Оттенки розового/красного Ярко красный

Рис. 4. Мера неравновесия по сцеплению для гч3812718, ге3812719, гв2217199, «2195144.

В исследуемой выборке частота полиморфизма ге2217199 [Т—>С] составила 30,3%

(15 пациентов), гетерозиготный генотип по данному полиморфизму был выявлен у

54,5% (27 человек) и гомозиготный генотип по мажорному аллелю был установлен

для 15,15% (8 больных). Таким образом, наблюдаемая распространенность маркера

ГЭ2217199 [Т—>С] у пациентов с эпилепсией соответствует таковой для группы

общей японской популяции (Таблица 3) в отсутствие европейского контроля (база

данных >ГСВ1 вМР). Как уже было отмечено ранее в исследуемой группе была

установлена более высокая распространенность генотипа АА для полиморфизма

ГС3812718 [О—>А] по сравнению с контролем (база данных N('81 8№) (Таблица 3).

В случае полиморфизма гв3812719 [А—>С] в группе пациентов с различными

формами эпилепсии частота встречаемости А/А генотипа составила 0,27 (23

пациента), тогда как для гетерозигот - 0,73 (27 больных). Не было обнаружено ни

одного носителя гомозиготного генотипа по минорному аллелю СС. Частота

аллелей соответствовала таковой для европейской популяции (база данных 1ЧСВ1

8№). Полиморфизм ге2195144 [О—>А] был представлен только гетерозиготами - 27

17

пациентов (0,73). У остальных больных был выявлен гомозиготный генотип по мажорному аллелю в. В отсутствие контрольных данных нет возможности сравнить частоту распространенности аллелей в различных группах. (Таблица 3).

Таблица 3.

Частоты аллелей полиморфных маркеров гена SCN1A

Пациенты с эпилепсией Европейская популяция

г$2217199|Т—С1* Т С Т С

Частота аллелей 0,42 0,58 0,477 0,523

Г83812718|(2-*А| G А G А

Частота аллелей 0,33 0,66 0,517 0,483

г$3812719[А—С] А С А С

Частота аллелей 0,73 0,27 0,642 0,358

г$2195144|С—»А] G А G А

Частота аллелей 0,73 0,27 Нет данных

*Для ге2217199[Т—>С] в качестве контроля приведена японская популяция (см. объяснения в тексте).

Перспективным представляется проведение анализа возможной ассоциации между гаплотипом и чувствительностью к ламотриджину, так как известно, что генетические полиморфизмы могут оказывать совместное влияние на формирование признака [Marchini J el al., 2005], однако подтверждение данной гипотезы требует проведения специальных исследований.

Анализ связи полиморфизма гена нейронального натриевого канала SCNUVSSN с эффективной дозой ламотриджина

В европейской и китайской популяциях наблюдается возрастание эффективной дозы фенитоина и карбамазепина для носителей генотипов GG—>GA—>АА по полиморфному маркеру SCN11VS5N (5G>A) [Tate et al., 2006; Heinzen et al, 2007].

Для проверки гипотезы об ассоциации генетического полиморфизма SCNIIVS5N (5G>A) с эффективной дозой ламотриджина проводили генотипирование 50 пациентов, принимавших ламотриджина в различных терапевтических дозах. Аллельный полиморфизм шпрошюй области SCNHVS5N был представлен тремя вариантами: GG - гомозиготный генотип по мажорному аллелю, GA -гетерозиготный и АА - гомозиготный генотип по минорному аллелю.

Следует отметать достаточно низкую ггредсгавленность носителей гомозиготного генотипа по мажорному аллелю бв - 7 человек в исследуемой выборке, тогда как группу с генотипом АА составило 23 пациента, а с гетерозиготным 20 больных. Ввиду ненормальности распределения, полученной в результате применения теста Колмогорова-Смирнова с поправкой Лилифорса, и учитывая размер выборки, для статистической обработки данных был применен 11-критерий Манна-Уитни, с помощью которого была установлена достоверная зависимость дозы ламотриджина от генотипа в группах ОА и ОС (Таблица 4).

Таблица 4.

Зависимость эффективной дозы ламотриджина от генетического полиморфизма 5СА71У$5№5

Ме- медиана; Ь(3, иО - нижний и верхний квартили; Я1, И2- сумма рангов в первой, второй группах; и - значение критерия Манна-Уитни; р - уровень значимости критерия, АА - гомозиготный генотип по минорному аллелю, ОА - гетерозиготный генотип, СО -гомозиготный генотип по мажорному аллелю.

Доза Группа АА Группа ОА Н1 Я2 и Р

Ме ьо ид Ме ьд ио 529 374 164 0,16

100 100,00 200,00 100 100,00 100,00

Доза Группа вА Группа СО 318 60 32 0,03

Ме ио Ме ЬО ио

100 100,00 100,00 100 75,00 100,00

Доза Группа АА Группа бб 380 55 27 0,01

Ме ио Ме ЬО ио

100 100,00 200,00 100 75,00 100,00

Больным с гетерозиготным генотипом требуются большие дозы в отличие от носителей гомозиготного генотипа по мажорному аллелю, для которых клинический эффект проявляется на фоне терапии более низкими дозами ламотриджина (р = 0.03). Достоверная зависимость дозы от генотипа была установлена также для групп вв и АА (Таблица 4). У носителей генотипа СО терапевтически эффективной была достоверно более низкая доза, чем у пациентов с гомозиготным генотипом по минорному аллелю (р = 0.01). В тоже время статистически значимых различий при попарном сравнении эффективных доз для носителей генотипов 6А и АА выявлено не было (р = 0.16). Применение рангового дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса (АМОУА) подтвердило полученные результаты.

Таким образом, данные по соотношению эффективных доз ламотриджина и генотипов SCNJ, соответствуют таковым для фенитоина и карбамазепина [Tate el ah, 2006; Heinzen et al., 2007].

Различия в эффективных дозах ламотриджина могут быть опосредованы наличием определенного варианта продукта транскрипции гена SCNIA, обладающего измененными электрическими характеристиками. Таким образом, тяжесть заболевания увеличивается в ряду генотипов GG-»GA—>АА, что соответствует повышению терапевтических доз ламотриджина для эффективного контроля приступов. В тоже время, зависимость дозы препарата от генотипа можно интерпретировать и с позиции изменения фармакодинамики ламотриджина в присутствии различных аллельных форм (т.е. изменение активности и /или эффективности препарата относительно продукта гена SCN1A).

Анализ распределения диапазонов суточных доз ламотриджина в зависимости от генетического полиморфизма SCNUVSSN (5G>A)

Объединив пациентов, для которых эффективная терапевтическая доза ламотриджина находилась в диапазоне 50 - 100 мг/сут в группу 1 (36 человек), 125 - 200 мг/сут - в группу 2(11 человек) и 250 - 300 мг/суг - в группу 3 (3 человека) проводили анализ распределения генотипов SCNIIVS5N (5G>A) в зависимости от терапевтического интервала ламотриджина.

В случае гомозигот по минорному аллелю эффект от терапии ламотриджином наблюдался в широком диапазоне с верхней границей в 300 мг/сут; тогда как у носителей гетерозиготного генотипа верхний порог терапевтически эффективного интервала доз был представлен 200 мг/сут. При наличии GG генотипа эффективность исследуемого препарата регистрировалась в более узком дозовом интервале - 50 - 100 мг/сут. Указанные интервалы (1, 2, 3) соответствуют низким, средним и высоким дозовым диапазонам ламотриджина, как правило, назначаемым в клинической практике. Таким образом, результаты исследования позволяют построить модель зависимости терапевтических диапазонов ламотриджина от генотипа пациентов по SCN1IVS5N (5G>A) (Рис.5).

Доадвый интервал, мг/сут |а50-100 ■ 125-200 а25&<300]

....................-..........*......—.....'М

— и....... • в

Ни вш

н '

АА 6А

Генотипы $СЫ1

Рис.5. Зависимость терапевтического интервала ламотриджина от генетического полиморфизма SCN1 /И55ЛМ-5 <?—►/! у пациентов с различными формами эпилепсии.

АА - гомозиготный генотип по минорному аллелю, йА - гетерозиготный генотип, вб -гомозиготный генотип по мажорному аллелю.

Анализ связи полиморфизма гена нейроиального натриевого канала SCN1IVS5N с эффективной концентрацией ламотриджина.

Исходя из того, что 5 пациентов наряду с ПЭП терапией принимали гормональные контрацептивы, что потенциально могло оказывать эффект на эффективную концентрацию препарата в плазме крови, и учитывая возможную низкую комплаентность больных, проводили определение концентрации ламотриджина у 50 пациентов с последующей оценкой зависимости С55шах от генотипа (Таблица 5) Исходя из размера выборки (распределение, полученное в результате применения теста Колмогорова-Смирнова с поправкой Лилифорса, приближалось к нормальному) для статистической обработки данных был использован критерий Манна-Уитни, который выявил достоверную зависимость концентрации ламотриджина от генотипа для групп Ой и АА (Таблица 5). У носителей АА генотипа наблюдалась более высокая максимальная равновесная концентрация ламотриджина по сравнению с пациентами, гомозиготными по мажорному аллелю ОС} (р=0.02), что соотносится с результатами, полученными при оценке ассоциации между дозой и генотипом, а также соответствует линейному характеру фармакокинетики ламотриджина. В результате проведенного исследования не было обнаружено значимых различий в концентрации

ламотриджина у женщин, принимавших оральные контрацептивы, по сравнению с остальной группой.

Таблица 5.

Зависимость С„тах ламотриджина от генетического полиморфизма йСМ №5№5 в->А.

Группа АА Группа ОА Ю Я2 и Р

Сишах Ме ьо ио Ме ьо иО 506 355 145 0,09

1,02 0,64 1,29 0,75 0,58 0,90

Сцтах Группа в А Группа вб 305 72 44 0,15

Ме ЬСЗ иО Ме ьо ио

0,75 0,58 0,90 0,62 0,48 0,64

С«тах Группа АА Группа вв 347,5 58,5 30,5 0,02

Ме ЬО ио Ме ЬО ио

1,02 0,64 1,29 0,62 0,48 0,64

С!5шах - максимальная равновесная концентрация; Ме - медиана; ЬО,110 - нижний и верхний квартили; Я1, 112 - сумма рангов в первой, второй группах; II - значение критерия Манна-Уитни; р - уровень значимости критерия, АА - гомозиготный генотип по минорному аллелю, 6А - гетерозиготный генотип, СО - гомозиготный генотип по мажорному аллелю.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена выявлению и изучению генетических полиморфизмов, ассоциированных с эффективностью терапии ламотриджином. В рамках работы проведено исследование возможной ассоциации аллельных форм генов нейрональнального потенциал-зависимого натриевого канала А'С\7/4 и уридивдифосфат глюкуронозилтрансферазы 1ЮТ1А4 с терапевтической дозой ламотриджина и его концентрацией в плазме крови у больных с различными формами эпилепсии.

На изученной выборке российских пациентов не обнаружено зависимости эффективной терапевтической дозы и концентрации ламотриджина от полиморфизма Р24Т 1ЮТ1Л4. Впервые установлен участок связывания 1ЮТ1А4 с ламотриджином, который позволяет в отсутствие кристаллической структуры комплекса определить функционально значимые аминокислотные остатки для процесса взаимодействия субстрата с ферментом.

Установлена более высокая распространенность полиморфизма Л7ЛГ//К£5Л' (5С>Л) среди пациентов с эпилепсией по сравнению с европейской популяцией,

22

что может свидетельствовать о потенциальном вкладе данного маркера в патогенез эпилепсии. Выявлена ассоциация между генетическим полиморфизмом SCN1IFS5N (5С>А) потенциал-зависимого натриевого канала и эффективностью терапии эпилепсии ламотриджином. Показано возрастание терапевтической дозы для носителей генотипов вО—»ОА—»АА по маркеру ЯСМПУЯЗЫ (5С>А).

Таким образом, в данном исследовании впервые проведена оценка значимости генетических полиморфизмов Р24Т гена уридиндифосфат глюкуронозилтрансферазы 1ЮТ1А и потенциал-зависимого натриевого канала SCN¡IVS5N (50>А) для эффективности терапии эпилепсии ламотриджином.

ВЫВОДЫ:

1. Выявлены генетические маркеры нейронального натриевого канала SCN1IVS5N (5й>А) и уридиндифосфат глюкуронозилтрансферазы Р24Т 1ЮТ1А4, обуславливающие фармакогенетические особенности терапии ламотриджином.

2. Показано отсутствие зависимости эффективной дозы и концентрации ламотриджина от генетического полиморфизма Р24Т гена 1ЮТ1А4 фермента уридиндифосфат глюкуронозилтрансферазы.

3. Установлен структурный участок связывания фермента 1ГСТ1А4 с ламотриджином га вШсо. Показано, что полиморфизм Р24Т располагается вне сайга связывания субстрата.

4. Обнаружена более высокая частота встречаемости полиморфизма

(5С>А) среди пациентов с фокальными формами эпилепсии по сравнению с контрольной европейской выборкой, что может свидетельствовать о вкладе данного полиморфизма в наследственную предрасположенность к возникновению эпилепсии.

5. Установлена ассоциация полиморфизма натриевого канала £СМ/РЖ5Л/' (5й>А) с эффективностью фармакотерапии эпилепсии ламотриджином. Показано, что для достижения клинически значимого эффекта требуется повышение дозы ламотриджина в ряду носителей СО—>СгА—>АА генотипов по полиморфному маркеру 5САЧП^5К' (Зй>А).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бурд, С.Г. Применение Конвульсана у больных эпилепсией [Текст] / С.Г. Бурд, О.Л. Бадалян, P.P. Биктимеров, О.Ю. Варашкевич, Е.В. Кракова, Ф.К. Ридер, Ю.В. Тихонов, О.Ю. Тертышник, Г.Г. Авакян // Тезисы докладов XV Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 486-487.

2. Бурд, С.Г. Качество жизни больных эпилепсией [Текст] / С.Г. Бурд, О.Л. Бадалян, Г.Г. Авакян, A.C. Чуканова, Е.В Кракова II Ж. Вестник эпилептологии. - 2008. №2. - С. 2426.

3. Авакян, Г.Н. Сравнительная эффективность препаратов ламотриджинового ряда [Текст] / Г.Н. Авакян, О.Л. Бадалян, P.P. Биктимеров, О.Ю. Варашкевич, Е.В. Кракова, Ф.К. Ридер, Ю.В. Тихонов, С. Г. Бурд // Ж. Врач. - 2007. №12. - С. 34-38

4. Крикова, Е.В. Генотипирование и анализ галлотипов гена SCM у пациентов с эпилепсией [Текст] / Е.В. Кракова, Е.В. Денисов, В.Г. Бурд, Г.Н. Авакян, Ф.К. Ридер, A.C. Чуканова, Т.А. Воронина // Материалы второй научно-практической конференции неврологов Северо-Западного Федерального округа Российской Федерации. -Сыктывкар, 2009. - С. 58-59

5. Авакян, Г.Н. Генетические аспекты дифференциальной терапии эпилепсии [Текст]/ Г.Н. Авакян, С.Г. Бурд, Т.А.Воронина, Е.В.Крикова // Тезисы докладов конференции "Эпилептология в медицине XXI века". - Москва-Казань, 2009. - С. 473-479

6. Крикова, Е.В. Изучение взаимосвязи генетического полиморфизма SCN1IVS5N 5 G-A а-субъединицы нейронального натриевого канала со средней эффективной дозой и среднемаксимальной концентрацией ламотриджина в плазме крови [Текст] / Е.В. Крикова, Г.Н. Авакян, A.C. Чуканова, Г.Г. Авакян, Ф.К. Ридер, P.P. Биктемеров, С.Г. Бурд II материалы конференции II международного форума неврологов. - Ереван, 2008. -С. 135-136

7. Кракова, Е.В. Изучение ассоциации полиморфизма гена SCN1A с эффективной дозой ламотриджина [Текст] I Е.В. Крикова, Е.А. Вальдмая, Г.Н. Авакян, Я.А. Андреев, Е.В. Денисов, Ф.К. Ридер, P.P. Биктимеров, A.C. Чуканова, С.Г. Бурд// Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова : научно-практический рецензируемый журнал. — 2009. — Том 10,— С. 59-65.

Подписано в печать 15.10.2009 г. Тираж 100 экз. Заказ № 2864 Отпечатано в типографии «АллА Принт» Тел. (495) 621-86-07, факс (495) 621-70-09 www.allaprint.ni