Автореферат и диссертация по медицине (14.01.02) на тему:Влияние метформина на устойчивость миокарда к ишемии при сахарном диабете 2 типа (клинико-экспериментальное исследование)

На правах рукописи

КРАВЧУК ЕКАТЕРИНА НИКОДИМОВНА

ВЛИЯНИЕ МЕТФОРМИНА НА УСТОЙЧИВОСТЬ МИОКАРДА К ИШЕМИИ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 2 ТИПА (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.02 - эндокринология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

тп

013

005537419

Санкт-Петербург - 2013

005537419

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный Центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Гринева Елена Николаевна, д.м.н., ФГБУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, директор Института эндокринологии

Галагудза Михаил Михайлович, д.м.н., ФГБУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, директор Института экспериментальной медицины

Официальные оппоненты:

Баранов Виталий Леонидович - доктор медицинских наук, профессор, заместитель главного врача по терапии ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Митрейкин Владимир Филиппович - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры патофизиологии с курсом клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени И.П.Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация - ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 20 ноября 2013 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.06 на базе ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ.

Автореферат разослан «»

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Черкашин Дмитрий Викторович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

Сахарный диабет 2 типа (СД2) является одним из наиболее распространенных хронических заболеваний и представляет собой серьезную проблему здравоохранения, так как приводит к снижению качества жизни, ранней инвалидизации и высокой летальности (Кисляк О.А., Мышляева Т.О., Малышева Н.В., 2008). При этом заболеваемость СД2 в большинстве стран мира неуклонно растет. По данным Государственного регистра больных сахарным диабетом (СД) в России на 1 января 2009 г. СД выявлен более чем у 3 млн. человек, причем около 90% из них страдают СД2.

СД занимает третье место среди непосредственных причин смерти после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний (Emerging Risk Factors Collaboration, 2010; Демидова Т.Ю., 2010). Ведущей причиной смертности у пациентов с СД2 является ишемическая болезнь сердца (ИБС) и инфаркт миокарда (ИМ), которые встречаются у больных СД2 в 2-4 раза чаще, чем в недиабетической популяции (Haffner S.M. et al., 1998).

В случае развития необратимого ишемического повреждения миокарда зона некроза является основной детерминантой, определяющей дальнейший прогноз, как при наличии СД, так и при его отсутствии. Таким образом, возможность ограничения ишемического повреждения миокарда является крайне важной в клинической практике. В то же время, специфических методов предотвращения ишемического повреждения миокарда у пациентов с СД2 в настоящее время не существует. Исходя из этого, особенно актуальным становится применение у больных СД2 и ИБС препаратов, обладающих не только сахароснижающей активностью, но и воздействующих на патогенетические механизмы ишемического-реперфузионного повреждения миокарда. На роль одного из таких препаратов может претендовать метформин, препарат из группы бигуанидов.

Основными доказанными эффектами метформина являются: 1) снижение инсулинорезистентности и увеличение утилизации глюкозы периферическими тканями; 2) угнетение глюконеогенеза в печени; 3) снижение тромбообразования, улучшение гемореологии; 4) положительное воздействие на липидный обмен. В исследованиях последних лет было доказано снижение факоров риска и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний у пациентов с СД2. Перспективной исследований является выявление прямых кардиопротективных эффектов метформина (Bhamra G.S. et al., 2008; Calvert J.W. et al., 2008).

Между тем механизм кардиопротективного действия метформина остается не до конца ясным. Результаты ряда исследований свидетельствуют о том, что большинство эффектов метформина опосредовано активацией аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (АМФК) (Zhou G., 2001). Этот фермент играет важнейшую роль в регуляции углеводного и липидного обмена, а также контролирует энергетический баланс в клетке. Проведенные исследования подтвердили, АМФК активно участвует в регуляции метаболизма, включая синтез и окисление жирных кислот (Kudo N. et al., 1995; Kudo N. et al., 1998; Luiken J.J. et al. 2003), угнетение печеночной продукции глюкозы (Коо S.H. et al., 2005;), активацию гликолиза (Marsin A.S. et al., 2000), подавление синтеза триглицеридов и белков (Steinberg G.R., Kemp В.Е, 2009), экспрессию транспортеров глюкозы (GLUT-4) на

мембранах клеток (Fujii N. et al., 2004; Richter E.A., Hargreaves M„ 2013). Кроме этого, доказано, что АМФК повышает фосфорилирование и активность эндотелиальной NO-синтазы (Chen Z.P. et al., 1999; Nagata D., Hirata Y., 2010).

В результате активация АМФК приводит к повышению устойчивости миокарда к таким стрессорным факторам, как ишемия и гипоксия, уменьшению эндотелиальной дисфункции, уменьшению оксидативного стресса и выработки активных форм кислорода, улучшению утилизации глюкозы и биологической активности инсулина. Такая метаболическая активность делает этот фермент одним из основных факторов защиты сердечно-сосудистой системы в условиях СД и ИБС.

Большой интерес представляет изучение феномена метаболического прекондиционирования миокарда, который проявляется парадоксальным повышением устойчивости миокарда к ишемии-реперфузии при наличии экспериментально индуцированных хронических метаболических заболеваний, таких как СД (Ravingerova Т. et al., 2003), гипо- и гипертиреоз (Pantos С. et al., 2003). Таким образом, актуальной проблемой является изучение выраженности ишемического-реперфузионного повреждения миокарда при СД2 в условиях терапии метформином в эксперименте и в клинической практике, а также исследование молекулярных механизмов кардиопротективного эффекта метформина и метаболического прекондиционирования при СД2.

Степень разработанности темы исследования

В литературе последних лет имеются экспериментальные данные о возможных кардиопротективных эффектах метформина, проявляющихся ограничением размера инфаркта и улучшением постишемической функции левого желудочка (Legtenberg R.J. et al., 2002; Bhamra GS. et al„ 2008; Calvert J.W. et al„ 2008; Solskov L. et al„ 2008; Paiva M.A. et al., 2010). Кроме того, в исследованиях, посвященных изучению активности АМФК, было доказано повышение резистентности миокарда к ишемии при активации этого фермента (Pons S. et al., 2012; Rüssel III R.R. et al., 2004). Изучение кардиопротективных свойств метформина в зависимости от путей введения препарата с уточнением молекулярно-биологических основ его эффектов является весьма перспективной темой научного исследования.

Большинство клинических исследований посвящены изучению в основном факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний при длительном проспективном наблюдении пациентов в отсутствие острых событий, либо при проведении терапии после уже состоявшегося события (UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group., 1998; Singh M. et al., 2004; Lamanna С. et al., 2011; Zhao J.L. et al., 2011). Попытка экстраполяции экспериментальных данных в клиническую практику является одним из основных направлений медицинской науки.

Цель исследования

Изучить проявления ишемического-реперфузионного повреждения миокарда при сахарном диабете 2 типа в условиях лечения метформином в эксперименте и в клинической практике для выявления возможных кардиопротективных эффектов препарата.

Задачи исследования

1. Оценить влияние экспериментального сахарного диабета 2 типа, как метаболического прекондиционирующего фактора, на ишемическое-реперфузионное повреждение миокарда.

2. Изучить эффект введения метформина на степень ишемического-реперфузионного повреждения миокарда у здоровых животных и у животных с сахарным диабетом 2 типа.

3. Сравнить выраженность ишемического-реперфузионного повреждения миокарда при использовании системного и локального (интракоронарного) пути введения метформина.

4. Проанализировать изменения тканевой активности аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы при сахарном диабете 2 типа и/или ишемии миокарда, а также на фоне терапии метформином.

5. Исследовать влияние лечения метформином на степень повреждения миокарда и течение раннего послеоперационного периода после операции аорто-коронарного шунтирования у пациентов с сахарным диабетом 2 типа, прооперированных в условиях экстракорпорального кровообращения.

Научная новизна

В настоящем исследовании выявлен феномен метаболического прекондиционирования при экспериментальном неонатальном стрептозотоцин-индуцированном СД2. Показано, что метформин вызывает ограничение размера инфаркта только при интракоронарном введении в периоде реперфузии, но не при регулярном системном введении до ишемии миокарда. Установлено, что интракоронарное введение метформина в сердце животных с СД2 не приводит к дополнительному усилению имеющегося кардиопротективного эффекта метаболического прекондиционирования.

Впервые показано, что активация АМФК является необходимым условием для реализации кардиопротективного эффекта изученных воздействий, а именно, метаболического прекондиционирования при экспериментальном СД2 и терапии метформином. При этом менее выраженная степень активации АМФК, вызванная системным введением метформина, не сопровождается инфаркт-лимитирующим действием. Выявлено, что активация АМФК обратно коррелирует с размером зоны некроза.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты позволяют судить о механизмах кардиопротективного эффекта метформина. Одним из путей реализации этого эффекта является активация АМФК в миокарде. В работе подтвержден феномен метаболического прекондиционирования при неонатальном стрептозотоцин-индуцированном СД2, также ассоциированный с активацией АМФК. Возможность дополнительного усиления кардиопротективного эффекта метаболического прекондиционирования с помощью терапии метформином маловероятна.

В клинической части исследования терапия метформином на догоспитальном этапе у пациентов с СД2 и ИБС, перенесших операцию аорто-коронарного шунтирования, не оказывала отрицательного влияния на течение раннего послеоперационного периода.

Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть исследования

Эксперименты были выполнены на 59 крысах-самцах линии Wistar. Животные содержались в условиях 12/12-часового светового режима и получали стандартный корм и питьевую воду ad libitum. Все эксперименты проведены в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (публикация Национального Института Здоровья США № 85-23) и «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» и были одобрены этическим комитетом ФГБУ «ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова» Минздрава РФ.

Экспериментальная модель СД2. В исследовании использовали модель неонатального стрептозотоцинового СД2 у крыс, являющегося широко используемым экспериментальным аналогом СД2 (Islam M.S., Loots du Т., 2009). Индукция СД2 проводилась путем однократного интраперитонеального введения стрептозотоцина, растворенного в цитратном буфере (pH 5,5), в дозе 65 мг/кг новорожденным крысам-самцам линии Wistar в возрасте 4-5 дней. В контрольной группе вводили цитратный буфер в том же объеме.

Глюкозотолерантный тест. На 8-10 неделе жизни проводили глюкозотолерантный тест путем введения перорально 40 % раствора глюкозы из расчета 3 г глюкозы на 1 кг веса животного. Измерения глюкозы проводили из венозной крови хвостовой вены глюкометром (Roche, Германия). Измерение проводили исходно (0 мин) и далее через 15, 30, 60 и 120 мин после введения глюкозы. Кроме этого, измерение гликемии производили перед выполнением глобальной ишемии-реперфузии миокарда.

Введение метформина. Использовали 2 различных пути введения метформина: системное введение до моделирования ишемии миокарда интраперитонеально и интракоронарное введение метформина сразу после периода глобальной ишемии миокарда в начале реперфузии. При интраперитонеальном введении расчет дозы метформина проводили на основании литературных данных (Davis B.J. et al., 2006; Calvert J.W. et al., 2008). Введение метформина (1,1-диметилбигуанид гидрохлорид, Sigma, США) проводилось в течение трех дней интраперитонеально в дозе 200 мг/кг один раз в день. В контрольной группе проводилось введение растворителя в том же объеме. При интракоронарном введении метформин вводили в концентрации 50 микроМ, растворенный в буферном растворе Кребса-Хенселейта, сразу после начала реперфузионного периода в течение 15 мин. (Bhamra GS. et al., 2008; Paiva M. et al., 2009; Paiva M.A. et al., 2010).

Ишемия—реперфузия изолированного сердца. Использовали модель перфузии изолированного сердца крысы по Лангендорфу с воспроизведением глобальной ишемии-реперфузии. Животных наркотизировали уретаном в дозе 1200 мг/100 г. Грудную клетку вскрывали широким чрездиафрагмальным билатеральным разрезом, сердце быстро вырезали и помещали в модифицированный ледяной (4°С) раствор Кребса-Хенселейта, содержащий (в шМ): глюкозы -11; NaCl - 118; KCl - 4,7; СаС12 - 1,5; MgS04 - 1,2; КН2Р04 - 1,2; ЫаНСОЗ - 25. После остановки сердца его присоединяли к модифицированному аппарату Лангендорфа (Leiris J. et al., 1984) и осуществляли ретроградную перфузию через канюлю, введенную в аорту, раствором Кребса-Хенселейта под постоянным давлением гидростатического столба 80 мм. рт.

ст. Температуру перфузионного раствора, насыщенного газовой смесью (карбогеном), содержащей 95% кислорода и 5% углекислого газа, поддерживали на уровне 37±0,5°С. рН раствора равнялось 7,3-7,4.

Регистрация гемодинамических показателей. В ходе эксперимента регистрировали частоту желудочковых сокращений (ЧСЖ) и давление в левом желудочке (ДЛЖ), по кривой которого программным методом вычисляли диастолическое левожелудочковое давление (ДЛЖД), систолическое (СДЛЖ) и пульсовое давление (ПЛЖД). Обработка сигнала проводилась при помощи программного обеспечения PhysExp 2.0. ДЛЖ измеряли в изоволюмическом режиме путем введения в полость ЛЖ через митральное кольцо полиэтиленового баллона, заполненного физиологическим раствором и соединенного с датчиком давления (Baxter, США). Стабилизация параметров работы сердца происходила в течение 15 минут, после чего моделировали период глобальной ишемии миокарда путем полного прекращения подачи перфузата к сердцу в течение 30 мин с последующей реперфузией в течение 120 мин. Параметры работы сердца оценивали в исходном состоянии (после 15 минут стабилизационного периода), перед периодом ишемии, на 5, 10, 15, 20, 25 и 30 минутах глобальной ишемии, а также каждые 10 минут реперфузии.

Оценка размера экспериментального инфаркта миокарда. Проводили оценку размера инфаркта с помощью окраски срезов 1%-м раствором 1,2,3 -трифенилтетразолия хлорида (ТТХ, MP Biomedicals, США). Для этого после завершения 120-минутной реперфузии сердце снимали с аппарата Лангендорфа, разрезали на 5 слоев одинаковой толщины и непосредственно после этого 4 среза инкубировали в 1 %-м растворе ТТХ при температуре 37 °С и рН 7,4. В дальнейшем после фотографирования срезов размер инфаркта для данного среза вычисляли как отношение площади ТТХ-негативных участков миокарда к общей площади среза, а размер инфаркта для данного сердца вычисляли как среднее арифметическое значений, полученных для 4 срезов (Song X. et al., 2003). Срез верхушки сердца (срез №5) и оставшиеся предсердия сразу после завершения реперфузии замораживали в жидком азоте для последующего Вестерн-блоттинга.

Клиническая часть исследования

Для выполнения клинической части исследования скринировали 104 пациента, госпитализированных в стационар для проведения оперативного вмешательства, аорто-коронарного шунтирования (АКШ) в условиях экстракорпорального кровообращения (ЭКК), по результатам проведенной ранее коронарографии. Критериям включения соответствовало 63 пациента, из них информированное согласие подписали и были включены в исследование 45 больных. Завершили исследование все включенные пациенты.

Критерии включения в исследование:

1) Мужчины и женщины 40-75 лет;

2) Наличие подтвержденного сахарного диабета 2 типа, на терапии метформином не менее 6 мес. в дозе не менее 850 мг или без медикаментозной сахароснижающей терапии;

3) Уровень гликированного гемоглобина (HbAlc) менее 8,0 % при включении в исследование;

4) Планируемое выполнение АКШ по результатам коронарографии;

5) Подписание информированного согласия. Критерии исключения:

1) Сахарный диабет тип 1

2) Наличие непереносимости метформина в анамнезе

3) Почечная недостаточность (скорость клубочковой фильтрации (СКФ)<60 мл/мин, креатинин более 132 мкмоль/л у мужчин, 123 мкмоль/л у женщин)

4) Нарушение функции печени (повышение аспартатаминогрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ) более чем в 3 раза от нормы)

5) Текущий инфаркт миокарда

6) Тяжелые заболевания легких с дыхательной недостаточностью

7) Онкологические заболевания в анамнезе

8) Беременность, лактация

9) Хронический алкоголизм, наркомания

10) Психические заболевания, способные помешать пациенту участвовать в исследовании.

Исследуемые группы были сформированы следующим образом: 1) СД2 - 15 больных с СД2, получавших терапию диетой перед госпитализацией, 2) СД2М - 15 больных с СД2, получавших терапию метформином, 3) К - группа сравнения, 15 больных без СД2, сравнимые по остальным критериям. Дизайн исследования: открытое, нерандомизированное, наблюдательное (Рисунок 1).

Рисунок 1 - Дизайн исследования

В группе контроля исключение СД2 проводилось на основании анамнестических данных, ранее выполнявшихся анализов крови на глюкозу и результатов обследования при госпитализации в стационар - измерение HbAlc.

Все пациенты получали базовую сердечно-сосудистую терапию, включавшую ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента или антагонисты к рецепторам ангиотензина II, p-адреноблокаторы, статины, дезагреганты, нитраты и мочегонные - по показаниям.

У пациентов, включенных в исследование, проводился сбор анамнеза, объективный осмотр, выполнялся биохимический анализ крови (ACT, АЛТ, креатинин, холестерин общий), оценивался уровень HbAlc.

Для оценки выраженности ишемического повреждения миокарда измеряли уровень маркеров некроза миокарда: креатинфосфокиназы MB (КФК MB) и тропонина I перед выполнением оперативного вмешательства, через 12, 24, 72 часа после вмешательства. Кроме этого в ходе операции оценивали время пережатия аорты - время аноксии, длительность экстракорпорального кровообращения (ЭКК) и восстановление сердечной деятельности.

В раннем послеоперационном периоде оценивали длительность искусственной вентиляции легких (ИВЛ), необходимость введения вазопрессоров, время нахождения в реанимационном отделении (РО).

Для выполнения Вестерн блотгинга, во время операции проводили забор образцов скелетной мышцы (межреберной мышцы), сегмент внутренней грудной артерии забирали при подготовке шунта. Образцы сразу замораживались в жидком азоте и хранились при температуре -80°С.

Вестерн-блоттинг для оценки экспрессии фосфорилированной и нефосфорилированной АМФК. Методикой Вестерн-блоттинга оценивали экспрессию фосфорилированной (активированной) АМФК и нефосфорилированной АМФК в полученном материале миокарда животных, скелетной мышце и стенке внутренней грудной артерии. Для этого из полученных образцов выделяли белковую фракцию, помещая материал в лизирующий буфер с использованием гомогенизатора (TissueLyser LT, Qiagen, Нидерланды). После уравнивания концентраций белка в пробах проводили электрофорез с последующим переносом белков на нитроцеллюлозную мембрану. Затем проводили блокирование мембраны для предотвращения неспецифического связывания антител (AT) и инкубировали мембрану с раствором AT к фосфорилированной (фосфо-АМФК) и нефосфорилированной (АМФК) формам АМФК. Для детекции использовали вторичные AT с пероксидазой хрена, набор ECL Advance (Amersham Biosciences, США) и систему ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, США). Проводили оценку плотности полученных бандов с использованием программы Gel analyzer. Активность АМФ-активируемой протеинкиназы рассчитывали по соотношению фосфо-АМФК / АМФК.

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ проводили на компьютере с использованием электронных таблиц Excel при помощи прикладных программ SPSS (ANOVA). В работе использовали графические представления данных. Данные в тексте и таблицах представлены в виде M±SE, М-среднее, SE-стандартная ошибка среднего. Указывали минимальное и максимальное значения. Критический уровень значимости р при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Экспериментальный сахарный диабет 2 типа является состоянием, вызывающим метаболическое прекондиционирование миокарда, и сопровождается повышением устойчивости миокарда к ишемии-реперфузии.

2. Способ введения метформина (интракоронарный или внутрибрюшинный) имеет определяющее значение в реализации кардиопротективного эффекта препарата.

3. Порог реализации инфаркт-лимитирующего эффекта метформина при

системном введении как в эксперименте, так и в клинической практике выше, чем активация аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы как одного из молекулярных механизмов кардиопротекции.

Степень достоверности и апробация работы

Материалы диссертации доложены на международных конференциях: Advanced Technologies and Treatments of Diabetes (Лондон, Великобритания, 16-19 февраля 2011 год), Frontiers in Cardiovascular Biology 2012 (Лондон, Великобритания, 30 марта-01 апреля 2012 год), 15th International Congress of Endocrinology and 14th European Congress of Endocrinology (Флоренция, Италия, 5-9 мая 2012 год), а также на международной встрече 3rd Almazov and DIfE Gerussfit Project Workshop (Потсдам, Германия, 25-26 февраля 2013 год).

Материалы диссертации были доложены на заседаниях проблемных комиссий Института эндокринологии и Института экспериментальной медицины ФГБУ «Федеральный центра сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова» Минздрава РФ.

Личный вклад автора

Автором был проведен анализ литературных данных, лично выполнена экспериментальная часть исследования, проведено клиническое обследование и наблюдение пациентов, госпитализированных с отделение сердечно-сосуцистой хирургии, выполнена оценка активности АМФК, статистическая обработка, анализ и обобщение полученных клинических и лабораторных данных, сделаны соответствующие выводы.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе в журналах из перечня рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК, — 3.

Внедрение результатов работы

Результаты и выводы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре патофизиологии с курсом клинической патофизиологии и кафедре факультетской терапии ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени И.П.Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 114 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержит 16 рисунков и 16 таблиц. Список литературы включает 165 источников, в том числе 146 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Результаты собственных исследований Экспериментальная часть исследования

Характеристика групп животных. Результаты глюкозотолеракгного теста, проведенного на 8-9 неделе жизни животных, представлены на рисунке 2. В ходе теста отмечалось достоверное увеличение уровня гликемии в группе животных с СД2 (р<0,0001).

С 20

—■—И нт акт ные животные —♦—Ж ивагные с СД2

о

}

р<0,0001

о

о

15

30

60

120

Время, мин

Рисунок 2 - Уровень гликемии в ходе глюкозотолерантного теста в Труппе здоровых животных и группе с СД2 (СД2)

Примечание: р < 0,0001 между группами интактных животных и животных с СД2

Далее в каждой группе (интактных животных и животных с СД2) были выделены 3 подгруппы в зависимости от путей введения метформина. Таким образом, для выполнения исследования животные были разделены на следующие группы:

1. Контрольная группа (К) (п=13) - интактные крысы, не получавшие метформин перед проведением эксперимента перфузии изолированного сердца.

2. КМ(в/б) (п=12) - интактные крысы, получавшие терапию метформином (Глюкофаж, Ыусошес!) в дозе 200 мг/кг внутрибрюшинно в течение 3 дней перед проведением эксперимента перфузии изолированного сердца.

3. КМ(и/к) (п=7) - группа интактных животных, в которой в ходе выполнения эксперимента по перфузии изолированного сердца по Лангендорфу вводили метформин интракоронарно в концентрации 50 микроМ в первые 15 мин реперфузии .

4. СД2 (п=12) - крысы с развившимся СД2, не получавшие метформин перед проведением эксперимента перфузии изолированного сердца.

5. СД2М(в/б) (п=7) - крысы с развившимся СД2, получавшие терапию метформином в дозе 200 мг/кг внутрибрюшинно в течение 3 дней перед проведением эксперимента перфузии изолированного сердца.

6. СД2М(и/к) (п=8) - группа крыс с развившимся СД2,в которой в ходе выполнения эксперимента по перфузии изолированного сердца по Лангендорфу вводили метформин интракоронарно в концентрации 50 микроМ в первые 15 мин реперфузии.

Ни у здоровых животных, ни у крыс с СД2 на фоне введения метформина внутрибрюшинно в течение трех дней не произошло значимого снижения уровня гликемии, что, вероятно, связано с малой продолжительностью терапии. Обращает на себя внимание достоверно более высокий уровень гликемии у животных с СД2 по сравнению со здоровыми животными (Р<0,05) (Таблица 1).

*

Таблица 1 - Уровень гликемии перед выполнением перфузии изолированного сердца

Показатель К КМ(в/б) СД2 СД2М(в/б)

Уровень гликемии перед выполнением перфузии изолированного сердца, ммоль/л 6,0 ± 0,6 6,4 ± 0,6 9,5 ±3,3* 8,2 ± 1,6*

Примечание: * - р < 0,05 между группами СД2, СД2М(в/б) и группой контроля

Гемодинамические показатели и размер зоны инфаркта в ходе эксперимента по перфузии изолированного сердца у животных с СД2 и при его отсутствии.

При оценке таких гемодинамических показателей, как ЧСЖ, ДЛЖД, ПЛЖД и КП, достоверных отличий в исходном состоянии и в течение всего эксперимента достоверных отличий между группами выявлено не было.

В контрольной группе (К) размер инфаркта составил 45 ± 10,4 %. Введение здоровым животным метформина внутрибрюшинно не приводило к уменьшению размера инфаркта (56 ± 15,8 %). При этом у животных с СД2 размер инфаркта был достоверно меньше, чем в контроле (24 ± 7,6 %, />=0,00017). Терапия метформином как при системном введении, так и интракоронарно не приводила к заметному увеличению или уменьшению размера инфаркта у животных с СД2 (38 ± 8,3 % и 25 ± 12,8 %, соответственно). Обращало на себя внимание значимое уменьшение зоны инфаркта при интракоронарном введении метформина здоровым животным, а именно, размер некроза в этой группе (КМ(и/к)) составил 29 ± 15,1 % (р=0,008, в сравнении с контрольной группой). Результаты представлены на рисунке 3.

.Р=0.00017

£ о. «о

-е-

ш х: о.

о «*

г

тг

Г 0,008

о оо

□ □□ п г

Пппп41

'1»

л

К КМ(|Л) КМ(и/к)

Рисунок 3 - Размер зоны инфаркта

ОД2 СД2М(вЮ) ОД2МДО)

Активность АМФК в миокарде у животных с СД2 и при его отсутствии.

Уровень экспрессии АМФК не отличался во всех исследуемых группах. Уровень экспрессии фосфо-АМФК во всех группах с СД2 (на фоне введения метформина и без него) был достоверно выше, чем в группе К, что свидетельствовало об активации АМФК в миокарде при СД2. При этом отмечалось нарастание активности АМФК при СД2 на фоне введения метформина, как интракоронарно, так и внутрибрюшинно по сравнению с группой СД2 (Рисунок 4).

В группах здоровых животных также отмечалось достоверное повышение экспрессии фосфо-АМФК на фоне введения метформина, соответственно и повышение активности АМФК. Наибольший уровень активации АМФК отмечался при введении метформина интракоронарно (Рисунок 4). Эти данные свидетельствуют об активации АМФК как при наличии СД2, так при терапии метформином при любом пути введения.

3,5 &

К КМ(в/б) Км(и/к) СД2 СД2М(в/б) СД2М(и/к)

Рисунок 4 - Экспрессия АМФК и фосфо-АМФК. Денситометрическая оценка экспрессии фосфо-АМФК по отношению к АМФК

Примечание: * - р<0,05 между группами КМ(в/б), КМ(и/к), СД2, СД2М(в/б), СД2М(и/к) и группой контроля, $ - р < 0,05 между группами КМ(и/к) и КМ(в/б), & -р < 0,05 между группами СД2М(и/к) и СД2М(в/б)

Соотношение фосфо-АМФК/АМФК, отражающее активность АМФК, обратно коррелировало с размером зоны некроза миокарда (Рисунок 5), что может объясняться как большей степенью сохранения жизнеспособного миокарда, в котором происходила активация АМФК при гипоксии, так и более выраженной степенью активации АМФК в клетках миокарда независимо от предыдущего фактора.

Размер инфаркта, %

Рисунок 5 - Диаграмма разброса значений соотношения фосфо-АМФК/АМФК и размера инфаркта миокарда

Клиническая часть исследования

Возраст включенных в исследование пациентов варьировал от 55 до 77 лет, составляя в среднем 64,3±5,6 лет, среди них было 16 женщин и 29 мужчин. Длительность СД2 в группах СД2 и СД2М от момента постановки диагноза колебалась от 8 мес. до 12 лет. Длительность ИБС во всех группах составила от 1 года до 12 лет.

Основные клинико-анамнестические характеристики групп пациентов представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Клиническая характеристика включенных в исследование пациентов

Показатель СД2 СД2М К

Кол-во больных 15 15 15

Половой состав, муж./жен. 9(60 %)/6(40 %) 9(60 %)/6(40 %) 11(73 %)/4(27%)

Возраст, годы 63,7 ± 6,3 65,4 ± 5,3 63,6 ± 5,4

ИМТ, кг/м2 28,6 ± 4,5 28,6 ±3,4 29,0 ± 3,6

Средняя длительность СД2, годы 4,4 ± 3,3 5,0 ±3,1 -

Продолжение Таблицы 2

Средняя длительность ИБС, годы 6,1 ±4,2 5,1 ±3,0 5,3 ± 3,2

Наличие ИМ в анамнезе, кол-во больных 7 9 11

Наличие ОНМК/ТИА в анамнезе, кол-во больных 1 0 2

Функциональный класс стенокардии, кол-во больных с II ф.кл./ кол-во больных с III ф.кл. . 5/10 5/10 4/11

ХСН, кол-во больных II ф.кл./ кол-во больных III ф.кл 13/2 12/3 12/3

Курение, кол-во больных 5 4 5

Примечание: ИМ - инфаркт миокарда; ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения; ТИА - транзиторная ишемическая атака; ХСН - хроническая сердечная недостаточность

Таким образом, группы пациентов были сравнимы по спектру и выраженности сердечно-сосудистой патологии. При оценке лабораторных данных группы пациентов были сравнимы по основным показателям, результаты представлены в таблице 2. По результатам измерения гликированного гемоглобина его уровень достигал 7,09 ± 0,87% в группе СД2 и 6,88 ± 0,93% в группе СД2М, в группе контроля уровень НЬАс был достоверно ниже - 5,07 ± 0,4% (р<0,05). Общий холестерин на фоне приема липидоснижающей терапии (статины) составил 4,9 ± 1,0 ммоль/л и не отличался достоверно во всех группах. Средние показатели общих биохимических показателей (ACT, AJIT, креатинин) были в пределах нормальных показателей и сопоставимы во всех группах. 3 пациента в группах СД2 и СД2М имели уровень креатинина выше нормы, но не превышавший 115 мкмоль/л и СКФ составила не менее 60 мл/мин.

Таблица 3 - Лабораторные показатели в группах пациентов

Показатель СД2 СД2М К

HbAlc, % 7,09 ± 0,87 6,88 ± 0,93 5,07 ± 0,4*

Общий холестерин, ммоль/л 5,2 ± 1,1 4,6 ± 1,1 4,8 ± 0,9

Креатинин, мкмоль/л 76,9 ± 17,0 81,4± 17,1 71,3 ± 12,0

ACT, Е/л 28,0 ± 17,0 22,1 ±4,5 23,2 ± 6,4

АЛТ, Е/л 33,3 ± 10.0 24,3 ± 7,3 27,7 ± 10,5

Примечание: * р<0,05 между группой К и группами СД2 и СД2М, HbAlc -гликированный гемоглобин, ACT — аспартатаминотрансфераза, АЛТ -апанинаминотрансфераза

Оценка степени интраоперационного повреждения миокарда у больных. В

ходе выполнения оперативного вмешательства оценивались время экстракорпорального кровообращения (ЭКК) и время аноксии, которые не отличались достоверно в исследуемых группах, что позволяет предположить относительно равное ишемическое повреждение (Таблица 4).

Таблица 4 - Параметры ЭКК в исследованных группах

Показатель СД2 СД2М К

Время ЭКК, мин 101,4 ±28,6 92,0 ± 32,7 100,8 ±27,1

Время аноксии, мин 64,4 ± 16,2 59,8 ± 17,2 57,6 ± 12,8

У всех пациентов произошло спонтанное восстановление сердечного ритма в ходе операции, кроме двух пациентов в группе СД2, которым потребовалась электроимпульсная терапия для восстановления сердечной деятельности после прекращения ЭКК.

Количество пациентов, которым потребовалась инотропная поддержка в первые сутки после операции, достоверно не отличалось в исследуемых группах: в группе СД2 7 пациентов, в группе СД2М - 6 пациентов, в группе К - 8 пациентов. Уровень тропонина I в послеоперационном периоде не отличался достоверно в исследованных группах. Отмечалось нарастание уровня с максимумом в пределах 12-24 часов (Таблица 5).

Таблица 5 - Динамика изменения уровня тропонина после операции

Показатель СД2 СД2М К

Тропонин I перед выполнением операции, нг/мл 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00

Тропонин I через 12 часов после операции, нг/мл 1,7 ±0,58 1,7 ±0,63 1,6 ±0,64

Тропонин I через 24 часов после операции, нг/мл 1,5 ±0,49 1,3 ±0,43 1,4 ±0,52

Тропонин I через 72 часов после операции, нг/мл 1,0 ±0,29 1,1 ±0,28 1,0 ±0,44

Уровень КФК-МВ в послеоперационном периоде также не отличался во всех исследуемых группах и достигал максимума в пределах 12 часов (Таблица 6).

Таблица 6 - Динамика изменения уровня КФК-МВ после операции

Показатель СД2 СД2М К

КФК-МВ через 12 часов 14,1 ±2,5 13,9 ±2,6 13,9 ±2,6

после операции, нг/мл

КФК-МВ через 12 часов 31,2 ±3,3 30,7 ±2,3 32,3 ±3,7

после операции, нг/мл

КФК-МВ через 24 часов 26,1 ±6,0 24,3 ± 4,7 24,4 ± 4,7

после операции, нг/мл

КФК-МВ через 72 часов 22,1 ±4,6 21,0 ±4,8 20,3 ± 3,9

после операции, нг/мл

При дальнейшем наблюдении за пациентами послеоперационный период протекал без осложнений у большинства пациентов.

Результаты исследования активности АМФК в скелетной мышце и сосудистой стенке у больных. Экспрессия фосфо-а-АМФК в скелетной мышце в группах СД2, СД2М и К достоверно не различались (Рисунок 6).

3,5 -,

з ■

К сдд сдм

Рисунок 6 - Экспрессия АМФК и фосфо-АМФК в скелетной мышце

Уровень экспрессии фосфо-АМФК в сосудистой стенке в группах СД2, СД2м и К также достоверно не различались (Рисунок 7) . Имело место некоторое увеличение экспрессии фосфо-АМФК в группе СД2 (р=0,05).

Рисунок 7 - Экспрессия АМФК и фосфо-АМФК в сосудистой стенке

Равный уровень экспрессии фосфо-АМФК позволяет предполагать одинаковый уровень активности АМФК в скелетной мышце и сосудистой стенке у пациентов. Такие результаты могут быть объяснены тем, что пациенты получали большое количество препаратов в различных дозах, а также сопутствующей патологией и различной выраженностью атеросклерсггического процесса. В настоящее время изучены не все факторы, способные активировать АМФК, что затрудняет интерпретацию данных.

Заключение и перспективы дальнейшей разработки темы

В проведенном исследовании было доказано кардиопротективное действие метформина при его локальном введении в сердце интактных животных, причем этот эффект был ассоциирован с активацией АМФК. Кроме того, был показан экспериментальный феномен метаболического прекондиционирования при СД, который также может быть связан с активацией АМФК.

В клинической части исследования не было выявлено достоверного кардиопротективного эффекта метформина при проведении терапии до выполнения кардиохирургического вмешательства. Такие результаты могут быть объяснены относительно малыми дозами препарата при проведении сахароснижающей терапии, а также небольшим количеством пациентов в каждой исследуемой группе.

Результаты клинической части исследования могут служить основой для дальнейших исследований в области кардиопротекции у пациентов с ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом.

19

Выводы

1. Экспериментальный неонатальный стрептозотоцин-индуцированный сахарный диабет второго типа сопровождается повышением резистентности миокарда к ишемическому-реперфузионному повреждению, что связано с метаболическим прекондиционированием.

2. Кардиопротективный эффект метаболического прекондиционирования и интракоронарного введения метформина сопровождается повышением активности аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы в миокарде животных.

3. Метформин оказывает достоверный инфаркт-лимитирующий эффект при интракоронарном введении в начальном периоде реперфузии. При этом системное введение метформина до ишемии миокарда не приводит к уменьшению размера инфаркта.

4. Интракоронарное введение метформина в сердце животных с сахарным диабетом 2 типа не сопровождается усилением имеющегося кардиопротективного эффекта метаболического прекондиционирования.

5. Терапия метформином у пациентов с сахарным диабетом 2 типа до выполнения операции аорто-коронарного шунтирования в условиях экстракорпорального кровообращения не оказывает значимого эффекта на уровень маркеров некроза миокарда и течение раннего послеоперационного периода.

Практические рекомендации

1. Полученные в эксперименте данные о выраженном инфаркт-лимитирующем эффекте метформина при его введении в начальном реперфузионном периоде после пролонгированной ишемии обосновывают проведение дальнейших клинических исследований кардиопротективной эффективности метформина у пациентов с острым коронарным синдромом.

2. Поскольку активация аденозинмонофосфат-акгивируемой протеинкиназы является одним из ключевых механизмов реализации кардиопротективного эффекта различных изученных воздействий, определенные перспективы представляет разработка способов фармакологической активации аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы с целью достижения максимального защитного действия.

3. Результаты клинической части исследования могут служить основой для дальнейших исследований в области кардиопротекции у пациентов с ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Kravchuk, Е. The effect of metformin on the myocardial tolerance to ischemia-reperfusion injury in the rat model of diabetes mellitus type II / Б. Kravchuk, Б. Grineva, A. Bairamov, M. Galagudza, T. Vlasov // Exp. Diabetes Res. - 2011. -doi: 10.1155/2011/907496.

2. Кравчук, E.H. Применение метформина при сочетании ишемической болезни сердца и сахарного диабета 2 типа: механизмы действия и клиническая эффективность / Е.Н. Кравчук, М.М. Галагудза // Сахарный диабет. - 2013. - JVs 1. - С. 5-14.

3. Кравчук, Е.Н. Роль АМФ-активируемой протеинкиназы в изменении устойчивости миокарда к ишемическому и реперфузионному повреждению под действием метформина при сахарном диабете тип 2 / Е.Н. Кравчук, Е.Н. Гринева, М.М. Галагудза, А.А. Костарева, А.А. Байрамов // Артериальная гипертензия. - 2012. - Т. 18. - № 3. - С. 206-212.

4. Kravchuk, E.N. The effect of metformin on myocardial tolerance to ischemia in rats with diabetes mellitus type 2 / E.N. Kravchuk, E.N. Grineva, M.M. Galagudza, A.A. Bairamov // The 4lh international conference on advanced technologies and treatments for diabetes (London, UK, February 16-19,2011). - P. 70.

5. Kravchuk, E. The effect of metformin and metabolic preconditioning on myocardial tolerance to ischemia and cardiac activity of adenosine monophosphate-activated protein kinase / E. Kravchuk, E. Grineva, M. Galagudza, A. Kostareva, A. Bairamov // Cardiovascular research. Abstract book of: Frontiers in Cardiovascular Biology (London, UK, March 30- April 01, 2012), 2nd Congress of the ESC Council on Basic Cardiovascular Science.-2012.-Vol. 93. (Suppl. 1)-P. 110.

6. Kravchuk, E. The role of AMP-activated protein kinase in myocardial tolerance to ischemia in rats with diabetes mellitus type 2 and its relation to metformin therapy / E. Kravchuk, E. Grineva, M. Galagudza, A. Kostareva // Endocrine abstracts 15th international and 14lh European congress of endocrinology (Florence, Italy, May 5-9, 2012).-Vol. 29.-P. 615.

Список сокращений

АКШ _ аорто-коронарное шунтирование

AJIT - аланинаминотрансфераза

АМФК - аденилатмонофосфат-активируемая протеинкиназа.

ACT - аспартатаминотрансфераза

AT - антитела

ДЛЖ - давление в левом желудочке

ДЛЖД - диастолическое давление в левом желудочке

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИВЛ - искусственная вентиляция легких

ИМ - инфаркт миокарда

КП - коронарный поток

КФК-МВ - креатинкиназа MB

ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения

ПЛЖД - пульсовое давление в левом желудочке

РО - реанимационное отделение

СД - сахарный диабет

СД2 - сахарный диабет 2 типа

СДЛЖ - систолическое давление в левом желудочке

СКФ - скорость клубочковой фильтрации

ТИА - транзиторная ишемическая атака

ТТХ - трифенилтетразолия хлорид

фосфо-АМФК - фосфорилированная АМФК

ХСН - хроническая сердечная недостаточность

ЧСЖ - частота желудочковых сокращений

ЭКК - экстракорпоральное кровообращение

HbAlc - гликированный гемоглобин

Подписано в печать 16.10.13 Формат 60x84/16

Обьем 1 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 633

Типография ВМедА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6.