Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние силимарина и янтарной кислоты на метаболические нарушения при экспериментальном сахарном диабете

На правах рукописи

Эскина Ксения Аркадьевна

ВЛИЯНИЕ СИЛИМАРИНА И ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ НА МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

14.00,25 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и ГУ Научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы РФ

Венгеровский Александр Исаакович

доктор медицинских наук, профессор

Хазанов Вениамин Абрамович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Суслов Николай Иннокентьевич

кандидат медицинских наук

Чернова Евгения Николаевна

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «_______»...........2007 года в «..„,.,» часов на

заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при ГУ' НИИ фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН по адресу 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томскою научного центра Сибирского отделения РАМН.

Автореферат разослан «_»______2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Амосова Е.Н.

ЛДФ/О ЛОЛ

дк

ЛПВГ1

мдл

иол

сд

сдг

як

С.'ПИСО К С.ХЖРЛЩК11 и й

коэффициент сопряженности окислительного фосфорилиронания амшгаоксиацстат

коэффициент дыхательного контроля лнпопротсины высокой плотности малоновый диальдегид перекисное окисление липидон коэффициент стимулированного дыхания ■ су кцинатдеп1дроге11ача ян тарная кислота

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА ___ 2DQ7__

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Сахарный диабет - хроническое метаболическое заболевание, характеризующееся гипергликемией вследствие дефекта секреции инсулина, нарушения его активности или сочетания обеих причин и приводящее к патологии обмена веществ, поражению сосудов, нервной системы и патологическим изменениям в различных органах и тканях. В структуре летальности среди хронических неинфекционных заболеваний сахарный диабет занимает третье место после сердечнососудистых и онкологических заболеваний. В промышленно развитых странах данным заболеванием страдают 6-10% населения, что можно оценить как «пандемия». Распространенность сахарного диабета имеет четкую тенденцию к увеличению, в первую очередь в возрастных группах старше 40 лет. Каждые 15 лет число больных сахарным диабетом удваивается. Это происходит в основном за счет роста количества больных сахарным диабетом типа 2. По данным ВОЗ в 2003 г. в мире насчитывалось около 80 млн больных, в 2005 г. - около 200 млн, к 2010 г. в мире ожидается более 230 млн больных [Балаболкин М.И., 2006].

Известно, что при сахарном диабете страдают все виды обмена веществ: вследствие нарушения проникновения глюкозы в клетку развивается стойкая гипергликемия, резко снижается синтез белка, замедляется тканевое дыхание, нарушается продукция АТФ, повышается образование кетоновых тел и триглицеридов в печени, в результате генерации большого количества свободных радикалов образуются и накапливаются высокотоксичные липоперекисные соединения. Эти метаболические нарушения являются причиной развития таких осложнений, как ангиология, ретинопатия, периферическая нейропатия, жировая инфильтрация печени Дедов И.И., 2003]. Несмотря ira достоянное внимание к вопросам повышения эффективности лечения сахарного диабета, эта проблема остается актуальной. В современной фармакотерапии сахарного диабета применяют инсулин и другие сахаропонижающие средства (производные сульфонилмочевины, бигуаниды, ингиби-

торы а-глгокозидазы, сенситайзеры инсулина и др.) [Гилман А.Г., 2006]. Данные препараты регулируют утилизацию глюкозы клеткой,

В патогенезе сахарного диабета большое значение придается процессам пе-рекисного окисления липидов [Дедов И.И., 2005]. Кроме того, образование большого количества липоперекисей и повреждение путей метаболизма при сахарном диабете приводят к нарушению биоэнергетики. В этой связи представляет несомненный интерес изучение метаболического статуса митохондрий на фоне развития экспериментального сахарного диабета (введение стреитозотоцина) и при коррекции его с помощью гепатопротекгора с антиоксидантным действием силимари-на, а также регулятора энергетического обмена янтарной кислоты.

Цель работы.

Изучение метаболических нарушений при экспериментальном сахарном диабете и возможности их коррекции гепатопротектором еилимарином и регулятором энергетического обмена янтарной кислотой.

Задачи исследования.

1, Изучить метаболические нарушения, определяющие патогене) экспериментального сахарного диабета, - • изменения содержания в крови глюкозы, белка, холестерина и лншшротеииов высокой плотности, процессов иерскисного окисления линидов и поджелудочной железе и печени и функционального состояния митохондрий пенсии крыс через 2 и 14 еут. после инъекции етренточогоцини.

2, Оценить влияние генатонротектра силимарнна ж» биохимические показатели крови, процессы перекисного окисления липидов в поджелудочной желаю и печени и энергопродукцию в печени крыс при экспериментальном сахарном диабете.

3. Оценить влияние регулятора энергетического обмена янтарной кислоты на биохимические показатели крови, липоперокевдацшо в поджелудочной желече и печени и эыергопродукцию в печени крыс при 'жеперимеиталыюм сахарном диабете.

4. Оценить значение антиоксидантного эффекта силимарнна и влияния янтарной кислоты на функцию быстрого метаболического кластера митохондрий пе-

чени для реализации терапевтического действия препаратов при модели сахарного диабета, вызванной введением стрептозотоцина.

Научная новизна работы.

Впервые изучены нарушения обмена энергии в митохондриях печени крыс в раннем и позднем периодах развития модели сахарного диабета, вызванной внут-рибрюшинным введением стрептозотоцина. Показано, что в патогенезе экспериментального сахарного диабета имеет значение нарушение энергетического метаболизма в митохондриях печени, обусловленное разобщением окисления и фосфо-рилирования.

Впервые изучено действие гепатопротектора силимарина и регулятора энергетического обмена янтарной кислоты на биохимические показатели крови, пере-кисное окисление липидов в поджелудочной железе и печени и обмен энергии в митохондриях печени крыс с моделью сахарного диабета. Силимарии как активный антиоксидант значительно тормозит липонероксидацию, в меньшей степени улучшает митохондриалъные процессы биоэнергетики. Янтарная кислота, оптимизируя процессы митохондриалыюго окисления, оказывает более выраженный терапевтический эффект.

Практическая значимость работы.

Полученные данные расширяют существующее представление о механизмах нарушения обмена веществ при сахарном диабете. В частности, показано, что у животных с экспериментальным сахарным диабетом нарушается энергетический обмен в печени.

Гешгашротектор силимарии нормализует' биохимические показатели крови, иигибирует процессы переписного окисления липидов и оказывает лишь незначительное воздействие на нарушенный энергетический обмен. Янтарная кислота восстанавливает биохимические показатели крови, подавляет перекисное окисление липидов, полностью нормализует энергетический обмен в митохондриях печени при интоксикации стрептозогоцином, Результаты экспериментальной терапии сви-

детельствуют о целесообразности клинических исследований силимарина и янтарной кислоты в качестве средств комплексной терапии сахарного диабета.

Апробация работы.

Основные положения диссертации представлены на ХШ Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.Н. Березне-говской (Томск, 2006), VII международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения» (Ленинск-Кузнецкий, 2006).

Публикации.

Материалы диссертации опубликованы в 5 научных статьях и материалах конференций, в том числе 1 статья опубликована в журнале, рекомендованном ВАК РФ для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения, выводов, библиог рафического указателя. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами и 2 рисунками, Библиографический указатель включает 151 источник, из которых 30 публикации иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили в зимне-весенний период на 120 беспородных крысах-самцах массой 200-220 г, полученных из клиники лабораторных животных НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН, Животные находились в стандартных условиях вивария при естественном освещении, свободном доступе к воде и пище. Все манипуляции (взвешивание, введение препаратов, де-кагштацию) осуществляли с 9 до 12 ч с целью исключения суточных влияний на метаболизм. Исследования выполняли в соответствии с рекомендациями «Руко-

7

водства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств» (2005).

В работе использовали экспериментальную модель сахарного диабета, вызванную у крыс внутрибрюхпинным введением стрептозотоцина. Данная модель позволяет воспроизводить сахарный диабет, в том числе отдельные стадии патологического процесса, что подтверждается результатами морфологических и биохимических исследований [Cardinal J., 1999].

Со 2-го дня после интоксикации крысам на протяжении 14 сут. вводили в желудок ежедневно силимарин (70 мг/кг) или янтарную кислоту (ЯК, 50 мг/кг) в виде суспензии на 1% крахмальной слизи, Дозы препаратов являются эффективными терапевтическими [Саратиков A.C., Венгеровский А.И., 1995; Хазанов В.А., 2004].

Силимарин - препарат семян расторопши пятнистой. Действующими веществами силимарина являются флаволигнаны - силибин (два изомера), силидианин и силикристии, соотношение которых в препарате - 3:1:1. Силибин является основным изомером не только по количественному содержанию, но и по лечебному эффекту [Самигуллина Л.И., 2004].

Ж - дикарбоновая кислота, естественный метаболит организма, субстрат цикла Кребса. Является действующим веществом лекарственных препаратов применяемых дня нормализации митохондриальных процессов. При введении в организм оказывает влияние на активность быстрого метаболического кластера [Хазанов В .А., 2002].

Через сутки после последнего введения препаратов крыс декапитировали под легким эфирным наркозом. Для исследований использовали сыворотку крови, го-могенаты печени и поджелудочной железы.

Содержание в сыворотке крови глюкозы определяли натощак глюкозоокси-дазным методом, количество общего белка оценивали биуретовым методом, концентрацию общего холестерина выявляли энзиматическим колориметрическим методом, уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) измеряли с помощью стандартного набора «Vital Diagnostics» (Камышников B.C., 2003].

Функциональное состояние митохондрий печени оценивали полярографическим методом с помощью закрытого электрода Кларка лабораторного изготовления по скорости потребления кислорода в метаболических состояниях по Б. Чансу с учетом градации метаболических состояний [Кондрашова М.Н., 2000]. В качестве субстратов окисления использовали МО"3 М и 5-10"3 М сукцината, а также глутамат и малат по З-Ю"3 М. В работе использовали ингибитор аминотрансфераз — амипоок-сиацетат (АОА, 2-10"3 М), а также ингибитор сукцинатдегидрогеназы (СДГ) — ма-лонат (2-Ю"3 М). Во всех случаях указаны конечные концентрации в полярографической ячейке.

Регистрировали скорости дыхания митохондрий до (V4„), после (Vto) и во время (V3) цикла фосфорилнрования АДФ, добавленной до концентрации МО '1 М. Для характеристики энергетического статуса исполь зовали коэффициенты стимуляции дыхания (СД=Уз/У4„), дыхательного контроля (ДК V¡/V,¡„) и сопряженности окислительного фосфорилнрования (АДФ/О).

Функциональное состояние системы чнергопродукции оценивали на спек-трофлуориметре Hitachi М-850 (Хсх = 355 нм и Хе„, = 450 нм) по уровню восстаиов-ленности ниридшшуклеотидов, Среда инкубации и субстраты те же, что и при полярографическом методе анализа. Регистрировали уровень воссташшлешюсти ииридиннуклеотидов (условные единицы флуоресценции) при окислении эндогенных и экзогенных субстратов (метаболическое состояние F,|„), его изменение после добавления в среду инкубации 50 мкМ АДФ (переход ич метаболического состояния покоя а активное фосфоршшрующее состояние F* и затем и состояние отдыха F^,, т.е. переход Р4и -»Fj » F*,). Вычисляли время перехода митохондрий из метаболического состояния покоя в состояние отдыха (Тг), скорость перехода ич метаболического состояния активного фосфорилнрования в состояние отдыха (V).

Активность перекисного окисления липидои (ПОЛ) исследовшш по скорости образования спонтанного и аскорбатзавиеимого малонового диальдегида (МДА), содержанию диеновых конъюгатов и оснований Шиффа [Владимиров К).А., Арча-ков А,И., 1972].

Результаты обрабатывали статистически методом парных сравнений по непараметрическому критерию Вилкоксона - Манна - Уитни, обсуждаемые в работе различия достоверны при вероятности ошибочного вывода не более 5% (р<0,05). Результаты представлены в виде средней арифметической и ошибки средней арифметической.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Стрептозотоцин (Ы-[метинилнитрозокарбамоил]-В-глюкозамин) - производное нитрозомочевины, алкилирующее соединение, подавляет синтез ДНК и пролиферацию клеток. Воздействуя на мембранные структуры р-клеток островков поджелудочной железы, стрептозотоцин активирует ПОЛ. Это сопровождается повреждением структуры ДНК р-клеток, стимуляцией патологической активности поли-АДФ-рибозосинтетазы, ответственной за репликацию ДНК, повышением утилизации НАД+ с последующим истощением его запасов в клетке, что является причиной снижения синтеза белков, в том числе проинсулина. Одним из важнейших результатов модифицирующего действия свободных радикалов является изменение антигенной структуры р-клеток с последующим развитием аутоиммунного процесса. Первоначально снижается синтез инсулина, затем наступает тотальная гибель Р-клеток. Интоксикация стрептозотоцином моделирует патологические изменения» характерные для сахарного диабета [Cardinal J., 1999],

В группе экспериментальных животных, получавших стрептозотоцин, уровень глюкозы повышался втрое по сравнению с показателем интактных животных. Причинами гипергликемии являются превращение глюкозо-6-фосфатата в глюкозу, нарушение транспорта глюкозы в клетки инсулинзависимых тканей, усиление гликолиза и глюконеогснеза в результате блокады синтеза инсулина в р-клетках островков поджелудочной железы. На 2-е сут. после инъекции стрептозотоцина концентрация общего белка в сыворотке крови снижалась на 43%. При модели сахарного диабета аминокислоты используются для глюконеогенеза, ослабляется стимулирующее влияние инсулина на ферментные системы синтеза белков, ухудшается

энергообеспечение белкового синтеза. Содержание холестерина в сыворотке крови превышало норму в 1,5 раза, концентрация ЛПВП становилась меньше в 2 раза (рис. 1). Холестерин образуется из ацетилкоэнзима А, источником которого являются жирные кислоты, накапливающиеся в результате недостаточного их окисления в поврежденных стрептозотоцином митохондриях печени. Дефицит ЛПВП обусловлен ухудшением синтеза липопротеинов в печени.

Рисунок 1

Влияние силимярина и янтарной кислоты на биохимические показатели крови при экспериментальном сахарном диабете

Глюкоза, ммоль/л

Общий белок, г/л

70 -

| И

Ш Ш

Холестерин, ммоль/л ЛПВП, моль/л

Примечания к рисункам 1-2:

1 - шггактиые животные

2 - спустя 2 сут. после ведения етреттаотоцшта

3 - спустя 14 сут, после введения стрептозотоцииа

4 - терапия силимарииом

5 - терапия янтарной кислотой

Изменения достоверны (р<0,05):

* - по сравнению с показателями у интакгных животных

• - по сравнению с показателями на 2-е сут. после введения отрептозотоцина

по сравнению с показателями на 14-е сут, после введения стрептозотоцииа

Рисунок 2

Влияние силимарина и янтарной кислоты на показатели перекисного окисления липидов в поджелудочной железе и печени при экспериментальном сахарном диабете

ПОДЖЕЛУДОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА

Диеновые коньюгаты, ЕД/мг липидов

Основания Шиффа, отн. ед. на 1 мг липидов

А 5

МДА спонтанный, нмоль/мг белка-мин

1,е — 1,в

1,5 1 о,г о,в

О,' 0,5

МДА аскорбатаависимый, нмоль/мг белка-мин

3 4 5

ПЕЧЕНЬ

Диеновые коиьюгаты, ЕД/мг липидов

Основания Шиффа, отн. ед. на 1 мг липидов

МДА спонтанный, нмоль/мг белка-мин

МДА аскорбатзависимый, нмоль/мг белка-мин

3,6

з

2.5 2

1.6 1

0,5 О

3 2,6 2 1,8 1 0,6 О

1 2 3

4 5

1 г з

В нашем исследовании на 2-е сут. после введения строптозотоцина у крыс существенно увеличивалось содержание в гомогенате поджелудочной железы как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ. Содержание диеновых конъюгатои повышалось в 2,5 раза по сравнению с нормой, оснований Шнффа - в 1,3 раза. Скорость образования спонтанного МДА возрастала в 3,5 раза, продукция аскорбатзавнсимого МДА ускорялась в 3,8 раза. Подобные изменения развивались и в печени крыс, Содержание диеновых коныогатов в гомогенатах печени повышалось в 2,4 раза, оснований Шиффа - в 1,5 раза, Образование спонтанного и аскорбатзавнсимого МДА протекало в 2,3 раза интенсивнее, чем в норме (рис. 2). Стрептозотоцин обладает прямым прооксидантным действием, ингибирует ферменты аитноксидаптной защиты [Cardinal J., 1999], повышает концентрацию перекисей лшшдов в головном мозге,

печени, почках и крови [van Dam Р., 1998]. Кроме того, гипергликемия является благоприятным условием для развития процессов Г10Л. Окислительный стресс усиливается за счет аутоокисления избытка глюкозы и гликозилирования белков, в том числе ферментов антиоксидантной защиты [Чистяков Д.А, 2000]. Избыточное количество свободных радикалов кислорода выделяется активированными макрофагами и поврежденными р-клетками поджелудочной железы, р-клетки высокочувствительны к токсическому действию свободных радикалов кислорода, характеризуются слабой антиоксидантной защитой [Смирнова О.М., 1999].

На 2-е сут. после инъекции стрептозотоцина при окислении митохондриями печени в качестве субстрат экзогенного сукцината (1 мМ) дыхание в состояниях покоя, активного фосфорилировання добавленной АДФ и отдыха ускорялось на 82, 39 и 68% соответственно. Коэффициенты СД и ДК становились на 18 и 14% меньше, чем у интактных животных. При окислении митохондриями печени сукцината время фосфорилировання сокращалось на 48%. Расчетная величина коэффициента АДФ/О уменьшалась на 37% относительно данного показателя в норме (табл.1).

При окислении сукцината в митохондриях печени крыс, подвергнутых интоксикации стрептозотоцином, стационарные уровни восстановленности НАД-Н (Р4п, F3, F^0) снижались на 55,7%; 52,6%; 58,2% соответственно, скорость восстановления НЛД'Н (V), характеризующая утилизацию восстановительных эквивалентов дыхательной цепыо, уменьшалась на 64,1% (табл.2), Это подтверждает мнение о развитии деэнергизации в системе энергопродукции печени под действием стрептозотоцина. Повышение субстратной нагрузки на митохондрии при окислении сукцината (5 мМ) способствовало контрастированию рассмотренных выше изменений, вызываемых стрептозотоцином.

При окислении НАД-зависимых субстратов (малата и глутамата) на 2-е сут. после введения стрептозотоцина увеличивались скорости дыхания митохондрий в метаболических состояниях 4п, 3 и 4о на 46%, 39% и 101% соответственно при уменьшении времени фосфорилировання АДФ на 47%. Коэффициент ДК становился меньше на 30%, коэффициент АДФ/О увеличивался на 19% (табл. 1). Уровни флуоресценции НАД-Н F4n, F3, после инъекции стрептозотоцина снижались на

14

53, 50 и 54,2% относительно показателей нормы, восстановление НАД-Н замедлялось на 48,4% (табл.2).

Таблица 1

Влияние силимарииа и янтарной кислоты на окислительное фосфорилирование в гомогенате печени при экспериментальном сахарном диабете (Mim, п—10)

Показатель Интакгные Спустя 2 Спустя 14 Терапия Терапия ян-

животные сут. после сут. после силимари- тарной ки-

введения введения ном слотой

стрептозо- стрептозо-

тоцина тоцина

Окисление сукцината(1 мМ) 38,5-*1,72'3

v4n Зб,1±1,9 65,6:15,4 62,3±1,3 42,4:11,9'

v3 81,9±2,8 114,0±4,9' 115,6±5,8' 74,2±3,12,3 82,9*3,32,3

V40 38,7±1,б 64,9±4,3' 58,6±2,3' 40,9*1,22'3 43,б±1,32'3

АДФ/О 2,5б±0,14 l,63±0,ll' l,59±0,ll' 2,36*0,042'3 1,83±0,10'

Окисление НАД-зависимых субстратов (малат + глутамат)

V-to 22,Ш,4 32,4±1,9 30,Ш,3' 23,5:11,9'"'

v3 5б,5±1,4 78,5±2,51 75,3±2,7' 57,7*1,42'3 68,8*2,91"3

v4a 17,5±1,9 35,1*1,7* 32,9±1,8' 21,8±1Д2'3 24,0=fcl,71™3

АДФ/О 2,16:10,10 2,57±0,10' 2,53^0,05' 1,99±0,082'3 2,690:0,071

Окисление НАД-зависимых субстратов в присутствии малоната

v„„ 16,3±1,7 34,2±1,6 39,6±1,0 20,2*1,1 ' 17,6*1,6

Vj 42,9±2,2 77,714,9' 76,7*4,11 45,4:1:2,2®'"' 44,9*3,12'3

v<0 17,б±1,б 33,1*1,3' 31,0±1,7' 23,712,8'''! 17,411 .б'^'1

АДФ/О 1,9010,08 2,31^=0,12' 2,69±0,07' l,68*0,15w 2,55*0,111

Окисление НАД-зависимых субстратов в присутствии иминооксиацетата

v„„ 18,311,8 32,7±2,4 31,1±1,5 17,0*1,4* 23,6*1,6 '

v3 56,712,1 87Д±6,3' 85,3±4,11 55, б±1,9а'л 51,813,'Я

V.„, 20,8±1,2 32,51.2,11 29,5±1,9' 22,5* U2'3 20,8.1.1,Зг";1

АДФ/О 2,03±0,05 2,38±0,10' 2,63±0,10' г^-ор2-' 2j34-.i0.081

Примечание к таблицам 1-2, Изменения доетоверци (р<0,05): ' - по отношению к иитактным животным; г - но отношению к стрептозотоцину;

а - по отношению к стрептозотоцииу спустя 14 дней после инъекции, В таблице I скорости дыхания V], У4„) вычислены в шшенрамм-лтом О/мии/мг белка митохондрий.

Таблица 2

Влияние силимарина и янтарной кислоты на показатели, характеризующие восстановление НАД'Н в гомогснате печени крыс при экспериментальном сахарном диабете (Мьтя, п=10)

Показа- Интактиые Спустя 2 Спустя 14 Терапия си- Терапия ян-

тель животные сут. после сут. после лимарином тарной ки-

введения введения слотой

стрептозо- стрептозо-

тоцина тоцина

Окисление сукцината (1 мМ) 0,61*0,013

Р<1п 0,70±0,05 0,31±0,0Г 0,83±0,03 0,71*0,04

Р3 0,57±0,06. 0,27*0,01' 0,70±0,032 0,63±0,02 0,49±0,06

И^о 0,б7±0,0б 0,28±0,011 0,75±0,042 0,69*0,02 0,55*0,03

Тг,с 13,00±2,41 10,50±4,42 9,00±2,64 11,00*2,41 16,00*2,41

V 8,99±1,25 3,23±0,4б' 10,03±1,5б2 б,75±2,41 б,85±2,02

Окисление НАД-зависимых субстратов (малат + глутамат)

Р„„ 0,62±0,03 0,29±0,02 0,68±0,01 0,67±0,04 0,69*0,04

Из 0,52±0,02 0,26±0,01! 0,61±0,022 0,59±0,02 0,58±0,03

Р4о 0,59±0,02 0,27±0,01' 0,65±0,032 0,62±0,03 0,61±0,03

Тг, с 10,00±1,20 10,50*1,47 9,00*1,20 11,00*1,20 8,00±2,41

V 9,54^1,07 4,92±0,бЗ' 7,70±1,222 9,39*1,46 8,63±1,88

Окисление НАД-зависимых субстратов в присутствии малоната

Р<1г| 0,5б±0,01 0,28±0,02 0,68*0,02 0,65±0,04 0,63±0,03

Р3 0,49^:0,02 0,23±0,011 0,58±0,012 0,55±0,02 0,54±0,03

0,54±0,02 0,2б±0,01' 0,63±0,022 0,59*0,02 0,58±0,06

Тг, с 12,00*2,08 7,50±1,47' 12,00*3,022 10,00*1,20 10,00*2,41

V 9,62±0,63 3,47±1,42' 6,15*1,05'" 9,05±1,623 8,24*3,63

Окисление НАД-зависимых субст затов в присутствии аминооксиацетата

Р4п 0,49±0,01 0,28±0,02 0,61*0,03^ 0,60±0,03 0,53±0,03

Рз 0,41±0,01 0,25±0,01' 0,51±0,012 0,49±0,03 0,44*0,05

Р«|о 0,47:1:0,01 0,27-Ь0,011 0,57:1:0,012 0,52*0,03 0,49*0,05

Тг, С 18,00^.5,89 9,00*0,45' 0,57±0,012 16,00*2,41 21,00*2,08

V 6,_50±1,33 3,Й9:Ы,43' 6,88*0,842 6,70*1,59 4,9810,613

Примечание: в таблице 2 уровни восстаиовлешшсти ииридиинуклеатидон (1г4П, Рь Е|0) выражены в условных единицах флуоресценции, скорость перехода из метаболического состояния активного фосфорилиронания в состояние отдыха (V) обозначено в условных единицах флуоресцеиции/с.

Ингибиторный анализ НАД-зависимого дыхания митохондрий печени с при' менением конкурентного ингибитора СДГ малоната выявил увеличение вклада эндогенного сукцината в энергопродукцию и рост параметров избирательного НАД-зависимого дыхания. Скорости дыхания увеличились (У4п - на 100%, У3 - на 81%,

16

У^р- на 111%) при сокращении времени фосфорилироваиия добавленной АДФ на 38%. Коэффициенты СД и ДК в этом эксперименте снижались на 14 и 17%, коэффициент АДФ/О возрастал на 21% (табл. 1). Такие изменения свидетельствуют о гиперактивном состоянии митохондрий.

Внесение ингибитора аминотрансфераз АОА в среду инкубации митохондрий, окисляющих НАД-зависимые субстраты, продемонстрировало увеличение по сравнению с нормой скоростей дыхания У4п, У3 и на 79%, 54% и 56% соответственно и уменьшение коэффициента СД на 13% (табл. 1). При этом повышался вклад реакций переаминирования в продукцию эндогенного сукцината, Полученные данные свидетельствуют о доминировании быстрого метаболического кластера митохондрий в энергопродукции при интоксикации стрептозотоцином.

Вероятно, нарушение энергетического метаболизма при модели сахарного диабета связано с повышением проницаемости мембран митохондрий печени для Н+ и разобщением окислительного фосфорилирования. Эти изменения могут быть обусловлены предшествующей генерацией активных форм кислорода под влиянием стрептозотоцина.

На 14-е сут. после однократной инъекции стрептозотоцина биохимические показатели крови и интенсивность ПОЛ в гомогенатах поджелудочной железы и печени оставались такими же, как на 2-е сут. после интоксикации (рис. 1, 2), Это указывает на то, что выявленные отклонения связаны не только с непосредственным токсическим воздействием стрептозотоцина, но и с глубокими патологическими процессами в организме.

Через 14 дней после введения стрептозотоцина снижались скорости дыхания митохондрий при окислении сукцината (1, 5 мМ) в сочетании с увеличением коэффициента АДФ/О на 41% по сравнению с показателями, регистрируемыми на 2-е сут. после введения панкреотоксииа (табл. 1). Окислительное фосфорилирование оставалось разобщенным. Переход окисленной формы НАД4 в восстановленную (V), ускорялся по сравнению с нормой в 3,1 раза, также значительно возрастали показатели стационарных уровней восстановления НАД'Н до, во время и после окисления АДФ на 15%, 19% и 11 % соответственно (табл. 2),

17

При окислении НАД-зависимых субстратов митохондриями печени на 14-й день после введения стрептозотоцина скорости контролируемого дыхания У4п и снижались на 38% и 35% соответственно относительно показателей, измеряемых в ранний период интоксикации. Коэффициент ДК повышался (табл. ]). Это указывает' на развитие репаративных процессов в митохондриях и рост вклада НАД-зависимого окисления в продукцию АТФ.

Под воздействием гепатопротектора-антиоксиданта силимарина, содержащего флаволигнаны, концентрация глюкозы в крови снижалась на 44,4% относительно ее содержания у животных на 2-е сут. после введения стрептозотоцина, но не достигала показателя нормы. Силимарии частично нормализует углеводный обмен, но не способен устранить дефицит инсулина, вызванный гибелью р-клеток островков поджелудочной железы. Применение силимарина также позволяло снижать содержание холестерина в крови на 31% и повышать концентрацию ЛПВП на 57,2% (рис, 1), Под влиянием силимарина улучшается метаболизм липолротеииов, угнетается синтез холестерина в печени и окисление липопротеинов низкой плотности [Шульпекова Ю.О., 2004]. При применении силимарина концентрация белка повышалась иа 38,4% (рис. 1), Силимарин частично нормализует синтез белка. Активируя РИК-полимеразу в клеточном ядре, препарат повышает транскрипцию и скорость синтеза РНК в печени. Усиленный синтез рибосомальной РНК приводит к увеличению количества рибосом и интенсивному образованию структурных и функциональных белков [Королева Д.Р., 2005].

При лечении силимарииом значительно менее интенсивно протекало ПОЛ (рис. 2). В поджелудочной железе уровень диеновых конъюгатов снижался иа 48,5 50,2% относительно содержания этих первичных продуктов ПОЛ в ранней и поздней стадии интоксикации стрептозотоцином, Количество оснований Шиффа уменьшалось на 20% по сравнению с показателем при ранней стадии интоксикации и на 30,6% по сравнению с их содержанием через 14 сут. после введения панкрео-токсина. Под влиянием гепатопротектора силимарина образование спонтанного и аскорбатзависисмого МДА замедлялось на 45,2% и 33% соответственно относительно показателей, регистрируемых на 2-е сут. после однократной инъекции

18

стрептозотоцина. Продукция спонтанного МДА тормозилась на 47,2%, аскорбатза-висимого МДА - на 63% то сравнению с интенсивностью лидапероксидации в отдаленный период модели сахарного диабета. Введение силимарина также нормализовало процессы ПОЛ в печени. Уровень диеновых конъюгатов снижался на 39,846,8%, количество оснований Шиффа становилось меньше на 29-36,1%, образование спонтанного МДА замедлялось на 39,9-44,6%, аскорбатзависимого МДА - на 38,5-46,2%.

Введение крысам силимарина в течение 14 дней после инъекции стрептозотоцина вызывало снижение до нормы скоростей дыхания митохондрий печени в состояниях покоя и фосфорилирования АДФ при утилизации сукцината (1, 5 мМ). Коэффициенты, характеризующие сопряженность окислительного фосфорилирования (СД, ДК, АДФ/О), уменьшались (табл. 1). Восстановление НАД-П митохондриями печени значительно замедлялось. Это свидетельствует о неспособности силимарина устранять вызываемую стрептозотоцином деэнергизадию митохондрий печени.

Такое предположение подтверждает анализ дыхания митохондрий при окислении НАД-зависимых субстратов. У животных, защищенных силимарином, при снижении по сравнению с нормой скоростей поглощения кислорода митохондриями печени во всех метаболических состояниях, коэффициент АДФ/О уменьшался на 29% (табл. I). Скорость восстановления НАД'Н и стационарные уровни восстановленное™ НАД1 нормализовались (табл. 2). йигибиториый анализ дыхания митохондрий печени крыс, получавших силимарин, с применением малоната и АОА позволил установить сохранение на шшштюм уровне показателей окисления и продукции эндогенного сукцината, хотя это не сопровождалось изменением характера окислительного фосфорилирования (табл. 1),

При введении крысам ЯК уровень глюкозы в сыворотке крови снижался на 36%. Инсулинотропный эффект ЯК связан с существенным увеличением активности СДГ, при этом установлено, что синтез инсулина под воздействием ЯК обусловлен усилением метаболических процессов в островковой ткани поджелудочной железы, Рост секреции инсулина р-клетками обеспечивается за счет стимуляции №+,К+-аминотрансферазы, активность которой не зависит от концентрации глюко-

19

зы во внеклеточной среде. Применение ЯК позволило также значительно снизить уровень холестерина в крови крыс на 14-е сут. после введения стрептозотоцина, что обусловлено вовлечением жирных кислот в процессы р-окисления. При этом в крови повышался уровень ЛПВП, находящихся в контрафазном отношении с ате-рогенными липидами. На фоне применения ЯК в течение 14 сут. концентрация общего белка увеличивалась на 32% (рис. 1). ЯК, устраняя дефицит а-кетоглутаровой кислоты, восстанавливает тканевое дыхание и синтез АТФ в клетках, улучшает энергообеспечение белковосинтетической функции печени.

Под влиянием ЯК снижалась активность процессов ПОЛ. В поджелудочной железе уровень диеновых копъюгатов снижался на 37,2% относительно показателя при острой интоксикации и на 39,4% относительно показателя на 14 сут. эксперимента. Содержание оснований Шиффа становилось меньше на 17,6-28,6%. Образование спонтанного МДА замедлялось на 42,7-44,8%. Продукция аскорбатзависи-мого МДА тормозилась на 44,8%-38,4% относительно показателей, регистрируемых у животных в ранней и поздней стадиях экспериментального сахарного диабета (рис. 2). В печени процессы ПОЛ при терапии ЯК также нормализовались. Уровень диеновых копъюгатов снижался на 34,9-42,4%, количество оснований Шиффа уменьшалось на 22,8-30,4%, образование спонтанного МДА замедлялось на 23,229,3%, аскорбатзависимого МДА - на 30-39%.

При интоксикации стрептозотоцином регулятор энергетического обмена ЯК нормализовала показатели окислительного фосфорилирования в митохондриях печени во всех метаболических состояниях. Так, при окислении сукцината (1, 5 мМ) восстанавливались до нормы скорости дыхания митохондрий. Коэффициент АДФ/О сохранялся сниженным. Судя по величине коэффициентов СД и ДК, это указывает на доминирование сукцинатзависимых процессов в энергопродукции (табл. 1). При окислении НАД-зависимых субстратов скорости дыхания митохондрий в состояниях Уд и У^о превышали скорости, регистрируемые у интактных животных. Показатели сопряженности окисления и фосфорилирования - коэффициенты СД, ДК, АДФ/О также увеличивались, что отражает преобладание роли окисления НАД-зависимых субстратов в продукции АТФ. Ингибиторный анализ дыха-

20

ния митохондрий печени крыс, получавших ЯК, свидетельствует о значительном вкладе образования и окисления эндогенного сукцината в энергопродукцгао по сравнению с сукцинатзависимыми процессами у животных через 14 сут. после введения стрептозотоцина (табл. 1). Стационарные уровни восстановлеиности НАД'Н и кинетические характеристики - скорость и время восстановления НАД1, в группе животных получавших ЯК достигали значений, выявленных у интакгаых животных. Такие изменения указывают на развитие репаративных процессов за счет активации быстрого метаболического кластера митохондрий.

Полученные результаты подтверждают целесообразность применения гепатопротекторов и регуляторов энергетического обмена в комплексной терапии сахарного диабета. Регулятор энергетического обмена ЯК при интоксикации стрептозотоцином обладает более выраженными положительными метаболическими эффектами, чем гепатопротектор силимарин. Судя по полученным данным, при моделировании сахарного диабета стратегия прямой антиоксидантной защиты клеток, может проигрывать в сравнении со стратегией регуляции митохондриального окисления.

ВЫВОДЫ

1. Стрептозотоцин при однократном внутрибрюшинном введении крысам приводит к изменениям биохимических показателей крови, характерным для сахарного диабета (повышение концентраций глюкозы и общего холестерина, снижение содержания общего белка и липопротеинов высокой плотности), активации процессов нерекисного окисления липидов в поджелудочной железе и печени, а также к стойким нарушениям дыхания в митохондриях печени, что проявляется значительным ростом скоростей дыхания во всех метаболических состояниях, снижением коэффициентов стимуляции дыхания и дыхательного контроля, сокращением времени фосфорилированид добавленной АДФ и разобщением окисления и фосфори-лирования.

2. Гепатопротектор силимарии и регулятор энергетического обмена янтарная кислота при курсовом введении внутрь на фоне интоксикации стрептозотоцином

препятствует развитию гипергликемии, гииерхолестеринемии, гипопротеииемии, снижению содержания липонротеинов высокой плотности в крови, тормозят продукцию диеновых конъюгатов, оснований Шиффа и малонового диальдегида в го-могенатах поджелудочной железы и печени.

3. Силимарин на фоне интоксикации стрептозотоцином уменьшает до нормы скорости дыхания митохондрий печени во всех метаболических состояниях, коэффициенты стимуляции дыхания и дыхательного контроля, ускоряет фосфорилиро-вание добавленной АДФ; при этом сохраняется частичное разобщение окисления и фосфорилирования.

4. Янтарная, кислота при интоксикации стрептозотоцином уменьшает до нормы скорости дыхания митохондрий печени во всех метаболических состояниях, коэффициенты стимуляции дыхания и дыхательного контроля, нормализует время фосфорилирования добавленной аденозиндифосфорной кислоты и коэффициент сопряженности окисления и фосфорилирования.

5. Повышение резистентности к нагрузке быстрого метаболического кластера митохондрий печени с помощью метаболита цикла Кребса янтарной кислоты оказывает более выраженный метаболический эффект при модели сахарного диабета, вызванной введением стрептозотоцина, чем антиоксидшгпюе действие флавоноида силимарина.

Перечень работ, опубликованных по теме диссертации

1. Эскина К.А,, Васильев К.Ю., Хазанов В.А. Влияние янтаря-антитокса на функциональное состояние митохондрий печепи при экспериментальном сахарном диабете // XIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тез. докл. - Москва, 2006. - С.60-65.

2. Эскина К.А., Васильев К.Ю. Влияние янтаря-ангитокса и силимарина на окислительное фосфорилирование и перекисное окислергае лшшдов в печени крыс при экспериментальном сахарном диабете // Бюллетень сибирской медицины, -2006. - №2. - С. 101-107.

3. Эскина К.А, Антиоксидаятное действие силимарина при экспериментальном сахарном диабете // Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.Н. Березнеговской.-Томск, 2006. ■ С.374-378.

4. Эскина К.А. Влияние силимарина на окислительное фосфорилирование и перекисное окисление липидов при экспериментальном сахарном диабете // Науки о человеке: Сборник статей молодых ученых и специшшстов. - Томск, 2006. -С. 151-152, '

5. Эскииа К.А. Влияние силимарина па перекисное окисление липидов в печени крыс при экспериментальном сахарном диабете // Многопрофильная больница: проблемы и решения: Тезисы докладов И Всероссийской научно-практической конференции. - Ленинск-Кузыецкий, 2006. - С. 44-45.

- 92 7 9

2007509803

Издательство ФГУ "Томский ЦНТИ". Лиц. ИД № 05060 от 14.06.2001 г. Отпечатано в ФГУ "Томский ЦНТИ". Лиц.ПД № 12-0084 от 16.04.2001 г.

_Подписано в печать 9.04.2007 г. Заказ № 177. Тираж 100 экз._

Россия, 634021, г.Томск, ир.Фрунзе, 115/3.

2007509803

Актуальность проблемы.

Сахарный диабет - хроническое метаболическое заболевание, характеризующееся гипергликемией вследствие дефекта секреции инсулина, нарушения его активности или сочетания обеих причин и приводящее к патологии обмена веществ, поражению сосудов, нервной системы и патологическим изменениям в различных органах и тканях. В структуре летальности среди хронических неинфекционных заболеваний сахарный диабет занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. В промышленно развитых странах данным заболеванием страдают 610% населения, что можно оценить как «пандемия». Распространенность сахарного диабета имеет четкую тенденцию к увеличению, в первую очередь в возрастных группах старше 40 лет. Каждые 15 лет число больных сахарным диабетом удваивается. Это происходит в основном за счет роста количества больных сахарным диабетом типа 2. По данным ВОЗ в 2003 г. в мире насчитывалось около 80 млн больных, в 2005 г. - около 200 млн, к 2010 г. в мире ожидается более 230 млн больных [84].

Известно, что при сахарном диабете страдают все виды обмена веществ: вследствие нарушения проникновения глюкозы в клетку развивается стойкая гипергликемия, резко снижается синтез белка, замедляется тканевое дыхание, нарушается продукция АТФ, повышается образование кетоновых тел и триглицеридов в печени, в результате генерации большого количества свободных радикалов образуются и накапливаются высокотоксичные липоперекисные соединения. Эти метаболические нарушения являются причиной развития таких осложнений, как ангиопатия, ретинопатия, периферическая нейропатия, жировая инфильтрация печени [43].

Несмотря на постоянное внимание к вопросам повышения эффективности лечения сахарного диабета, эта проблема остается актуальной. В современной фармакотерапии сахарного диабета применяют инсулин и другие сахаропонижающие средства (производные сульфонилмочевины, бигуаниды, ингибиторы а-глюкозидазы, сенситайзеры инсулина и др.) [53]. Данные препараты регулируют утилизацию глюкозы клеткой.

В патогенезе сахарного диабета большое значение придается процессам перекисного окисления липидов [84]. Кроме того, образование большого количества липоперекисей и повреждение путей метаболизма при сахарном диабете приводят к нарушению биоэнергетики. В этой связи представляет несомненный интерес изучение метаболического статуса митохондрий на фоне развития экспериментального сахарного диабета (введение стрептозотоцина) и при коррекции его с помощью гепатопротектора с антиоксидантным действием силимарина, а также регулятора энергетического обмена янтарной кислоты.

Цель работы.

Изучение метаболических нарушений при экспериментальном сахарном диабете и возможности их коррекции гепатопротектором силимарином и регулятором энергетического обмена янтарной кислотой.

Задачи исследования.

1. Изучить метаболические нарушения, определяющие патогенез экспериментального сахарного диабета, — изменения содержания в крови глюкозы, белка, холестерина и липопротеинов высокой плотности, процессов перекисного окисления липидов в поджелудочной железе и печени и функционального состояния митохондрий печени крыс через 2 и 14 сут. после инъекции стрептозотоцина.

2. Оценить влияние гепатопротектора силимарина на биохимические показатели крови, процессы перекисного окисления липидов в поджелудочной железе и печени и энергопродукцию в печени крыс при экспериментальном сахарном диабете.

3. Оценить влияние регулятора энергетического обмена янтарной кислоты на биохимические показатели крови, липопероксидацию в поджелудочной железе и печени и энергопродукцию в печени крыс при экспериментальном сахарном диабете.

4. Оценить значение антиоксидантного эффекта силимарина и влияния янтарной кислоты на функцию быстрого метаболического кластера митохондрий печени для реализации терапевтического действия препаратов при модели сахарного диабета, вызванной введением стрептозотоцина.

Научная новизна работы.

Впервые изучены нарушения обмена энергии в митохондриях печени крыс в раннем и позднем периодах развития модели сахарного диабета, вызванной внутрибрюшинным введением стрептозотоцина. Показано, что в патогенезе экспериментального сахарного диабета имеет значение нарушение энергетического метаболизма в митохондриях печени, обусловленное разобщением окисления и фосфорилирования.

Впервые изучено действие гепатопротектора силимарина и регулятора энергетического обмена янтарной кислоты на биохимические показатели крови, перекисное окисление липидов в поджелудочной железе и печени и обмен энергии в митохондриях печени крыс с моделью сахарного диабета. Силимарин как активный антиоксидант значительно тормозит липопероксидацию, в меньшей степени улучшает митохондриальные процессы биоэнергетики. Янтарная кислота, оптимизируя процессы митохондриального окисления, оказывает более выраженный терапевтический эффект.

Практическая значимость работы.

Полученные данные расширяют существующее представление о механизмах нарушения обмена веществ при сахарном диабете. В частности, показано, что у животных с экспериментальным сахарным диабетом нарушается энергетический обмен в печени.

Гепатопротектор силимарин нормализует биохимические показатели крови, ингибирует процессы перекисного окисления липидов и оказывает лишь незначительное воздействие на нарушенный энергетический обмен. Янтарная кислота восстанавливает биохимические показатели крови, подавляет перекисное окисление липидов, полностью нормализует энергетический обмен в митохондриях печени при интоксикации стрептозотоцином. Результаты экспериментальной терапии свидетельствуют о целесообразности клинических исследований силимарина и янтарной кислоты в качестве средств комплексной терапии сахарного диабета. Положения, выносимые на защиту:

1. Стрептозотоцин вызывает у крыс нарушения биохимических показателей крови, характерные для сахарного диабета. При развитии модели сахарного диабета повышается продукция первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов в поджелудочной железе и печени. Нарушение энергетического обмена в митохондриях печени проявляются ростом скоростей дыхания во всех метаболических состояниях, снижением коэффициентов стимуляции дыхания и дыхательного контроля, сокращением времени фосфорилирования добавленной АДФ и разобщением окислительного фосфорилирования.

2. Гепатопротектор силимарин при введении в течение 14 сут. после инъекции стрептозотоцина нормализует биохимические показатели крови, подавляет липопероксидацию, но лишь частично устраняет нарушения митохондриальных процессов обмена энергии в печени.

3. Регулятор энергетического обмена янтарная кислота при применении в течение 14 сут. после введения стрептозотоцина нормализует биохимические показатели крови и процессы липопероксидации, полностью устраняет нарушения энергетического обмена в митохондриях печени.

Апробация работы.

Основные положения диссертации представлены на XIII Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора JI.H. Березнеговской (Томск, 2006), VII международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения» (Ленинск-Кузнецкий, 2006).

Публикации.

Материалы диссертации опубликованы в 5 научных статьях и материалах конференций, в том числе 1 статья опубликована в журнале, рекомендованном ВАК РФ для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения, выводов, библиографического указателя. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 таблицами и 2 рисунками. Библиографический указатель включает 167 источников, из которых 45 -публикации иностранных авторов.

104 ВЫВОДЫ

1. Стрептозотоцин при однократном внутрибрюшинном введении крысам приводит к изменениям биохимических показателей крови, характерным для сахарного диабета (повышение концентраций глюкозы и общего холестерина, снижение содержания общего белка и липопротеинов высокой плотности), активации процессов перекисного окисления липидов в поджелудочной железе и печени, а также к стойким нарушениям дыхания в митохондриях печени, что проявляется значительным ростом скоростей дыхания во всех метаболических состояниях, снижением коэффициентов стимуляции дыхания и дыхательного контроля, сокращением времени фосфорилирования добавленной АДФ и разобщением окисления и фосфорилирования.

2. Гепатопротектор силимарин и регулятор энергетического обмена янтарная кислота при курсовом введении внутрь на фоне интоксикации стрептозотоцином препятствует развитию гипергликемии, гиперхолестеринемии, гипопротеинемии, снижению содержания липопротеинов высокой плотности в крови, тормозят продукцию диеновых конъюгатов, оснований Шиффа и малонового диальдегида в гомогенатах поджелудочной железы и печени.

3. Силимарин на фоне интоксикации стрептозотоцином уменьшает до нормы скорости дыхания митохондрий печени во всех метаболических состояниях, коэффициенты стимуляции дыхания и дыхательного контроля, ускоряет фосфорилирование добавленной АДФ; при этом сохраняется частичное разобщение окисления и фосфорилирования.

4. Янтарная кислота при интоксикации стрептозотоцином уменьшает до нормы скорости дыхания митохондрий печени во всех метаболических состояниях, коэффициенты стимуляции дыхания и дыхательного контроля, нормализует время фосфорилирования добавленной аденозиндифосфорной кислоты и коэффициент сопряженности окисления и фосфорилирования.

5. Повышение резистентности к нагрузке быстрого метаболического кластера митохондрий печени с помощью метаболита цикла Кребса янтарной кислоты оказывает более выраженный метаболический эффект при модели сахарного диабета, вызванного введением стрептозотоцина, чем антиоксидантное действие флавоноида силимарина.

106

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сахарный диабет - эндокринное заболевание, характеризующееся синдромом хронической гипергликемии. На сегодняшний день сахарный диабет называют «неинфекционной эпидемией», которая охватила более 150 млн человек в мире (к 2010 году прогнозируется 220 млн больных). Только в России сахарным диабетом болеют 8 млн. человек [10].

При сахарном диабете возникают недостаточная продукция (сахарный диабет I типа) или дефект действия инсулина (сахарный диабет II типа), что приводит к нарушению всех видов обмена веществ, и, прежде всего, углеводного обмена, развитию ангиопатии, нейропатии и поражению других органов и систем. Инсулин участвует в регуляции ряда клеточных процессов (биоэнергетика, трансмембранный перенос ионов, аминокислот, синтез и распад белков). При диабете нарушается поступление глюкозы в клетку инсулинзависимых тканей; снижается активность основных ферментов аэробного гликолиза, цикла Кребса, нарушается образование энергии, развиваются энергетический дефицит, гипоксия клеток; усиливаются гликогенолиз и глюконеогенез, а также превращение глюкозо-6-фосфата в глюкозу. Кроме того, активируются пути метаболизма глюкозы, независимые от инсулина: полиоловый, глюконатный и гликопротеиновый. Это является причиной развития нейропатии и поражения сосудов. Нарушение метаболизма белка ведет нарушению пластических процессов в организме, замедлению заживления ран, снижению устойчивости к инфекциям [7]. Недостаток инсулина приводит к снижению поступления глюкозы в жировую ткань. Нарушается образование липидов из углеводов, накапливаются в избыточном количестве кетоновые тела, развивается гиперхолестеринемия, создаются предпосылки для жировой инфильтрации печени [22].

При сахарном диабете развивается окислительный стресс, вызываемый свободными радикалами кислорода. У больных резко ухудшаются антиокислительные свойства крови; при экспериментальном сахарном диабете снижается активность ферментов антиокислительной защиты, повышается концентрация липоперекисей в мозге, печени, почках и крови.

Изменения, подобные сахарному диабету, можно вызвать в эксперименте при применении срептозотоцина. Стрептозотоцин — аклилирующее соединение, производное нитрозомочевины, подавляет синтез ДНК и пролиферацию клеток, активирует поли-АДФ-рибозосинтетазу -фермент, использующий НАД* в качестве субстрата [77, 130].

В группе экспериментальных животных, получавших стрептозотоцин, на 2 сут. после его введения повышался уровень глюкозы в крови. Очевидно, гипергликемия обусловленна снижением синтеза инсулина поврежденными /3-клетками островков поджелудочной железы. Причинами гипергликемии являются активное превращение глюкозо-6-фосфата в глюкозу, нарушение поступления глюкозы в клетки инсулинзависимых тканей, усиление гликогенолиза и глюконеогенеза. Потребление большого количества аминокислот для процессов глюконеогенеза усиливает распад белков при сахарном диабете. Синтез белка нарушается также в связи с потерей стимулирующего влияния инсулина на соответствующие ферментные системы, недостаточным уровнем энергетического обмена и уменьшением поступления аминокислот в клетку. В эксперименте уже на 2 сут. после введения стрептозотоцина отмечалось выраженное снижение концентрации общего белка в сыворотке крови. Развитие сахарного диабета у экспериментальных животных сопровождалось изменением содержания холестерина в сыворотке крови. В частности, значительно повышалось его содержание, как на 2-е, так и на 14-е сут. после введения стрептозотоцина. Это обусловлено усилением синтеза холестерина из ацетил-КоА, количество которого в условиях недостатка инсулина резко возрастает [78]. Нарушение липидного обмена у животных со стрептозотоциновым сахарным диабетом сопровождалось достоверным снижением уровня ЛПВП как в ранний, так и в поздний период интоксикации. Как известно, синтез ЛПВП осуществляется преимущественно в печени [53], поэтому можно предположить, что уменьшение их содержания в сыворотке крови животных с экспериментальным сахарным диабетом обусловлено повреждением печеночных клеток и нарушением их синтетической функции. Последнее может быть следствием активации процессов ПОЛ и повреждающего действия свободных радикалов на мембраны гепатоцитов.

Стрептозотоцин обладает прямым прооксидантным действием. При экспериментальном сахарном диабете выявлено снижение активности ферментов антиокислительной защиты в мозге крыс и мышей [146], повышение концентрации перекисей липидов в мозге, печени, почках и крови [165]. В нашем исследовании был подтвержден механизм повреждающего действия стрептозотоцина, связанный с усилением ПОЛ. На 2-е и 14-е сут. после введения данного панкреотоксина у крыс существенно увеличивалось содержание в поджелудочной железе как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ. Аналогичные изменения развивались и в печени крыс. Кроме того, следует иметь ввиду, что сама гипергликемия является благоприятным условием для развития процессов ПОЛ, так как окислительный стресс усиливается за счет аутоокисления избытка глюкозы и гликозилирования белков, в том числе ферментов антиоксидантной защиты [133,166, 112, 156].

Избыточное количество свободных радикалов кислорода выделяется активированными макрофагами и поврежденным /3-клетками поджелудочной железы. /З-Клетки необычайно чувствительны к токсическому действию свободных радикалов кислорода, и процессы ПОЛ наиболее выражены в клетках островков Лангерганса. Островковые клетки имеют слабую антиоксидантную защиту и особенно уязвимы для свободных радикалов, что является одной из причин их лизиса при сахарном диабете [94,127].

Изучение обмена энергии и функционального состояния митохондрий позволило выявить следующие особенности биоэнергетики при экспериментальном сахарном диабете. После введения стрептозотоцина митохондрии печени крыс характеризовались при окислении сукцината повышением скоростей дыхания до, во время и после фосфорилирования АДФ. Коэффициенты СД и ДК снижались, что указывает на активацию сукцинатзависимой энергопродукции в митохондриях печени крыс при токсическом воздействии стрептозотоцина. При окислении НАД-зависимых субстратов после введения животным стрептозотоцина увеличивались скорости дыхания митохондрий в состояниях 4п, 3 и 4о. Коэффициент ДК уменьшался, коэффициент АДФ/О становился больше, чем в норме. Ингибиторный анализ НАД-зависимош дыхания митохондрий печени с применением конкурентного ингибитора СДГ малоната выявил увеличение параметров избирательного НАД-зависимого дыхания и вклада эндогенного сукцината в энергопродукцию, что подтверждает гиперактивное состояние митохондрий. Внесение АОА в среду инкубации митохондрий, окисляющих НАД-зависимые субстраты, продемонстрировало увеличение по сравнению с нормой скорости дыхания и уменьшение коэффициента СД. При этом повышался вклад реакций переаминирования в продукцию эндогенного сукцината. Полученные данные свидетельствуют о доминировании быстрого метаболического кластера митохондрий [103] в энергопродукции в условиях развития экспериментального стрептозотоцинового сахарного диабета.

Характер выявленных изменений в системе энергопродукции печени указывает на наличие гиперкомпенсированного низкоэнергетического сдвига, очевидно, связанного с повышением проницаемости мембран митохондрий для Н* и разобщением окислительного фосфорилирования [103, 125]. Изменения обусловлены предшествующей генерацией активных форм кислорода под действием стрептозотоцина.

Через 14 дней после введения стрептозотоцина снижались скорости дыхания митохондрий при окислении сукцината в сочетании с увеличением коэффициента АДФ/О по сравнению с показателями, измеренными у животных на 2-е сут. после введения панкреотоксина, однако сопряженность окислительного фосфорилирования не достигала нормальных значений. При окислении НАД-зависимых субстратов митохондриями печени на 14-й день после введения стрептозотоцина скорости контролируемого дыхания (V4n и V4o) снижались относительно показателей непосредственно после интоксикации, коэффициент ДК повышался. Это указывает на наличие репаративных процессов в митохондриях и рост вклада НАД-зависимого окисления в продукцию АТФ. Вместе с тем, интенсивность липопероксидации в печени сохранялась такой же, как на 2-е сут. после интоксикации.

Сахарный диабет является эндокринным заболеванием, при котором особенно часто и тяжело поражается печень, что отрицательно влияет на течение и прогноз данного заболевания. По данным В.И. Зайчиковой морфофункциональные нарушения в печени возникают у 30-100 % больных диабетом. В работах других авторов «диабетическая гепатопатия» встречается у 60-80 % больных [121, 123, 151]. Поражение печени при сахарном диабете обусловлено инсулиновой недостаточностью [123], которая приводит к уменьшению содержания гликогена в печени, мобилизации жира из депо, избыточному поступлению в печень свободных жирных кислот. Развивается жировой гепатоз, являющийся прямым следствием нарушения липидного обмена, снижения синтеза и транспорта липопротеинов, избыточного освобождения нейтрального жира [114]. По мнению многих авторов [159, 160] стимуляция ПОЛ является одним из основных механизмов поражения печени как в клинике, так и в эксперименте. При этом установлена положительная корреляция между степенью активации ПОЛ и выраженностью сахарного диабета [159]. Учитывая собственные данные и данные литературы, свидетельствующие о том, что важным патогенетическим механизмом повреждения печеночных клеток при сахарном диабете является активация ПОЛ [6, 150], нами была предпринята попытка экспериментальной терапии стрептозотоцинового диабета с помощью гепатопротектора силимарина, обладающего выраженным антиоксидантным действием [116]. Под воздействием силимарина концентрация глюкозы в крови снижалась, хотя и не достигала нормы. Силимарин частично нормализовал углеводный обмен, но не был способен устранить дефицит инсулина, вызванный гибелью jS-клеток островков поджелудочной железы. Применение силимарина также позволяло снизить уровень холестерина и повысить содержание ЛПВП. Под влиянием гепатопротектора улучшался метаболизм липопротеинов, угнетались синтез холестерина в печени и окисление липопротеинов низкой плотности [161]. При введении силимарина экспериментальным животным повышалась концентрация белка. Показано, что силимарин нормализует синтез белка. Активируя РНК-полимеразу в клеточном ядре, препарат повышает транскрипцию и скорость синтеза РНК в печени. Усиленный синтез рибосомальной РНК приводит к увеличению количества рибосом и интенсивному образованию структурных и функциональных белков [116].

Введение крысам силимарина в течение 14 дней после воздействия стрептозотоцином вызывало снижение до нормы скоростей дыхания митохондрий в состояниях покоя и фосфорилирования АДФ при утилизации сукцината. Коэффициенты, характеризующие сопряженность окислительного фосфорилирования (СД, ДК, АДФ/О) уменьшались. Это свидетельствует о неспособности силимарина устранять вызываемую стрептозотоцином деэнергизацию митохондрий. Наше предположение подтверждает анализ дыхания митохондрий при окислении НАД-зависимых субстратов. У животных, защищенных силимарином, при снижении скоростей поглощения кислорода митохондриями во всех метаболических состояниях относительно скоростей, регистрируемых при интоксикации стрептозотоцином, существенно уменьшался коэффициент АДФ/О. Ингибиторный анализ дыхания митохондрий печени крыс, получавших силимарин, с применением малоната и АОА, позволил установить сохранение на уровне нормы показателей окисления и продукции эндогенного сукцината, хотя характер окислительного фосфорилирования не изменялся. Введение силимарина в течение 14 сут. после интоксикации стрептозотоцином полностью сдерживало накопление диеновых конъюгатов и оснований Шиффа.

Скорости образования МДА также снижались, но не достигали значений, выявленных у интактных животных.

Митохондрии поставляют энергию для биологических процессов и участвуют во всех видах клеточного метаболизма [108]. Любой патологический процесс, приводящий к нарушению состояния клетки, сопровождается изменением функционирования митохондрий [56, 57, 59, 61]. Сахарный диабет как метаболический синдром, характеризуется выраженным нарушением анаболических и катаболических процессов, протекающих при участии митохондрий [147, 53]. Патология углеводного, жирового, белкового обменов при сахарном диабете нарушает субстратное обеспечение обмена энергии и функционирование митохондрий [163]. Об этом свидетельствуют данные, полученные нами при экспериментальном сахарном диабете, вызванном введением стрептозотоцина.

В настоящее время активно разрабатываются методы фармакологической коррекции энергетического обмена [81, 85, 104, 109] при различных видах патологии, создаются препараты - регуляторы обмена энергии. Следует подчеркнуть, что одним из наиболее эффективных препаратов данной группы является ЯК [96]. Описаны ее свойства и механизм действия [65, 96]. В этой связи нами была предпринята попытка использования ЯК для регуляции обмена энергии и, соответственно, других патологических изменений метаболизма при модели сахарного диабета. При введении крысам ЯК снижался уровень глюкозы. Инсулинотропный эффект ЯК связан с существенным увеличением активности СДГ, при этом установлено, что синтез инсулина под воздействием ЯК обусловлен усилением метаболических процессов в островковой ткани поджелудочной железы [7]. Стимуляция секреции инсулина jS-клетками обеспечивается за счет стимуляции фермента №+-К+-аминотрансферазы, активность которой не зависит от концентрации глюкозы во внеклеточной среде. Применение ЯК позволило значительно снизить уровень холестерина у крыс на 14-е сут. после введения стрептозотоцина, что обусловлено вовлечением жирных кислот в процессы /3-окисления. При этом повышался уровень ЛПВП, находящихся в контрафазном отношении с атерогенными липидами [124]. На фоне применения ЯК в течение 14 дней концентрация общего белка значительно увеличивалась. При сахарном диабете энергетический обмен нарушается вследствие дефицита а-кетоглутаровой кислоты [78]. Дефицит АТФ ограничивает синтез белка гепатоцитами. ЯК восстанавливает тканевое дыхание и синтез АТФ в клетках, тем самым, восстанавливая синтетическую функцию печени.

При интоксикации стрептозотоцином ЯК нормализовала показатели окислительного фосфорилирования митохондрий печени во всех метаболических состояниях. При окислении сукцината восстанавливались до нормы скорости дыхания митохондрий. Сниженный коэффициент АДФ/О, судя по величине коэффициентов СД и ДК, указывает на доминирование сукцинатзависимых процессов в энергопродукции. При окислении НАД-зависимых субстратов скорости дыхания митохондрий в состояниях V3 и V4o превышали показатели интактных животных. Увеличение сопряженности окисления и фосфорилирования (рост коэффициентов СД, ДК, АДФ/О относительно нормы) отражает преобладание вклада НАД-зависимых субстратов в продукцию АТФ. Ингибиторный анализ дыхания митохондрий крыс, получавших ЯК, показал значительное увеличение вклада образования и окисления эндогенного сукцината в энергопродукцию по сравнению с сукцинатзависимыми процессами у животных через 14 дней после введения стрептозотоцина. Это свидетельствует о развитии репаративных процессов за счет активации быстрого метаболического кластера митохондрий. Терапия ЯК в течение 14 сут. после интоксикации стрептозотоцином нормализовала продукцию липоперекисей в печени крыс, что указывает на отчетливое антиоксидантное действие ЯК, которое реализуется посредством положительного влияния на систему энергопродукции печени.

Полученные результаты указывают на целесообразность применения гепатопротекторов и РЭО в комплексной терапии сахарного диабета. ЯК при интоксикации стрептозотоцином обладает более выраженными положительными метаболическими эффектами, чем гепатопротектор силимарин. Судя по полученным данным, при моделировании сахарного диабета стратегия прямой антиоксидантной защиты клеток, может проигрывать в сравнении со стратегией регуляции митохондриального окисления [86,93].