Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Исследование белковых соединений тимуса и IgG сыворотки крови при миастении

Актуальность проблемы. Myasthenia Gravis - аутоиммунное заболевание, при котором вырабатываются антитела (AT) к никотиновым ацетилхолиновым рецепторам (АХР) постсинаптической мембраны мышц, вследствие чего нарушается прохождение импульса от нервной к мышечной клетке. Клиническим проявлением такой аутоиммунной агрессии является патологическая мышечная слабость и утомляемость (Гехт Б.М., Коломенская Е.А. 1965; Кузин М.И, Гехт Б.М, 1996).

Основным аутоантигеном при миастении является АХР постсинаптической мембраны. АХР - это трансмембранная молекула, состоящая из 5 субъединиц. Ацетилхолиновые рецепторы могут рассматриваться как преобразователи сигнала (Lindstrom J, 1997), функцией которых является передача внеклеточных сигналов внутрь клетки. Для АХР лигандом является нейромедиатор ацетилхолин. Все субъединицы рецептора (а)2, р, у и 5 - гликозилированы. В зависимости от стадии развития организма мышечный АХР имеет два варианта: эмбриональный содержит у-субъединицу, у взрослых она заменяется на е-субъединицу (Vincent A. et al., 2000). Известно, что существует два подтипа АХР: мышечный, содержащий al и pi субъединицы и нейрональный, содержащий а2-9 и |32-4 субъединицы (Уткин Ю.Н. и др.,

1999). Нейрональные АХР локализованы пост-, пери-, экстра-, и пресинаптически и могут являться мишенями при некоторых заболеваниях ЦНС (Lindstrom J, 1997).

Патогенетическую роль AT доказывает развитие экспериментальной аутоиммунной миастении (EAMG) у животных, иммунизированных сывороткой крови и лимфоцитами больных миастенией (Wang Z. et al.,

2000). При этом происходит сенсибилизация CD4+ клеток и появление в крови подопытных животных высокоаффинных IgG антител, реагирующих с мышечными АХР (Bellone М. et al., 1993; Karachunski P.I. et al., 2000).

Аутоантитела при миастении направлены к различным участкам (Zimmermann C.W. et al.,1993; Vincent A. et al., 2000) и субъединщам (Oda К, 1993; Tsouloufis Th. et al., 2000) АХР, при этом сывороточный пул AT на 80% состоит из молекул, направленных против главного иммуногенного региона (участок 67-76) экстрацеллюлярного домена (1-209) al-субъединицы АХР. Определение общей концентрации аутоантител в сыворотке крови позволяет с вероятностью до 80% подтвердить диагноз миастении, но не дает возможности провести корреляцию между количеством обнаруженных AT и тяжестью состояния, особенностями распределения мышечной слабости, а также характером течения патологического процесса.

В последнее время исследуется абзимная активность IgG антител при некоторых аутоиммунных и онкологических заболеваниях (Габибов А.П, 1988; Генералов ИМ. и др., 1998; Сидорская Е.В. и др., 2000; Paul S, 1996). До настоящего времени абзимная активность IgG при миастении не изучалась. Вместе с тем, уникальность каждого организма связана с особенностями функционирования ферментативных систем и, возможно, что индивидуальные особенности проявлений миастении (характер течения заболевания, распределения мышечной слабости, реакция на различные виды лечения и др.) могут быть связаны с каталитической активностью специфических AT. Предполагается, что появление AT, обладающих различной каталитической активностью, в организме при миастении указывает, с одной стороны, на наличие аутоиммунного заболевания (диагностическая значимость), а с другой - может проливать свет на их роль как специфического агента, который модифицирует метаболические процессы, протекающие в синапсе.

Среди большого спектра аутоиммунных болезней миастения занимает особое место, так как механизмы ее развития неизмеримо более интимно связаны с тимусом (вилочковой железой), чем другие аутоиммунные заболевания (Харченко В.П и др., 1998). Патологические изменения тимуса встречаются у 60% больных миастенией (Кузин М.И, Гехт Б.М, 1996; Vincent А, 1988). Ни при одном другом аутоиммунном заболевании удаление вилочковой железы не дает такого высокого процента положительных результатов (улучшение или выздоровление), как при миастении (от 60 до 80% по данным Харченко В.П. и др., 1997; Лайсек Р.П., Барчи Р.Л, 1984; Bemh-Aknin S. et al., 1987; Drachman D, 1987; LisakR, 1990).

Примерно в 9-16 % наблюдений генерализованная миастения сочетается с тимомами - наиболее часто встречающимися новообразованиями переднего средостения (Кузин М.И, Гехт Б.М, 1996; Lisak R, 1990; Eymard В., Berrih-Aknin S, 1995).

Многообразие функций тимуса в человеческом организме отражается в многообразии его молекулярных структур. Лишь некоторые го них локализованы, установлена их химическая структура и биологическая активность. До настоящего времени практически не изучен вопрос о механизме возможного участия системы углутамилтранспептидазы (у-ГТП) в иммунологических реакциях. Известна универсальная роль у-ГТП в таких ключевых процессах поддержания гомеостаза, как обмен глутатиона и аминокислот. Кроме этого, будучи сиалогликопротеидами по природе, субъединицы у-ГТП в определенных условиях, могут образовывать комплексы с белками или их фрагментами и служить собственно антигенами или способствовать антигенообразованию (ЧернобровкинаТ. В, 1992).

Цель исследования - изучить роль белков тимуса и IgG сыворотки крови больных в патогенезе миастении и разработать дополнительные критерии для дифференциальной диагностики различных форм миастении. Задачи исследования:

1. Выявление биохимических особенностей белков тимуса больных миастенией при различных его морфологических изменениях.

2. Идентификация методом иммуноблоттинга антигенных белков тимуса с помощью поликлональных кроличьих антител к различным участкам субъединиц АХР и по взаимодействию их с антителами сывороток крови больных миастенией.

3. Определение каталитической активности IgG антител сыворотки крови больных миастенией.

4. Подбор условий и проведение твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики миастении.

Научная новизна исследования.

Впервые обнаружено значительное повышение активности (у-ГТП) при миастении с тимомой во внеопухолевой и опухолевой ткани, в меньшей степени - в гиперплазированном тимусе и наличие в ткани тимом трех бежов с м.в. 14, 12 и 10 кДа, которые связывают антитела к цитоплазматическому участку нейрональной а4 (375-404) субъединицы АХР. Впервые показано наличие абзимной активности (креатинфосфокиназной) IgG сыворотки крови и возможность использования этого феномена для дифференциальной диагностики миастении и миастении с тимомой. Впервые показана возможность использования экстрацеллюлярного домена мышечного АХР al (1-209), полученного с помощью гетерологической экспрессии соответствующего фрагмента кДНК в E.Coli, для количественного определения аутоантител в сыворотке крови больных миастенией методом иммуноферментного анализа.

Теоретическая и практическая значимость работы. Повышение активности у-ГТП может свидетельствовать о предрасположении к опухолевому росту даже в морфологически неизмененных клетках, что дает возможность прогнозировать склонность к опухолевому перерождению. Появление в ходе поликлонального аутоиммунного ответа в сыворотке крови иммуноглобулинов, обладающих каталитической активностью, открывает дополнительные возможности для объяснения полиморфизма клинических проявлений миастении и дифференциальной диагностики генерализованной формы миастении и миастении с тимомой. Показана возможность создания первого отечественного набора для диагностики миастении с использованием экстрацеллюлярного домена al субъединицы мышечного АХР человека, полученного с помощью гетерологической экспрессии соответствующего фрагмента кДНК в E.Coli. Положения, выносимые на защиту:

1. Количественное определение антител в сыворотке крови служит дополнительным методом для диагностики генерализованной формы миастении и может применяться для мониторинга и оценки эффективности тимэктомии и других методов лечения.

2. Выявленные иммунобиохимические особенности белков тимуса и IgG антител сыворотки крови позволяют использовать эти феномены для дальнейшего изучения патогенеза.

выводы.

1. Комплексный подход к изучению иммунологических и биохимических свойств бежов тимуса и IgG сыворотки крови позволил выявить различия в механизмах патологического процесса у больных с миастенией и миастенией с тимомой.

2. Впервые обнаружено значительное повышение у-глутамилтранспептидазы при тимомах во внеопухолевой и опухолевой ткани, в меньшей степени - в гиперплазированном тимусе, что может свидетельствовать о предрасположении к опухолевому росту даже в морфологически неизмененных клетках.

3. Показано наличие в ткани тимом трех бежов с м.в. 14, 12 и 10 кДа, которые связывают антитела к цитоплазматическому участку 375-404 нейрональной <*4- субъединицы ацетилхолинового рецептора, что может быть отражением многообразия антигенных структур опухолевого тимуса при миастении.

4. Показана возможность использования экстрацеллюлярного домена мышечного АХР (HR2), полученного с помощью гетерологической экспрессии соответствующего фрагмента кДНК в E.Coli, для количественного определения аутоантител в сыворотке крови больных миастенией методом ИФА.

5. Показано наличие абзимной активности (креатинфосфокиназной) IgG сыворотки крови и возможность использования этого феномена для дифференциальной диагностики миастении и миастении с тимомой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В современной литературе как зарубежной, так и отечественной, отражены результаты многочисленных исследований, посвященных изучению основных механизмов развития миастении и других аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз, системные заболевания соединительной ткани. Значение аутоиммунных механизмов в патогенезе миастении не вызывает сомнений, так как они доказаны как в экспериментах на животных, так и при изучении их у человека. Выявление различных типов иммунного ответа при миастении свидетельствует в пользу того, что исследуемый патологический процесс является достаточно разнородным даже в рамках одного диагноза.

Клинические проявления миастении весьма вариабельны и различаются в степени генерализации патологического процесса и тяжести нервно-мышечных нарушений (Кузин М.И., Гехт Б.М., 1996; Osserman К., 1958). Особую форму аутоиммунной патологии представляет собой миастения в сочетании с тимомой. Дифференциальная диагностика между локальной (глазной), генерализованной формами миастении, миастенией, ассоциированной с тимомой, а также с другими заболеваниями -фенокопиями миастении - в ряде случаев весьма затруднительна. В этой связи важно иметь дополнительные методы диагностики. Например, определение антител к у - субъединице АХР позволило бы дифференцировать глазную форму миастении от эндокринной офтальмопатии, выявление антител к рианодиновым рецепторам, titin -белку, VICE - альфа и некоторым другим антигенным бежам помогло бы установлению диагноза тимомы, особенно в тех случаях, когда рентгенологические и другие методы исследования не подтверждают наличие опухоли, и т.д.

Основные механизмы стадий обострения и ремиссии, которые отражены на приводимой в диссертации схеме, составленной с использованием данных литературы и результатов собственных исследований, являются общими как для миастении, так и для других аутоиммунных болезней. Этот факт дает основание сделать предположение о неспецифичности иммунологических механизмов при этих патологических состояниях. Высказываются предположения (Завалишин И.А. и др., 2000), что гетерогенность пула антител сыворотки крови при рассеянном склерозе отражает неспецифическую гиперактивность В-клеток, вызванную нарушением иммунной регуляции, например, дисбалансом соответствующих цитокинов.

При этом поражаемые антигенные мишени различны при разных заболеваниях. Для миастении это АХР постсинаптической мембраны, белки мышечной ткани, рианодиновые рецепторы, для рассеянного склероза - миелин и олигодендроглия, для системных болезней соединительной ткани - структуры соединительной ткани. Способность организма к развитию иммунного ответа против определенного аутоантигена генетически детерминирована.

Существенно повышается риск развития конкретного заболевания при наличии характерного для данного патологического процесса типа HLA ассоциации. Многие исследователи сообщают о клинической неоднородности, большом полиморфизме и разбросе данных в отношении показателей иммунитета и при миастении, и при рассеянном склерозе.

С одной стороны, возможно, что одним из факторов, определяющих разнообразие клинических проявлений и течения этих заболеваний является различие антигенных мишеней на разных стадиях болезни (Завалишин И.А. и др., 2000). С другой стороны, клинический полиморфизм может быть связан с различиями в каталитической активности IgG антител. Фаворова О.О. (2002) считает, что исследование уровня активности в сыворотке крови больных рассеянным склерозом каталитических антител, специфически гидролизующих ДНК, РНК и основной белок миелина, может являться принципиально новым диагностическим признаком, позволяющим оценить глубину патологического процесса.

Существующее в течение 50 лет предположение о том, что одной из причин заболевания может быть инфекционный агент, подтверждается новыми данными о развитии аутоиммунного процесса в ответ на инфицирование по типу молекулярной мимикрии с образованием высокоаффинных аутоантител, обладающих абзимной активностью. Механизм возникновения абзимной активности приведен на схеме 4.

Схема.4 ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ IgG.

Проникновение в Бактериальный (вирусный) белок или Процессинг антигена и клетку вируса, его фрагмент, обладающий презентация в комплексе бактерии субстратоподобной специфичностью ? с HLA

Цитокины, обладающие провоепалительной активностью и стимулирующие синтез IgG

INF-у

Распознавание Т клеткой, имеющей специфический Т клеточный рецептор

Каталитические IgG антитела V

Fc X

Fab комплекс АХР/АТ -»-С al- субъединица АХР

N -

67 76

Завалишин И.А. и соавт. (2000) приводят данные о наличии 129 вирусных и бактериальных пептидов, сходных со структурой участка 8599 основного бежа миелина. Вполне возможно, что внешний агент (вирус или паразит), вызвав образование антител, несущих общий перекрестно реагирующий с рецепторами аутореактивных Т- и В- клеток идиотип, способен провоцировать аутоиммунный ответ. Если закодированные в геноме гамет идиотипы аутоантигел генерируют целый спектр антиидиотипов, реагирующих с экзогенными антигенами, то можно предполагать, что антитела, образующиеся в ответ на инфекцию, взаимодействуют с соответствующим идиотипом на поверхности аутореактивного лимфоцита. Например, одна из гибридом, полученная из лимфоцитов больного миастенией, секретировала антиидиотип к аутоантителам против АХР. Эти антиидиотипы, как обнаружилось, реагируют с 1,3-декстраном, представляющим собой продукт бактериальной природы (Ройг А., 1991).

Подобный механизм исследован в работе Конорева М.Р. и соавт. (2000) у пациентов, инфицированных Helicobacter pylori Была выявлена корреляционная зависимость между уровнем уреазной активности у поликлональных IgG антител, выделенных из сывороток пациентов и их количеством.

Изучение иммунологических и биохимических процессов, происходящих в организме больного миастенией, имеет целью разработку наиболее эффективных методов диагностики, лечения и профилактики заболевания. С этой точки зрения, перспективными представляются работы Karachunski P.I. et al. (1998, 1999), в которых обоснован метод индукции толерантности к развитию миастении. С этой целью животным до и после развития EAMG вводили подкожно, интраназально и через рот синтетические пептиды - эпитопы а субъединицы АХР 146-169, 181-200 и 360-378. Наилучшие результаты - предотвращение развития EAMG или уменьшение мышечной слабости с ускорением выздоровления - были получены при использовании пептида 146-169 .

Вторым, не менее интересным, направлением в поиске препаратов для лечения миастении являются ингибиторы метилирования. Известно, что важную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний играет исходное состояние мембран клетки, например: при рассеянном склерозе (Жученко Т.Д., 2000), кроме иммунопатологических механизмов, имеют значение метаболический дефект миелина и состояние липидного бислоя. При миастении существенное влияние на конформацию трансмембранного бежа, каким является АХР, оказывает состояние окружающей его мембраны. Drachman D. (1997, 1998) изучал на культуре мышечных клеток и на животных с EAMG действие ингибиторов метилирования фосфолипидов клеточных мембран. Оказалось, что эти соединения могут уменьшать скорость деградации АХР в обеих моделях.

Дальнейшие исследования в этих направлениях, а также поиск методов коррекции дисбаланса на уровне цитокинов и как следствия -клеточных иммунопатологических реакций - позволят приблизиться к решению одной из актуальных проблем современной медицины - лечению аутоиммунной миастении.

Данная работа выполнена на стыке двух наук: бежовой химии и медицины. Междисциплинарный подход к изучению бежовых соединений тимуса и IgG сыворотки крови больных миастенией позволил получить дополнительную информацию о их роли в патологическом процессе, предположить возможные варианты иммунного ответа и оценить диагностическую значимость количественного определения общего уровня антител по взаимодействию с гетерологически экспрессированным доменом АХР человека, а также наметил дальнейшие перспективы изучения миастении.