Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Диагностическое значение новых (стимулирующего и антирецепторного) свойств сыворотки крови больных миастенией



^ ^ На правах рукописи

СЕЛИВОХИНА Ольга Ивановна

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НОВЫХ (СТИМУЛИРУЮЩЕГО И АНТИРЕЦЕПТОРНОГО) СВОЙСТВ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ МИАСТЕНИЕЙ

14.00.13 - нервные болезни 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ПЕРМЬ -1998

Работа выполнена в Пермской государственной медицинской академии.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор A.A. Шутов

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник A.A. Быкова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ю.И. Кравцов

кандидат медицинских наук, доцент Ю.И. Шилов

Ведущая организация:

Омская государственная медицинская академия

Защита диссертации состоится мяа^иг 1998 г. в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д 084.09.01 при Пермской государственной медицинской академии (г. Пермь, ул. Куйбышева, 39).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной медицинской академии (614000, г. Пермь, ул. Коммунистическая,26)

Автореферат разослан ^октября 15SS г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

доктор медицинских наук,

профессор

Л.Е. Леонова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Миастения - тяжелое нервно-мышечное заболевание, обусловленное блокадой антителами холи-норецепторов и невозможностью нормального функционирования нервно-мышечного синапса.

Диагноз «миастения» вызывает определенные трудности в связи с полиморфизмом клинической симптоматики заболевания, разнообразием его дебютов, вариабельностью течения и наличием ряда невропатологических симптомов и синдромов, протекающих под маской миастении. Существующие клинические и лабораторные тесты, выявляющие патологическую мышечную утомляемость, степень компенсации мышечной слабости антихолинзстеразными препаратами, патологию вилочковой железы и состояние нейромышечной передачи, помогают в постановке диагноза, но не решают полностью задачу, так как встречаются прозериннегативные формы миастении и формы без изменения тимуса.

Новым направлением в диагностике миастении стала разработка сотрудниками Пермской государственной медицинской академии способов выявления в крови больных миастенией антител к ацетилхолину {А.А.Быкова, М.Ф.Гаришина, Т.А.Юшкова, 1989; А.А.Быкова, Е.Ф.Ольховская, А.А.Шутов, 1997). Базирующиеся на концепции иммунного механизма химического гомеостаза, предложенной д.м.н. А.А.Быковой и проф. А.С.Заксом в 1976-1977 гг, запатентованные методы диагностики миастении углубляют представления о патогенезе заболевания и используются в клинической неврологии в качестве лабораторных маркеров миастении.

Надёжным диагностическим признаком миастении является обнаружение антител к холинорецепторам нейромышечного синапса, но, по данным литературы (Vincent А., 1997), у 10 - 15 % больных миасте-

нией современными методами исследования антитела к холинорецеп-торам не определяются.

В этой связи становится актуальным поиск новых лабораторных способов диагностики миастении и выявления антител к холинорецеп-торам.

В настоящее время методами конкурентного анализа с меченым изотопом и немечеными лигандами доказано наличие на Т-лимфоцитах периферической крови, а также тимоцитах М-холинорецепторов, экспрессия которых изменяется при антигенной стимуляции (М. Plaut, 1987; Н. Metzger, 1988; А.А.Быкова, 1990). На основании непрямых данных (В.В. Абрамов, 1988; А.Д. Адо, 1993) можно предполагать наличие на лимфоцитах и Н-холинорецепторов. Поэтому для анализа факторов сыворотки крови больных миастенией вместо применяемых традиционно дорогостоящих очищенных холинорецепторов электрического органа ската или электрического угря в качестве объекта можно использовать лимфоциты периферической крови.

Целью настоящей работы является изучение некоторых особенностей взаимодействия сыворотки крови больных миастенией с лимфоцитами крови здорового донора для решения вопроса об использовании их в качестве диагностических и дифференциально-диагностических тестов миастении.

Задачи исследования:

1. Изучить стимулирующее свойство сыворотки крови больных миастенией по отношению к интактным лимфоцитам крови донора в реакции розеткообразования с ацетилхолиновым диагностикумом.

2. Изучить блокирующее (антирецепторное) свойство сыворотки крови больных миастенией по отношению к активированным

ацетилхолином лимфоцитам крови донора в реакции розеткообразования с ацетилхолиновым диагностикумом.

3. Провести анализ стимулирующего и антирецепторного свойств сыворотки крови больных миастенией в зависимости от клинической формы, продолжительности, типа течения, степени тяжести заболевания.

4. Сопоставить результаты изучения стимулирующего и антирецепторного свойств сыворотки крови больных миастенией с аналогичными показателями здоровых лиц, больных с заболеваниями периферической нервной системы и больных с заболеваниями, имитирующими миастению.

Научная новизна.

Впервые выявлено, что сыворотка крови больных миастенией в разведении 1:10 и 1:20 обладает стимулирующим свойством по отношению к интактным лимфоцитам крови донора, что проявляется экспрессией их рецепторов и статистически достоверным увеличением числа розеткообразующих клеток в реакции розеткообразования с ацетилхолиновым диагностикумом по сравнению с исходным показателем.

Впервые показано, что цельная сыворотка крови больных миастенией обладает блокирующим (антирецепторным) свойством по отношению к предварительно стимулированным ацетилхолином лимфоцитам крови донора, что характеризуется статистически достоверным снижением по сравнению с исходным показателем числа розеткообразующих клеток в реакции розеткообразования с ацетилхолиновым диагностикумом.

Стимулирующее и антирецепторное свойства сыворотки крови больных миастенией выявляются на всем протяжении заболевания, как при очаговых, так и при генерализованных формах миастении,

имеют прямую зависимость от генерализации процесса, степени тяжести и типа течения миастении, не зависят от пола и возраста больных, продолжительности заболевания. Это явление предлагается использовать в качестве дополнительного диагностического и дифференциально-диагностического теста при миастении.

Практическая значимость. Выявление стимулирующего экспрессию рецепторов лимфоцитов и антирецепторного свойств сыворотки крови больных миастенией, может быть использовано в качестве дополнительного диагностического лабораторного теста миастении на любой стадии заболевания, в том числе в дебюте, при стертых, атипичных и прозеринрезистентных формах заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Сыворотка крови больных миастенией в разведении 1:10 и 1:20 оказывает стимулирующее влияние на лимфоциты крови донора, что проявляется усилением специфического розеткообразования с эритроцитами барана, нагруженными ацетилхолином.

2. Цельная сыворотка крови больных миастенией оказывает блокирующее (антирецепторное) влияние на активированные ацетилхолином лимфоциты донора, что проявляется снижением специфического розеткообразования с эритроцитами барана, нагруженными ацетилхолином.

3. Предложенные способы выявления стимулирующей и антирецеп-торной активности сыворотки крови больных миастенией информативны в любом возрасте, при различных клинических формах и типах течения, в том числе на ранних стадиях заболевания, могут быть использованы в качестве диагностических и дифференциально-диагностических тестов при заболеваниях со сходной с миастенией симптоматикой.

Внедрение в практику. Способы диагностики миастении, основанные на выявлении стимулирующего экспрессию рецепторов и антирецепторного свойств сыворотки крови больных миастенией, внедрены в работу клиники неврологии на базе неврологического отделения Пермской областной клинической больницы. Материалы диссертации применяются в учебном процессе на кафедре неврологии Пермской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научно-практической конференции неврологов и нейрохирургов (Омск, 1997), конференции молодых ученых Пермской государственной медицинской академии (Пермь, 1997); научных сессиях Пермской государственной медицинской академии (Пермь, 1997, 1998); на VI Съезде неврологов Пермской области (Пермь, 1998), на совместном заседании коллективов кафедр неврологии лечебного и педиатрического факультетов, факультета последипломного образования и научной проблемной комиссии по иммунологии Пермской медицинской академии (1998).

Публикации. По материалам диссертации имеется 8 публикаций в отечественной печати. Получены две приоритетные справки на изобретения «Способ диагностики миастении» № 97109052 от 16 июня 1997 года и № 98107360 от 27 апреля 1998 года.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Общий объем работы составляет 154 страниц машинописного текста, включая список литературы. Работа иллюстрирована 29 таблицами, 17 рисунками и 10 клиническими наблюдениями. Список литературы включает 109 работ отечественных и 75 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика групп наблюдения.

Обследовано 39 больных миастенией (основная группа). Группа включала 30 (77%) женщин и 9 (23 %) мужчин в возрасте от 17 до 69 лет (средний возраст 41,5 год). Локальная форма миастении наблюдалась у 14 (36%) больных, генерализованная - у 25 (64%). Из 14 больных локальными формами миастении у 7 больных (50%) диагностирована глазная форма заболевания, у 5 - краниальная (35,7%), у 2 -бульбарная (14,2%). Среди 25 человек генерализованной формой заболевания у 3 (13,3%) были эпизоды нарушения дыхания в анамнезе или во время госпитализации, связанные с утомляемостью и слабостью межреберных мышц и мышц диафрагмы, у 12 (48%) присутствовали бульбарные нарушения различной степени выраженности.

Группа контроля включала 30 практически здоровых лиц в возрасте от 18 до 44 лет (средний возраст - 30,1 года), из них 16 женщин и 14 мужчин. Данные обследования этой группы использованы как лабораторный контроль.

Первую группу сравнения составили 30 человек с заболеваниями нервной системы без аутоиммунных механизмов в патогенезе, клиническая картина которых не напоминала миастению. Среди них было 13 мужчин и 17 женщин в возрасте от 20 до 49 (средний возраст - 37,2 лет). У 23 (68%) человек имел место остеохондроз поясничного отдела позвоночника с корешковым или мышечно-тоническими синдромами, у 5 (16%) - остеохондроз шейного отдела позвоночника с мышечно-тоническими синдромами.

Вторая группа сравнения сформировалась в процессе практической работы, так как у большинства больных этой группы проводился трудный дифференциальный диагноз с миастенией. Её составили больные с заболеваниями, клиническая картина которых имела сход-

ную с миастенией симптоматику, и на определенном этапе наблюдения им устанавливался диагноз миастении. Группа состояла из 20 человек (2 мужчин и 18 женщин) в возрасте от 20 до 74 (средний возраст 51,5 год). После обследования больным установлены следующие диагнозы: локальная мышечная дистония, блефароспазм - 4 (20%); офтальмоп-легическая миопатия - 3 (15%); инфекционно-аллергическая нейропа-тия глазодвигательного нерва - 2 (10%); астенический невроз - 2 (10%); аневризма внутренней сонной артерии - 2 (10%); поздний восстановительный период острого нарушения мозгового кровообращения в вертебро-базилярном бассейне, миастеноподобный синдром -2 (10%); дерматомиозит, хроническое течение, миастенический синдром; прогрессирующая мышечная дистрофия; церебральный атеросклероз, острое нарушение мозгового кровообращения в вертебро-базилярном бассейне; острый энцефаломиелит, бульбарная форма; синдром хронической усталости - по одному человеку.

Материалы и методы исследования Свойства сыворотки крови больных миастенией исследовали по оригинальной методике, в основе которой лежит разработанный А. А.Быковой с сотр. в 1990 принцип регистрации свойств сыворотки крови больных в проводимой in vitro реакции пассивного розеткообразо-вания лимфоцитов донора с эритроцитарным диагностикумом.

Методы осуществлялись следующим образом. Из вены обследуемого забирали кровь в количестве 1,5 мл, центрифугированием выделяли сыворотку, которую затем инактивировали при 56 °С в течение 30 мин. Из вены донора забирали кровь в количестве 3 мл в пробирку, содержащую антикоагулянт, и после отстаивания выделяли взвесь лейкоцитов в количестве 2х10®кл/мл, которые обрабатывали сывороткой крови обследуемых лиц.

Стимулирующую экспрессию рецепторов активность сыворотки крови обследуемых выявляли в реакции розеткообразования (Быкова A.A. с соавт, 1994). Лимфоциты донора (2x10® кл/мл) обрабатывали сывороткой крови обследуемого (0,4 мл) в разведении 1:10 и 1:20 в течение 30 мин при 37 °С, с последующей постановкой реакции пассивного розеткообразования с эритроцитарным диагностикумом.

Антирецепторную (блокирующую) активность сыворотки крови обследуемых выявляли, используя лимфоциты донора (2x10® кл/мл), предварительно активированные ацетилхолином в конечной концентрации 2,5x1 О^г/мл в течение 30 мин при 37 °С (Быкова A.A. с соавт, 1994), которые затем обрабатывали цельной сывороткой крови обследуемых (0,4 мл) в течение 30 мин при 37 °С. На заключительном этапе проводили реакцию пассивного розеткообразования с эритроцитарным диагностикумом.

Эритроцитарный диагностикум готовили из предварительно обработанных глутаровым альдегидом и нагруженных ацетилхолином эритроцитов барана по методу, предложенному ААБыковой с соавт. (1990):

Исследование проводилось на базе клиники неврологии (зав. -д.м.н., проф. A.A. Шутов) и иммунологического отдела (зав.- к.б.н. Л.К. Буренкова) Центральной научно-исследовательской лаборатории Пермской государственной медицинской академии (зав. - д.м.н.,проф. М.Ф. Болотова).

Результаты иммунологического исследования Первым этапом исследования было изучение свойств сыворотки крови больных миастенией, модулирующих экспрессию рецепторов лимфоцитов донора.

I. Выявлено (табл. 1), что сыворотка крови больных миастенией в разведении 1:10 и 1:20 действует стимулирующе на экспрессию ре-

цепторов лимфоцитов донора, что проявляется усилением их адгезивной активности и увеличением числа (относительного и абсолютного) розеткообразующих клеток (РОК) в 2 и более раза по сравнению с исходным фоном в реакции розеткообразования с эритроцитами барана, нагруженными ацетилхолином.

Таблица 1

Влияние разведённой сыворотки крови здоровых лиц, больных миастенией и больных групп сравнения на интактные лимфоциты донора

Группы обследованных л Сред ний возраст (лет) Число розеткообразующих клеток (М ± т)

Исходное в крови донора После добавления сыворотки крови обследованных в разведении

1 :10 1:20

% Абс. число в 1 мкл % Абс. число в 1 мкл % Абс. число а 1 мкл

Здоровые лица 30 30,1 5,8±0,3 93,6±14,3 9,1+0,5 144,7+18,3 7,9±0,5 129,4±15,4

Больные миастенией 39 41,6 6,5+0,2 105,8+5,1 24,5±0,8 394.3+14,2 26,5±1,2 420,4±19,7

Больные с заболеваниями пне 30 37,2 6,3±0,4 98,6+6,9 8,7±0,5 148,6+8,6 9,6+0,4 162,6±7,8

Больные с заболеваниями, имитирующими миастению 20 51,5 6,2±0,3 101,4+7,7 10,7+0,6 169,7±11,2 9,2±0,5 146,2±9,1

Р Р1 <0,001 р2 >0,05

Примечание: л - число обследованных; р, - достоверность различий значений при исследовании сывороток крови больных миастенией и обследованных других групп; рг- достоверность различий значений при исследовании сывороток крови здоровых лиц и больных групп сравнения.

Число РОК при обработке лимфоцитов донора сывороткой крови больного миастенией в разведении 1:10 составило 24,5+0,8% (абсолютное значение 394,3 ±14,2 в 1 мкл крови), что существенно (р<0,001) превышало исходный показатель в крови донора - 6,5±0,2% (абсолютное значение 105,8 ±5,1 в 1 мкл крови). При обработке сывороткой больного в разведении 1:20 число РОК оказалось еще выше - 26,5±1,2 % и 420,4±19,7 в 1 мкл крови. В контрольной группе обследованных и группах сравнения соответствующие показатели существенно не превысили исходный фон в крови донора. Из этого можно сделать вывод о том, что сыворотки крови здоровых лиц, больных с заболеваниями

ПНС, а также с заболеваниями со сходной с миастенией симптоматикой не имеют выраженных стимулирующих свойств.

II. Предварительно нами выявлено, что ацетилхолин в дозе 5x1 о-5 г/мл на 2x106 кл/мл лимфоцитоа крови донора вызывает повышение способности их к розеткообразованию с эритроцитами барана, нагруженными этим медиатором. Число РОК составило 29,2 ±1,2 % и 461,6+24,3 в 1 мкл крови, то время как в исходном фоне - 6,5+0,2% (абсолютное значение 105,8 ±5,1 в 1 мкл крови). Это явление было использовано для изучения другой способности сыворотки крови больных миастенией: блокировать рецепторы лимфоцитов донора.

Таблица 2

Влияние цельной сыворотки крови здоровых лиц, больных миастенией и больных групп сравнения на стимулированные ацетилхолином лимфоциты донора

Группы Обследованных п Средний возр. (лет) Число роз^ткообразующих клеток (М ± т)

После активации аце-тил-холином в крови донора После внесения цельной сыворотки крови обследуемого

% Абс. число В 1 мкл % Абс. Число в 1 мкл

Здоровые лица 30 30,1 26,8+0,7 427,7±34,5 24,6±0,8 р2>0,05 411,8±29,5 р2>0,05

Больн&е миастенией 39 41,6 29,2±1,2 461,6±24,3 9±0,5 Р1<0,001 142,3+8,5 р-1<0,001

Больные с заболеваниями ПНС 30 37,2 24,8±0,7 421,0±14,9 22,4±0,6 р2>0,05 384,1±12,6 р2>0,05

Больные с заболеваниями, имитирующими миастению 20 51,5 28,5+1,0 442,6+22,9 24,5+1,1 р2>0,05 380,4±22,9 р2>0,05

Примечание: п - число обследованных; Р1-достоверность различий значений при исследовании сывороток крови больных миастенией и обследованных других групп; рг- достоверность различий значений при исследовании сывороток крови здоровых лиц и больных групп сравнения.

После внесения цельной сыворотки крови больных миастенией в суспензию стимулированных ацетилхолином лимфоцитов донора наблюдалось достоверное (р<0,001) снижение числа РОК до 9,0±0,5% (абсолютное число в 1 мкл - 142,3±8,5). Это свидетельствует о блокирующей (антирецепторной) активности цельной сыворотки крови

больных миастенией (табл. 2). При исследовании сывороток крови практически здоровых лиц и больных групп сравнения такого эффекта не наблюдалось. Число РОК оставалось по-прежнему высоким: - 24,6 ±0,8 % (абсолютное значение 411,8±29,5 в 1 мкл крови) для группы контроля, 22,4 ± 0,6 % (428,7±19,1 в 1 мкл крови) - для первой группы сравнения и 24,5+1,1% (380,4±22,9 в 1 мкл крови) - для второй группы сравнения.

III. Результаты исследования показали, что выраженность стимулирующих экспрессию рецепторов лимфоцитов и антирецепторных свойств сыворотки крови больных миастенией не зависит от пола и возраста больных, продолжительности миастении, состояния вилочковой железы, феномена прозеринрезистентности. Однако наблюдалась отчетливая направленность к более выраженному эффекту действия сыворотки у больных генерализованной формой заболевания (табл. 3 и 4), с прогрессирующим типом течения (табл. 5 и 6) и с нарастанием степени тяжести миастении (табл. 7 и 8).

Таблица 3

Выраженность стимулирующего свойства сыворотки крови больных миастенией в зависимости от клинической формы заболевания

Клинические формы миастении п Сред. Возраст (лет) Число розеткообразующих клеток (М ± т)

Исходное в крови донора После добавления сыворотки крови больного в разведении

1 :10 1:20

% Абс. число в 1 мкл % Абс. число в 1 мкл % Абс. число в 1 мкл

Локальная 14 40,8 7,1 ±0,3 117,б± 7,3 22,1±1,0 349,4±19,2 24,1±2,4 412,7±41,6

Генерализованная 25 42,1 6,2±0,3 99,2±6,6 25,9+1,1 р<0,05 419,4±17,7 ! 28,8+1,3 р<0,05 | р>0,05 484,7+20,7 р>0,05

Примечание: п - число обследованных; р - достоверность различий значений при исследовании сывороток хрози больных локальной и генерализованной миастенией.

Клинические формы Миастении п Сред, возраст (лет) Число розеткообразующих клеток (М ± т)

После активации Ацетилхолином в крови донора После внесения цельной сыворотки крови больного

% Абс. число в 1 мкл % Абс. число 8 1 мкл

Локальная 14 40,8 30,3+2,1 486,5+43,8 11,0+ 0,8 172,3±14,3

Генерализованная 25 42,1 28,6 ±1,4 447,7±29,3 7,9 ±0,4 р<0,01 125,6+9,1 р<0,01

Примечанием - число обследованных; р - достоверность различия значений при исследовании сывороток крови больных локальной и генерализованной миастенией.

Таблица 5

Выраженность стимулирующего свойства сыворотки крови больных миастенией в зависимости от типа течения заболевания

Тип течения миастении л Число розеткообразующих клеток (М ± т)

Исходное в крови Донора После внесения сыво| в разве зотки крови больного дении

1:10 1:20

% Абс. число в 1 мкл крови % Абс. число в 1 мкл крови % Абс. число в 1 мкл крови

Миастенц-ческие эпизоды 7 7,8 +0,4 121,3+9,9 21,1 ±1,4 Р1>0,05 р2<0,01 333,6±26,3 р,>0,05 р2<0,01 25,0 ±1,7 Р1>0,05 р2<0,05 391,0±55,4 Р1>0,05 р2<0,05

Стационарное течение 22 6,2 ±0,3 95,6±7,5 24,2± 1,1 Рз>0,05 388,2±18,2 Рз>0,05 26,0 ±1,5 Рз>0,05 409,0+24,8 р3>0,05

Прогрессирующее течение 10 6,9±0,4 117,9±5,7 27,8+1,7 449,9±25,9 28,9 ±1,6 498,1+27,8

Примечание: л - число обследованных; Р, - достоверность различия показателей больных с миастеническими эпизодами и стационарным течением заболевания; Р2 - достоверность различия показателей больных с миастеническими эпизодами и прогрессирующим течением заболевания; Рз - достоверность различия показателей больных со стационарным и прогрессирующим течением заболевания.

Тип течения миастении п Число розеткообразуюших клеток (М ± т)

Исходное в крови донора после активации ацетилхолином После внесения цельной сыворотки крови больного

% Абс. число в 1 мкл крови % Абс. число э 1 мкл крови

Миастенические эпизоды 7 29,8+3,9 485,2+48,1 11,0+0,9 Р1>0,05 р2<0,05 173,8+19,2 Р1>0,05 р2<0,05

Стационарное течение 22 29,5+ 1,6 464,6±33,0 8,7+0,7 Рз>0,05 141,5+10,2 Рз>0,05

Прогрессирующее течение 10 26,9± 0,9 424,6+27,2 8,2± 0,7 122,2±18,7

Примечание: п - число обследуемых; Р, - достоверность различия показателей больных с миастеническими эпизодами и стационарным течением заболевания; Р2 - достоверность различия показателей больных с миастеническими эпизодами и прогрессирующим течением заболевания; Р3 - достоверность различия показателей больных со стационарным и прогрессирующим течением заболевания.

Таблица 7

Выраженность стимулирующего свойства сыворотки крови больных миастенией в зависимости от тяжести заболевания

Степень тяжести миастении п Число розеткообразующих клеток (М + т)

Исходное в крови донора После внесения сыворотки крови больного миастенией в разведении

1:10 I 1:20

% Абс. число а 1 мкл крови % Абс. число в I 0. 1 мкл крови ° Абс. число з 1 мкл крсеи

Легкая 13 6,4 ±0,5 101,7±10,1 22,3+ 0,5 р1>0,05 346,9+17,1 р,>0,05 25,5 ±2,6 р1>0,05 397,3±47,7 Рт>0.05

Средняя 20 6,6 ±0,3 105,8+7,4 24,7+ 1,3 р3>0,05 400,7±21,0 Рз>0.05 26,4 ±1,5 Рз>0,05 418,2±22,6 р3>0,05

Тяжелая 6 6,5 +0,5 114,5±6,8 30,1+ 1,6 р2<0,05 485,1±24,4 р2<0,05 27,1 ± 1,7 р2<0,05 434,2±28,4 р2<0,05

Примечание: л - число обследованных; Р1 - достоверность различия значений больных легкой и средней степенью тяжести ; Р2 - достоверность различия значений больных легкой и тяжелой миастенией; Рз-достоверность различия значений больных средней и тяжелой степенью тяжести.

Степень тяжести миастении п Число розеткообразующих клеток (М ± т)

Исходное в крови донора после активации ацети/тхолином После внесения цельной сыворотки крови

% Абс. число в 1 мкл крови % Абс. число в 1 мкл крови

Легкая 13 29,6± 2,3 469,6±47,8 10,3± 1,1 Р! >0,05 166,0±14,5 р-1>0,05

Средняя 18 29,4 ±1,9 475,6+34,6 8,8+ 0,6 Рз>0,05 136,6±12,2 Рз>0,05

Тяжелая 8 28,1 ±1,8 427,9±35,4 7,0 ±0,5 р2<0,05 110,1 ±9,9 Рг<0,05

Примечание: п - число обследованных; Р1 - достоверность различия значений больных легкой и средней степенью тяжести; Р? - достоверность различия значений больных легкой и тяжелой миастенией; Р3 - достоверность различия значений больных средней и тяжелой миастенией.

Вторым этапом нашего исследования стало изучение природы факторов сыворотки крови больных миастенией. Сделано предположение, что указанная активность крови больных миастенией связана с наличием в сыворотке крови антител к холинорецепторам и действием этих антител на холинорецепторы мембраны лимфоцитов крови донора-

1. Для доказательства того, что фактором сыворотки крови является не свободный ацетилхолин (баланс которого может быть изменён при миастении), взаимодействующий с холинорецепторами, производилась предварительная обработка сыворотки крови больного ацетилхолинэстеразой - ферментом, как известно, разрушающим ацетилхолин (100 мкг ацетилхолинэстеразы на 0,2 мл цельной сыворотки). Результаты исследования показали, что стимулирующие экспрессию рецепторов лимфоцитов свойства сыворотки крови 6 больных генерализованной миастенией до и после обработки её холинэстеразой достоверно не изменились, число РОК в той и другой реакции достоверно не отличается (табл. 9).

Число розеткообразующих клеток (М ± т)

Исходное в крови донора После добавления сыворотки крови больного в разведении После добавления сыворотки крови больного, обработанной холинэстеразой, в разведении

I 110 1:20 1:10 1:20

% Абс. число в 1 мкп % Абс. число в1мкл % Абс. число в 1 мкл % Абс. число в 1 мкп % Абс. число в 1 мкп

6,8 ± 0,4 104,2 ± 8,3 26,3 ±1,9 389,9 ± 29,5 25,6 ±2,1 380,7+ | 26,0+ 33,1 | 0,9 386,0 ± 17,8 25,6 +1,1 380,5 ± 19

Р >0,05

Примечание: Р - достоверность различий между значениями при использовании интактной сыворотки больного и сыворотки, обработанной холинэстеразой.

2. Для изучения типа холинорецепторов мембраны лимфоцитов доноров, вступающих во взаимодействие с факторами сыворотки крови больного миастенией, был проведен фармакологический анализ. Изучено действие сыворотки крови 6 больных генерализованной формой миастении на рецепторы лимфоцитов донора до и после обработки их М- и Н-холинолитиками - атропином, ардуаном и их комбинацией (1 мг/мл холинолитика инкубировали с 2x106 кл/мл лимфоцитов в течение 30 мин при 37 °С).

Результаты исследования показали, что после обработки лимфоцитов донора указанными соединениями сыворотка крови больных миастенией не оказывала своего стимулирующего действия на экспрессию рецепторов. Если до обработки лимфоцитов донора атропином число РОК клеток при использовании сыворотки больных в разведении 1:10 составило 23,0 ±1,9% (102,5±5,9 в 1 мкп крови), то после блокады рецепторов холинолитиком число «розеток» достоверно (р<0,001) снизилось до 6,0+0,8% (97,2±12,6 в 1 мкл крови). Аналогичные результаты получены при внесении сыворотки больных миастенией в разведении 1:20: до блокады число РОК - 22,8±2% (369,9+26,8 в 1 мкл крови), а после блокады - 7,5+1,1% (123,4±20,2 в 1 мкл крови). По-

еле блокады рецепторов лимфоцитов донора Н- холинолинолитиком ардуаном число «розеток» также значимо (р<0,001) уменьшилось: 5,3±0,7% (86,4±11,3 в 1 мкл крови) - при разведении сыворотки 1:10 и 3,5±0,8% (55,9±14,1 в 1 мкл крови) - при разведении сыворотки 1:20. При одновременном внесении атропина и ардуана эффект блокады был также выражен: показатели соответственно равны 4,3±1% (70,2±16,6 в 1 мкл крови) и 3,8±0,8% (64,3±15,6 в 1 мкл крови).

3. Дополнительным аргументом в пользу того, что факторы сыворотки крови больного миастенией взаимодействуют с холинорецепто-рами мембраны лимфоцитов донора, являются результаты исследования с адсорбцией их из сыворотки лимфоцитами донора (0,1 мл цельной сыворотки адсорбировали 2x10® кл/мл лимфоцитов в течение 30 мин при 37 °С), предварительно обработанными ацетилхоли-ном для повышения экспрессии холинорецепторов (в конечной концентрации 2,5x10"® мг/мл). Выявлено, что стимулирующие свойства сыворотки крови 6 больных генерализованной формой миастении при этом теряются. Так, число РОК после внесения неадсорбированной сыворотки * в суспензию клеток донора в разведении 1:10 составляет 26,5±1,5% (372,0+21,3 в 1 мкл крови), а в разведении 1:20 - 27,0±2,1% (379,1+29,6 в 1 мкл крови), что значимо превышает исходный фон -8,0±0,5 % (112,3±12,3 в 1 мкл крови). Однако при применении абсорбированной сыворотки крови разведении 1:10 число РОК существенно (р<0,001) уменьшилось до 7,8 ±1,1% (110,0±15,1 в 1 мкл крови), в разведении 1:20 соответственно - 8,3±1,0 % (116,0±14,3 в 1 мкл крови).

4. Для выявления специфичности взаимодействия фактора сыворотки крови больных миастенией, обладающего стимулирующим экспрессию рецепторов эффектом, в реакции розеткообразования были использованы иные диагностикумы: эритроциты барана,

нагруженные другими медиаторами, в частности, серотонином, адреналином, гистамином.

При использовании в реакции розеткообразования ацетилхолинового диагностикума получен следующий результат: увеличение числа РОК после внесения сыворотки больного в разведении 1:10 - до 25,0±2,0 % (435,6±25,9 в 1 мкл крови) и в разведении 1 :20- до 25,4+2,1 % (430,1±25,6 в 1 мкл крови), что высоко достоверно (р<0,001) отличается от исходного значения в 6,7+0,5 % (106,1±9,1 в 1 мкл крови). Однако при использовании серотонинового диагностикума показатели оставались низкими и соответственно составили 6,1 ±0,8 % (95,3+14,2 в 1 мкл крови) и 7,6 ±1,1 % (120,4±20,0 в 1 мкл крови), что достоверно (р>0,05) не превышает исходный уровень (5,5+0,8 %; 85,3+16,8 в 1 мкл крови). При использовании адреналинового диагностикума соответствующие показатели равны 8,0±1,1% (126,7±17,1 в 1 мкл крови) и 8,8±0,9% (141,1±15,7 в 1 мкл крови), что также не существенно (0,01 <р<0,05) превышают исходное значение (5,2±0,6 %; 80,0±10,4в 1 мкл крови). С гистаминовым диагностикумом соотвествующие значения составили - 6,0±0,8 % (93,8+15,1 в 1 мкл крови) и 8,0+0,7 % (130,0±16,0 в 1 мкл крови), что незначительно выше (0,01 <р<0,05) исходного числа РОК 4,8±0,6% (76,5+11,8 в 1 мкл крови). Таким образом, фактор сыворотки крови больных миастенией избирательно стимулирует только экспрессию холинорецепторов лимфоцитов донора, которые тропны к ацетилхолину, сорбированным на эритроцитах барана.

Учитывая, что факторы сыворотки больного миастенией обладают активностью при достаточно высоком разведении сыворотки (1:10 и 1:20), можно предположить, что они являются антителами. Для окончательного подтверждения этого положения в будущем будут необходи-

мы дополнительные исследования с использованием препаративных методов современного арсенала иммунохимиии, которые выходят за рамки данной работы. Однако проведённый нами фармакологический анализ с холинолитиками указывает на то, что изученные факторы взаимодействуют с активной лигандсвязывающей областью холиноре-цепторов, либо с участками рецептора, непосредственно прилегающими к ней. Вне зависимости от природы и точных механизмов действия факторов наши исследования показывают высокую диагностическую значимость данных методов изучения свойств сыворотки крови больных миастенией в ранней диагностике и дифференциальной диагностики заболевания.

Выводы

1. Сыворотка крови больных миастенией в разведении 1:10 и 1:20 обладает свойством, повышающим экспрессию рецепторов интактных лимфоцитов крови донора.

2. Цельная сыворотки крови больного миастенией обладает антире-цепторной (блокирующей) активностью по отношению к стимулированным ацетилхолином лимфоцитам крови донора.

3. Сыворотки крови здоровых лиц, больных с заболеваниями периферической нервной системы не имеют антирецепторного и стимулирующего свойств.

4. Сыворотка крови больных с заболеваниями, имитирующими миастению также не обладает антирецепторным и стимулирующим эффектами, что может быть использовано в дифференциальной диагностике этих заболеваний с миастенией.

5. Стимулирующая экспрессию рецепторов и антирецепторная активность сыворотки крови больных миастенией определяется на всем протяжении заболевания, в том числе в дебюте миастении, зависит от степени генерализации миастенического процесса, степени тяжести и

типа течения заболевания, не имеет зависимости от возраста и пола больных, длительности миастении.

6. Определение в реакции розеткообразования свойств сыворотки крови больных миастенией, взаимодействующих с лимфоцитами донора, может использоваться в диагностике миастении, её стертых, атипичных и прозеринрезистентных форм, а также в дифференциальной диагностике миастении.

Практические рекомендации

1. Выявление стимулирующих экспрессию рецепторов и антирецептор-ных свойств сыворотки крови больных миастенией может служить дополнительным лабораторным диагностическим тестом миастении.

2. Предложенные способы диагностики миастении информативны при различном течении, разных стадиях и степени тяжести миастении, при атипичных и стертых формах заболевания и в её дебюте, независимо от пола и возраста больных и длительности заболевания.

3. Тесты, выявляющие стимулирующее экспрессию рецепторов и анти-рецеторное свойства сыворотки крови больных миастенией, могут быть использованы в дифференциальной диагностике миастении с заболеваниями, имитирующими миастению, при которых указанные свойства не выражены.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. A.A. Быкова, О.И. Селивохина, A.A. Шутов. Выявление антител к хо-линорецепторам как способ диагностики миастении // Научно - практическая конференция с участием представителей Урала и Сибири: Тез. докл./ Омск, 1997. - С. 40 - 41.

2. О.И. Селивохина. Иммунологический тест диагностики миастении // 62 научная конференция студентов и молодых ученых: Тез. докл. / Уфа, 1997.-Часть III.

3. О.И. Селивохина. Определение антител к холинорецелторам в диагностике миастении // Научно - практическая конференция молодых ученых "Актуальные вопросы современной медицины": Тез. докл./ Пермь, 1997.-С. 43-44.

4. A.A. Быкова, О.И. Селивохина, A.A. Шутов. Метод определения антител к холинорецепторам и его диагностические возможности.// Актуальные вопросы клинической и военной неврологии: Сборник трудов юбилейной научной конференции./ Санкт-Петербург, 1997. - № 44.

5. A.A. Быкова, О.И. Селивохина, A.A. Шутов. Гаптенмиметический эффект крови больных миастенией и его диагностическое значение // Материалы Международной научной конференции "Проблемы здоровья семьи - 2000": Тез. докл./ Пермь - Халкидики, 1998. - С. 81-81. (№172).

6. О.И. Селивохина. Антирецепторная активность крови больных миастенией // Научная сессия ПГМА: Тез. докл. / Пермь, 1998, - № 431 .

7. О.И. Селивохина. Влияние сыворотки крови больных миастенией на М- и Н-холинорецепторы лимфоцитов крови донора // Материалы VI съезда неврологов Пермской области: Тез. докл./ Пермь: Практическая неврология, 1998. - С. 46 - 47.

8. A.A. Быкова, О.И. Селивохина, A.A. Шутов. Влияние сыворотки крови больных миастенией на холинорецепторы лимфоцитов крови донора до и после блокады их антисыворотками против IgG и IgM // Материалы конференции "Актуальные вопросы неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики". / Уфа, 1998. -С.40-41.