Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Использование тестов аллергодиагностики IN VITRO для изучения хламидийной инфекции

На правах рукописи

sfi

//

/О*

ХАНЖИН Сергей Константинович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕСТОВ АЛЛЕРГОДИАГНОСТИКИ IN VITRO ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.7 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь - 1997

Работа выполнена в Пермской государственной медицинской академии

Научный руководитель -

доктор медицинских наук, профессор Э.С.Горовиц

официальные оппоненты:

доктор биологических наук О.Н.Октябрьский, доктор медицинских наук, профессор И.Ф.Елькин

Ведущее учреждение - Уральская медицинская академия, г.Екатеринбург

Защита диссертации состоится " Лд " _ 1997 г. -

на заседании диссертационного совета К 200.46.01 при институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии Паук (614081, г.Пермь, ул.Голева, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан " _ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

И.Б.Ившина

ЛЛ&

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Внедрение эффективных методов специфической профилактики, разработка соответствующих программ под эгидой ВОЗ привели к существенном}' снижению уровня заболеваемости целым рядом инфекций. На этом фоне стали заметнее так называемые "малые инфекции", к которым ранее относили хламидиозы. Однако накапливающиеся новые данные о биологии хламидий, тропизме, ареале распространения позволили установить, что эти микроорганизмы, отличаясь разнообразием естественных хозяев, являются причиной целого ряда инфекций, ранее относившихся к заболеваниям неясной этиологии. Это было убедительно показано на примере негонококковых, посттонококковых уретритов, кольпитов, цервицитов и других заболеваний мочеполовой сферы, а также болезни Рейтера и различных заболеваний животных (И.И. Терских, 1973; Э.С.Горовиц, 1985; И.И.Ильин,. О.В.Лысенко и др., 1992; А.А.Шаткин, М.А.Башмакова, И.И.Мавров и др., 1990).

В настоящее время доказано, что хламидии вызывают самые разнообразные по патогенезу и клиническим проявлениям заболевания, от локализованных поражений конъюнктивы и органов мочеполовой системы до генерализованных, при этом, как уже отмечалось, спектр поражений достаточно широк. Кроме того, отсутствие хозяиноспецифичности обусловливает широкую циркуляцию возбудителя (И.И.Мавров, 1994; А.А.Шаткин, И.И.Мавров, 1983).

з

Не вызывает сомнения, что успешная борьба с хламидиозами невозможна без использования эффективных методов лабораторной диагностики. Это связано с отсутствием патогномоничных симптомов при большинстве хламидийных поражений, особенно патологии урогениталыюго тракта.

На сегодняшний день наиболее распространенной и доступной является серодиагностика хламидиозов. Разработаны и выпускаются на промышленной основе специфические диагностические препараты для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции непрямой иммунофлюоресценции (рНИФ), обоснована рациональная схема выявления хламидийной патологии (О.В.Бароян, АА.Шаткин, 1979; Э.С.Горовиц, 1982; Э.С.Горовиц, С.П.Кяушас и др., 1982).

Однако применяемые методы иммунодиагностики связаны, в основном, с выявлением антител в сыворотке крови, тогда как клеточное звено иммунного ответа, по существу, осталось вне внимания исследователей. В то же время известно, что при инфекциях, возбудители которых характеризуются внутриклеточным паразитизмом, развивается клеточный иммунный ответ, в частности - гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ).

Цель исследования.

Совершенствование лабораторной диагностики

урогенитальных хламидиозов за счет использования тестов аллергодиагностики in vitro.

Задачи исследования.

1. Выявить и изучить специфическую сенсибилизацию у различных видов лабораторных животных при экспериментальной хламидийной инфекции.

2. Исследовать в условиях экспериментальной хламидийной инфекции динамику развития ГЗТ, регистрируемую тестами аллергодиагностики in vitro и определить степень корреляции этих тестов с классическими методами выяпленга аллергии.

3. Сопоставить динамику развития гуморального и клеточного иммунного ответа у лабораторных животных, зараженных разными видами хламидий. •

4. Определить диагностическую и прогностическую ценность реакций аллергодиагностики in vitro при выявлении хламидиозов у больных с разнообразной урогенитальной патологией.

Научная новизна исследования.

1. Впервые применительно к хламидиозам были адаптированы тесты аллергодиагностики in vitro (показатель повреждения нейтрофилов и реакция непрямого лейкоцитолиза).

2. На модели экспериментальной хламидийной инфекции показана высокая чувствительность и специфичность аллерготестов.

3. В тестах ППН и PHJI изучена динамика развития ГЗТ у лабораторных животных разных видов при экспериментальной хламидийной инфекции, показана прямая

коррелятивная связь динамики ГЗТ и гуморального иммунного ответа.

4. В условиях экспериментальной хламвдийной инфекции установлено, что специфическая сенсибилизация организма лабораторных животных, регистрируемая тестами ППН РНЛ, формируется в более ранние сроки, чем гуморальный иммунный ответ.

5. Впервые показана возможность применения ППН и РНЛ для диагностики хламвдийной инфекции у людей.

Практическая значимость работы:

усовершенствована методика постановки ППН для диагностики урогенитальных хламидиозов;

- показано, что тесты ППН и РНЛ могут быть использованы для изучения различных аспектов экспериментальной хламвдийной инфекции;

- изучена диагностическая ценность тестов ППН и РНЛ при урогенитальных хламидиозах у больных, показана возможность их использования для выявления данной патологии.

Внедрение в практику.

Материалы работы явились основанием для использования предложенных методов на кафедрах микробиологии и патологической физиологии ПГМА. По материалам диссертации опубликовано 2 рацпредложения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Выявлена достаточно высокая специфичность и чувствительность ППН и PHJI при экспериментальной хламидийной инфекции.

2. Гиперчувствительность замедленного типа у экспериментально зараженных животных развивается и угасает в более поздние сроки, чем гуморальный иммунный ответ.

3. Используемые тесты аллергодиагностики in vitro в равной мере, как и классический метод регистрации ГЗТ, отражают аллергическую перестройку организма при хламидиозах.

4. Тесты ППН и РНЛ наряду с серологическими методами могут быть использованы для диагностики хламидийной патологии у людей.

Апробация работы.

Работа выполнена на кафедре микробиологии ПГМА (№ госрегистрации темы 01900058062).

Основные положения диссертации изложены: на конференции молодых ученых в НПО "Биомед" "Теоретические и прикладные исследования в иммунологии" (Пермь, 1990); на IX иммунологической конференции Пермского мединститута (1994).

Диссертация апробирована на расширенном заседании проблемной комиссии "Теоретическая и прикладная иммунология" и профессорско-преподавательского состава кафедр микробиологии и патологической физиологии Пермской государственной медицинской академии.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 центральной печати.

- в

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 96 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы - материалы и методы, а также трех глав с изложением собственных результатов, заключения и выводов. В конце работы приведен библиографический указатель, включающий 186 источников (61 отечественных и 125 иностранных авторов). Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 7 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Моделью для воспроизведения экспериментальной хламидийной инфекции служили беспородные белые мыши (770 животных), мыши линии СВАхС57 FI Black (170 животных), морские свинки (30 животных). Развитие ГЗТ и гуморального иммунного ответа исследовали также у естественно инфициованных сизых голубей (16 птиц). Динамику антителообразования выявляли в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) и реакции непрямой иммунофлюоресценции (рНИФ). Специфическую сенсибилизацию организма экспериментальных животных определяли в тестах: показатель повреждения нейтрофилов (ППН) и реакция непрямого

лейкоцитолиза (РНЛ), у части животных и в реакции агломерации лейкоцитов (РАЛ).

Под наблюдением находились 124 больных, в том числе 30 с урогенитальным хламидиозом, 67 - с генитальной патологией иной этиологии, 27 детей до 1 года жизни с заболеваниями респираторного тракта, а также 14 здоровых доноров (контрольная группа). Диагноз хламидиоза ставился на основании комплексного клинико-лабораторного обследования больных. Клинические наблюдения проводили на базе Пермского областного кожно-венерологического диспансера, железнодорожной больницы, детской больницы № 13, а также врачами женских консультаций города Перми. Лабораторное обследование включало регистрацию уровня накопления специфических антител к хламидиям в РИГА и рНИФ, а также исследование мазков и соскобов с помощью люминесцирующих антител с целью индикации хламидий и их антигенов. Для регистрации ГЗТ использовали тесты ППН и РНЛ с родоспецифическим комплементсвязывающим хламидийным антигеном. Аллерготесты проводили в динамики до и после лечения больных хламидиозом. ППН ставили по методу В.А.Фрадкина (1977, 1985), используя модифицированный нами микровариант. РНЛ и РАЛ выявляли традиционными методами. РЫТА и рНИФ проводили по методике, предложенной Э.С.Горовицем и О.А.Тимашевой (1985). Индикацию антигенов хламидий в мазках проводили в рНИФ, используя антивидовую ФИТЦ-меченую иммунную сыворотку.

Все показатели, имеющие числовые значения, обрабатывали с применением методов вариационной статистики (М.Б.Славин, 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализируя данные литературы в отношении использования различных тестов аллергодиагностики in vitro, мы остановили свой выбор на ППН, PHJI и PAJI, как наиболее традиционных. В первых наблюдениях в условиях экспериментальной хламидийной инфекции на белых мышах мы сопоставили их специфичность и чувствительность с тем, чтобы в последующем использовать наиболее эффективные из них. Мышей (20 животных) заражали внутрибрюшинно, материал вводили в виде 10% овокультуры C.trachomatis, серовар L2 в объеме 0,1 мл. Как показали эти исследования, наибольший процент совпадений положительных результатов тестов аллергодиагностики in vitro с серологическими реакциями (94,1%) был у ППН и PHJI. Агломерацию лейкоцитов в положительных значениях выявляли лишь в 76,4% случаев, к тому же положительную РАЛ прослеживалась корреляция, то в отношении PAJI такой зависимости не наблюдали. В результате в последующих мы отказались от использования PAJI и применяли ППН и РНЛ, отдавая предпочтение тесту ППН, как наиболее информативному методу.

Не располагая объективными данными в отношении степени информативности различных тестов регистрации ГЗТ in vitro в сравнении с традиционными методами, в последующих экспериментальных наблюдениях на классической модели туберкулеза изучали чувствительность и специфичность ППН в сравнении с классическим методом выявления аллергии. На

ю

основании проведенных исследований была установлена достаточно высокая степень корреляции (г=0,8б) между результатами степени выраженности ГЗТ у вакцинированных БЦЖ белых мышей по ППН с одной стороны и отеком лапки - с другой.

Убедившись в достаточной результативности ППН на классической модели, в последующем мы уже в условиях экспериментальной хламидийной инфекции повторили эти исследования. Параллельно сопоставили динамику развития ГЗТ с динамикой накопления специфических антител. Данная серия экспериментов была выполнена на линейных мышах СВАхС57 FI Black, внутрибрюшинно зараженных 10% овокультурой C.trachomatis. Анализ полученных данных свидетельствовал о прямой коррелятивной зависимости между сроками и уровнем выраженности как гуморального, так и клеточного иммунного ответа, практически не зависящим от особенностей аллерготестов, используемых для регистрации ГЗТ.

В последующих сериях опытов на белых мышах мы исследовали закономерности развития ГЗТ при различных способах заражения лабораторных животных, инфицируя самцов внутрибрюшинно, что приводило к генерализованной инфекции, а самок - интравагинально в определенную стадию цикла, вызывая "локализованный" хламидиоз. При генерализованной инфекции положительные значения теста ППН выявляли уже на третьи сутки инфекции, тогда как у самок - на 5 сутки. Максимальные средние значения ППН (0,16-0,2±0,002) у обеих групп животных регистрировали на 7-14 сутки с последующим постепенным снижением. К 28 суткам ГЗТ с помощью ППН практически не выявляли. Следует подчеркнуть, что динамика ППН практически

и

совпадала с уровнем накопления специфических антител в РНГА. Однако на 21 сутки, когда ППН был отрицательным, антитела в РНГА еще выявляли.

Таким образом, при различных формах течения экспериментальной хламидийной инфекции мы наблюдали практически одинаковую тенденцию развития ГЗТ, регистрируемую в ППН. При этом положительные результаты ППН выявляли в более ранние сроки, чем специфические антитела в РНГА.

Достаточно высокая чувствительность и специфичность Г1ПН и PHJI была также подтверждена при воспроизведении адоптивного переноса ГЗТ на белых мышах. Этот феномен был регистрирован тестами ППН и PHJI. Цифровые значения соответственно составляли - 0,22±0,002 и 42,0±0,7 у всех 10 мышей-реципиентов.

В специальной серии экспериментов мы, по существу, повторили эти исследования с той лишь разницей, что хламидийную инфекцию воспроизводили на линейных мышах СВАхС57 FI Black, а развитие ГЗТ изучали параллельно с помощью ППН и PHJ1. Уровень накопления специфических антител регистрировали в рНИФ. Всего было заражено 170 мышей, материал вводили в виде 10% овокультуры C.trachomatis, серовар L2 внутрибрюшинно. Положительные результаты ППН и PHJI выявляли на 5 и 3 сутки соответственно, максимальных значений эти показатели достигали к 10-21 суткам инфекции (ППН=0,11±0,002, PHJI=45,2±0,5). После этого отмечали снижение цифровых значений обоих тестов. Специфические антитела в рНИФ выявляли на 5 сутки после заражения, а максимальный уровень их накопления наблюдали на 710 сутки.

Результаты изучения этой экспериментальной инфекции, в принципе, подтверждали предыдущие данные, наблюдались лишь некоторые расхождения в сроках развития ГЗТ. Следует подчеркнуть, что и динамика антителообразования в данном случае также была несколько иной: Максимальный уровень их приходился на 7-10 сутки инфекции. Возможно, эти различия связаны с биологическими особенностями линии животных.

Уровень и развитие специфической сенсибилизации у морских свинок изучали, заражая их более вирулентной культурой -С.ряШаа. Накопление специфических антител регистрировали в рНИФ. В этих опытах позитивные значения ППН выявляли уже на 1 сутки инфекции, что, возможно, связано с использованием в качестве инфекта другого вида хламидий, а также с биологическими особенностями организма морских свинок. В дальнейшем динамика развития ГЗТ, по существу, не отличалась от таковой у белых мышей. Максимум средних положительных значений ППН (0,26±0,003) приходился на 14 сутки инфекции. Антитела в рНИФ выявляли только на 5 сутки после заражения, в то же время они регистрировались и на 25 сутки, тогда, когда тест ППН уже был отрицательным. Вновь прослеживалась корреляция между динамикой ГЗТ и антителообразованием. Следовательно, тенденции развития аллергии и гуморального иммунного ответа при экспериментальной хламидийной инфекции у морских свинок также были одинаковыми.

В заключительной серии опытов были проведены исследования по изучению возможности применения ППН при орнитозе для выявления аллергической перестройки у сизых голубей, как основного резервуара возбудителя. Исследование крови птиц в ППН

проводили, параллельно используя в качестве диагностикума комплементсвязывающий родоспецифический хламидийный антиген и стандартный орнитозный аллерген, производственный выпуск которого прекращен, сравнивая эффективность ППН с тем и другим препаратом. Положительные значения ППН с аллергеном и антигеном были выявлены у одних и тех же птиц (43,8%). У этих же голубей регистрировали специфические антитела в РИГА. Коэффициент корреляции между ППН и РНГА г=0,71. Таким образом, с помощью теста ППН удалось выявить орнитоз и у птиц, что свидетельствует о возможности его применения для диагностики инфекции. Причем с этой целью наряду с аллергеном можно использовать и коммерческий препарат, выпускаемый Пермским НПО "Биомед" - родоспецифический комплементсвязывающий хламидийный антиген.

Основываясь на положительных результатах широкой апробации тестов аллергодиагностики in vitro в условиях экспериментальной хламидийной инфекции, мы применили ППН и PHJI для выявления специфической сенсибилизации приурогенитальной хламидийной патологии у людей. Всего было обследовано 97 взрослых с заболеваниями урогениталыгого тракта, в том числе до 1 года жизни с поражениями респираторного тракта, родившихся от матерей с различной патологией родов, с клиническим диагнозом хламидиоза. Контрольная группа -здоровые люди (доноры), состояла из 14 человек. У этих лиц во всех случаях ППН и PHJI, как и серологические реакции, были отрицательными.

Из 30 обследованных больных с диагнозом урогениталыюго хламидиоза положительные значения ППН и PHJI были выявлены

соответственно у 18 980%) и 17(56,6%) больных. Коэффициент линейной корреляции между положительными 1ШН и РНЛ и позитивными результатами РНГА и рНИФ составил 0,71. Хламидийную инфекцию чаще выявляли у больных с диагнозом негонококкового уретрита, а также у женщин с эрозией шейки матки. У части больных удалось проследить в динамике изменение показателей аллерготестов на фоне и после курса комплексного лечения хламидиоза и сопоставить их с динамикой титров антител в РНГА и рНИФ. Отмечалась прямая их коррелятивная зависимость между "падением" титров специфических антител и снижением показателей ППН и PHJI.

У больных с урогенитальной патологией иной этиологии (67 человек) при отрицательных серологических реакциях тест ППН был положительным в двух, a PHJI - в четырех случаях, причем в одном случае оба этих теста совпадали.

Из 27 обследованных детей до 1 года жизни диагноз был подтвержден серологически у 8 (29,6%). Положительные значения ШШ выявляли у 7 из этих "серопозитивных" больных, PHJI - у 6 детей (22,2%). В то же время в ряде случаев отмечались позитивные тесты ППН и РНЛ при отрицательных результатах РНГА и рНИФ.

Анализ полученных данных по комплексному обследованию больных с различной патологией урогенитального тракта, а также детей до 1 года жизни свидетельствует о возможности применения тестов аллергодиагностики in vitro для выявления ГЗТ при хламидиозах. Представляется, что сочетанное использование аллергических и серологических реакций расширит диагностические возможности в области изучения хламидийной патологии.

выводы

1. На различных экспериментальных моделях хламидийной инфекции с помощью тестов аллергодиагностики in vitro установлено формирование гиперчувствительности замедленного типа. Изучены особенности ее развития в зависимости от вида использованного штамма возбудителя и способа аппликации инфскта.

2. В условиях экспериментальной хламидийной инфекции подтверждена достаточно высокая чувствительность и специфичность ППН и РНЛ при адоптивном переносе ГЗТ.

3. Выявлена прямая коррелятивная зависимость между результатами теста ППН и Классического метода регистрации ГЗТ при экспериментальном хламидиозе.

4. В серии широких экспериментальных наблюдений установлено соответствие динамики развития ГЗТ, регистрируемой тестами аллергодиагностики in vitro, и динамикой накопления специфических иммуноглобулинов.

5. Показана возможность использования для постановки ППН и РНЛ в качестве диагностического препарата родоспецифического комплементсвязывающего хламидийного антигена.

6. Тесты аллергодиагностики in vitro: ППН и РНЛ могут быть использованы для выявления хламидийной инфекции у больных людей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фагоцитарная активность нейтрофилов при экспериментальной хламидийной инфекции / Е.Н.Харина, Е.И.Самоделкин, Э.С.Горовиц, Ю.Н.Маслов, О.А.Тимашева, С.К.Ханжин, В.В.Леденцов // Тезисы докладов. - Челябинск, 1988. - С.39-40.

2. Изучение некоторых показателей гуморального и клеточного иммунного ответа у белых мышей при хламидийной генитальной инфекции / Э.С.Горовиц, Ю.Н.Маслов, О.А.Тимашева, С.П.Кяушас, Е.Н.Харина, С.К.Ханжин,

B.В.Леденцов // Депонирована в ВИНИТИ 03.01.90. - № 20-В90.

3. С.К.Ханжин, Е.Н.Харина, Ю.Н.Маслов. Использование показателя повреждения нейтрофилов для оценки уровня сенсибилизации организма при экспериментальной хламидийной инфекции // Теоретические и прикладные исследования в иммунологии: Тезисы докладов научно-практиеской конференции молодых ученых. - Пермь, 1990. -

C.30-31.

4. Е.Н.Харина, С.К.Ханжин, О.В.Пашковская. Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов при орнитозной инфекции // Там же. - С.29-30.

5. С.К.Ханжин, М.И.Боброва. Использование теста ППН для оценки уровня сенсибилизации при экспериментальной хламидийной инфекции // Профилактическая медицина.

Состояние и перспективы: Тезисы докладов. - Ленинград, 1991.-С.122.

6. Тест ППН: оценка диагностического значения при урогенитальных хламидиозах / С.К.Ханжин, Э.С.Горовиц, Ю.Н.Маслов, Е.Н.Харина и др. // Иммунологические реакции в диагностике, профилатике и эпидемиологическом надзоре за инфекционными болезнями. - Пермь, 1991. - С.27-30.

7. Иммунный ответ при экспериментальной хламидийной инфекции / Э.С.Горовиц, С.П.Кяушас, С.К.Ханжин, О.А.Тимашева и др. // Журн.микробиол. - 1993. - № 6. - С.95-96.

8. С.К.Ханжин. Применение реакции непрямого лейкоцитолиза при экспериментальной хламидийной инфекции // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тезисы докладов XII Российской научной конференции. - Челябинск, 1995. - С.113-114.

_шно в печать 15.05.97. Форм:: •»'К84,/|». Объем 0,75 уч.-игд. л.

______Тираж 100.

1\илкцик ' ¡срмского медицинского журнала" Пер :,. \л.Большевистская, 85 - 604