Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Использование стволовых клеток пуповинной крови крыс при воспалительно-деструктивных процессах десны

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ КРЫС ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ДЕСТРУКТИВНЫХ ПРОЦЕССАХ ДЕСНЫ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.14 - стоматология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

15 ЯН8 2015

Красноярск-2015

005557153

005557153

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Алямовский Василий Викторович Научный консультант: кандидат медицинских наук

Шестакова Людмила Анатольевна

Официальные оппоненты:

Медведев Юрий Алексеевич - доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, заведующий кафедрой

Железный Павел Александрович - доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра стоматологии детского возраста, заведующий кафедрой

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «26» февраля 2015 года в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.037.03 при ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России по адресу: 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на сайте ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, http://www.krasgmu.ru

Автореферат разослан » О^Уч&^^О 14 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор ^^ Горбач Наталья Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Проблемы, связанные с заболеваниями пародонта, занимают одно из центральных мест в стоматологии. Они широко распространены, поражают преимущественно работоспособную часть населения и приводят, в конечном итоге, неизбежной утратой зубов. Медикаментозное лечение воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта малоэффективно, и практическая стоматология не располагает достаточным набором средств широкого спектра действия. В связи с этим необходимым является поиск новых методов лечения, одним из которых может стать клеточная терапия с использованием гемопоэтических стволовых клеток.

В настоящее время в лечении заболеваний пародонта применяется достаточно большой спектр фармакологических средств. Это, прежде всего, различные антимикробные лекарственные препараты (антибиотики, антисептики, противогрибковые и антипротозойные) (А. И. Грудянов с соавт., 2001; И.А.Горбачева, 2004; В.В.Новиков, 2009). Набор лекарственных форм, используемых для местного применения, также достаточно обширен. Препараты применяют в виде растворов, суспензий, паст, аэрозолей, полосок из полимерных материалов, содержащих лекарственное вещество (Л.А.Александрова, 2001; А И. Грудянов, 2004; О. Н. Бронников с соавт., 2005; В. С. Мелихова с соавт., 2007). Наряду с этим, остается проблема создания не только адекватной, но и пролонгированной локальной концентрации препаратов.

Пуповинная кровь как источник гемопоэтических стволовых клеток обладает рядом преимуществ, среди которых быстрая и безболезненная процедура сбора; возможность получения и длительного хранения аутологичных, родственных и неродственных аллогенных образцов, тестированных и НЬА-типированных, непосредственно готовых к использованию; сниженная вероятность развития острой и хронической формы реакции трансплантат против хозяина; возможность проведения трансплантаций с неполной НЬА-совместимостью; сниженная вероятность

вирусной контаминации трансплантата; возможность получения образцов от представителей редких этнических меньшинств и детей от смешанных браков (J.Zhang, 2003; F. Arai et al., 2004; G. Polimeni et al., 2004; С. V. Weaver et al., 2008; M. J. Haller, 2009).

Стволовые клетки крови плода имеют большой дифференцирующий потенциал и могут быть использованы в разработке репаративных технологий для практической стоматологии. Также стоит отметить простоту сбора клеток, в сравнении со стволовыми клетками костного мозга, и соблюдение этических норм в использовании стволовых клеток пуповинной крови. В целом, создание новых и оптимизация существующих методов трансплантации стволовых клеток и последующее их внедрение в клиническую стоматологию позволят повысить эффективность терапии заболеваний пародонта и улучшить качество жизни пациентов.

Наиболее часто воспалительное-деструктивные процессы наблюдаются вначале в десневой части пародонта, затем они приводят к поражению альвеолярных отростков костей челюстей, разрушению периодонта и потере зубов. Лечению они поддаются очень плохо.

Цель исследования: научное обоснование и разработка метода лечения воспалительно-деструктивных процессов десны с использованием стволовых клеток пуповинной крови крыс.

Задачи исследования:

1. Усовершенствовать способ выделения стволовых клеток пуповинной крови крыс и разработать метод лечения воспалительно-деструктивных процессах десны у животных.

2. Исследовать способность стволовых клеток дифференцироваться в ткани десны.

3. Сравнить репаративные возможности тканей десны при различных методах лечения пародонтита.

4. Разработать практические рекомендации по получению стволовых клеток пуповинной крови для использования в лечении заболеваний пародонта.

Научная новизна. Впервые в стоматологии использованы эффективный метод лечения воспалительно-деструктивных процессах десны и способ выделения стволовых клеток - автоматическая сепарация стволовых клеток.

Впервые проведена сравнительная оценка эффективности предложенного метода использования стволовых клеток пуповинной крови с известными лекарственными средствами и медицинскими изделиями у экспериментальных животных. Установлена высокая эффективность использования стволовых клеток пуповинной крови в лечении воспалительно-деструктивных процессов десны у животных.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана модификация способа получения стволовых клеток пуповинной крови, что позволяет рекомендовать его для использования при проведении клинико-морфологических исследований, направленных на совершенствование подходов к лечению воспалительных и деструктивных заболеваний пародонта.

Полученные результаты используются в учебном процессе вузовской подготовки и дополнительного профессионального образования по специальностям: «Стоматология» и «Патологическая анатомия».

Положения, выносимые на защиту

1. Усовершенствованный способ выделения стволовых клеток позволяет получить стволовые клетки, пригодные для использования в лечении воспалительно-деструктивных процессах десны у животных.

2. Стволовые клетки пуповинной крови дифференцируются в ткани десны при лечении экспериментального пародонтита у животных.

3. Установлена высокая эффективность использования стволовых клеток пуповинной крови крыс в лечении воспалительно-деструктивных процессов десны у животных.

Степень достоверности и апробация результатов работы. Работа выполнена по классической схеме статистического исследования. Объекты исследования стандартизированы по линии Вистар. Исследования проводились в надлежащих лабораторных условиях с применением измерительных приборов откалиброванных по соответствующим ГОСТам. Полученные данные зафиксированы в протоколах исследования и занесены в электронную базу данных. Статистическая обработка выполнена с применением традиционных методов описательных и сравнительных статистик, на лицензионной программе SPSS 22 версии.

Основные положения диссертации были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Сибирский стоматологический форум» (Красноярск, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» (Киров, 2014), а также на заседании проблемной комиссии по стоматологии и оториноларингологии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России (Красноярск, 2014).

По материалам исследования опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных изданиях, 1 методические рекомендации («Технология получения концентрата стволовых клеток пуповинной крови для использования в стоматологии»).

Личное участие автора. Автором лично проводился поиск и анализ литературы по теме диссертации, воспроизведена модель экспериментального пародонтита на животных, осуществлялось выделение и забор стволовых клеток пуповинной крови крыс, дана оценка эффективности методов лечения экспериментального пародонтита и

обосновано их применение. Результаты исследования автором систематизированы и представлены в методических материалах, внедрены в учебный процесс.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа содержит 13 таблиц, 29 рисунков. Список литературы включает 58 отечественных и 138 зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обосновывается актуальность исследования, сформулированы цель и задачи, научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы и положения, выносимые на защиту.

В первой главе на основании данных отечественной и зарубежной литературы рассмотрены этиология и патогенез заболеваний пародонта, проанализированы существующие методы лечения, а также обоснована необходимость создания новых эффективных методов лечения воспалительных-деструктивных процессов в пародонте, в том числе и использование стволовых клеток пуповинной крови.

Вторая глава посвящена материалам и методам исследования. Исследования проводились на базе вивария ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России. Для исследования были взяты экспериментальные животные — крысы линии Вистар: половозрелые самцы и 5 самок в возрасте от восьми месяцев до года и массой тела от 180 до 200 граммов. Общая численность животных составила 40 особей. Экспериментальных животных случайным образом распределяли в клетки по 10 особей в каждую группу. Все животные находились на одинаковом пищевом рационе и проходили предоперационную подготовку в течение

12 часов до операции (моделирование пародонтита), не получали пищу при свободном доступе к воде. Все экспериментальные животные к началу исследования имели интактную слизистую оболочку полости рта, без видимых патологических изменений: отсутствие кровоточивости десны и наличия экссудата при пальпации. Патологическая подвижность резцов нижней челюсти отсутствовала, глубина зубодесневого соединения в среднем у животных составляла (1,0 ± 0,017 мм).

Все манипуляции с животными проводили в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» № 1045-73 от 06.04.1973, Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях (г. Страсбург, Франция, 1986), Директивой Совета 86/609/ЕЕС от 24.11.1986.

При создании модели пародонтита у экспериментальных животных использовали методику моделирования экспериментального пародонтита у крыс (С. П. Рубникович, 2011). При операциях на животных использовали ингаляционный эфирный наркоз. Состояние слизистой оболочки десны и глубину зубодесневых карманов оценивали с 1 по 14 день создания модели пародонтита.

Оценку развития воспалительных изменений в пародонте животных производили по наличию кровоточивости при пальпации десны. Пародонтологическим зондом измеряли глубину зубодесневых карманов, а также наблюдали наличие и характер отделяемого из них, наличие или отсутствие патологической подвижности резцов нижней челюсти.

Лабораторный этап эксперимента предусматривал выделение концентрата стволовых клеток из пуповинной крови крысы путём центрифугирования.

Экспериментальные животные были разделены на 4 группы:

группа 1 (не получавшие лечения) - естественное течение модели экспериментального пародонтита;

группа 2 - на 14 день модели экспериментального пародонтита в область середины альвеолярного отростка, между резцами нижней челюсти, в слизистую оболочку десны вводили антибиотик широкого спектра действия - 30 % раствор линкомицина гидрохлорида в течение 7 дней по 1 мл.

группа 3 - на 14 день производили однократное введение суспензии из стволовых клеток по 1 мл.

группа 4 — на 14 день модели экспериментального пародонтита в исследуемую область однократно вводили биоматериал «Аллоплант», по 1 мл.

Перед созданием модели пародонтита из каждой группы было выведено из эксперимента по одной особи для сравнения здоровых тканей десны (контроль — контрольные показатели) с течением патологических процессов и сравнения динамики репаративных процессов после введения препаратов животным.

После выведения животных из эксперимента проводили препарирование и выделение нижних челюстей, из которых образцы тканей десны помещали в 10% забуференный формалин, с дальнейшим обезвоживанием в батарее спиртов и изготовлением парафиновых блоков. Наряду с обзорной окраской гематоксилином и эозином срезы толщиной 4-6 мкм окрашивали по Ван Гизону и орсеином по Унна-Тенцеру. Светооптическое исследование и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе «Axiostar» (Германия) при увеличении (х 200 и х 400). Морфометрическое исследование полученных срезов проводили при помощи программы «Image Tool»: сфотографированные в цифровом формате срезы (при увеличении х 200 и х 400) вводили в компьютер (операционная система Windows ХР) в формате BMP и посредством

копирования из буфера обмена анализировали данной программой. В отношении каждого случая производили измерение заданных критериев в 10 полях зрения. Всего было изучено 120 гистологических препаратов.

Для отображения количественных показателей использовали среднее (М), стандартную ошибку среднего (ш). Для отображения качественных параметров (цвет и состояние десны, кровоточивость, характер отделяемого, подвижность) использовали количество животных с данным признаком в процентах от общего их числа и среднюю ошибку коэффициента.

Для выбора методов статистического анализа использовали оценку параметров распределения количественных показателей по критерию Шапиро - Уилкса.

Для сравнения учетных признаков, соответствовавших нормальной функции распределения и равенству дисперсий, применяли однофакторный дисперсионный анализ с последующим межгрупповым сравнением по критерию Шеффе.

Для непараметрических учетных признаков общегрупповые различия оценивали с помощью критерия Краскела - Уоллиса и попарно по U-критерию Манна-Уитни (Mann - Whitney). Внутригрупповые различия зависимых переменных (для парных сравнений в группах) оценивали с помощью критерия Уилкоксона (Wilcoxon-test).

Качественные показатели межгрупповых различий оценивали с помощью критерия %2 и точного критерия Фишера.

Различия между выборками считали статистически значимыми при р < 0,05.

Обработку статистических данных проводили с помощью пакета статических программ SPSS 22.0 for Windows.

В третьей главе проанализированы и представлены результаты собственного исследования тканей десны животных. В течение первой

недели эксперимента в десне у всех животных регистрировались клинические признаки воспаления. Отмечались отек и гиперемия слизистой оболочки десны.

На 14 сутки в группа (1, 2, 3, 4) воспалительные изменения слизистой оболочки десны и зубодесневого прикрепления нарастали: у всех животных с экспериментальным пародонтитом появились кровоточивость и серозно-гнойное отделяемое из зубодесневых карманов и образование свищей в поднижнечелюстной области. Гистологически свищи были представлены очагом некроза десневой части пародонта, отграниченного от окружающих тканей зоной демаркационного воспаления.

В группе 1 на 7 сутки эксперимента отмечались: обильная кровоточивость из зубодесневых карманов при средней глубине (3,36 ± 0,14 мм), наблюдалось серозно-гнойное отделяемое, III степень подвижности резцов нижней челюсти.

К 14 суткам эксперимента у трех крыс этой группы наблюдались свищи в ткани поднижнечелюстной области, с обильным гнойным отделяемым, с летальным исходом.

У остальных особей этой группы сохранялись кровоточивость из зубодесневых карманов и серозное отделяемое. Патологическая подвижность резцов нижней челюсти - II степени. Средняя глубина зубодесневых карманов в группе 1 на 14 сутки эксперимента составила (2,70 ± 0,20 мм).

Гистологически в исследуемом материале этой группы животных в десне отмечались признаки острого серозно-гнойного воспаления: полнокровие сосудов, выраженный отек, набухание и деструкция волокнистого компонента, диффузная инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами, с примесью эозинофильных гранулоцитов, макрофагов и лимфоцитов. Перифокапьно в десне серозное воспаление, с выраженным отеком тканей.

На 21 сутки эксперимента у особей группы 1 в тканях десны гистологически наблюдалось снижение доли клеточного компонента и образование зрелой соединительной ткани, представленной коллагеновыми волокнами, с небольшой долей межклеточного вещества. Патологическая подвижность резцов нижней челюсти отсутствовала. Средняя глубина зубодесневых карманов составила (2,47 ± 0,27 мм).

В группе 2 экспериментальных животных на 14 сутки создания модели пародонтита отмечалось нарастание экссудативного воспаления. Появились кровоточивость и серозно-гнойное отделяемое из зубодесневых карманов, регистрировалась патологическая подвижность резцов нижней челюсти III степени. Глубина зубодесневого кармана при измерении увеличилась до (2,65 ± 0,12 мм).

При гистологическом исследовании образцов десны экспериментальных животных группы 2 отмечались признаки, характерные для механической деструкции тканей: некроз, кровоизлияния, миграция нейтрофильных гранулоцитов, макрофагов.

После инъекций 30 % раствора линкомицина гидрохлорида, на 7 сутки эксперимента, у животных данной группы сохранялась кровоточивость и серозно-гнойное отделяемое из зубодесневых карманов, подвижность фронтальных резцов нижней челюсти II степени. Средняя глубина зубодесневых карманов в этой группе на 7 сутки эксперимента составила (2,47 ± 0,09 мм). У данной группы животных в зоне экспериментального пародонтита морфологическая картина характеризовалась образованием грануляционной ткани. Клеточный компонент представлен полиморфно-ядерными лейкоцитами, макрофагами, пролиферирующими фибробластами, единичными лимфоцитами.

На 14 сутки эксперимента (после недели инъекций 30% раствора линкомицина гидрохлорида) у животных сохранялось серозное отделяемое и кровоточивость при пальпации десны. Патологическая подвижность резцов нижней челюсти - I степени. Средняя глубина зубодесневых

карманов в этой группе составила (2,48 ± 0,12 мм). У этой группы животных на микросрезах отмечалось образование грануляционной ткани. Клеточный компонент был представлен нейтрофильными гранулоцитами, макрофагами, пролиферирующими фибробластами, единичными лимфоцитами. У одного животного наблюдали образование свища в поднижнечелюстную область, с обильным гнойным отделяемым. Развившееся острое гнойное воспаление в десне закончилось летальным исходом.

На 21 сутки эксперимента у животных данной группы признаков воспаления отмечено не было, подвижность резцов нижней челюсти отсутствовала. Средняя глубина зубодесневых карманов в этой группе на 21 сутки эксперимента составила (2,22 ± 0,13 мм). В исследуемом материала наблюдается образование рыхлой волокнистой соединительной ткани с большим количеством коллагеновых волокон.

У животных 3 группы на 14 сутки модели пародонтита признаки воспаления нарастали. Появились кровоточивость и серозно-гнойное отделяемое при пальпации десны, патологическая подвижность резцов нижней челюсти III степени. Глубина зубодесневых карманов при измерении в среднем составила (2,73 ± 0,12 мм).

На 7 сутки эксперимента у животных 3 группы отмечено появление признаков острого воспаления: серозное отделяемое при пальпации десны, зубодесневые карманы, глубина которых составляла (2,20 ± 0,11 мм), подвижность резцов нижней челюсти — I степени. В данной группе отмечалось образование грануляционной ткани. Клеточный компонент представлен полиморфно-ядерных лейкоциов, макрофагами, пролиферирующими фибробластами, единичными лимфоцитами. Отмечено краевое появление преэластических волокон.

На 14 сутки эксперимента у животных при пальпации десны отделяемого не наблюдали. В этой группе средняя глубина зубодесневых карманов на 14 сутки эксперимента составила (1,72 ± 0,06 мм); кровоточивость и подвижность резцов нижней челюсти отсутствовали.

В 3 группе животных зафиксировано образование молодой соединительной ткани, представленное коллагеновыми волокнами с появлением преэластического компонента. Отмечена тенденция к полной репарации десны; определяются компоненты ткани, соответствующие нормальному гистологическому строению, с наличием пролиферирующих фибробластов и снижением количества полиморфно-ядерных лейкоцитов, макрофагов и лимфоцитов.

На 21 сутки эксперимента у животных серозное отделяемое и кровоточивость при пальпации десны, патологическая подвижность резцов нижней челюсти - отсутствовали. Средняя глубина зубодесневых карманов в этой группе составила (1,48 ± 0,04 мм).

В 3 группе за счет активной миграции полиморфно-ядерных лейкоциов и макрофагов, удовлетворительной фагоцитарной активности фибробластов произошла адекватная репарация - образование молодой соединительной ткани, содержащей коллагеновые и преэластические волокна. В основе этого процесса лежит сбалансированная деградация коллагена, которая предотвращает образование грубой соединительной ткани (рисунки 1, 2).

Рисунок 1 - Коллагеновые волокна десны экспериментальных животных 3 группы на 21 сутки эксперимента. Окраска по Ван Гизону

Рисунок 1 а (Ув. х 200)

Рисунок 16 (Ув. х 400)

Соотношение коллагеновых и преэластических волокон составило — 3:1. В данной группе отмечена выраженная динамика репаративных процессов в тканях десны по сравнению с 1 и 2 группами.

Рисунок 2а (Ув. х 200) Рисунок 26 (Ув. * 400)

Рисунок 2 - Преэластические волокна десны экспериментальных животных 3 группы на 21 сутки эксперимента.

Окраска орсеином по Унна-Тенцеру

В 4 группе экспериментальных животных с первого по четырнадцатый день исследования (модель экспериментального пародонтита) наблюдали нарастание воспалительных изменений в десне, так же, как и в предыдущих трех группах. Животным этой группы на 14 день эксперимента вводили «Аллоплант», 1 мл, однократно.

На 14 сутки модели пародонтита у животных наблюдалась кровоточивость при пальпации десны. Средняя глубина зубодесневых карманов в данной группе составила (2,77 ± 0,13 мм), при пальпации десны наблюдали серозно-гнойное отделяемое, также регистрировали патологическую подвижность резцов нижней челюсти III степени.

При гистологическом исследовании образцов десны экспериментальных животных 4 группы в полученном материале наблюдали деструкцию десны, с миграцией нейтрофильных гранулоцитов и макрофагов в область деструкции.

На 7 день эксперимента, после введения «Аллопланта», кровоточивость при пальпации слизистой оболочки десны сохранялась. Отделяемое при пальпации десны также сохранялось, но имело серозный характер. Подвижность резцов нижней челюсти - II степени. Средняя глубина зубодесневых карманов в 4 группе на 7 сутки эксперимента составила (2,73 ± 0,17 мм). В данной группе отмечалось образование грануляционной ткани, а клеточный компонент был представлен полиморфно-ядерными лейкоцитами, макрофагами, пролиферирующими фибробластами, единичными лимфоцитами.

На 14 день эксперимента при пальпации десны наблюдали кровоточивость и серозное отделяемое. Патологическая подвижность резцов нижней челюсти - I степени. Средняя глубина зубодесневых карманов в 4 группе на 14 сутки эксперимента составила (2,45 ±0,18 мм). В указанной группе наблюдали менее интенсивное, по сравнению с 3 группой, увеличение удельного веса волокнистого компонента, пролиферирующих фибробластов.

На 21 день эксперимента в 4 группе кровоточивость и отделяемое при пальпации десны отсутствовали. Средняя глубина зубодесневых карманов в 4 группе на 21 сутки эксперимента составила (2,05 ± 0,11 мм); подвижность резцов нижней челюсти отсутствовала.

В 4 группе наблюдалось образование молодой соединительной ткани, с выраженной функциональной активностью фибробластов и соотношением коллагеновых и преэластических волокон 5:1.

Таким образом, исследования показали, что у всех оперированных животных в течение двух недель после операции наблюдалось развитие острого воспаления в тканях десны. На 14 сутки модели экспериментального пародонтита у животных всех групп появилось серозно-гнойное отделяемое из зубодесневых карманов, глубина которых увеличилась. Наблюдалась патологическая подвижность резцов нижней челюсти I - II степени. Введение стволовых клеток и «Аллопланта» животным 3 и 4 групп сопровождалось наибольшим

противовоспалительным и репаративным эффектом у экспериментальных животных 3 группы.

При гистологической оценке в 1 группе (наличие у экспериментальных животных воспалительно-деструктивных изменений в десне, отсутствие введения препаратов) в тканях десны зарегистрированы очаги воспалительной деструкции. При течении пародонтита у животных 1 группы в 100 % случаев наблюдали неполную регенерацию десны (у 3 крыс). Естественное течение пародонтита привело к летальному исходу 3 животных.

Использование 30 % раствора линкомицина гидрохлорида при воспалительно-деструктивных процессах в тканях десны оказалось эффективным только у 6 особей из 9. На наш взгляд, это обусловлено тем, что процессы регенерации реализуются через нивелирование процессов воспаления. На этапе регенерации происходило формирование молодой соединительной ткани, в которой преобладал коллагеновый компонент.

Во 2 группе исследования в 100 % случаев течение заболевания завершилось неполной регенерацией тканей десны (у 5 крыс). На 14 сутки — летальный исход зарегистрирован у 1 особи.

Использование материала «Аллоплант» и стволовых клеток показало хорошую терапевтическую эффективность и схожие результаты процессов репарации десны.

Введение стволовых клеток пуповинной крови исследуемым животным сопровождалось полной регенерацией повреждённых тканей десны. Это подтверждает тот факт, что стволовые клетки обладают не только регенеративным потенциалом, но и иммуностимулирующим и противовоспалительным действиями. В зоне регенерации образовалась зрелая соединительная ткань, в которой соотношение коллагенового и преэластического компонентов составило 3:1.

Использование биоматериала «Аллоплант» оказалось эффективным у 8 особей из 9. В конце эксперимента было отмечено образование зрелой

соединительной ткани, в которой соотношение коллагеновых и преэластических волокон составило 5:1.

Статистический анализ сравнения глубины зубодесневых карманов позволяет говорить о наличии статистически значимых различий (р < 0,001) между группами сравнения начиная с 7 дня до конечной точки измерения.

Попарное сравнение глубины зубодесневого кармана между группами на 7 день позволяет определить статистически значимые различия между 1 группой и группами 2, 3, 4. На 14 и 21 день имелись статистически значимые различия между 3 группой и группами 1, 2, 4. Нулевая гипотеза не отвергается только в следующих случаях:

— группа без лечения / группа с применением 30 % раствора линкомицина гидрохлорида,

— группа без лечения / группа с применением материала «Аллоплант» и 30 % раствора линкомицина гидрохлорида,

— группа без лечения / группа с применением материала «Аллоплант».

Сказанное свидетельствует о том, что с момента начала эксперимента до введения препаратов глубина зубодесневых карманов увеличивалась равномерно во всех группах (р = 0,819).

После инъекций 30 % раствора линкомицина гидрохлорида, стволовых клеток и «Аллопланта» патологическая глубина зубодесневых карманов во всех группах уменьшалась неравномерно. Согласно статистическим показателям наибольший репаративный эффект наблюдался у экспериментальных животных 3 группы - средняя глубина зубодесневых карманов на 21 сутки эксперимента составила (1,48 ± 0,04 мм).

Изучение количества коллагеновых и преэластических волокон в тканях десны на 21 день эксперимента позволяет говорить о наличии статистически значимых различий (р < 0,001).

На 21 день количество коллагеновых волокон в 1 группе составило -(56,62 ± 1,59); во 2 группе - (65,59 ± 0,67); в 3 группе - (45,96 ± 0,46); в 4 группе - (45,94 ± 0,38). Эти данные позволяют определить статистически значимые различия между группами 1 и 3, 1 и 4, 2 и 3. Статически не значимы различия между группами 3 и 4. На 21 сутки количество преэластических волокон в 3 группе составило (10,34 ± 0,18); в 4 группе -(9,08 ±0,16), что позволяет определить статистически не значимые различия между группами 3 и 4. Данный результат отражает то, что в 1 и 2 группах наблюдается наибольшее количество коллагеновых волокон и отсутствие преэластических волокон.

Наиболее близкое к контрольным показателям количество коллагеновых (46,08 ±0,75) и преэластических (11,73 ±0,31) волокон наблюдалось у экспериментальных животных 3 группы. Количество коллагеновых волокон в этой группе составило (45,96 ± 0,46), а преэластических волокон (10,34 ± 0,18).

Количество преэластических волокон на 21 день, по сравнению с контрольными показателями, указывает на наличие статистически значимых различий как для стволовых клеток, так и для материала «Аллоплант». На основании статистических данных можно сказать о том, что в группах 3 и 4 количество преэластических волокон статистически значимо не отличается от контрольной группы, что свидетельствует о качестве репаративных процессов в десне животных.

Результаты изучения количества коллагеновых волокон в тканях десны на 21 день эксперимента, в сравнении с контрольным показателям, свидетельствуют о наличии статистически значимых различий для групп 1 и 2. Из этого следует, что гистологическое строение десны в группах 3 и 4 близко к контрольным показателям. В группах 1 и 2 количество коллагеновых волокон статистически значимо больше, чем в контрольных показателях, что свидетельствует о формировании грубоволокнистой соединительной ткани.

На основании статистических данных можно сказать, что в группах 3 и 4 количество коллагеновых волокон приближенно к контрольным показателям, что подтверждает качество репаративного процесса в группах со стволовыми клетками и материалом «Аллоплант».

Попарное сравнение толщины (мкм - микрометр) преэластичеческих волокон между 3 и 4 группами позволило определить статистически значимые различия по всем дням измерений, что свидетельствует о более выраженных процессах репарации.

В частности, для групп 3-7 день (0,80 ± 0,09), 14 день (1,19 ± 0,19), 21 день (1,6 ±0,08) и 4-7 день (0,20 ±0,02), 14 день (0,59 ± 0,05), 21 день (0,85 ± 0,03) выявлено статистически значимое увеличение толщины преэластических волокон, что говорит о положительной динамике репаративного процесса в этих группах.

Сравнение толщины (мкм - микрометр) коллагеновых волокон по дням позволяет говорить о наличии статистически значимых различий (р = 0,005) между группами только на 21 день измерения. Попарное сравнение между группами на 21 день позволяет определить статистически значимые различия в группах: 1 - (4,61 ± 0,20) и 2 - (5,49 ± 0,16).

Сравнение толщины преэластичеческих волокон между контрольными показателями и остальными экспериментальными животными в группе с использованием стволовых клеток в сочетании с материалом «Аллоплант» позволило установить статистически значимые различия, заключающиеся в меньшей толщине преэластических волокон на 21 день у животных групп: 3 - (1,6 ±0,08) и 4 - (0,85 ±0,03) в сравнении с контрольными показателями 3 - (3,67 ±0,35) и 4 -(3,58 ±0,38).

Сравнение толщины коллагеновых волокон у животных экспериментальных групп на 21 день позволило установить отсутствие статистически значимых различий в сравнении с контрольными показателями.

Следует отметить, что в группах животных 3 - (4,95 ±0,14) и 4 -(4,97 ±0,15) количество коллагеновых волокон статистически значимо приближено к контрольным показателям 3 - (5,10 ±0,48) и 4 -(5,10 ±0,31), что свидетельствует о качестве репаративного процесса в группе с использованием стволовых клеток и материала «Аллоплант».

Проведенная оценка степени подвижности резцов нижней челюсти в группах животных свидетельствует об отсутствии различий между группами животных на 14 день. Через 7 дней появляются значимые различия по факту снижения подвижности до 1 степени при применении стволовых клеток в сочетании с материалом «Аллоплант». К 21 дню эксперимента отмечены значимые различия между всеми группами, кроме 1 группы.

Анализ характера отделяемого из зубодесневых карманов выявил статистически значимые отличия на 14 день эксперимента между частотой выявления серозного отделяемого в группах с использованием стволовых клеток и материала «Аллоплант». На 7 день значимые отличия, по встречаемости гнойного отделяемого, отмечались для групп 1-3 и 3-4. На 14 сутки установлены существенные различия по признаку прекращения выделений из зубодесневых карманов между группой с использованием стволовых клеток и остальными группами наблюдения. К 21 дню эксперимента во всех изучаемых группах, за исключением группы без лечения (р < 0,05), отмечалось прекращение выделений из зубодесневых карманов, что свидетельствует об устранении воспалительных явлений в десне животных групп 2, 3 и 4. При этом следует отметить, что к 14 дню отмечалось 3 летальных случая в 1 группе, что объясняет отсутствие случаев гнойного выделения при оценке результатов данного дня.

Изучение показателей кровоточивости десны показало ряд характерных особенностей, выявленных у животных экспериментальных групп, что позволяет говорить о проявлении значимых различий только с 14 дня эксперимента, между группой с использованием стволовых клеток и остальными группами. Различия между группами наблюдались до

последнего дня исследования. К 21 дню эксперимента во всех изучаемых группах, за исключением группы без лечения (р < 0,05), отмечалось прекращение кровоточивости десны.

Анализ показателей летальности в группах экспериментальных животных свидетельствует о том, что случаи летальных исходов были отмечены только на 14 день эксперимента, без наличия статистически значимых различий.

Таким образом, проведенный анализ гистологических данных тканей десны экспериментальных животных позволил установить наиболее высокие показатели эффективности лечения воспалительно-деструктивных процессов десны в случае сочетанного использования стволовых клеток и биоматериала «Аллоплант». Самые низкие показатели состояния десны были получены в группе животных, не получавших лечения после формирования модели экспериментального пародонтита.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован способ выделения стволовых клеток пуповинной крови крыс за счет оптимизации забора биоматериала и алгоритма его центрифугирования, что позволило получить концентрат стволовых клеток и в последующем разработан метод лечения воспалительно-деструктивных процессов десны у животных.

2. Установлена способность дифференцирования стволовых клеток пуповинной крови в ткани десны. У всех особей животных в конце эксперимента наблюдались процессы полной регенерации клеточно-волокнистого компонента, подтвержденные его качественным составом при соотношении коллагеновых и преэластических волокон 3:1, что соответствует гистологической норме и демонстрирует факт наличия высокого дифференцировочного потенциала полученных стволовых клеток.

3. Сравнительная оценка репаративных возможностей при применении 30 % раствора линкомицина гидрохлорида, биоматериала

«Аллоплант» и стволовых клеток пуповинной крови показала, что использование линкомицина гидрохлорида при воспалительно-деструктивных процессах в десне не приводит к нормализации состава клеточно-волокнистого компонента к 21 суткам. Лечение оказалось эффективным в 66,7 % случаев.

При использовании биоматериала «Аллоплант» в конце эксперимента отмечено образование молодой соединительной ткани, в которой соотношение коллагеновых и преэластических волокон отличается от гистологической нормы и соответствует 5:1, что свидетельствует о неполной регенерации тканей десны.

Использование стволовых клеток пуповинной крови крысы при воспалительно-деструктивных процессах в десне оказалось высокоэффективным, что подтверждается фактами формирования качественного состава клеточного компонента на 21 сутки от начала экспериментального лечения.

4. Разработанные практические рекомендации по получению концентрата стволовых клеток пуповинной крови позволят унифицировать технологию их выделения для последующего использования в стоматологической практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанный метод лечения воспалительно-деструктивных процессов десны у крыс позволяет распространить опыт для организации дальнейших экспериментально-клинических исследований в области лечения заболеваний пародонта.

Изученные исследовательские подходы настоящего исследования следует использовать в учебном процессе интернов и ординаторов по специальностям: «Стоматология» и «Патологическая анатомия».

Выделенный концентрат стволовых клеток пуповинной крови может быть использован в проведении биотехнологических исследований в различных областях стоматологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Перспективы использования стволовых клеток в терапии заболеваний тканей пародонта / Г. Г. Манашев, JI. И. Лазаренко, Е. И. Ярыгин, Э. В. Мутаев, В. С. Бондарь // Сиб. мед. обозрение. - 2012. -№4.-С. 3-6.

2. Эффективность современной терапии при лечении заболеваний тканей пародонта / Г. Г. Манашев, Л. И. Лазаренко, Э. В. Мутаев, Е. И. Ярыгин, О. А. Шарапова, В. С. Бондарь // Сиб. мед. обозрение. -2012,-№5.-С. 7-9.

3. Использование стволовых клеток крови плода крысы при воспалительно-деструктивных процессах в тканях пародонта / В. В. Алямовский, Л. А. Шестакова, Е. И. Ярыгин, П. А. Шмидт, Л. И. Лазаренко // Институт стоматологии. - 2014. —№ 1. - С. 103-105.

4. Результаты использования стволовых клеток крови плода крысы при воспалительно-деструктивных процессах в тканях пародонта / В. В. Алямовский, Л. А. Шестакова, Е. И. Ярыгин, Л. И. Лазаренко // Труды VIII Всерос. науч.-практ. конф. «Сибирский стоматологический форум». - Красноярск, 2014. - С. 3-8.

5. Ярыгин, Е. И. Технология получения стволовых клеток пуповинной крови крысы при заболеваниях тканей пародонта / Е. И. Ярыгин // Труды Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. первому выпуску стоматологического факультета Кировской ГМА «Современные достижения стоматологиии челюстно-лицевой хирургии». - Киров, 2014. - С. 291-294.

6. Ярыгин, Е. И. Технология получения концентрата стволовых клеток пуповинной крови для использования в стоматологии: метод, рекомендации для интернов, ординаторов по специальности «Стоматология общей практики» / Е. И. Ярыгин, В. В. Алямовский, Л. А. Шестакова. - Красноярск : тип. КрасГМУ, 2014. - 28 с.

Подписано в печать 18.12.14 Формат 60x84/16, объем 1 авт. лист Тираж 100 экз.

Заказ № 879 ООО «Аспазия» 660025, г. Красноярск, ул. Семафорная, 321.