Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Использование клеток пуповинной крови крыс при воспалительно-деструктивных процессах периодонта

Ярыгин Евгений Иванович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛЕТОК ПУИОВИННОЙ КРОВИ КРЫС ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ДЕСТРУКТИВНЫХ ПРОЦЕССАХ ПЕРИОДОНТА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.14 - стоматология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

и КЮЛ 2015

Москва-2015

005570391

005570391

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Алямовский Василий Викторович

Официальные оппоненты:

Трунин Дмитрий Александрович - доктор медицинских наук, профессор, директор Стоматологического института ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Железный Павел Александрович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой стоматологии детского возраста ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский

университет» Минздрава России

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России

Защита состоится « » 2015г. в «\lSft» часов на заседании

диссертационного совета Д 208.040)14 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России по адресу: 119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГЦНМБ ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Минздрава России по адресу: 119034, г.Москва, Зубовский бульвар, д. 37/1 и на сайте www.mma.ru.

Автореферат разослан «УУ\ » 2015г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

Басин Евгений Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Проблемы, связанные с заболеваниями маргинального периодонтита, занимают одно из важнейших мест в стоматологии. Наиболее часто воспалительно-деструктивные процессы наблюдаются сначала в пульпе зуба, в костной альвеоле, периодонте, цементе, затем они приводят к разрушению связки зуба, поражению альвеолярных отростков костей челюстей и потере зубов.

Необратимые изменения в маргинального периодонте, как правило, начинаются с воспалительных изменений в десне с достаточно быстрым вовлечением в патологический процесс связочного аппарата зуба. В результате чего нарушаются функции круговой связки зуба: барьерная, опорно-удерживающая, амортизирующая, пластическая, трофическая, сенсорная и как следствие приводит к воспалительно-деструктивным поражениям всего пародонта. Врачи-стоматологи очень часто сталкиваются с тем, что медикаментозное лечение воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта является малоэффективным, за счет отсутствия в распоряжении достаточного набора средств широкого спектра действия.

Использование антимикробных лекарственных препаратов (антибиотики, антисептики, противогрибковые) (А. И. Грудянов с соавт., 2001; И. А. Горбачева, 2004; В. В. Новиков, 2009); местно-действующих лекарственных форм (растворы, суспензии, пасты, аэрозоли, полоски из полимерных материалов, содержащие лекарственные вещества (Л. А. Александрова, 2001; А И. Грудянов, 2004; О. Н. Бронников с соавт., 2005; В. С. Мелихова с соавт., 2007) далеко не всегда позволяют добиться желаемой эффективности. Наряду с этим, остается проблема создания не только адекватной, но и пролонгированной локальной концентрации препаратов.

В связи с этим, на сегодняшний день лечение периодонта остается важным вопросом в стоматологии, а именно: восстановление круговой связки зуба, поэтому необходимым является поиск новых методов лечения периодонта, одним из которых может стать клеточная терапия с использованием клеток пуповинной крови, которые обладают рядом преимуществ. Они отличаются быстрой и безболезненной процедурой сбора, возможностью получения и длительного хранения аутологичных, родственных и неродственных аллогенных образцов, тестированных и HLA-типированных, непосредственно готовых к использованию, сниженной вероятностью развития острой и хронической форм реакции трансплантат против хозяина, возможностью проведения трансплантаций с неполной HLA-совместимостью, сниженной вероятностью вирусной контаминации трансплантата, возможностью получения образцов от представителей редких этнических меньшинств и детей от смешанных браков (J.Zhang, 2003; F. Arai et al., 2004; G. Polimeni et al., 2004; С. V. Weaver et al., 2008; M. J. Haller, 2009).

Кроме того, клетки пуповинной крови имеют большой регенеративный потенциал и могут быть использованы в разработке регенераторных технологий для практической стоматологии. В сравнении со стволовыми клетками (СК) костного мозга, пуповинная кровь отличается простотой сбора, при этом в использовании соблюдаются этические нормы. Результаты исследований и данные научной литературы свидетельствуют о том, что создание новых и оптимизация существующих методов трансплантации клеток и последующее их внедрение в клиническую стоматологию позволят повысить эффективность терапии заболеваний пародонта и улучшить качество жизни пациентов, что обусловило направление настоящего диссертационного исследования.

Цель работы: научное обоснование и разработка метода лечения воспалительно-деструктивных процессов периодонта, с использованием клеток пуповинной крови крыс.

Задачи исследования:

1. Усовершенствовать способ выделения клеточного концентрата пуповинной крови крыс.

2. Разработать метод лечения воспалительно-деструктивных процессов в периодонте у животных.

3. Исследовать регенераторные способности клеток пуповинной крови крыс при воспалительно-деструктивных процессах в периодонте у животных.

4. Сравнить регенераторные возможности периодонта при различных методах лечения воспалительно-деструктивных процессов .

5. Разработать практические рекомендации по получению лейкоцитарного концентрата клеток пуповинной крови крыс для использования в лечении воспалительно-деструктивных процессов периодонта.

Научная новизна. Впервые использованы эффективный метод лечения воспалительно-деструктивных процессов периодонта и способ выделения концентрата ядросодержащих клеток пуповинной крови крыс — автоматическая сепарация клеток пуповинной крови крыс.

Впервые проведена сравнительная оценка эффективности предложенного метода использования клеток пуповинной крови с известными лекарственными средствами и медицинскими изделиями у экспериментальных животных. Установлена высокая эффективность использования клеток пуповинной крови в лечении воспалительно-деструктивных процессов периодонта у животных.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана модификация способа получения клеток пуповинной крови, что позволяет рекомендовать его для использования при проведении клинико-

морфологических исследований, направленных на совершенствование подходов к лечению воспалительных и деструктивных заболеваний периодонта.

Полученные результаты используются в учебном процессе вузовской подготовки и дополнительного профессионального образования по специальностям: «Стоматология» и «Патологическая анатомия».

Положения, выносимые на защиту

1. Усовершенствованный способ выделения концентрата ядросодержащих клеток позволяет получить клетки, пригодные для использования в лечении воспалительно-деструктивных процессов периодонта у животных.

2. Клетки пуповинной крови крыс обладают высокими регенераторными способностями при воспалительно-деструктивных процессах в периодонте у животных.

3. Установлены особенности регенерации периодонта при различных методах лечения.

Степень достоверности и апробация результатов работы. Работа выполнена по классической схеме статистического исследования. Объекты исследования стандартизированы по линии Вистар. Исследования проводились в надлежащих лабораторных условиях с применением измерительных приборов откалиброванных по соответствующим ГОСТам. Полученные данные зафиксированы в протоколах исследования и занесены в электронную базу данных. Статистическая обработка выполнена с применением традиционных методов описательных и сравнительных статистик, на лицензионной программе SPSS 22 версии.

Основные положения диссертации были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Сибирский стоматологический форум» (Красноярск, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» (Киров, 2014), а также на заседании

проблемной комиссии по стоматологии и оториноларингологии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России 02.12.2014 г.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных изданиях, 1 методические рекомендации («Технология получения лейкоцитарного концентрата клеток пуповинной крови крыс»).

Личный вклад автора. Автором лично проводился поиск и анализ литературы по теме диссертации, воспроизведена модель экспериментального периодонтита на животных, осуществлялось выделение и забор клеток пуповинной крови крыс, дана оценка эффективности методов лечения экспериментального периодонтита и обосновано их применение. Результаты исследования автором систематизированы и представлены в методических материалах, внедрены в учебный процесс.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертация соответствует паспорту специальности 14.01.14 -стоматология, области исследования согласно п. 2. Изучение этиологии, патогенеза, эпидемиологии, методов профилактики, диагностики и лечения заболевании пародонта.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственного исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа содержит 13 таблиц, 29 рисунков. Список литературы включает 58 отечественных и 138 зарубежных источников.

Большую признательность автор выражает бывшей заведующей кафедрой патологической анатомии им. проф. П. Г. Подзолкова ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, к. м. н. доц. Шестаковой Людмиле Анатольевне, д. м. н. профессору, заведующему лаборатории функциональной морфологии, ФГНОУ НИИ медицинских проблем Севера Пуликову Анатолию Степановичу за помощь при выполнении патоморфологических исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обосновывается актуальность исследования, сформулированы цель и задачи, научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы и положения, выносимые на защиту.

В первой главе на основании данных отечественной и зарубежной литературы рассмотрены этиология и патогенез заболеваний пародонта и маргинального периодонтита, проанализированы существующие методы лечения, а также обоснована необходимость создания новых эффективных методов лечения воспалительных-деструктивных процессов в пародонте, в том числе и использование клеток пуповинной крови.

Вторая глава посвящена материалам и методам исследования. Исследования проводились на базе вивария ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России. Для исследования были взяты экспериментальные животные — крысы линии Вистар: половозрелые самцы 40 особей и 5 самок в возрасте от восьми месяцев до года и массой тела от 180 до 200 граммов. Экспериментальных животных случайным образом распределяли в клетки по 10 особей в каждую группу. Все животные находились на одинаковом пищевом рационе и проходили предоперационную подготовку в течение 12 часов до операции (моделирование периодонтита), не получали пищу при свободном доступе к воде. Все экспериментальные животные к началу исследования имели интактную слизистую оболочку полости рта, без видимых патологических изменений: отсутствие кровоточивости десны и наличия экссудата при пальпации. Патологическая подвижность резцов нижней челюсти отсутствовала, глубина зубодесневого соединения в среднем у животных составляла (1,0 ± 0,017 мм).

Все манипуляции с животными проводили в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» № 1045-73 от 06.04.1973, Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях (г. Страсбург, Франция, 1986), Директивой Совета 86/609/ЕЕС от 24.11.1986.

В работе за основу создания моделирования экспериментального периодонтита была взята методика (С. П. Рубниковичем, 2011), так как данный метод наиболее был приближен данному исследованию. При операциях на животных использовали ингаляционный эфирный наркоз. Состояние слизистой оболочки десны и глубину зубодесневых карманов оценивали с 1 по 14 день создания модели периодонтита.

Оценку развития воспалительных изменений в периодонте животных производили по наличию кровоточивости при пальпации десны. Пародонтологическим зондом измеряли глубину зубодесневых карманов, а также наблюдали наличие и характер отделяемого из них, наличие или отсутствие патологической подвижности резцов нижней челюсти.

Лабораторный этап эксперимента предусматривал выделение лейкоцитарного концентрата клеток из пуповинной крови крысы путём центрифугирования. Разделение пуповинной крови на эритроцитарную массу и лейкоцитарный концентрат производили с помощью 6 % раствора гидроксиэтилкрахмала, 0,3 мл (кл. 3,5 х 107/мл) (А. В. Мельникова, 2009). В гемоцитометре (камере Горяева) подсчитывали общее количество ядросодержащих клеток, а также вывяли жизнеспособности их, использовали окраску клеток 0,1 % раствором трипанового синего который окрашивает только мертвые клетки с равным количеством клеточной суспензии. Считали на 100 клеток количество окрашенных синим цветом клеток. Таким образом, определяя процент жизнеспособных клеток (85-95%).

Экспериментальные животные были разделены на 4 группы: группа 1 (не получавшие лечения) — естественное течение модели экспериментального периодонтита;

группа 2 — на 14 день модели экспериментального периодонтита в область середины альвеолярного отростка, между резцами нижней челюсти, в слизистую оболочку десны вводили антибиотик широкого спектра действия — 30 % раствор линкомицина гидрохлорида в течение 7 дней по 1 мл.

группа 3 — на 14 день модели экспериментального периодонтита в область середины альвеолярного отростка, между резцами нижней

челюсти, в слизистую оболочку десны вводили однократно клеточный концентрат пуповинной крови крысы, в объеме 1,0 мл.

группа 4 — на 14 день модели экспериментального периодонтита в область середины альвеолярного отростка, между резцами нижней челюсти, в слизистую оболочку десны вводили биоматериал «Аллоплант», по 1 мл.

Перед созданием модели периодонтита из каждой группы было выведено из эксперимента по одной особи для сравнения здоровых тканей периодонта (контроль — контрольные показатели) с течением патологических процессов и сравнения динамики регенеративных процессов после введения препаратов животным.

После выведения животных из эксперимента проводили препарирование и выделение нижних челюстей, из которых образцы тканей периодонта помещали в 10 % забуференный формалин, с дальнейшим обезвоживанием в батарее спиртов и изготовлением парафиновых блоков. Наряду с обзорной окраской гематоксилином и эозином срезы толщиной 4-6 мкм окрашивали по Ван Гизону и орсеином по Унна-Тенцеру. Светооптическое исследование и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе «Axiostar» (Германия) при увеличении (х 200 и х 400). Морфометрическое исследование полученных срезов проводили при помощи программы «Image Tool»: сфотографированные в цифровом формате срезы (при увеличении х 200 и х 400) вводили в компьютер (операционная система Windows ХР) в формате BMP и посредством копирования из буфера обмена анализировали данной программой. В отношении каждого случая производили измерение заданных критериев в 10 полях зрения. Всего было изучено 120 гистологических препаратов.

Для отображения количественных показателей использовали среднее (М), стандартную ошибку среднего (ш). Для отображения качественных параметров (цвет и состояние десны, кровоточивость, характер отделяемого, подвижность) использовали количество животных с данным признаком в процентах от общего их числа и среднюю ошибку коэффициента.

Для выбора методов статистического анализа использовали оценку параметров распределения количественных показателей по критерию Шапиро — Уилкса.

Для сравнения учетных признаков, соответствовавших нормальной функции распределения и равенству дисперсий, применяли однофакторный дисперсионный анализ с последующим межгрупповым сравнением по критерию Шеффе.

Для непараметрических учетных признаков общегрупповые различия оценивали с помощью критерия Краскела - Уоллиса и попарно по U-критерию Манна —Уитни (Mann— Whitney). Внутригрупповые различия зависимых переменных (для парных сравнений в группах) оценивали с помощью критерия Уилкоксона (Wilcoxon-test).

Качественные показатели межгрупповых различий оценивали с помощью критерия х2 и точного критерия Фишера.

Различия между выборками считали статистически значимыми при р < 0,05.

Обработку статистических данных проводили с помощью пакета статических программ SPSS 22.0 for Windows.

В третьей главе проанализированы и представлены результаты собственного исследования тканей периодонта животных. В течение первой недели эксперимента в периодонте у всех животных регистрировались клинические признаки воспаления. Отмечались отек и гиперемия слизистой оболочки десны.

На 14 сутки в группа (1, 2, 3, 4) воспалительные изменения слизистой оболочки десны и зубодесневого прикрепления нарастали: у всех животных с экспериментальным периодонтитом появились кровоточивость и серозно-гнойное отделяемое из зубодесневых карманов и образование свищей в поднижнечелюстной области. Гистологически свищи были представлены очагом некроза в периодонтальной части пародонта, отграниченного от окружающих тканей зоной демаркационного воспаления.

В группе 1 на 7 сутки эксперимента отмечались: обильная кровоточивость из зубодесневых карманов при средней глубине

(3,36 ± 0,14 мм), наблюдалось серозно-гнойное отделяемое, III степень подвижности резцов нижней челюсти.

К 14 суткам эксперимента у трех крыс этой группы наблюдались десневые и наружные свищи в ткани поднижнечелюстной области, с обильным гнойным отделяемым, с летальным исходом.

У остальных особей этой группы сохранялись кровоточивость из зубодесневых карманов и серозное отделяемое. Патологическая подвижность резцов нижней челюсти - II степени. Средняя глубина зубодесневых карманов в группе 1 на 14 сутки эксперимента составила (2,70 ± 0,20 мм).

Гистологически в исследуемом материале этой группы животных в периодонте отмечались признаки острого серозно-гнойного воспаления: полнокровие сосудов, выраженный отек, набухание и деструкция волокнистого компонента, диффузная инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами, с примесью эозинофильных гранулоцитов, макрофагов и лимфоцитов. Перифокально в мягких тканях - серозное воспаление, с выраженным отеком.

На 21 сутки эксперимента у особей группы 1 в тканях периодонта гистологически наблюдалось снижение доли клеточного компонента и образование зрелой соединительной ткани, представленной коллагеновыми волокнами, с небольшой долей межклеточного вещества. Патологическая подвижность резцов нижней челюсти отсутствовала. Средняя глубина зубодесневых карманов составила (2,47 ± 0,27 мм).

В группе 2 экспериментальных животных на 14 сутки создания модели периодонтита отмечалось нарастание экссудативного воспаления. Появились кровоточивость и серозно-гнойное отделяемое из зубодесневых карманов, регистрировалась патологическая подвижность резцов нижней челюсти III степени. Глубина зубодесневого кармана при измерении увеличилась до (2,65 ± 0,12 мм).

При гистологическом исследовании образцов периодонта экспериментальных животных группы 2 отмечались признаки, характерные для механической деструкции тканей: некроз, кровоизлияния, миграция нейтрофильных гранулоцитов, макрофагов.

После инъекций 30 % раствора линкомицина гидрохлорида, на 7 сутки эксперимента, у животных данной группы сохранялась кровоточивость и серозно-гнойное отделяемое из зубодесневых карманов, подвижность фронтальных резцов нижней челюсти II степени. Средняя глубина зубодесневых карманов в этой группе на 7 сутки эксперимента составила (2,47 ± 0,09 мм). У данной группы животных в зоне экспериментального периодонтита морфологическая картина характеризовалась образованием грануляционной ткани. Клеточный компонент представлен полиморфно-ядерными лейкоцитами, макрофагами, пролиферирующими фибробластами, единичными лимфоцитами.

На 14 сутки эксперимента (после недели инъекций 30 % раствора линкомицина гидрохлорида) у животных сохранялось серозное отделяемое и кровоточивость при пальпации десны. Патологическая подвижность резцов нижней челюсти - I степени. Средняя глубина зубодесневых карманов в этой группе составила (2,48 ± 0,12 мм). У этой группы животных на микросрезах отмечалось образование грануляционной ткани. Клеточный компонент был представлен нейтрофильными гранулоцитами, макрофагами, пролиферирующими фибробластами, единичными лимфоцитами. У одного животного наблюдали образование наружного свища в поднижнечелюстную область, с обильным гнойным отделяемым. Развившееся острое гнойное воспаление в периодонте закончилось летальным исходом.

На 21 сутки эксперимента у животных данной группы признаков воспаления отмечено не было, подвижность резцов нижней челюсти отсутствовала. Средняя глубина зубодесневых карманов в этой группе на 21 сутки эксперимента составила (2,22 ± 0,13 мм). В исследуемом материала наблюдается образование рыхлой волокнистой соединительной ткани с большим количеством коллагеновых волокон.

У животных 3 группы на 14 сутки модели периодонтита признаки воспаления нарастали. Появились кровоточивость и серозно-гнойное отделяемое при пальпации десны, патологическая подвижность резцов

нижней челюсти III степени. Глубина зубодесневых карманов при измерении в среднем составила (2,73 ± 0,12 мм).

На 7 сутки эксперимента у животных 3 группы отмечено появление признаков острого воспаления: серозное отделяемое при пальпации десны, зубодесневые карманы, глубина которых составляла (2,20 ±0,11 мм), подвижность резцов нижней челюсти - I степени. В данной группе отмечалось образование грануляционной ткани. Клеточный компонент представлен полиморфно-ядерных лейкоциов, макрофагами, пролиферирующими фибробластами, единичными лимфоцитами. Отмечено краевое появление преэластических волокон.

На 14 сутки эксперимента у животных при пальпации десны отделяемого не наблюдали. В этой группе средняя глубина зубодесневых карманов на 14 сутки эксперимента составила (1,72 ± 0,06 мм); кровоточивость и подвижность резцов нижней челюсти отсутствовали.

В 3 группе животных зафиксировано образование молодой соединительной ткани, представленное коллагеновыми волокнами с появлением преэластического компонента. Отмечена тенденция к полной регенерации периодонта; определяются компоненты ткани, соответствующие нормальному гистологическому строению, с наличием пролиферирующих фибробластов и снижением количества полиморфно-ядерных лейкоцитов, макрофагов и лимфоцитов.

На 21 сутки эксперимента у животных серозное отделяемое и кровоточивость при пальпации десны, патологическая подвижность резцов нижней челюсти — отсутствовали. Средняя глубина зубодесневых карманов в этой группе составила (1,48 ± 0,04 мм).

В 3 группе за счет активной миграции полиморфно-ядерных лейкоциов и макрофагов, удовлетворительной фагоцитарной активности фибробластов произошла адекватная регенерация — образование молодой соединительной ткани, содержащей коллагеновые и преэластические волокна. В основе этого процесса лежит сбалансированная деградация коллагена, которая предотвращает образование грубой соединительной ткани (рисунки 1,2).

/< 1 жш Рисунок 1а (Ув, х 200)

кг.1-

■ Шт 1 а

Рисунок 1 б (Ув. х 400)

Рисунок 1 - Коллагеновые волокна периодонта экспериментальных животных 3 группы на 21 сутки эксперимента. Окраска по Ван Гизону

Соотношение коллагеновых и преэластических волокон составило — 3:1. В данной группе отмечена выраженная динамика регенеративных процессов в тканях периодонта по сравнению с 1 и 2 группами.

щШш

...»г 1 * Шй • -.•>•. Рисунок 2а (Ув. х 200)

Рисунок 26 (Ув. х 400)

Рисунок 2 - Преэластические волокна периодонта экспериментальных животных 3 группы на 21 сутки эксперимента. Окраска орсеином по Унна-Тенцеру

В 4 группе экспериментальных животных с первого по четырнадцатый день исследования (модель экспериментального периодонтита) наблюдали нарастание воспалительных изменений в периодонте, так же, как и в предыдущих трех группах. Животным этой группы на 14 день эксперимента вводили «Аллоплант», 1 мл, однократно.

На 14 сутки модели периодонтита у животных наблюдалась кровоточивость при пальпации десны. Средняя глубина зубодесневых

карманов в данной группе составила (2,77 ± 0,13 мм), при пальпации десны наблюдали серозно-гнойное отделяемое, также регистрировали патологическую подвижность резцов нижней челюсти III степени.

При гистологическом исследовании образцов периодонта экспериментальных животных 4 группы в полученном материале наблюдали деструкцию периодонта, с миграцией нейтрофильных гранулоцитов и макрофагов в область деструкции.

На 7 день эксперимента, после введения «Аллопланта», кровоточивость при пальпации слизистой оболочки десны сохранялась. Отделяемое при пальпации десны также сохранялось, но имело серозный характер. Подвижность резцов нижней челюсти - II степени. Средняя глубина зубодесневых карманов в 4 группе на 7 сутки эксперимента составила (2,73 ± 0,17 мм). В данной группе отмечалось образование грануляционной ткани, а клеточный компонент был представлен полиморфно-ядерными лейкоцитами, макрофагами, пролиферирующими фибробластами, единичными лимфоцитами.

На 14 день эксперимента при пальпации десны наблюдали кровоточивость и серозное отделяемое. Патологическая подвижность резцов нижней челюсти — I степени. Средняя глубина зубодесневых карманов в 4 группе на 14 сутки эксперимента составила (2,45 ± 0,18 мм). В указанной группе наблюдали менее интенсивное, по сравнению с 3 группой, увеличение удельного веса волокнистого компонента, пролиферирующих фибробластов.

На 21 день эксперимента в 4 группе кровоточивость и отделяемое при пальпации десны отсутствовали. Средняя глубина зубодесневых карманов в 4 группе на 21 сутки эксперимента составила (2,05 ± 0,11 мм); подвижность резцов нижней челюсти отсутствовала.

В 4 группе наблюдалось образование молодой соединительной ткани, с выраженной функциональной активностью фибробластов и соотношением коллагеновых и преэластических волокон 5:1.

Таким образом, исследования показали, что у всех оперированных животных в течение двух недель после операции наблюдалось развитие острого воспаления в тканях периодонта. На 14 сутки модели

экспериментального периодонтита у животных всех групп появилось серозно-гнойное отделяемое из зубодесневых карманов, глубина которых увеличилась. Наблюдалась патолопгческая подвижность резцов нижней челюсти I - II степени. Введение клеток пуповинной крови крысы и «Аллопланта» животным 3 и 4 групп сопровождалось наибольшим противовоспалительным и регенеративным эффектом у экспериментальных животных 3 группы.

При гистологической оценке в 1 группе (наличие у экспериментальных животных воспалительно-деструктивных изменений в периодонте, отсутствие введения препаратов) в тканях периодонта зарегистрированы очаги воспалительной деструкции. При течении периодонтита у животных 1 группы в 100 % случаев наблюдали неполную регенерацию периодонта (у 3 крыс). Естественное течение периодонтита привело к летальному исходу 3 животных.

Использование 30 % раствора линкомицина гидрохлорида при воспалительно-деструктивных процессах в тканях периодонта оказалось эффективным только у 6 особей из 9. На наш взгляд, это обусловлено тем, что процессы регенерации реализуются через нивелирование процессов воспаления. На этапе регенерации происходило формирование молодой соединительной ткани, в которой преобладал коллагеновый компонент.

Во 2 группе исследования в 100 % случаев течение заболевания завершилось неполной регенерацией тканей периодонта (у 5 крыс). На 14 сутки - летальный исход зарегистрирован у 1 особи.

Использование материала «Аллоплант» и клеток пуповинной крови крысы показало хорошую терапевтическую эффективность, но были выявлены различия в результатах процессов регенерации периодонта.

Введение клеток пуповинной крови исследуемым животным сопровождалось полной регенерацией повреждённых тканей периодонта. Это подтверждает тот факт, что клетки пуповинной крови крысы обладают не только регенеративным потенциалом, но и иммуностимулирующим и противовоспалительным действиями. В зоне регенерации образовалась зрелая соединительная ткань, в которой соотношение коллагенового и преэластического компонентов составило 3:1.

Использование биоматериала «Аллоплант» оказалось эффективным у 8 особей из 9. В конце эксперимента было отмечено образование зрелой соединительной ткани, в которой соотношение коллагеновых и преэластических волокон составило 5:1.

Статистический анализ сравнения глубины зубодесневых карманов позволяет говорить о наличии статистически значимых различий (р < 0,001) между группами сравнения начиная с 7 дня до конечной точки измерения.

Попарное сравнение глубины зубодесневого кармана между группами на 7 день позволяет определить статистически значимые различия между 1 группой и группами 2, 3, 4. На 14 и 21 день имелись статистически значимые различия между 3 группой и группами 1, 2, 4. Нулевая гипотеза не отвергается только в следующих случаях:

- группа без лечения / группа с применением 30 % раствора линкомицина гидрохлорида,

- группа без лечения / группа с применением материала «Аллоплант» и 30 % раствора линкомицина гидрохлорида,

- группа без лечения / группа с применением материала «Аллоплант».

Сказанное свидетельствует о том, что с момента начала эксперимента до введения препаратов глубина зубодесневых карманов увеличивалась равномерно во всех группах (р = 0,819).

После инъекций 30 % раствора линкомицина гидрохлорида, клеток пуповинной крови крысы и «Аллопланта» патологическая глубина зубодесневых карманов во всех группах уменьшалась неравномерно. Согласно статистическим показателям наибольший регенеративный эффект наблюдался у экспериментальных животных 3 группы — средняя глубина зубодесневых карманов на 21 сутки эксперимента составила (1,48 ±0,04 мм).

Изучение количества коллагеновых и преэластических волокон в тканях периодонта на 21 день эксперимента позволяет говорить о наличии статистически значимых различий (р < 0,001).

На 21 день количество коллагеновых волокон в 1 группе составило -(56,62 ± 1,59); во 2 группе - (65,59 ± 0,67); в 3 группе - (45,96 ± 0,46); в 4

группе — (45,94 ± 0,38). Эти данные позволяют определить статистически значимые различия между группами 1 и 3, 1 и 4, 2 и 3. Статически не значимы различия между группами 3 и 4. На 21 сутки количество преэластических волокон в 3 группе составило (10,34 ± 0,18); в 4 группе -(9,08 ±0,16), что позволяет определить статистически не значимые различия между группами 3 и 4. Данный результат отражает то, что в 1 и 2 группах наблюдается наибольшее количество коллагеновых волокон и отсутствие преэластических волокон.

Наиболее близкое к контрольным показателям количество коллагеновых (46,08 ±0,75) и преэластических (11,73 ±0,31) волокон наблюдалось у экспериментальных животных 3 группы. Количество коллагеновых волокон в этой группе составило (45,96 ± 0,46), а преэластических волокон (10,34 ± 0,18).

Количество преэластических волокон на 21 день, по сравнению с контрольными показателями, указывает на наличие статистически значимых различий как для клеток пуповинной крови крысы, так и для материала «Аллоплант». На основании статистичесюгх данных можно сказать о том, что в группах 3 и 4 количество преэластических волокон статистически значимо не отличается от контрольной группы, что свидетельствует о качестве регенеративных процессов в периодонте животных.

Результаты изучения количества коллагеновых волокон в тканях периодонта на 21 день эксперимента, в сравнении с контрольным показателям, свидетельствуют о наличии статистически значимых различий для фупп 1 и 2. Из этого следует, что гистологическое строение периодонта в группах 3 и 4 близко к контрольным показателям. В группах 1 и 2 количество коллагеновых волокон статистически значимо больше, чем в контрольных показателях, что свидетельствует о формировании грубоволокнистой соединительной ткани.

На основании статистических данных можно сказать, что в группах 3 и 4 количество коллагеновых волокон приближенно к контрольным показателям, что подтверждает качество регенеративного процесса в группах с клетками пуповинной крови крысы и материалом «Аллоплант».

Попарное сравнение толщины (мкм — микрометр) преэластичеческих волокон между 3 и 4 группами позволило определить статистически значимые различия по всем дням измерений, что свидетельствует о более выраженных процессах регенерации.

В частности, для групп 3-7 день (0,80 ± 0,09), 14 день (1,19 ± 0,19), 21 день (1,6 ± 0,08) и 4 - 7 день (0,20 ± 0,02), 14 день (0,59 ± 0,05), 21 день (0,85 ± 0,03) выявлено статистически значимое увеличение толщины преэластических волокон, что говорит о положительной динамике регенеративного процесса в этих группах.

Сравнение толщины (мкм - микрометр) коллагеновых волокон по дням позволяет говорить о наличии статистически значимых различий (р = 0,005) между группами только на 21 день измерения. Попарное сравнение между группами на 21 день позволяет определить статистически значимые различия в группах: 1 - (4,61 ± 0,20) и 2 - (5,49 ± 0,16).

Сравнение толщины преэластичеческих волокон между контрольными показателями и остальными экспериментальными животными в группе с использованием клеток пуповинной крови крысы в сочетании с материалом «Аллоплант» позволило установить статистически значимые различия, заключающиеся в меньшей толщине преэластических волокон на 21 день у животных групп: 3 - (1,6 ± 0,08) и 4 - (0,85 ± 0,03) в сравнении с контрольными показателями 3 — (3,67 ± 0,35) и4-(3,58 ±0,38).

Сравнение толщины коллагеновых волокон у животных экспериментальных групп на 21 день позволило установить отсутствие статистически значимых различий в сравнении с контрольными показателями.

Следует отметить, что в группах животных 3 - (4,95 ±0,14) и 4 -(4,97 ±0,15) количество коллагеновых волокон статистически значимо приближено к контрольным показателям 3 - (5,10 ±0,48) и 4 -(5,10 ±0,31), что свидетельствует о качестве регенеративного процесса в группе с использованием клеток пуповинной крови крысы и материала «Аллоплант».

Проведенная оценка степени подвижности резцов нижней челюсти в группах животных свидетельствует об отсутствии различий между группами животных на 14 день. Через 7 дней появляются значимые различия по факту снижения подвижности до 1 степени при применении клеток пуповинной крови крысы в сочетании с материалом «Аллоплант». К 21 дню эксперимента отмечены значимые различия между всеми группами, кроме 1 группы.

Анализ характера отделяемого из зубодесневых карманов выявил статистически значимые отличия на 14 день эксперимента между частотой выявления серозного отделяемого в группах с использованием клеток пуповинной крови крысы и материала «Аллоплант». На 7 день значимые отличия, по встречаемости гнойного отделяемого, отмечались для групп 13 и 3-4. На 14 сутки установлены существенные различия по признаку прекращения выделений из зубодесневых карманов между группой с использованием клеток пуповинной крови крысы и остальными группами наблюдения. К 21 дню эксперимента во всех изучаемых группах, за исключением группы без лечения (р < 0,05), отмечалось прекращение выделений из зубодесневых карманов, что свидетельствует об устранении воспалительных явлений в периодонте животных групп 2, 3 и 4. При этом следует отметить, что к 14 дню отмечалось 3 летальных случая в 1 группе, что объясняет отсутствие случаев гнойного выделения при оценке результатов данного дня.

Изучение показателей кровоточивости десны показало ряд характерных особенностей, выявленных у животных экспериментальных групп, что позволяет говорить о проявлении значимых различий только с 14 дня эксперимента, между группой с использованием клеток пуповинной крови крысы и остальными группами. Различия между группами наблюдались до последнего дня исследования. К 21 дню эксперимента во всех изучаемых группах, за исключением группы без лечения (р < 0,05), отмечалось прекращение кровоточивости десны.

Анализ показателей летальности в группах экспериментальных животных свидетельствует о том, что случаи летальных исходов были

отмечены только на 14 день эксперимента, без наличия статистически значимых различий.

Таким образом, проведенный анализ гистологической характеристики зубодесневого соединения экспериментальных животных позволил установить наиболее высокие показатели эффективности лечения воспалительно-деструктивных процессов периодонта в случаях использования клеток пуповинной крови крысы. Самые низкие показатели динамики регенерации периодонта были получены в группе животных, не получавших лечения после формирования модели экспериментального периодонтита.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован способ выделения клеток пуповинной крови крыс за счет оптимизации забора биоматериала и алгоритма его центрифугирования.

2. Разработан метод лечения воспалительно-деструктивных процессов периодонтита у животных, заключающийся в применении инъекций клеток пуповинной крови крыс.

3. Установлены регенераторные способности клеток пуповинной крови крыс при воспалительно-деструктивных процессах в периодонте у животных. У всех особей животных в конце эксперимента наблюдались процессы полной регенерации клеточно-волокнистого компонента, подтвержденные его качественным составом, при соотношении коллагеновых и преэластических волокон 3:1, что соответствует гистологической норме и демонстрирует факт наличия высокого регенеративного потенциала полученных клеток пуповинной крови.

4. Сравнительная оценка регенеративных возможностей при применении 30% раствора линкомицина гидрохлорида, биоматериала «Аллоплант» и клеток пуповинной крови показала, что использование линкомицина гидрохлорида при воспалительно-деструктивных процессах в периодонте не приводит к нормализации состава клеточно-волокнистого компонента к 21 суткам. Лечение оказалось эффективным в 66,7% случаев.

При использовании биоматериала «Аллоплант» в конце эксперимента отмечено образование молодой соединительной ткани, в которой соотношение коллагеновых и преэластических волокон отличается от гистологической нормы и соответствует 5:1, что свидетельствует о неполной регенерации тканей периодонта.

Использование клеток пуповинной крови крысы при воспалительно-деструктивных процессах в периодонте оказалось высокоэффективным, что подтверждается фактами формирования качественного состава клеточного компонента на 21 сутки от начала экспериментального лечения.

5. Разработанные практические рекомендации по получению лейкоцитарного концентрата клеток пуповинной крови крыс позволят унифицировать технологию 1гх выделения и в перспективе рекомендовать разработанный метод в качестве способа лечения периодонтита.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанный метод лечения воспалительно-деструктивных процессов периодонта у крыс позволяет распространить опыт для организации дальнейших экспериментально-клинических исследований в области лечения заболеваний периодонта, а так же вполне обоснованно рекомендовать использовать результаты данного исследования по применению клеток пуповинной крови не только в эксперименте на животных, но и пуповинной крови человека в условиях клинической стоматологии.

Изученные исследовательские подходы настоящего исследования следует использовать в учебном процессе интернов и ординаторов по специальностям: «Стоматология» и «Патологическая анатомия».

Выделенный лейкоцитарный концентрат клеток пуповинной крови может быть использован в проведении биотехнологических исследований в различных областях стоматологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Перспективы использования стволовых клеток в терапии заболеваний тканей пародонта / Г. Г. Манашев, Л. И. Лазаренко, Е. И. Ярыгин, Э. В. Мутаев, В. С. Бондарь // Сибирское медицинское обозрение.-2012,-№4.-С. Ъ-А.

2. Эффективность современной терапии при лечении заболеваний тканей пародонта / Г. Г. Манашев, Л. И. Лазаренко, Э. В. Мутаев, Е. И. Ярыгин, О. А. Шарапова, В. С. Бондарь // Сибирское медицинское обозрение. - 2012. - № 5. - С. 7-9.

3. Использование стволовых клеток крови плода крысы при воспалительно-деструктивных процессах в тканях пародонта / В. В. Алямовский, Л. А. Шестакова, Е. И. Ярыгин, П. А. Шмидт, Л. И. Лазаренко // Институт стоматологии. - 2014. - № 1. - С. 103-105.

4. Результаты использования стволовых клеток крови плода крысы при воспалительно-деструктивных процессах в тканях пародонта / В. В. Алямовский, Л. А. Шестакова, Е. И. Ярыгин, Л. И. Лазаренко // Труды VIII Всерос. науч.-практ. конф. «Сибирский стоматологический форум». - Красноярск, 2014. - С. 3-8.

5. Ярыгин, Е. И. Технология получения стволовых клеток пуповинной крови крысы при заболеваниях тканей пародонта / Е. И. Ярыгин // Труды Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. первому выпуску стоматологического факультета Кировской ГМА «Современные достижения стоматологиии челюстно-лицевой хирургии». - Киров, 2014. - С. 291-294.

6. Ярыгин, Е. И. Технология получения лейкоцитарного концентрата клеток пуповинной крови крыс: Метод, рекомендации для интернов, ординаторов по специальности «Стоматология общей практики» / Е. И. Ярыгин, В. В. Алямовский, Л. А. Шестакова. -Красноярск : тип. КрасГМУ, 2015.-28 с.

Подписано в печать 23.06.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 8720-6-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39