Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Замещение клетками пуповинной крови костных полостей экспериментального остеомиелита (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

МЕЛЬНИКОВА АРИНА ВИКТОРОВНА

ЗАМЕЩЕНИЕ КЛЕТКАМИ ПУПОВИННОЙ КРОВИ КОСТНЫХ ПОЛОСТЕЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОМИЕЛИТА (экспериментальное исследование)

14.00.27 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

УФА-2009

003460700

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Хасанов Анвар Гиниятович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Хунафин Саубан Нурлыгаяпович канидидат медицинских наук Хафизов Рафаэль Маратович

Защита диссертации состоится "_"_2009 года в_часов на

заседании диссертационного совета при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

Автореферат разослан "_"_2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Федоров С.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Проблема лечения хронического остеомиелита находится в центре внимания хирургов и травматологов и не теряет свою актуальность на протяжении многих лет. Среди гнойных заболеваний на долю остеомиелита приходится от 3 до 10% (Линник С.А., 1982; Каплан А.В. с соавт., 1985; Шипляк В.М., 1986; Гостищев В.К., 1999). Широкое внедрение в практику травматологии и ортопедии различных методов остеосинтеза вызвало увеличение числа гнойных осложнений. Послеоперационное нагноение при экстренно выполненном остеосинтезе у больных с открытыми переломами отмечается в 8-10 раз чаще, чем у оперированных пациентов в плановом порядке (Амирсланов Ю.А. с соавт., 2000; Aufdermaur М., 1979; Allgower М. et al., 1998).

Удельный вес постгравматического остеомиелита длинных трубчатых костей в общей структуре инвалидности колеблется от 10.6 до 11.1% (Гринев М.В. с соавт., 1972; Линник С.А., 1982; Шипляк В.М., 1986).

Несмотря на применение современных методов и средств борьбы с хирургической инфекцией, результаты лечения остеомиелита пока нельзя признать удовлетворительными. У 15-30% больных острый гематогенный остеомиелит переходит в хроническую форму, рецидивы при хроническом остеомиелите даже после радикальной операции возникают у 10-49.1% пациентов (Каплан А.В. с соавт., 1985; Арапович A.M., 1995; Гостищев В.К., 1999; Оноприенко Г.А. с соавт., 1999). Средняя длительность стационарного лечения больного с хроническим остеомиелитом составляет более 3 месяцев, при осложненных формах, как правило, требуется многократная госпитализация (Грицай Н.П., 1992; Амирсланов Ю.А. с соавт., 2000; Kaim A. et al., 2002).

Одной из основных проблем лечения хронического остеомиелита является выбор способа пластического замещения послеоперационного костного дефекта. Такие методы, как мышечная, кожно-фасциальная пластика, пломбирование полости синтетическими материалами не приводят к полному восстановлению анатомической и функциональной целостности кости (Гостищев В.К., 1999; Оноприенко Г.А. с соавт., 1999; Омельяненко Н.П. с соавт., 2002; Delloye С. et al, 1987). Трансплантация аллогенной, ксеногенной и собственной костной ткани также имеет ряд недостатков. Наиболее значимым является дефицит донорского материала (Никитин Г.Д. с соавт., 2000; Гришин И.Г. с соавт., 2001; Германов В.Г. с соавт., 2006).

Анализ отдаленных результатов лечения хронического остеомиелита выявил ряд существенных недостатков существующих способов костнопластических операций: травматичность, длительную перестройку трансплантатов в течение порой нескольких лет, необходимость длительной госпитализации и иммобилизации больного (Каплан А.В. с соавт., 1985; Гостищев В.К., 1999; Оноприенко Г.А. с соавт., 1999; Амирсланов Ю.А. с соавт., 2000; Никитин Г.Д. с соавт., 2000). Поэтому усилия хирургов направлены на поиски такого материала, который бы не только замещал

послеоперационный дефект, но и способствовал быстрому восстановлению целостности костной ткани.

Наиболее перспективным и быстроразвивающимся направлением в медицине является клеточная терапия. В клиниках США и Европы клеточные технологии нашли свое применение в лечении гемобластозов, аутоиммунных нарушений, цирроза печени, дегенеративных заболеваний нервной системы, репродуктивной системы, повреждений костной, хрящевой и покровных тканей и т.д. Учеными разрабатываются биокомпозиционные материалы с иммобилизованными стволовыми клетками. Такие композиты приводят к полноценной регенерации костной ткани в достаточно короткий срок (Шумаков В.И. с соавт., 2004; Деев Р.В. с соавт., 2007; Joshua R. Et al., 2004; Muschler G.F. et al, 2004).

Основным источником стволовых клеток костной ткани является костный мозг. Однако практическое применение костного мозга выявило ряд недостатков данного метода: инвазивность и болезненность процедуры забора, ограниченность материала в объеме, прогрессивное уменьшение содержания стволовых клеток с возрастом (Родионова Н.В. с соавт., 1989; Фриденштейн А.Я. с соавт., 1999; Tondreau Т. et al., 2005). Вследствие этого, рассматриваются альтернативные источники стволовых клеток для регенерации костной ткани. Наибольший приоритет отдается пуповинной крови человека, которая нашла свое применение в лечении гематологических заболеваний. Наличие мезенхимальных, эндотелиальных и плюрипотентной популяции стволовых клеток из крови пуповины обосновывает возможность ее трансплантации для лечения других заболеваний, в частности заболеваний костной системы (Goodwin H.S. et al., 2001; Erices A. et al., 2002; Kógler G. et al., 2004; Lee O.K. et al., 2004).

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности данной проблемы и является основанием для изучения нового способа стимуляции костной регенерации с позиций современных клеточных технологий.

Цель исследования. Стимуляция репаративной регенерации костной ткани путем трансплантации клеток пуповинной крови на модели экспериментального остеомиелита у лабораторных животных.

Задачи исследования.

1. Воспроизвести модель экспериментального остеомиелита на лабораторных животных (крысах).

2. Разработать методы выделения и подготовки клеток пуповинной крови животных для трансплантации в костную полость.

3. Изучить морфологические и фенотипические характеристики клеток пуповинной крови экспериментальных животных.

4. Изучить особенности регенераторных процессов в костной ткани у экспериментальных животных после трансплантации клеток пуповинной крови и без нее.

5. Выработать рекомендации по применению метода трансплантации клеток пуповинной крови для стимуляции костной регенерации.

Научная новизна.

Разработана методика получения пуповинной крови у мелких лабораторных животных (крыс). Изучены субпопуляционная структура пуповинной крови крыс методом иммунофенотипирования и морфологические характеристики клеток при культивировании. Доказано, что в пуповинной крови крыс имеются стволовые клетки, гемопоэтического и мезенхимальиого фенотипа.

Воспроизведена модель экспериментального остеомиелита на бедренных костях крыс. На фоне воспалительного процесса в костной ткани регенераторные процессы не приводили к полноценному восстановлению костной структуры. Впервые на модели экспериментального остеомиелита у животных проведено изучение эффективности трансплантации клеток пуповинной крови и обоснована возможность замещения клетками пуповинной крови костных полостей.

Новым является то, что используемые клетки пуповинной крови не подвергались предварительному культивированию и направленной цитодифференцировке в остеогенном направлении, что значительно упрощает метод клеточной трансплантации. Показано, что замещение костных полостей свежевыделенными клетками пуповинной крови обеспечивает быстрое формирование органоспецифичного костного регенерата и восстановление полноценной анатомической структуры поврежденной кости.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Отработана модель экспериментального остеомиелита у лабораторных животных (крыс), которая позволяет объективно оценивать возможности новых методов костной пластики, в том числе клеточной трансплантации.

Впервые предложено использовать клетки пуповинной крови мелких лабораторных животных для стимуляции репаративного остеогенеза на модели экспериментального остеомиелита. Разработана методика получения пуповинной крови у крыс, изучены морфологические и фенотипические характеристики данных клеток. Выявлена эффективность трансплантации недифференцированных клеток пуповинной крови при регенерации костной ткани в условиях инфицирования.

Результаты проведенного экспериментального исследования являются теоретической и практической основой для разработки в клинике новых методов пластического замещения остеомиелитических дефектов костной ткани.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанный в эксперименте способ получения пуповинной крови крыс позволяет выделить взвесь функционально активных стволовых клеток гемопоэтического и мезенхимальиого ряда.

2. Воспроизведенный на крысах экспериментальный остеомиелит является адекватной моделью для испытания новых методов костной пластики,

в том числе и метода клеточной трансплантации.

3. Клетки пуповинной крови лабораторных животных (крыс) обладают способностью стимулировать репаративный остеогенез без их предварительного культивирования и направленной цитодифференцировки.

4. Трансплантация свежевыделенных клеток пуповинной крови позволяет сократить сроки заживления инфицированных костных дефектов и добиться раннего восстановления анатомической целостности кости как органа.

Апробация диссертации.

Основные результаты по теме диссертационного исследования доложены на 72-й итоговой конференции молодых ученых БГМУ (Уфа, 2007), на заседании Ассоциации хирургов РБ (Уфа, 2007), 11 Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва 2007), V конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).

Объем и структура работы.

Диссертация содержит 139 страниц машинописного текста. Состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций. Содержит 6 таблиц, иллюстрирована 27 рисунками. Список литературы включает 268 отечественных и зарубежных источников.

Публикации результатов исследования.

По материалам диссертации опубликованы 6 печатных работ, одна публикация в журнале ВАК.

СОДЕРЖАНИЕ РАКОТЬТ Материалы и методы исследования

В соответствии с поставленными целью и задачами был выполнен эксперимент на 79 половозрелых белых крысах линии «Вистар» обоего пола массой тела от 250 до 400 г (табл. 1). Содержание животных и все манипуляции на них производились согласно приказу МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977г. и с соблюдением принципов Хельсинской декларации по гуманному обращению с животными. Длительность эксперимента составила 6 месяцев.

Первым этапом проводилась отработка технологии получения взвеси ядросодержащих клеток из пуповинной крови животных. С этой целью проведен эксперимент на 25 беременных самках, ориентировочно на 21-24 сутки беременности. Сроки беременности подтверждались размерами плодов, их жизнеспособностью, наличием самостоятельного дыхания, двигательной активности. Не травмируя сосудистые связи, удалялись все оболочки с плода и пуповины. У плодового конца проводилась пункция сосудов пуповины иглой диаметром 0,33*12 мм со шприцем, смоченным 6%-ым раствором ЭДТА

(динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Для трансплантации в костный дефект готовилась взвесь ядросодержащих клеток методом седиментации эритроцитов в 33%-ном растворе полиглюкина. Таким образом, получена взвесь ядросодержащих клеток в количестве 1,8-2* 105 в 1 мкл.

Таблица 1

Общая характеристика эксперимента и методов исследования.

Этапы эксперимента Методы исследования Кол-во животных Сроки исследования

1. Отработка технологии получения клеток пуповинной крови Выделение ядросодержащих клеток для трансплантации 15 самок 21-24 сутки беременности

Оценка жизнеспособности клеток

Изучение морфологии клеток в культуре 10 самок

Иммуноцитофлюориметрический анализ клеток

2. Моделирование инфицированной костной полости Клиническое изучение послеоперационного периода 54 самца с 1 по 30 сутки после операции

Рентгенологическое исследование 6 самцов на 30 сутки после операции

Бактериологические исследование

Гистологическое исследование

3. Трансплантация клеток пуповинной крови Клиническое изучение послеоперационного периода 32+16* самцов с 1 по 30 сутки после операции

Бактериологическое исследование на 15, 30, 60, 90, 120 сутки после операции

Рентгенологическое исследование

Гистологическое исследование

Всего животных 79 крыс

Примечание: (*) - контрольная группа животных.

В 5 образцах свежевыделенной пуповинной крови от разных особей произведен общий анализ (гемограмма) на геманализаторе АВХ Micros бО-ОТ User Manual. Подсчет лейкоцитарной формулы проведен с окраской материала по Романовскому-Гимзе.

Иммунофенотипический анализ клеток пуповинной крови проводился в отделении клинико-лабораторной диагностики ФГУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» на проточном цитофлюориметре Becton Dickinson FACSCalibur. К 100 мкл каждого образца пуповинной крови (п-9) добавлялось по 5 мкл моноклональных антител («Catlag Labs», Invitrogen, USA) к антигенам CD34, CD45, CD90, меченным флюорохромами FITC и РЕ. Образцы инкубировались 15-20 мин при постоянном перемешивании в шейкере при комнатной температуре (20-25°). Затем добавлялось по 1 мл рабочего

лизирующего реагента («Cal-Lyse», USA), перемешивалось, инкубировалось 10 мин при комнатной температуре. После центрифугирования в течение 5 мин при 1500 об/мин, удалялась надосадочная жидкость, осадок перемешивался на вортексе, добавлялось 2 мл промывающего буфера («CELL-Wash», USA). После центрифугирования в течение 5 мин при 1500 об/мин, осадок перемешивался с 0,5 мл промывающего буфера. Анализ проводился при количестве событий 50 тысяч. В качестве отрицательного изотопического контроля использовались мышиные IgGl FITC и IgG2aPE. Результаты анализировались в рамках программы Cell Qest

Культивирование клеток пуповинной крови проводилось в проблемной научно-исследовательской лаборатории трансплантологии ГОУ ВПО «Башкирский Государственный Медицинский Университет». Отмытые ядросодержащие клетки пуповинной крови рассеивались в стерильные культуральные пластиковые флаконы ("Gostar", USA) с плотностью 1,5 млн клеток в 1 мл. Питательная среда состояла из 90% среды ДМЕМ, 10% бычьей сыворотки («Биолог», Санкт-Петербург) и 40мг/мл гентамицина. Клетки культивировались в С02-инкубаторе («Jouan», Франция) в условиях С02-5% при +37°С в течение 15 суток. Через сутки после помещения в культуру неприкрепившиеся клетки удалялись, добавлялась новая порция среды. В дальнейшем среду меняли на 4-е и 6-е сутки культивирования. Ежедневно проводили динамическое наблюдение за первичными культурами клеток на инвертированном микроскопе с программным обеспечением («Leica», Германия) и регистрацией морфологических признаков.

Для оценки жизнеспособности полученных клеток проводился тест на исключение суправитального красителя методом окрашивания 0,1% раствором трипанового синего. К 0,1 мл суспензии клеток добавляли 1 мл красящего раствора, окрашивание проводилось в термостате при температуре +37°С в течение 10 минут. Степень окрашивания контролировалась под микроскопом. Подсчет числа живых клеток проводился в камере Горяева под световым микроскопом. Гибнущие клетки с поврежденной мембраной имели синюю окраску цитоплазмы. Результаты исследований регистрировались и сравнивались между собой. Под микроскопом подсчитывалось общее количество клеток, в том числе окрашенных клеток в 25 «больших» квадратах камеры Горяева. Подсчет клеток проводился по формуле: X = N-S-10000, где X - количество клеток в 1 мл суспензии, N - количество клеток в 25 больших квадратах, S - кратность разведения суспензии красителем. Далее вычисляли процентное содержание живых клеток.

Второй этап — моделирование экспериментального остеомиелита. Оперированы 54 крысы. Оперативные вмешательства проводились на нижних конечностях под эфирным наркозом. Крыс укладывали на стол, конечности фиксировали растяжками. Операционное поле выбривали, обрабатывали 70% спиртовым раствором хлоргексидина, накрывали стерильной салфеткой. По переднемедиальной поверхности бедра производился разрез кожи длиной 3 см. Мышцы тупо разводились и фиксировались. В области передней поверхности

метадиафиза бедра проводилась остеотомия на протяжении 0,5 см, ограниченная отслойка надкостницы, вскрытие костномозгового канала. Ложкой Фолькмана удалялся костный мозг. В образованный дефект вносилась марлевая турунда с культурой золотистого стафилококка - 106 микробных тел (культура приготовлена из лиофилизата Staphylococcus aureus АТС №25923(F 49) производства NCDC, USA, 1980 г.). Рана послойно ушивалась. На 30-е сутки у 6 животных проводилось бактериологическое, рентгенологическое и гистоморфологическое исследование патологических изменений костной ткани.

Третий этап - трансплантация стволовых клеток в костный дефект и изучение репаративных процессов в инфицированных костных полостях после трансплантации стволовых клеток и без нее. На 30-е сутки после моделирования инфицированной костной полости проводилась операция аналогично эксперименту по созданию инфицированной костной полости. В области патологического очага ложечкой скребущими движениями удаляли патологические грануляции, полость дополнительно санировалась раствором диоксидина. С целью остановки кровотечения костная полость тампонировалась салфеткой с 3%-ым раствором перекиси водорода. 32 животным (опытная группа) в послеоперационный дефект бедренной кости вводилось 0,2 мл взвеси клеток пуповинной крови в количестве 1,8-2*107 клеток. Дефект прикрывали коллагеновой пленкой для предотвращения миграции клеток за пределы костной полости. Рана послойно ушивалась. У 16 крыс дефект бедренной кости заполнялся гемопломбой, рана послойно ушивалась. Изменения в этой конечности служили контролем. Оперированные конечности фиксации не подвергались. Всем животным опытной группы на 5 и 10-е сутки были проведены повторные инъекции по 0,1 мл взвеси клеток пуповинной крови (1,8-2*107 клеток) в область оперативного вмешательства на нижней конечности. Животные выводились из опыта на 15, 30, 60, 90, 120 сутки после операции.

В ходе эксперимента осуществляли динамическое наблюдение за состоянием животных: аппетит, двигательная активность, состояние оперированных конечностей.

Рентгенологическое исследование оперированных конечностей опытных животных выполнялось на рентгенологическом аппарате РУМ-20 в режиме 44 тА 0.1 кВ с экспозицией в 1 сек. Проводился сравнительный анализ рентгенографических данных на 30-е сутки после моделирования экспериментального остеомиелита; на 15, 30, 60, 90, 120 сутки после трансплантации клеток пуповинной крови в костный дефект и без нее. Оценивались размеры костного дефекта, его форма, однородность структуры регенерата, состояние надкостницы, кортикальной пластины и костномозгового канала.

Сразу после выведения из эксперимента животных подвергали аутопсии, во время которой оценивали состояние окружающих мягких тканей, наличие или отсутствие выпота в области операционного вмешательства, состояние надкостницы, кортикального слоя и костномозгового канала. Из области

операции проводилось взятие пробы на бактериологический посев на среду Чистовича (желточно-солевой агар). Результаты оценивались на 2-4 сутки.

Забор материала для гистологического исследования проводился путем тщательного сепарирования мышц от костей, выделения сегментов костей длиной 1-1,5 см с областью костного регенерата. Костный материал фиксировался в 10%-ном растворе формалина в течение трех суток, подвергался декальцинации в 7%-ном растворе азотной кислоты, обезвоживался в спиртах возрастающей концентрации и заливался в парафин. Срезы толщиной 0,8 мм окрашивались гематоксилин-эозином. Всего приготовлено 250 гистологических препаратов. Микроскопическое исследование проводилось на светооптическом микроскопе (Leica, Германия) с применением увеличения 100-400Х.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась стандартными методами: определение средней арифметической вариационного ряда (М), стандартного отклонения (SD), объем выборки (п). Для определения статистической значимости полученных результатов были использованы: для сравнения средних величин опытной и контрольной группы - критерий Стьюдента (t) для независимых выборок, для сравнения качественных показателей - угловое преобразование Фишера (ф*). Все статистические данные считались достоверными при уровне значимости а менее 5% (р<0,05). Статистическую обработку результатов проводили с применением современных программных пакетов математико-статистического анализа (Боровиков В.П., 2001; Реброва О.Ю., 2002)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологический анализ пуповннной крови крыс.

При анализе клеточного состава в 1 мл пуповинной крови крыс получены следующие данные: эритроциты - 6,16±1,02*109, лейкоциты - 18,4±1,6*10б, тромбоциты - 584±81,3*106, гемоглобин - 10,3±1.4 , гематокрит - 27,8±4,3%; лимфоциты - 60,3±3,3%, моноциты - 20,3±2,3%, гранулоциты - 19,6±0,4% (M±SD). При выделении фракции ядросодержащих клеток методом седиментации эритроцитов в полиглкжине получено 92% жизнеспособных клеток, что подтверждено методом суправитального окрашивания.

При анализе экспрессии антигенов клетками пуповинной крови на цито граммах определены четкие субпопуляции клеток: CD45+/CD90-коммитированные лейкоцитарные предшественники, CD45+/CD90+ гемопоэтические стволовые клетки, CD45-/CD90+ негемопоэтические стволовые клетки (мезенхимальные) (рис. 1А); CD34+/CD45+ линейно некоммитированные гемопоэтические стволовые клетки и CD34+/CD45-фракция более ранних стволовых клеток, среди которых присутствуют эндотелиальные предшественники и мезенхимальные стволовые клетки (рис.1 Б).

ю

■ 5.002 )

5.003

104

ш 0.

ю хг

а и

10"

ю'

ю'

,07% .Од. 3,81% ч§

' У, ¡ЯШШ&щ?. |.11% |о1%

10о

10

ш а.

со О О

10"

10'

10

56% ■ ■ ■ ■ 0,10%

■ .. . :.. ■■ ,83% 3,51%

10

10

10 со48р1тс10 10 10" 10 сЫйчтс10'

А Б

Рисунок 1 - Цитограммы в формате дот-плот, иллюстрирующие субпопуляционную структуру пуповинной крови крыс. Цитограмма А - уровни экспрессии СТ)А51С090 антигенов. По оси х - экспрессия 0)9011ТС, по оси у - экспрессия СБ45РЕ. Цитофамма В - уровни экспрессии СП45/С034 антигенов. По оси х - экспрессия С045РГГС, по оси у - экспрессия С034РЕ.

Установлено, что содержание клеток в пуповинной крови крыс (М±80) с фенотипом СБ45+С090- составило 3,05±2,18%; С090+С045- составило 3,78±2,15%; СП34+С045- составило 0,71 ±1,2%; СБ34+С045+ составило 0,09±0,11% от всего количества ядросодержащих клеток.

Для подтверждения наличия стволовых клеток в пуповинной крови крыс мы изучили их морфологические особенности при культивировании. С этой целью отмытые моноядерные клетки были рассеяны в культуры. Не прикрепившиеся к пластику клетки удалялись из культуры в процессе смены питательной среды. На 3-5-е сутки в культуре определялись пластикадгезивные клетки округлой формы, небольших размеров, с крупными ядрами. По мере культивирования размеры клеток увеличивались, появлялись крупные многоядерные клетки и веретеновидные фибробластоподобные клетки. На 15-е сутки формировались редко распределенные колонии, состоящие, главным образом, из фибробластоподобных клеток.

Таким образом, в ходе экспериментального исследования получено подтверждение того, что пуповинная кровь крыс имеет в своем составе стволовые клетки гемопоэтического и мезенхимального фенотипа, обладающие пролиферативной активностью и фибробластоподобной морфологией в культуре.

В репаративном остеогенезе играют важную роль не только мезенхимальные стволовые клетки, способные дифференцироваться в остеоциты, но и гемопоэтические стволовые клетки. В литературе имеются сведения о том, что введение С034+ стволовых клеток ускоряет заживление переломов костей за счет стимуляции ангиогенеза (Те1 Я. е! а1., 2008; М|Типе У.

е( а!., 2008). Из этой же фракции выделены клетки, способствующие регенерации нервной ткани (Вигапвка Ь. й а1., 2001; Ьи Б е1 а1., 2002). В условиях выраженной гипоксии и нейротрофических нарушений в костной ткани при хроническом остеомиелите трансплантация клеток пуповинной крови имеет большие теоретические обоснования. Литературные данные дают основание полагать, что стимулирующий эффект на регенерацию поврежденной кости будет оказывать свежевыделенная фракция ядросодержащих клеток пуповинной крови без предварительного культивирования.

Результаты моделирования экспериментального остеомиелита.

В раннем послеоперационном периоде до 3 суток животные оставались вялыми, мало двигались, щадили оперированную конечность. Аппетит и двигательная активность крыс восстанавливались к 3-5 суткам, однако отсутствовала опора на больную конечность. На 5-12 сутки после операции у 19 животных появился отек мягких тканей в области операции, у 12 -локальная гиперемия кожи. В среднем на 17,5±4,1 сутки (М±БО) отек и гиперемия купировались. Опора на конечность появлялась на 5,18±1,14 сутки после операции (М±БО). Операционные раны заживали в среднем на 10±1,6 сутки (М±80). Летальных случаев в послеоперационном периоде среди крыс не наблюдалось.

С целью изучения морфологических характеристик инфицированной костной полости у 6 животных на 30-е сутки после операции проведено гистологическое и бактериологическое исследование. У одной из выбранных нами крысы имелось расхождение краев послеоперационной раны с серозно-гнойным отделяемым.

Животных умерщвляли путем передозировки эфирного наркоза. Рассечение мягких тканей проводилось по рубцу, выделялась бедренная кость. Из области костного дефекта производилось взятие мазка на бактериологический посев. Бактериологический анализ мазков из области костного дефекта показал рост Аигеш во всех пробах (п=6).

Рентгенологическое исследование оперированных конечностей крыс показало следующее: в области дефекта определялось гомогенное просветление с неровными контурами, утолщение надкостницы (рис. 2А).

При макроскопическом исследовании области патологического процесса визуальное исследование показало, что окружающие мягкие ткани инфильтрированы, в области костного дефекта рыхлые массы соединительной ткани плотно спаяны со стенками костной полости. В одном случае наблюдался патологический перелом без смещения отломков.

А Б

Рисунок 2 - А - Рентгенограмма бедренной кости крысы на 30 сутки после моделирования инфицированной костной полости. Б - Секвестрация некротизированного участка компактной кости (С), экссудативное воспаление в костной ткани (КТ), лейкоцитарная инфильтрация рыхлой соединительной ткани (РСТ) и хрящевой ткани (ХТ) в зоне дефекта на 30 сутки после моделирования инфицированной костной полости. Окраска гематоксилин-зозин. Увеличение XI00.

На 30-е сутки после моделирования инфицированной костной полости в гистологических препаратах отмечался выраженный воспалительный процесс, охвативший прилегающую мышечную ткань конечности, а также все структуры трубчатой кости, включая надкостницу, костную ткань и эндост. Костный дефект заполнялся соединительно-тканным рубцом, состоящим из большого количества клеточных элементов, плотно расположенных структур межклеточного вещества и коллагеновых волокон. Кровеносные сосуды были расширены, полнокровны, со стазом форменных элементов крови. В некоторых препаратах имелись очаги склерозированной костной ткани с отсутствием остеоцитов, формировались секвестры (рис. 2Б).

Таким образом, созданная экспериментальная модель остеомиелита характеризовалась возникновением выраженного воспалительного процесса в костной ткани с образованием плотного соединительно-тканного рубца в зоне дефекта.

Анализ эффективности замещении клетками пуновинной крови крыс костных полостей экспериментального остеомиелита.

32-м животным на 30-е сутки после моделирования экспериментального остеомиелита бедренной кости проведена трансплантация клеток пуповинной крови. В контрольной группе животных (16 крыс) послеоперационный дефект бедренной кости заполнялся аутогемопломбой.

Проведен сравнительный анализ клинической картины у экспериментальных животных опытной группы (после замещения дефекта клетками пуповинной крови) и контрольной группы (без введения клеток пуповинной крови), результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Течение послеоперационного периода у экспериментальных животных.

исследуемый признак сутки после операции (М±ББ) критерий 1; уровень значимости

опытная группа контрольная группа

Восстановление опороспособности оперированной конечности 4,28±0,9* 5,56±1,2** 1=3,73; р«0,01

Заживление операционной кожной раны 7,4±0,9* 9,9±1,7** г=5,6; р«0,01

Купирование отека и гиперемии мягких тканей 8,75±0,96* 11,7±1,8*** 1=3,56; р«0,01

Примечание: * - достоверность различия со значениями, полученными у группы животных после моделирования остеомиелита р«0,01;

" - достоверность различия со значениями, полученными у группы животных после моделирования остеомиелита р>0,05;

*** - достоверность различия со значениями, полученными у группы животных после моделирования остеомиелита р<0,01.

Замещение клетками пуповинной крови костных полостей экспериментального остеомиелита приводит к значительно более быстрому заживлению послеоперационных кожных ран и раннему восстановлению опорных свойств оперированной конечности, по сравнению со значениями, полученными у животных после моделирования остеомиелита и в контрольной группе. Воспалительные изменения мягких тканей в области операции также купировались значительно быстрее в опытной группе животных, чем в группе сравнения.

Результаты проведенного экспериментального исследования показали (табл. 3), что при трансплантации клеток пуповинной крови в инфицированный костный дефект длинных трубчатых костей крыс послеоперационный период характеризовался статистически значимым уменьшением количества воспалительных осложнений со стороны мягких тканей. Инфицированность золотистым стафилококком костного дефекта также встречалась реже, чем в группе контроля. После стимуляции костной регенерации клетками пуповинной крови перелом бедренной кости наблюдался только в одном случае, в контрольной группе в четырех, однако статистическая значимость полученных данных превышает допустимый уровень. Это не позволило нам однозначно судить о влиянии клеток пуповинной крови на частоту возникновения такого осложнения, как перелом трубчатой кости в области операции.

Таблица 3

Характеристика послеоперационных осложнений у экспериментальных

животных

сутки после операции Отек мягких тканей, кол-во животных Инфицированносгь костного дефекта, кол-во животных Перелом бедренной кости, кол-во животных

опыт контроль опыт контроль опыт контроль .

0-4 - 2 - - - -

5-10 4 5 - - - -

11-15 - 1 2 3 - 1

16-30 - - - 2 1 2

31-60 - - - 1 - 1

61-120 - - - - - -

Всего(доля) 4(0,13) 8(0,5) 2(0,06) 6(0,38) 1(0,03) 4(0,25)

Достоверность различия <р*=2,77 р<0,01 Ф*=2,654 р<0,01 Ф*=2,259 р<0,05

Анализ рентгенографических данных оперированных конечностей животных обеих грУпп показало следующую картину. На 15-е сутки после трансплантации клеток пуповинной крови в проекции костного дефекта определялся участок просветления округлой формы с четкими границами с облачковидным затемнением в центре. На 60-е сутки после операции у большинства животных опытной группы рентгенологическая картина характеризовалась восстановлением кортикальной пластинки и костномозгового канала, структура костной ткани полностью соответствовала нормальной. На 90120 сутки у всех животных рентгенологически подтверждалось восстановление анатомической структуры кости. В контрольной группе животных на 90-120 сутки сохранялась неоднородность структуры регенерата, утолщение надкостницы, костномозговой канал не прослеживался.

Восстановление анатомической структуры костной ткани наблюдалось только в группе животных с замещением костной полости клетками пуповинной крови. В контрольной группе животных полноценного восстановления костной структуры не наблюдалось на протяжении всего эксперимента, т.е. четырех месяцев.

Гистологическое исследование препаратов на 15 сутки. При

гистологическом исследовании препаратов опытной группы дефект в центре был заполнен грубо-волокнистой соединительной тканью с выраженным ангиогенезом и пролиферацией клеток. Преимущественно вокруг новообразованных сосудов имелись очаги остеобластического характера, включающие единичные примитивные костные балки. У краевой зоны наряду с остеобластами появлялись активно пролиферирующие хондробластические и фибробластические клетки. Зона остеогенеза характеризовалась выраженной базофилией клеток и остеомукоида развивающейся костной ткани. Формировалась надкостница в области дефекта, богатая сосудами и клеточными структурами, плотно сращенная с подлежащей соединительной тканью. (Рис. 3)

Рисунок 3 - Формирование хрящевой ткани (ХТ) и примитивных костных балок (КТ) по краям дефекта (Д), образование надкостницы (НК) на 15 сутки после трансплантации клеток пуповинной крови.

В контрольной группе данного срока дефект заполнялся рыхлой соединительной тканью с участками грануляционной ткани и остатками детрита. Отмечалась выраженная лейкоцитарная инфильтрация регенерата, гиперемия кровеносных сосудов со стазом форменных элементов крови, периваскулярный отек, сосудистая сеть слабо выражена. (Рис. 4)

Рисунок 4 - Воспалительная реакция в зоне дефекта (Д) бедренной кости крыс на 15 сутки после операции контрольной группы. КТ - костная ткань. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение Х100.

Гистологическое исследование препаратов на 30-е сутки. В опытной группе дефект уменьшался в размерах, был заполнен грубо-волокнистой костной и хрящевой тканью. Вокруг сосудов вновь образующихся остеонов концентрически наслаивалось межклеточное вещество, формировались костные пластинки. Сформированный остеон постепенно минерализовался, зона активного остеогенеза характеризовалась выраженной базофилией клеток и остеомукоида развивающейся костной ткани. По периферии дефекта костная ткань более зрелая, остеонно-балочного строения, расположение остеонов нерегулярное, гавесрсовы каналы различной ширины, полнокровны, периваскулярный отек отсутствует. Шло формирование костно-мозгового канала, характеризующегося обилием кровеносных капилляров и костно-мозговых клеток. Со стороны надкостницы наблюдалась регенерация путем аппозиционного роста. В контрольной группе дефект по периферии заполнялся незрелой костной тканью, в центре был представлен грубо-волокнистой рубцовой и хрящевой тканью. Васкуляризация регенерата и окружающей костной ткани не выражена. Надкостница утолщена, инфильтрирована клетками макрофагального ряда.

Гистологическое исследование препаратов на 60-е сутки. Микроскопически дефект в опытной группе представлен сетью переплетающихся костных перекладин различной степени зрелости, включая примитивные грубоволокнистые. Наблюдались явления активной перестройки грубоволокнистой костной ткани с расширенными полнокровными сосудами в пластинчатую кость, что проявлялось в выраженной базофилии клеток. Вокруг полнокровных сосудов гаверсовых каналов наслаивались костные пластины, откладывалось межклеточное вещество. Формирующиеся остеоны характеризовались большим количеством активно синтезирующих остеоцитов. В контрольной группе наблюдалось снижение темпов регенерации. В центре дефекта сохранялись прослойки плотной неоформленной соединительной ткани с чрезмерным отложением коллагеновых волокон, что создавало механический барьер на пути роста хрящевой и костной ткани. На границе рубцовой и костной тканью наблюдались очаги активно функционирующего хряща.

Гистологическое исследование препаратов на 90-120-е сутки. На 90-е сутки во всех препаратах опытной группы наблюдались признаки, указывающие на полное восстановление целостности костной структуры. Надкостница полностью моделирована, состояла из наружного и внутреннего слоев. Костная ткань различной степени зрелости, пластинчатого строения, расположение остеонов нерегулярное, увеличивалось количество зрелых фиброцитов и остеоцитов. Межуточное вещество становилось оптически более плотным и гомогенным. Между костными трабекулами в сформированном костномозговом канале располагалась миелоидная и ретикулярная ткань (рис. 5).

В контрольной группе на 90-е сутки область дефекта определялась по сужению костной ткани в месте операции. Микроскопически в препаратах дефект заполнялся достаточно зрелой костной тканью, местами с прослойками хрящевой ткани. Преобладала грубоволокнисгая костная ткань с малочисленными остеонами, межклеточное вещество менее гомогенное и

рыхлое. Клетки представлены в основном зрелыми фибробластами, хондроцитами и остеоцитами, не наблюдалось базофилии клеток и межклеточного вещества. В некоторых препаратах определялся плотный соединительно-тканный рубец, препятствующий формированию кортикальной пластины (6).

Рис.5.- Сформированная костная ткань (КТ), надкостница (НК) и костномозговой (КМ) канал на 90-е сутки после операции на животных опытной группы. Окраска гематоксилин-зозин. Увеличение XI00.

Рис. 6 - Плотный соединительно-тканный рубец (Д) между краями кортикальной пластины (КТ) на 90 сутки после операции контрольной группы. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение Х100.

На 120-е сутки после операции гистологическое исследование контрольной группы животных показало следующее: кортикальная пластинка сужена, костная ткань более зрелая, клетки малочисленны, в межбалочных

пространствах узкие сосуды синусоидного типа, костномозговой канал либо резко сужен, либо закрыт замыкательной пластинкой.

Таким образом, в ходе эксперимента установлено, что под воздействием клеток пуповинной крови купирование воспалительного процесса, заживление послеоперационных ран и восстановление функциональных свойств оперированных конечностей происходило в 1,3 раза быстрее, чем в контрольной группе животных. Количество послеоперационных осложнений у животных опытной группы наблюдалось в 3 раза меньше по сравнению с контрольной группой животных. Морфогенез репаративных процессов в экспериментальных полостях бедренных костей крыс после трансплантации клеток пуповинной крови характеризовался восстановлением анатомической и функциональной целостности костей к 60 суткам. Без трансплантации клеток пуповинной крови в дефект полноценного восстановления костной структуры не происходило.

Ускорение репаративных процессов костной ткани при трансплантации клеток пуповинной крови может быть обусловлено с несколькими факторами. В первую очередь, клетки пуповинной крови обладают собственной потенцией костеобразования за счет наличия стволовых клеток мезенхимального ряда и плюрипотентной популяции стволовых клеток, так называемых неограниченно делящихся соматических стволовых клеток (USSCs - unrestricted somatic stem cells). Об этом свидетельствует ряд экспериментальных работ, демонстрирующих способность клеток пуповинной крови животных и человека дифференцироваться в клетки костной ткани при культивировании в специальных средах (A. Erices et al. 2000, H.S. Goodwin et al. 2001, G. Kogler et al. 2004, K. Bieback et al. 2004, T. Tondreau et al. 2005). Помимо этого, с наличием в пуповинной крови эндотелиальных прогениторных клеток может быть связано явление стимулированного ангиогенеза, что в условиях нарушенного кровоснабжения костной ткани имеет большое значение для эффективного репаративного остеогенеза (Т. Murohara et al. 2000, М. Pesce et al. 2003, R. Sarugaser et al. 2003, H.X. Duan et al. 2006, Z.A. Khan et al. 2006,Y. Mifune et al. 2008).

Таким образом, мы получили подтверждение, что клетки пуповинной крови крыс способствуют быстрой и полноценной регенерации поврежденной костной ткани, стиханию воспалительных изменений за счет наличия среди них стволовых клеток.

ВЫВОДЫ

1. Воспроизведенная модель экспериментального остеомиелита у лабораторных животных (крыс) характеризуется возникновением выраженного воспалительного процесса с образованием плотного соединительно-тканного рубца в зоне дефекта, препятствующего полноценному восстановлению анатомической целостности костной ткани, что является адекватной моделью для исследования новых методов костной пластики, в том числе клеточной трансплантации.

2. Из пуповинной крови крыс возможно выделить не менее 92% жизнеспособных и функционально активных ядросодержащих клеток для трансплантации в костный дефект.

3. В пуповинной крови крыс определяются клетки, активно пролиферирующие в культуре и имеющие фибробластоподобную морфологию. Методом иммунофенотипирования показано, что в пуповинной крови крыс содержится: гемопоэтических стволовых клеток 0,71±1,2%, мезенхимальных -3,78±2,15% от всего количества ядросодержащих клеток.

4. Трансплантация клеток пуповинной крови крыс в инфицированный костный дефект приводит к полноценному восстановлению анатомической и функциональной целостности кости как органа.

5. Замещение клетками пуповинной крови костных полостей экспериментального остеомиелита приводит к сокращению количества послеоперационных осложнений в 3 раза по сравнению с контрольной группой животных. Купирование воспалительного процесса и заживление послеоперационных кожных ран после стимуляции клетками пуповинной крови происходит в 1,3 раза быстрее, чем в контрольной группе животных.

6. Предложенный способ клеточной стимуляции костной регенерации может быть использован для разработки в клинике новых методов костнопластической хирургии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Создание искусственного дефекта в диафизе бедренной кости экспериментального животного, при размерах не менее 1/3 диаметра и удалении костного мозга в условиях инфицирования патогенным стафилококком, приводит к развитию воспалительного процесса, препятствующего полноценному восстановлению костной структуры. Данная модель является достаточной для изучения влияния клеточной трансплантации.

2. Получение пуповинной крови возможно у мелких лабораторных животных на максимальных сроках беременности пункционным способом. Методом седиментации эритроцитов в полиглюкине возможно выделение фракции ядросодержащих клеток, сохраняющих свои физиологические свойства и пригодных к трансплантации в изучаемый объект.

3. Клетки пуповинной крови крыс стимулируют регенерацию костной ткани с хорошими анатомическими и функциональными исходами без предварительного культивирования, что значительно упрощает методику. Тем самым предложен новый метод стимуляции костной регенерации недифференцированными клетками пуповинной крови, который позволяет сократить сроки заживления костных дефектов и снизить частоту послеоперационных осложнений.

4. Результаты проведенного исследования являются теоретическим основанием для использования клеток пуповинной крови с целью стимуляции репаративной регенерации костной ткани. Возможно использование клеток пуповинной крови в составе различных синтетических и биологических

композиционных материалов, а также совместно с аутологичными костномозговыми клетками при недостаточном объеме клеточного материала. Таким образом, открыты широкие перспективы применения клеток пуповинной крови для стимуляции регенерации костной ткани.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мельникова, A.B. Изучение в эксперименте остеогенетической активности пуповинной крови при репаративной регенерации костных дефектов / A.B. Мельникова // Вестник РГМУ. - 2007. - № 2 (55): Материалы Всероссийской конференции студентов и молодых ученых с международным участием (20 октября 2006 г., Москва). - С. 115.

2. Мельникова, A.B. Экспериментальное изучение остеогенетической активности пуповинной крови при репаративной регенерации костных дефектов / A.B. Мельникова // Вопросы теоретической и практической медицины: материалы 72-й Республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых Республики Башкортостан. - Уфа, 2007. - С. 170171.

3. Мельникова, A.B. Принципы лечения больных с хроническим остеомиелитом в условиях отделения хирургической инфекции городской клинической больницы / A.B. Мельникова, Р.Ш. Сакаев, A.M. Широбоков // Вопросы теоретической и практической медицины: материалы 72-й Республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых Республики Башкортостан. - Уфа, 2007. - С. 171-172.

4. Хасанов, А.Г. Особенности репаративной регенерации костной ткани после трансплантации клеток пуповинной крови у животных / А.Г. Хасанов, Ф.А. Каюмов, A.B. Мельникова // Медицинский вестник Башкортостана. - 2008. - № 1. - С. 42-45.

5. Мельникова, A.B. Экспериментальное исследование репаративной регенерации костной ткани при трансплантации клеток пуповинной крови / A.B. Мельникова, А.Г. Хасанов, Ф.А. Каюмов // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: тезисы 5 конференции молодых ученых России с международным участием. - М., 2008. - С. 288.

6. Хасанов, А.Г. Эффективность использования клеток пуповинной крови для восстановления дефектов длинных трубчатых костей в условиях инфицировании / А.Г. Хасанов, Ф.А. Каюмов, A.B. Мельникова // Казанский медицинский журнал. - 2008. - Т. 89. - № 4. - С. 462-466.

МЕЛЬНИКОВА АРИНА ВИКТОРОВНА

ЗАМЕЩЕНИЕ ИНФИЦИРОВАННЫХ ДЕФЕКТОВ Д ЛИННЫХ РУБЧАТЫХ КОСТЕЙ КЛЕТКАМИ ПУПОВИННОЙ КРОВИ (экспериментальное исследование)

14.00.27 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 14.01.09 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 216. Гаршпура «ТшезЫеи'К.отап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРЮ. Объем 1,14 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Проблема лечения хронического остеомиелита находится в центре внимания хирургов и травматологов и не теряет своей актуальности на протяжении многих лет. Среди гнойных заболеваний на долю остеомиелита приходится от 3 до 10% [23,38,53,105]. Широкое внедрение в практику травматологии и ортопедии различных методов остеосинтеза, часто необоснованное их применение при недостаточной квалификации специалистов и отсутствии возможности закрытия обширных дефектов тканей вызвало увеличение числа гнойных осложнений. Открытые переломы длинных трубчатых костей в 5,5-75,4% и огнестрельные ранения конечностей в 34-90% случаев осложняются посттравматическим остеомиелитом [27,38,53,105]. Послеоперационное нагноение при экстренно выполненном остеосинтезе у больных с открытыми переломами отмечается в 810 раз чаще, чем у оперированных в плановом порядке пациентов [62,114,118].

По тяжести клинического течения, трудности ранней диагностики, большому проценту осложнений, приводящих к инвалидности, эту патологию следует отнести к очень тяжелым гнойным заболеваниям. Удельный вес посттравматического остеомиелита длинных трубчатых костей в общей структуре инвалидности колеблется от 10,6 до 11,1% [26,53,105].

Несмотря на применение современных методов и средств борьбы с хирургической инфекцией, результаты лечения остеомиелита пока нельзя признать удовлетворительными. У 1530% больных острый гематогенный остеомиелит переходит в хроническую форму, рецидивы при хроническом остеомиелите даже после радикальной операции возникают у 10-49,1% пациентов [5,23,3 8,100]. Средняя длительность стационарного лечения больного с хроническим остеомиелитом составляет более 3-х месяцев, при осложненных формах, как правило, требуется многократная госпитализация [29,62].

Проблема лечения хронического остеомиелита заключается не столько в выборе метода оперативного лечения, сколько в способе пластического замещения послеоперационного костного дефекта. Несмотря на значительные прорывы в научно-технической , области медицины, проблема создания универсального пластического материала для замещения костной ткани остается до конца не решенной [62, 99]. Анализ отдаленных результатов лечения хронического остеомиелита выявил ряд существенных недостатков существующих способов костнопластических операций: травматичность, длительную перестройку трансплантатов в течение нескольких лет, необходимость длительной госпитализации и иммобилизации больного [23,29,38,62,99,100]. Такие методы, как мышечная, кожно-фасциальная пластика, пломбирование полости синтетическими материалами не приводят к восстановлению анатомической и функциональной целостности кости [23,84,100,205]. Трансплантация аллогенной, ксеногенной и собственной костной ткани также имеет ряд недостатков. Наиболее значимым является дефицит донорского материала [47,67,99].

С учетом этого усилия хирургов направлены на поиски такого материала, который не только замещает послеоперационный дефект, но и способствует более быстрому восстановлению целостности костной ткани.

Наиболее перспективным и быстро развивающимся направлением в медицине является клеточная терапия. В клиниках США и Европы клеточные технологии нашли свое применение в лечении гемобластозов, аутоиммунных нарушений, циррозов печени, дегенеративных заболеваний нервной системы, репродуктивной системы, повреждений костной, хрящевой и покровных тканей и т.д.

Современным направлением является разработка биокомпозиционных материалов с иммобилизованными стволовыми клетками, которые приводят к полноценной регенерации костной ткани в кратчайшие сроки [85,107,233].

Использование клеточных технологий эффективно в критических ситуациях, когда стоит вопрос о спасении жизни человека. Кроме того, снижается инвалидизация пациентов, качественно улучшается восстановление поврежденной ткани и ускоряются процессы заживления, снижающие сроки пребывания в стационаре и стоимость лечения [10,16,59,84].

Основным источником стволовых клеток костной ткани является костный мозг. Однако практическое применение костного мозга выявило ряд недостатков данного метода: инвазивность и болезненность процедуры забора, ограниченность материала в объеме, прогрессивное уменьшение содержания стволовых клеток с возрастом [17,80,217]. Вследствие этого рассматриваются альтернативные источники стволовых клеток для регенерации костной ткани. Наибольший приоритет отдается пуповинной крови, которая нашла свое применение в лечении гематологических заболеваний. Выделение мезенхимальных, эндотелиальных и плюрипотентной популяции стволовых клеток из крови пуповины обосновывает возможность ее трансплантации для лечения других заболеваний, в частности заболеваний костной системы [109,162,218,225].

В Великобритании и Евросоюзе создан совместный проект исследования клеток пуповинной крови. Главной целью данной работы является получение костной ткани из клеток пуповинной крови.

Все вышеизложенное обусловило актуальность выполнения данной работы и изучения нового способа стимуляции костной регенерации.

Цель исследования

Стимуляция репаративной регенерации костной ткани путем трансплантации клеток пуповинной крови на модели экспериментального остеомиелита у лабораторных животных.

Задачи исследования

1. Воспроизвести модель экспериментального остеомиелита на лабораторных животных (крысах).

2. Разработать методы выделения и подготовки клеток пуповинной крови животных для трансплантации в костную полость.

3. Изучить морфологические и фенотипические характеристики клеток пуповинной крови экспериментальных животных.

4. Изучить особенности регенераторных процессов в костной ткани у экспериментальных животных после трансплантации клеток пуповинной крови и без нее.

5. Выработать рекомендации по применению метода трансплантации клеток пуповинной крови для стимуляции костной регенерации.

Научная новизна

Разработана методика получения пуповинной крови у мелких лабораторных животных (крыс). Изучены субпопуляционная структура пуповинной крови крыс методом иммунофенотипирования и морфологические характеристики клеток при культивировании. Доказано, что в пуповинной крови крыс имеются стволовые клетки, гемопоэтического и мезенхимального фенотипа.

Воспроизведена модель экспериментального остеомиелита на бедренных костях крыс. На фоне воспалительного процесса в костной ткани регенераторные процессы не приводили к полноценному восстановлению костной структуры. Впервые на модели экспериментального остеомиелита у животных проведено изучение эффективности трансплантации клеток пуповинной крови и обоснована возможность замещения клетками пуповинной крови костных полостей.

Новым является то, что используемые клетки пуповинной крови не подвергались предварительному культивированию и направленной цитодифференцировке в остеогенном направлении, что значительно упрощает метод клеточной трансплантации. Показано, что замещение костных полостей свежевыделенными клетками пуповинной крови обеспечивает быстрое формирование органоспецифичного костного регенерата и восстановление полноценной анатомической структуры поврежденной кости.

Теоретическая и практическая значимость работы

Отработана модель экспериментального остеомиелита у лабораторных животных (крыс), которая позволяет объективно оценивать возможности новых методов костной пластики, в том числе клеточной трансплантации.

Впервые предложено использовать клетки пуповинной крови мелких лабораторных животных для стимуляции репаративного остеогенеза на модели экспериментального остеомиелита. Разработана методика получения пуповинной крови у крыс, изучены морфологические и фенотипические характеристики данных клеток. Выявлена эффективность трансплантации недифференцированных клеток пуповинной крови при регенерации костной ткани в условиях инфицирования.

Результаты проведенного экспериментального исследования являются теоретической и практической основой для разработки в клинике новых методов пластического замещения остеомиелитических дефектов костной ткани.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанный в эксперименте способ получения пуповинной крови крыс позволяет выделить взвесь функционально активных стволовых клеток гемопоэтического и мезенхимального ряда.

2. Воспроизведенный на крысах экспериментальный остеомиелит является адекватной моделью для испытания новых методов костной пластики, в том числе и метода клеточной трансплантации.

3. Клетки пуповинной крови лабораторных животных (крыс) обладают способностью стимулировать репаративный остеогенез без их предварительного культивирования и направленной цитодифференцировки.

4. Трансплантация свежевыделенных клеток пуповинной крови позволяет сократить сроки заживления инфицированных костных дефектов и добиться раннего восстановления анатомической целостности кости как органа.

Апробация диссертации

Основные результаты по теме диссертационного исследования доложены на 72-й итоговой конференции молодых ученых БГМУ (Уфа, 2007), на заседании Ассоциации хирургов РБ (Уфа, 2007), 11 Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва 2007), V конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).

Результаты исследований отражены в 6 публикациях, из них одна — в рецензируемом ВАК журнале.

Объем и структура работы

Диссертация содержит 139 страниц машинописного текста. Состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций. Содержит 6 таблиц, иллюстрирована 27 рисунками. Список литературы включает 268 отечественных и зарубежных источников.

Выводы

1. Воспроизведенная модель экспериментального остеомиелита у лабораторных животных (крыс) характеризуется возникновением выраженного воспалительного процесса с образованием плотного соединительно-тканного рубца в зоне дефекта, препятствующего полноценному восстановлению анатомической целостности костной ткани, что является адекватной моделью для исследования новых методов костной пластики, в том числе клеточной трансплантации.

2. Из пуповинной крови крыс возможно выделить не менее 92% жизнеспособных и функционально активных ядросодержащих клеток для трансплантации в костный дефект.

3. В пуповинной крови крыс определяются клетки, активно пролиферирующие в культуре и имеющие фибробластоподобную морфологию. Методом иммунофенотипирования показано, что в пуповинной крови крыс содержится: гемопоэтических стволовых клеток 0,71±1,2%, мезенхимальных - 3,78±2,15% от всего количества ядросодержащих клеток.

4. Трансплантация клеток пуповинной крови крыс в инфицированный костный дефект приводит к полноценному восстановлению анатомической и функциональной целостности кости как органа.

5. Замещение клетками пуповинной крови костных полостей экспериментального остеомиелита приводит к сокращению количества послеоперационных осложнений в 3 раза по сравнению с контрольной группой животных. Купирование воспалительного процесса и заживление послеоперационных кожных ран после стимуляции клетками пуповинной крови происходит в 1,3 раза быстрее, чем в контрольной группе животных.

6. Предложенный способ клеточной стимуляции костной регенерации может быть использован для разработки в клинике новых методов костно-пластической хирургии.

Практические и теоретические рекомендации

1. Создание искусственного дефекта в диафизе бедренной кости экспериментального животного, при размерах не менее 1/3 диаметра, и удалении костного мозга в условиях инфицирования патогенным стафилококком, приводит к развитию воспалительного процесса, препятствующего полноценному восстановлению костной структуры. Данная модель является достаточной для изучения влияния клеточной трансплантации.

2. Получение пуповинной крови возможно у мелких лабораторных животных на максимальных сроках беременности пункционным способом. Методом седиментации эритроцитов в полиглюкине возможно выделение фракции ядросодержащих клеток, сохраняющих свои физиологические свойства, и пригодных к трансплантации в изучаемый объект.

3. Клетки пуповинной крови крыс стимулируют регенерацию костной ткани с хорошими анатомическими и функциональными исходами даже без их предварительного культивирования, что значительно упрощает методику. Тем самым, предложен новый метод стимуляции костной регенерации недифференцированными клетками пуповинной крови, который позволяет сократить сроки заживления костных дефектов и снизить частоту послеоперационных осложнений.

4. Результаты проведенного исследования являются теоретическим основанием для использования клеток пуповинной крови с целью стимуляции репаративной регенерации костной ткани. Возможно использование клеток пуповинной крови в составе различных синтетических и биологических композиционных материалов, а также совместно с аутологичными костномозговыми клетками при недостаточном объеме клеточного материала. Таким образом, открыты новые перспективы применения клеток пуповинной крови для стимуляции регенерации костной ткани.

104

Заключение

Несмотря на прогрессивное развитие медицинской науки, проблема стимуляции костной регенерации остается актуальной. Как было сказано выше, существующие методы костнопластических операций не всегда приводят к желаемому результату и имеют ряд недостатков, такие как длительность лечения и дороговизна используемых материалов. Все это обусловливает неугасаемый интерес ученых к проблеме клеточных технологий.

Огромное количество исследований в данной области свидетельствуют о том, что трансплантация стволовых клеток в поврежденный орган приводит к положительному эффекту не только за счет заместительных свойств самих клеток, но и за счет индуктивных и информационных свойств, которые поддерживаются адекватным микроокружением. За счет выделения биологически активных веществ, таких как факторы роста, трофические факторы и другие, происходит активация регенерации собственных клеток поврежденного органа посредством стимуляции процессов ангиогенеза и нейрогенеза, уменьшаются явления апоптоза клеток [112,183,198,211].

В проведенных ранее экспериментах и в ряде клинических наблюдений было показано, что применение стволовых клеток позволяет не только ускорить вживление трансплантата в костную ткань при тяжелых переломах, но и активизировать собственные клетки организма реципиента и практически полностью регенерировать поврежденную костную ткань[102,115,129,132,164,167,171,191,222,243].

Использование костного мозга как основного источника стволовых клеток костной ткани ограничивается целым рядом существующих проблем: прогрессивное снижение количества стволовых клеток с возрастом, необходимость общей анестезии и инвазивность процедуры забора костного мозга, ограниченность в количестве получаемого материала[17,80,142,217,224]. Фетальные ткани теоретически имеет больше преимуществ в качестве источника стволовых клеток, однако нерешенность правовых и этических проблем ограничивают их клиническое применение.

С целью решения вышеперечисленных проблем предложено использование пуповинной крови, клеточный состав которой аналогичен костному мозгу. По литературным данным пуповинная кровь человека и животных содержит не только гемопоэтические, но и мезенхимальные стволовые клетки, эндотелиальные клетки предшественники, популяцию плюрипотентных соматических стволовых клеток[2,34,75,136,165,175,215].

Основная масса исследований, направленных на изучение морфологических и фенотипических свойств стволовых клеток сводится к изучению клеток пуповинной крови человека. Как правило, эксперименты проводятся in vitro — исследуются морфологические изменения клеток при культивировании и под воздействием факторов направленной цитодифференцировки. In vivo исследуются свойства стволовых клеток человека, трансплантированных иммунодефицитным мышам

109,144,162,215,218,225]. Имеются единичные сообщения о проведении экспериментальных исследований пуповинной крови крупных животных, периферической крови мелких лабораторных животных [174,194,211]. Данные этих исследований подтверждают факт наличия в пуповинной крови человека и животных стволовых клеток, способных дифференцироваться в клетки другого фенотипа.

Недостаток в литературе сведений об особенностях непосредственного воздействия клеток пуповинной крови на регенерацию костной ткани побудило обратиться к данной проблеме. В качестве объекта исследования выбраны крысы, с учетом того, что в литературе не найдены данные об исследовании клеток крови крыс, полученной на поздних сроках гестации.

В целях изучения морфологических изменений костной ткани при пересадке клеток пуповинной крови нам предстояло решить несколько задач. Во-первых, определить количественный и качественный состав пуповинной крови. Во-вторых, требовалось создать модель инфицированной костной полости, обладающей высокой воспроизводимостью при низкой летальности животных. В-третьих, изучить характер морфологических изменений костной ткани после трансплантации клеток пуповинной крови.

В соответствии с поставленными задачами нами проведено исследование образцов пуповинной крови животных. С этой целью производился забор пуповинной крови у 25 беременных самок, крыс линии Вистар на сроке 21-24 сутки гестации. Образцы пуповинной крови подверглись морфологическому и цитофлюориметрическому исследованию. Проведенное исследование показало, что пуповинная кровь крыс содержит в своем составе 18,4±1,6*10б лейкоцитов в 1 мл, что аналогично количеству ядросодержащих клеток в пуповинной крови человека [2,24,34,75]. В лейкоформуле преобладали мононуклеары - до 80%, среди которых и обнаруживаются стволовые клетки. При краткосрочном культивировании (до 15-и суток) исследуемые клетки проявляли фибробластоподобную морфологию, прикреплялись к стенкам культуральной посуды и активно пролиферировали.

Цитофлюориметрическое исследование показало, что в пуповинной крови крыс содержится до 1,41% гемопоэтических стволовых клеток, несущих на своей мембране антигены СБ34 и СБ45; а также до 3,3% мезенхимальных стволовых клеток, характеризующихся СВ34-СБ45-СВ90+ фенотипом (во фракции ядросодержащих клеток). По данным литературных источников во фракции гемопоэтических стволовых клеток имеются клетки-предшественники эндотелиоцитов, а также клетки, способные дифференцироваться в нервную ткань

116,148,161,183,186,198,211,229,231,260]. Мезенхимальные стволовые клетки являются родоначальниками костных и хрящевых клеток [109,141,144,162,217,218,225].

Полученные нами данные подтвердили факт наличия в свежевыделенной пуповинной крови крыс стволовых клеток. Предложенный метод получения клеток пуповинной крови крыс позволил добиться выделения до 92% жизнеспособных и функционально активных клеток^

При разработке экспериментальной модели остеомиелита нас не удовлетворили известные на сегодняшний день методики воспроизведения остеомиелитической костной полости в виду сложности техники выполнения, многоэтапности и длительности воспроизведения, высокой летальности животных.

В связи с чем, в основу используемой нами модели положено создание костной полости, не способной к самостоятельному полноценному восстановлению, и инфицирование ее штаммом золотистого стафилококка. Такая модель, по нашему мнению, позволила решить принципиальный вопрос о характере и сроках восстановления целостности костной ткани после трансплантации клеток пуповинной крови и без нее.

Эксперимент проведен на 54-х половозрелых крысах линии Вистар. Механически созданные полости бедренных костей животных инфицировались штаммом золотистого стафилококка. На 30-е сутки производилось морфологическое и бактериологическое исследование у шести животных с целью оценки адекватности воспроизводимой модели инфицированной костной полости. У всех исследованных животных были выявлены воспалительные изменения в окружающих мягких тканях оперированных конечностей. Бактериологический анализ выявил инфицированность костной раны штаммом золотистого стафилококка. Рентгенологическое и гистологическое исследование костной ткани выявило морфологические изменения, характерные для хронических гнойно-воспалительных явлений. Таким образом, воспроизведенная экспериментальная модель оказалась в полной мере отвечающей поставленным задачам.

36 животным на 30-е сутки после моделирования экспериментального остеомиелита произведена операция -механическая санация костной полости, трансплантация клеток пуповинной крови в дефект правой бедренной кости (опытная группа). У 16 животных контрольной группы костный дефект заполнялся аутогемопломбой.

Анализ течения послеоперационного периода показал, что созданная экспериментальная модель позволила избежать летальности среди животных. Клиническое улучшение состояния животных опытной группы после операции наступало на 3-4 сутки и выражалось в повышении двигательной активности, нормализации аппетита, восстановлении опороспособности оперированных конечностей. При анализе клинической картины в послеоперационном периоде у животных опытной группы в 1 значительно меньшей мере, чем в контрольной группе, проявлялись осложнения со стороны мягких тканей и оперированной кости. Купирование воспалительного процесса в области операции происходило в более ранние сроки после трансплантации клеток пуповинной крови по сравнению с контрольной группой, что подтверждалось бактериологическим исследованием. Все это свидетельствовало о благоприятном влиянии клеток пуповинной крови на течение раневого процесса.

В ходе исследования проводился рентгенологический контроль за восстановлением костного дефекта. В целом, рентгенологическая картина характеризовалась у большинства животных завершением регенерации костной ткани в области искусственно созданной полости к 60-м суткам после трансплантации клеток пуповинной крови, что доказывало стимулирующее воздействие клеток пуповинной крови на регенерацию и восстановление костной ткани.

Для подтверждения данного положения проведено сравнительное исследование репаративных процессов костной ткани после трансплантации клеток пуповинной крови и без нее. В опытной группе животных в более ранние сроки происходило формирование клеточно-волокнистой ткани. Гистологические структуры, характерные для трубчатых костей (остеоны с функционирующими гаверсовыми каналами) в опытной группе также появлялись в более ранние сроки, чем в группе сравнения. Морфогенез репаративных процессов в экспериментальных полостях бедренных костей крыс после трансплантации клеток пуповинной крови характеризовался формированием органоспецифичного костного регенерата к 60-м суткам. Без трансплантации клеток пуповинной крови в дефект полноценного восстановления костной ткани в контрольной группе животных не происходило на протяжении всего эксперимента.

Ускорение репаративных процессов костной ткани при трансплантации клеток пуповинной крови может быть связано с несколькими факторами. В первую очередь, клетки пуповинной крови обладают собственной потенцией костеобразования за счет наличия стволовых клеток мезенхимального ряда и плюрипотентной популяции стволовых клеток, так называемых неограниченно делящихся соматических стволовых клеток (USSCs - unrestricted somatic stem cells). Это подтверждается рядом экспериментальных работ, демонстрирующих способность клеток пуповинной крови животных и человека дифференцироваться в клетки костной ткани при культивировании в специальных средах [109,144,162,215,217,218,225]. Описанный факт прямой дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток и плюрипотентной популяции стволовых клеток пуповинной крови в костные клетки, хотя бы даже в условиях in vitro, уже может свидетельствовать о существовании такой возможности и in situ в организме. Помимо этого, с наличием в пуповинной крови эндотелиальных прогениторных клеток может быть связано явление стимулированного ангиогенеза, что в условиях нарушенного кровоснабжения костной ткани имеет большое значение для эффективного репаративного остеогенеза [116,148,161,211,229,231,260].

Анализ гистоморфологического исследования экспериментальной работы подтверждает эти данные: остеогенетические процессы в опытной группе наблюдались не только со стороны эндоста и надкостницы, где процесс идет за счет собственных костных клеток, но и в центральной части регенерата. Причем новообразованных сосудов в опытной группе было значительно больше. Именно в окружающей сосуды соединительной ткани наблюдались очаги активного остеогенеза. Это, в свою очередь, способствовало меньшему развитию хрящевой ткани в области регенерата.

Проведенное исследование показало, что заживление костных дефектов под воздействием клеток пуповинной крови сопровождалось меньшей вероятностью развития таких осложнений, как патологические переломы, ложные суставы. Анализ экспериментальных результатов показал, что после пересадки клеток пуповинной крови в костный дефект количество послеоперационных осложнений существенно снижается по сравнению с контролем, что является еще одним положительным фактом.

Необходимо отметить, что для трансплантации нами целенаправленно использовались клетки, не подвергающиеся предварительному культивированию. Это было связано со стремлением изучить влияние самих клеток пуповинной крови на костную регенерацию и, тем самым, показать отсутствие необходимости в предварительной дифференцировки используемых клеток. На наш взгляд, такой подход позволил бы значительно упростить процедуру подготовки клеток для трансплантации и у человека.

Суммируя все выше изложенное, необходимо отметить, что клетки пуповинной крови крыс способствуют быстрой и полноценной регенерации поврежденной костной ткани, стиханию воспалительных изменений за счет наличия среди них стволовых клеток.