Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Использование сосудистого ксенобиопротеза, обработанного эпоксисоединением, в реконструкции артерии (экспериментально-клиническое исследование)

Министерство здравоохранения Российской Федерации Кемеровский государственный медицинский институт

на правах рукописи > Г Б 0ТК" *6!5,4772; 616—1°89-28/29)—1616.13—1089

■5 -1 дг п

'„ < Ч ЛУЧАНКИН Александр Александрович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОСУДИСТОГО КСЕНОБИОПРОТЕЗА, ОБРАБОТАННОГО 1ПОКСИСОЕДИНЕНИЕМ, В РЕКОНСТРУКЦИИ

АРТЕРИИ

(экспериментально-клиническое исследование). 14.00.27 — хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Кемерово—1995

Работа выполнена в Кемеровском кардиологическом це] и Кемеровском государственном медицинском институте.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор медицинских наук, профессор Л. С. Барбараш. доктор биологических наук, профессор С. П. Новикова.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Т. И. Шраер.

доктор медицинских наук, профессор В. В. Кунгурцев.

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт хирургии им. А. В. Вишневского г. Москва.

Защита состоится « » 1995 г. в // час

заседании Специализированного Ученого Совета К. 084.65.01 Кемеровском государственном медицинском институте Минздр Российской Федерации (Кемерово, Ворошилова, 22а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кемерова государственного медицинского института Минздрава Российс Федерации.

Автореферат разослан « ^ »

Ученый Секретарь Специализированного Совета,

кандидат медицинских наук, доцент В. И. Подолужи

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Арсенал сосудистых заменителей, ользуемых для хирургического лечения окклюзионных пораже-I периферических и венечных артерий достаточно велик. Для становления проходимости отдельных артериальных сегментов Iмен я ются синтетические протезы, аутогенные ткани, ксено- и ютраисплантаты. Однако, данные литературы о результатах чсння ближайших и, в основном, отдаленных исходов подоб-с операции позволяют заключить, что ни одни из имеются в настоящее время искусственных пли биологических мате-лов не удовлетворяет в полной мере всем требованиям пластикой сосудистой хирургии.

Традиционный способ пластики артерий малого и среднего .метров аутогенной подкожной веной продолжает оставаться рацией выбора при .хронической артериальной недостаточности личных сосудистых бассейнов, несмотря на то что, в 10—30% чаев подкожная вена не может быть использована, из-за осо-ностей строения, патологических изменений и предыдущего пемзования (А. В. Покровский с соавт. 1993; ЬЫа, 1992). Неудачи при использовании эксплантатов для протезирования днпх и мелких артерий, а также ограниченные возможности в учении аутотканей создали предпосылки для поиска возмож-тей применения ксепо и аллотрапеплантатов. Многолетние ин-спвные поиски как экспериментального, так и клинического актера показывают, что решающим фактором сохранения уктурной стабильности и предупреждения тканевой дегепера-

бнотрансплантатов, является способ их консервации (В. В. 1гуриев с соавт. 1991; ¿¿му^ал^/е-а-1969). Одним из сиективных направлении является изучение возможностей при-!ення для реконструкции артерий ксено- н аллотканей, обра-аниых различными химическими агентами, в основном с прикинем глутаральдегида (ГА) (Л. С. Барбараш е соавт. 1991).

Однако, добившись падежной структурной стабильности био-ни, безусловно отдаляющей развитие тканевой дегенерации, ледователи столкнулись с проблемой низкой тромборезистент-тн сосудистого бпоматернала, обработанного ГА ( ¿¿ог^э/ъ^' 7), причем последующие многочисленные модификации ГА—

обработанной ткани не решали этой задачи. В последние годы явились сообщения о перспективном использовании ряда коне пирующих агентов из группы эпокснсоедннений ( хА^/У/1/ е-а-1987, Л. С. Барбараш с соавт. 1992). Таким образом, низ1 тромборезистентность биологических материалов, обработан! глутаральдегидом, требовала комплексного решения данной пр лемы, а именно—замены общепринятого консерванта глутара дегида на новый сшивающий агент.

Актуальность настоящей работы определяется тем, что < направлена пе просто па поиски нового консерванта, а па исс дованне оптимального пути замены традиционного копсерва] глутаральдегида новым сшивающим агентом из класса эпоксис динепий с сохранением всех положительных свойств, присуп глутаральдегндному воздействию па биоткань и предупрежде ем основного осложнения биопротезирования сосудов — тром образования.

Цель и задачи работы. Цель исследования — разработ оптимальную модель сосудистого бпопротеза из внутренней гр ной артерии быка для пластики артерий малого и среднего д метров.

Задачи диссертации:

— разработать и стандартизировать оптимальные парамет способа консервации биоткани сосуда новым сшивающим аг том;

— изучить биомеханические свойства бпопротеза, обработ пгто эпоксисоединеннем и модифицированного гепарином;

— оценить тромборезистентность биоткани, обработ ной эпокснсоедпнением, а также изучить возможности усиле! антикоагуляцнонного эффекта бпоматериала после присоедине] к нему гепарина. Исследовать морфологические проявления ад тацип биопротеза в различные сроки после имплантации в ус виях эксперимента;

— пронести клиническую оценку ксенобиопротеза при рек струкцин артерий малого и среднего диаметра в ближайшие с ки после имплантации.

Научная новизна. Впервые обоснован, разработан и станд тизирован способ консервации ксеногенных сосудов представи лем класса эпокснсоедннений — диглицидиловым эфиром этил гликоля (ДЭС), такая обработка обеспечивает достаточную ст ктурную стабильность биоткани сосудов из внутренней груд1 артерии быка. Разработаны режимы обработки и метод компле ной оценки структурной стабильности бпоматериала.

Впервые показаны удовлетворительные прочностные свойс биоткани ксенососудов, обработанных эпоксисоединеннем, ус

овлена возможность улучшения их тромборезистептных свойств а счет последующей ковалентиой фиксации гепарина. Впервые кспериментально и клинически доказана эффективность продолжительного (в течение года) функционирования биопротезов в со-удистом русле реципиента, после консервации в эпоксисоедипе-ии.

Практическая ценность и реализация результатов работы, кспериментально обосновано влияние нового сшивающего аген-а из класса эпоксисоеднненнй па повышение устойчивости ксено-нопротезов из внутренней грудной бычьей артерии к биодеграда-ии и тромбообразованшо. Применение эпоксисоединения позво-ило осуществить эффективное связывание гепарина и уменьшить плпчество стадий консервации биопротеза, упростив тем самым ;хпологшо обработки биоткани, предложенную ранее.

Разработанный способ консервации внедрен в лаборатории э производству биопротезов клапанов сердца н сосудов Кемеров-<ого кардиологического центра. Результаты, полученные при зучеиии проблемы использования нового сшивающего агента, римепяются в отделении сердечно-сосудистой хирургии Новокуз-гцкого ГИДУВа и в отделении сосудистой хирургии Областной типической больницы Л» 1 г. Кемерова, а также в Кемеровском [фднологнческом центре для создания ксеногенных протезов кла-пнов сердца и при чтении лекций и проведении практических за-нтий со студентами Кемеровского мединститута и практическими )ачамн области.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждены на кедаиии Областного общества сердечно-сосудистых хирургов Кемерово, 1994), па объединенной научной конференции Кемеро-жого кардиологического центра п кафедры хирургических болезни № 1 Кемеровского медицинского института (Кемерово, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных абот, 2 рационализаторских предложения.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введе-1Я, обзора литературы, методической части описания и обсужде-1Я результатов экспериментального раздела работы, состоящих 5 трех глав, главы с результатами клинической апробации биоп-угезоп, заключения, выводов, практических рекомендаций и шска литературы. Работа изложена на 103 страницах мапшпо-!сиого текста, содержит 35 рисунков и 10 таблиц. Список лите-зтуры включает ЮГ) наименований отечественных и 106 зару-:жных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы.

1. Объекты исследования.

Морфологическим субстратом для изготовления биопротег выбрана внутренняя грудная артерия быка, которая нспользуетс в настоящее время в качестве пластического сосудистого матер] ала для замещения артерий небольшого диаметра, в частиост при аорго-коронарном шунтировании (Suma е-а- 1991). Виутре! няя грудная артерия быка является субстратом для получ<ши коммерческого биопротеза « » фирмы « 3/г ж?¿Mías

(США).

Не позднее 3—4 часов с момента забора артерию помещали консервирующие растворы. В качестве контрольного способа о( работки бноматериала использовали стандартную консервацию 0,625% растворе ГА при рН 7,4, создаваемом фосфатным буф| ром. Биоткань консервировали в течение 28 суток с трех кратне сменой раствора на 1, 3 и 7 сутки от начала обработки пр 20°С в защищенном от света месте. В качестве исследуемого m пользован водный раствор дпглпцидилового эфира этилепгликол при рН 7,4 (фосфатный буфер). Изучено влияние двух различны концентраций (2% и 5%) растворов. Консервацию проводили статическом режиме без смен растворов. Максимальная продо, жительность консервации составила 21 сутки при 20"С в светот доступном месте.

Настоящая работа построена по принципу сравнительно оценки нового консерванта — днглнцндплового эфира этиленгл) коля с глутаральдегидом — в отношении структурирующего во, действия на биоткань, а также по ряду биологических эффекто включая одно из основных свойств, а именно — резистентность тромбообразовашпо. Кроме этого, при исследовании структурнс стабильности бноматериала использованы нативные образцы бш ткани.

2. Методы исследования структурной стабильности консерв] рованного биоматериала.

Использован прямой метод оценки расходования первичнь аминогрупп лизина и гидроксилнзипа с помощью амннокислотн' го анализа (АА). Сравнивали остаточное количество «неизрасх' ловяннь'х» па образование поперечных связей первичных амнтг групп указанных кислот в консервированной разными сшивают: ми агентами биоткани. Исследовано исходное содержание указа: ных аминокислот в натпвном бноматериале.

Полный аминокислотный состав определен в натпвных, а та же контрольных — обработанных 0,625% ГА. и опытных обра цах, обработанных 2% и 5% растворами ДЭС. Исследовано по образной каждой серии (всего 32). АА проведен по методике, пр пятой в Российском НИИ Молекулярной биологии СО АН РФ, реализован на автоматическом аминокислотном анализаторе м дели «CL 5001» фирмы «BIOTRO№lK» (ФРГ). Регистрация пнкс 4

все расчеты проведены с помощью обработки данных с использованием компьютерного интегратора СК — ЗЛ фирмы БШМАИги» (Япония).

Данные АА оценивали в сочетании с результатами определе-ия устойчивости к коллагеназному перевариванию, проведенному знмсстпо с Лабораторией анализа Новосибирского института би-эргапической химии СО АН РФ. Резистентность к действию кол-агеиазы определяли по величине остаточной массы сосуда после нкубацин в растворе коллагеназы определенной активности. Для того лпофилизпрованные образны натнвных и модифицировап-ых артерий заливали соответствующим количеством фермента и одерживали в шейкере в течение 24 часов при 37'С. Продолжи-1лыюст!> инкубации определялась по достижению максимально) лизиса нативпой биоткани. Исследовано 7 образцов ткани из зждой группы (всего 28).

Разработанные ранее методы исследования структурной ста-ильностн биоткани-, были дополнены оценкой прочностных харак-?рнстик консервированного биоматериала при односно-продоль-зм растяжении однотппноприготовлеиных образцов на разрывай машине « -1122». Исследование выполнено в Ла-эратории полимеров РПИИИМТ МЗ РФ. Запись диаграмм усиление-перемещение» проводили в масштабе 2:1 с расчетом 7едугощнх показателей:

^ = Р шах / Б , где разрушающее напряжение при

растяжении (кг/см) Р тах — разрушающая нагрузка (кг)

Б — площадь поперечного сечения образца (см2)

= 1т /1 , где Е — отношение удлинения (%)

1т — максимальное удлинение образца до разрушения, определяемое по машинным диаграммам (см)

1 — исходная длина образца (см).

Испытаны пять групп биоматериала: натпвные образцы; об-1зцы, обработанные 0".625% ГА; 2% ДЭС; 5% ДЭС и 5% ДЭС+ парии. Исследовано по 23 образна каждой группы (всего 115).

Морфологическое исследование биоткани.

Для контроля адекватности выбранных условий обработки 'пользовали морфологическую опенку сосудистого биоматериала Лаборатории патоморфологин экспериментального НИИ Мос-жской Медицинской Академии им. И. М. Сеченова. Исследова-1Я выполнены с Помощью светового и электронного микроскопа : (/ЕМ — 100 В»), Изучено три группы биоматериала: натив-

ный, обработанный 0,625% ГА, 5% ДЭС. Морфологическому ш следованию подвергнуты также имплантированные образцы (сс баки), за исключением иатнвных сосудов, иа различных срока 7, 21 день, 3, 6, 9, 12 мес.

3. Изучение тромборезнстентности биоткани.

Одним из наиболее информативных способов оценки тромбе генных свойств является тест с пристеночным тромбообразоваш ем в эксперименте «ех У1Уо» при контакте материала с нативно кровью без добавления антикоагулянтов и гемостабилизаторо] Л1етод основан на сравнительной оценке количества тромботиче! ких масс, фиксировавшихся на образцах через определенные вр< менные интервалы после контакта с кровью. Исследование вь полнено в Лаборатории полимеров Института сердечно-сосудш той хирургии им. А. И. Бакулева АМН РФ.

Перед опытом «ех У1Уо» производилась оценка количеств присоединившегося гепарина в зависимости от длительности обр; ботки биоткани, так как выяснилось, что продолжительность о( работки биоткани ДЭС влияет па степень раскрытия эпоксигруп! к которым впоследствне фиксировался гепарин по типу ковалей' ной связи. Для этого образцы сосудов длиной 2 см в различив сроки консервации через 3, 5, 7, 10, 12, 14, 21, 24 суток обрабатыв; ли гепарином из расчета 100 ЕД/ыл при рН7.4, Т—20°С, экспоз! цня.З часа. Фотоэлектроколориметром КФК — 2 МП проводил количественное определение гепарина. Исследовали 40 образцов

Для опыта «ех У1Уо» использовали сосудистые фрагменты р 60 мм длиной и диаметром 2—3 мм. Исследовано пять групп ка нососудов обработанных — 0,625% ГА (контрольные), а так» 5% ДЭС в течение 14 суток; 5% ДЭС в течение 14 суток + геи; рнн; 5% ДЭС в течение 21 суток и 5% ДЭС в точение 21 сутокь гепарин. Всего исследовано по 9 образцов каждой группы.

Перед экспериментом сосудистые фрагменты различных грул помещали в специальное устройство, обеспечивающее одинаковь условия перфузии. Конструкцию затем подключали по типу пар; корпорального артерио-вепозного шунта в систему кровообращ нпя экспериментальной собаки. Продолжительность экспозици составила соответственно 13, 17 и 21 мин. После перфузии обра: цы высушивали в сушильном шкафу до постоянной массы, зате взвешивали на аналитических весах. Данные регистрировали кз значения конечного веса с наличием тромбомасс. Затем образц тщательно отмывали от тромбомасс, высушивали при тех же у ловиях и определяли исходный вес образцов.

Относительное увеличение веса опытных образцов по сравп нию с увеличением веса контрольных образцов вычисляли по фо] муле: 6

А = Ро/Рк x 100%

Ä — отношение веса тромбомасс на ткани, обработанной эпо-ксисоедипеннем, по сравнению с контрольной обработкой ГЛ (%).

Po = Ро2—Pol — разница веса образцов, обработанных ДЭС, до п после контакта с кровыо, соошетствепно (г).

Рк =- Рк2 — Рк1 — разница исходною и конечного веса контрольных образцов (г).

4. Оценка свойств сосудистых биопротезов в эксперименте :m YiYO».

Подготовку биопротезов к имплантации осуществляли отмы-¡аиием в стерильном физиологическом растворе при соотношении объемов биоткань (раствор не менее 1) 30—50 при постоянном юмешпваппн и трех-пятнкратпой смене раствора.

Хронический эксперимент выполнен па разнополых беспородных собаках массой тела 18—24 кг. Операцию проводили под )бщпм обезболиванием (С. Л. Шалимов с соавт. 1989). Использо-¡алп три группы образцов ксенопротезов: обработанные 0,625% "А (контроль), 5% раствором ДЭС и 5% раствором ДЭС с гепарином.

Зиопротезы были имплантированы билатерально в сонные арте-:>ин собак по типу «конец в конец». Всего проведено 24 имплантации образцов бпопротезов всех групп 12 собакам.

Учитывая затруднения в пльпаторной верификации проходимости протеза, мы попользовали ультразвуковой мониторинг аппаратом ИСКН-1 определяющим скорость и направление кровото-<а. Исследование проводилось по известной методике с помощью датчика в проекции кнвательпых машцнереже 1 раза в 2 педели. Кроме этого для контроля за функцией бпопротеза использовали ангиографию.

Эвтаназию животных для гистологического изучения или в :'вязн с развитием тромбоза проводили гексеналом; использовали 1 г сухого вещества одномоментно до остановки дыхания и сердечной деятельности.

Для морфологического исследования из макропрепаратов вырезали продольные блоки в области проксимальных и дистальных анастомозов с участками прилегающей артерии реципиента, а также поперечный блок через середину биопротеза.

5. Токсикологические испытания ксенобиопротезов, контроль стерильности консервирующих растворов ДЭС.

Для токсикологической опенки биопротезов в Российском научно-исследовательском и испытательном институте медицинской техники МЗ РФ были подготовлены 10 образцов ткани, обработанных по описанной выше методике с использованием 5% раствора диглицидилового эфира этиленгликоля и гепарина.

В вытяжках, приготовленных из биоматериала, определял содержание восстановительных примесей, отклонение величины р? остаточное количество стерилизующего агента. Изучали гемолг тическую активность приготовленных вытяжек, а также их обще 'юкснческое, сенсибилизирующее влияние на организм эксиериме! тальных животных, для. чего использовали биохимические покг затели крови, динамику массы тела, коэффициенты массы внут ренпих органов.

Контроль стерильности осуществляли путем забора проб кот серванта и фрагментов биопротеза с последующим посевом и кровяной агар и тпогликолевую среду. Забор проб для контрол осуществляли каждые трое суток в течение всего 21-го дневног периода консервации, а затем каждый месяц на этапе хранени биоматернала в эпоксисоедннении. В качестве контроля исполь зовали нативный биоматериал и результаты его посевов на те ж питательные среды. При появлении роста отмечали число коло пий микроорганизмов, выросших в чашках с питательной средог

Хранение бпопротезов осуществляли в герметичных стеклян ных контейнерах при Т 20'С в защищенном от света сухом месте.

6. Клиническая апробация ксенобиопротезов.

В отделении сердечно-сосудистой хирургии Кемеровского Ка рдиологического центра (директор клиники —■ проф. Л. С. Барба раш), и в отделении сосудистой хирургии Областной клипическо: больницы № 1 г. Кемерово (директор хир. клиники — проф. Т. И Шраер) с октября 1993 г. по сентябрь 1994 г. имплантировали 1' сосудистых ксенобиопротезов, подготовленных по новой техноло гни, 13 пациентам с окклюзноннымн поражениями артерий ннжни. конечностей и 1 пациенту с поражением коронарного русла. Воз раст больных от 42 до 74 лет. Все больные с поражением бедрен по-подколенного сегмента имели выраженную ишемию нижни: конечностей IIB, III, IV по критериям Покровского-Fontaine и ра спространенное атеросклеротическое поражение артерий нижни: конечностей: у всех пациентов отмечено поражение одной берцо ной артерии, а у 8 (61,5%) пациентов отмечено поражение дву: артерий.

Прямым показанием к применению сосудистых биопротезо] являлась у 9 (64,3%) больных невозможность использования дл: этой цели аутогенной вены (рассыпной тип строения, педостаточ ность диаметра и длины), у 5 (35,7%) пациентов — наличие i прошлом операций, когда аутовена уже была использована.

В сроки до 12 месяцев после операции функция биопротезо! оценена с помощью клинического, ультразвукового и ангиографи ческого методов исследования.

Результаты исследований и их комплексная оценка.

1. Результаты аминокислотного анализа.

Известно, что материальным субстратом для образования 1тра- и интермолекулярных связей коллагеновой матрицы при 5работке бифункциональным сшивающим агентом служат -Л'=Н^-группы лизина и гидроксилизина (Со1отЬ е-а- 1987). осле обработки ГА число остатков указанных аминокислот сни-ается не менее чем на 90%, что служит критерием адекватности щствия бифункциональных сшивающих агентов, в частности ЭС (Л. С. Барбараш с соавг. 1992). В таблице 1 указаны ре-,'льтаты такого рода анализа, проведенные в настоящей работе.

Таблица 1.

Относительное содержание аминокислот с стенке ксенососуда на 1000 аминокислотных остатков (М±ш)

АЛ

0

1

2

3

ТН1? БЕИ

аьи

ОНР Р1?о ОЬУ АЬА УАЬ онь

МЕТ

1ЬЕ

ЬЕи

ТУ1?

РНЕ

Н1Б

Т1?Р

ЬУБ

абр А!^

1.39 1.59

3.77 2.32 7.96

20.25± 32.28 ± 69.84 + 20.93 ± 140. 3 + 246. 3 + 24.3 149. 3+ 2.96 73.04± 4.58 6.71 + 0.55 7.49+ 0.45 24.44 + 50.37 + 9.90+ 27.14+ 14.48 +

1.35 3.37 0.62 2.01 2.53

24.37 + 1.89 43.78+ 2.36 38.83+ 2.81

20.90 ± 0.92 29.43+ 2.42 66.31 ± 4.33 14.69± 2.55 130. 1 + 10.94 256. 5± 14.23 161. 3± 5.87 89.34+ 9.87 1.05 + 2.48± 27.55+ 57.14: 6.60: 30.13+ 27.36: 1.04 + 2.97+ 41.39 + 35.27±

0.21

0.36

1.45

2.97

0.75

2.79

1.79

0.19

1.47

3.2

2.64

22.31 ± 1.73 32.43+1. 14 75.13+ 4.25 16.64+ 5.06 131. 1 ± 15.15 244. 9+36. 6 150. 8± 6.71 77.67+ 13.59 1.47+ 0.05 8.42± 1.07 27.36± 3.83 55.74+ 11.95 + 32.48:

9.14 3.20

3.15

19.33+ 5.04 *

4.89+ 0.95 47.35± 2.59 40.71 + 4.13

21.04± 1.46 31.11+ 1.84 67.16+ 5.21 16.30+ 1.63 118. 5+10.45 271. 8+18.12 161. 3± 5.39 85.89+ 5.03 0.79 ± 3.65± 27.4856.76 + 2.82+ 29.26: 28.28± 0.67:

0.13 0.99 0.69 2.05 1.12 1.05 3.68 0.11

41.94 + 35.31 +

3.39 3.02

Примечание: 0 — нативная ткань, 1 — биоткань, обработанная 0,625% ГА, - обработка 2% ДЭС, 3 — обработка 5% ДЭС, * — ничтожно малое коли-

Из таблицы видно, что содержание свободных лизиновых и кенлизиповых остатков в пативной ткани составляет 24,37±1,89 6,71 ±0,55 соответственно (в сумме около 31 па 1000 ОА). Учившая, что в литературе результаты аминокислотного состава тепки натнвной артерии быка отсутствуют — данные были взя-ы за основу.

Закономерное снижение количества лизиновых и оксилизнно-ых остатков в ткани обнаружено после стабилизации в ГА. Так, уммарное количество остатков лизина и оксилизина уменьши-ось до 4,02/1000 ОА (количество лизина до 2,97± 1,47, оксилизи-а до 1,05±0,21 соответственно). В дальнейшем для удобства равнения будут приводиться суммарные величины остатков ами-

нокислот. Подобное достоверное (р<0,01) снижение на 87% с держания аминокислот с потенциально — реакционными амин группами, свидетельствует, что при традиционной схеме обрабс ки ГА достигается высокая плотность сшивки ткани ксеносос дов.

Обработка ксеноартернн в 2% ДЭС дает суммарное снижен лизина и оксилизина до 6,36/1000 ОА. (Р<0,01), т. е. снижен ОА происходит только на 79%. Данный факт свидетельствует том, что обработка ткани 2% раствором ДЭС не является "опт мальной и вряд ли обеспечивает достаточную структурную ст бильность биоматериала. С увеличением концентрации ДЭС , 5% отмечается уменьшение числа свободных остатков лизина оксилизина до 0,79/1000 ОА, т. е. сшивка достигает 97 (0,79/1000 ОА против 31/1000 ОА в нативиой ткани.)

Результаты аминокислотного анализа показывают, что до адекватного структурирования ткани, по аналогии с воздействие ГА, использовать 2% концентрацию ДЭС вряд ли правомерн Более высокая плотность сшивки достигается большими конце трациями ДЭС, в частности, 5%. Такая 5% концентрация рабе чего раствора ДЭС более полноценно обеспечивает плотность п перечной сшивки коллагена биоткани.

Кроме того, после обработки 5% раствором ДЭС в ткани и меняется относительное содержание метиошша и тирозина (ум пылилось), гистпдина (увеличилось). Детальный анализ эт! данных важен для выяснения механизма биологического действ! ДЭС и, вероятно, позволит выявить новые звенья структурнруг щего воздействия нового консерванта на биоматериал.

2. Результаты теста на коллагеназную устойчивость биоткани, консервированной ДЭС

Результаты оценки эффектов. воздействия фермента привеД' пы в таблице 2.

Таблица 2

Остаточный вес ( в % к исходному) ксенососудов, подвергну тых воздействию коллагеиазы, (М±т).

Способ обработки образцов Исходный пес (мг), Л Остаточный вес (мг), В % остаточного веса соотношение В/А

0 32,62± 1,24 5,98± 1,09 18,3

1 39,27±2,01 27,33 ±2,10 69,6

2 24,60 ±1,06 14,84 ± 1,34 60,3

3 23,85±0,98 14,59±0,30 61,2

Примечания те же, что и к таблице 1.

Как видно из таблицы, под влиянием коллагеназы нативная шь подвергается неполному лизису, что связано с содержани-в стенке нативнон артерии определенного количества эластина . П. Слуцкий, 1988).

Консервация ксепососудов ГА по традиционной схеме приво-г к существенному повышению стабильности ткани. Процент аточного всса после воздействия коллагеназы в этой группе кшилз равен 69,6. Эти данные послужили критерием для по-■дуюшен устойчивости ткани к коллагеназпому перевариванию.

Обработанные эпоксисоединением (2% и 5% концентрации) эазиы опытных серий проявили идентичную устойчивость при ¡действии коллагеназы (60% и 61% остаточный вес соответст-1но, в обоих случаях р<0,01). Однако незначительное расхож-ше в процентах остаточного веса можно считать существенно с н потому, что полностью нативная ткань не лизируется. И I не менее, адекватная устойчивость ксенобиопротезов, обрабо-шых в растворе ДЭС различной концентрации, соизмеримая и :товерпо не отличающаяся от контрольной группы свидетельст-:т, что даже в жестких условиях протеолиза структурная ста-лыюсть консервированной ткани остается высокой.

Таким образом, результаты аминокислотного анализа и ис-.иепания устойчивости ткани к коллагенозно.му перевариванию [детельствуют о достаточном уровне стабильности биоматериа-обработанного ДЭС, не уступающем эффектам традиционной тботки ГА.

3. Прочностные свойства биоткани ксепососудов

Важным требованием, выдвигаемым к способу консервации тяется сохранение тканыо основных механических свойств точности и эластичности).

Анализ оценки этих свойств позволил выявить следующее: пцина стенки образцов ксепососудов в результате ДЭС—об-ботки достоверно не отличается от натпвпых фрагментов.

Стабилизация ксеноартерии в растворе ДЭС как 2%, так и 1 концентрации (таблица 3), приводит к увеличению прочности :пок получаемых биопротезов.

Таблица 3

ючностиые характеристики образцов степок ксеноартерии и ютовлепных из нее биопротезов (М).

Разрушающее 6* Относительное

"мособ обработки ткани напряжение. кг/см удлинение. % Е

а ь а Ь

0 43,45 33,40 26,6 *

1 62,65 43,30 16,0 *

2 46,58 37,30 25,0 *

3 60,46 39,20 27,6 *

4 59,26 37,98 26,5 *

Примечание: 0,1-2,3,* — см. прим. таблицы 1.4—образ обработанные 5% ДЭС и гепарином, а — образец вырезанг продольно, Ь — образец вырезанный поперечно.

Отмечено, что если обработка 2% раствором ДЭС незпа телыю п недостоверно (р> 0,05) увеличивает прочность тка оставляя ее по существу па уровне иативного образца, то об ботка 5% ДЭС увеличивает прочность фрагмента практпческ; 1,3 раза (р<0,01), что соответствует образцам, обработанным (р>0,05).

Эластичность ткани оценена по величине относительного линения при ее растяжении. Наиболее благоприятные резуль ты получены при исследовании образцов, обработанных эпок соединением, — достоверный прирост величины в сравнени контрольными образцами был более чем в 1,5 раза (р<0,0С соответствуя при этом параметрам нативных образцов (р>0,С

Оценка прочностных свойств биопротезов, приготовленных внутренней грудной артерии быка, свидетельствует о том, стабилизация артерии в 5% растворе ДЭС приводит к существ ному увеличению прочности и жесткости стенки получаемого п теза, аналогичной тем же образцам, но после воздействия I Однако, обработка образцов эпоксисоедннением способств значительному улучшению эластичности ткани, что имеет болы практическое значение.

4. Морфологическая оценка неимплангируемого биоматериал

По данным световой и электронной микроскопии внутреш грудная бычья артерия по своему гистологическому строению носится к артериям мышечно-эластического тина с трехслош структурой: интима, медпя, адвентиция.

Оба метода обработки (0.625% ГА и 5% ДЭС) одинаю влияли на гладкомышечные клетки, но на другие структур! компоненты сосудистой стенки влияли по-разному. Как было таповлено ранее, протеолнтический фермент папани, являющш одним из компонентов фермептпо-хпмического метода консер цнн с использованием ГА, обладает эластолитическим действи фрагментпруя эластические волокна в определенных участк что выражается в просветлении медии. Морфологический ана* коллагеновых волокон протеза после ферментпо-хпмической работки позволил отмстить отсутствие в них изменений. С д гой стороны ксенососуды, консервированные 5% диэпокснсое, пением, демонстрируют выраженную структурную стабилыюс эластических компонентов и коллагеновых волокон медии, 1 является немаловажным фактом. При этом отмечаются лишь значительные очаги набухания коллагеновых волокон адвентн: алыюго слоя при полном сохранении их поперечной исчерченн

I формы, что свидетельствует о стабильном состоянии этого шнительно-тканпого элемента стенки.

Таким образом, морфологическая оценка биоматериала, обеганного ДЭС до имплантации, подтверждает, что предлагае-режимы обработки ткани не вызывают нарушения се колла-эластппового каркаса.

Проведенный анализ структурной стабильности биоткани пошл определиться, что наиболее приемлемой для консервации юсосудов является 5% раствор ДЭС.

Результаты оценки тромборсзистентных свойств биоткани в опыте «ех

Наибольшее количество гепарина (402 мкг/г) связывается с чсисоедпиепием па образцах к 14 суткам, после этого колпче-> присоединенного гепарина несколько падает, оставаясь к 21 4 сут. (329 мкг/г. и 334 мкг/г. соответственно) стабильным, мшо эти образцы на данных сроках обработки гепарином ис-ьзовапы для опыта «ех \ЧУо».

Результаты динамики пристеночного тромбообразовапия пред-злены в таблице 4.

Таблица 4

ошепне веса тромбомасс в опыте по сравнению с контролем, %)■

■работка материала Л (%)

премп (мин.), 13 17 21

ГА 100 100 100

ДЭС, 14 сут. 69,9 71,3 78,0

ДЭС, гепарин, 14 сут. 25,9 52,9 59,7

ДЭС, 21 сут. 52,5 58,7 66,4

ДЭС, гепарин, 21 сут. 24,9 50,7 55,6

Дополнительная фиксация генарнпа при обработке сосудов ДЭС после 14 п 21 сут. соответственно до 402 мг/г и мкг/г обеспечила пролонгацию антитроыбогениой активности материала не только по сравнению с контролем, по и в сравни с биотканью опытных образцов, не подвергавшихся гепа-овой обработке.

На основании эксперимента «ех УЧУо» можно заключить, что эльзоваииые образцы ткани, обработанные 5% раствором С и модпфнцнроиаппые гепарином, обладают достоверно бо-высокой тромборезпстентностыо.

О. Результаты имплантации биопрогезов в эксперименте «ш У/Уо»

Перед имплантацией - контрольный биоиротез желтого цве-

та, плотен, малоэластичен, прорезывается при наложении ш Б отличии от этого, опытный биопротез имеет белый нвет, по лиз, эластичен, хорошо адаптируется к артерии реципиента с не анастомоза во время его формирования.

К 12 мес. после имплантации проходимость эпоксиобр танных 'бпопротезов составила 63%. Опытные бнонротезы, м фнцироваиные гепарином, показали еще большую тромборезис тность: проходимость их была равна 78%, что с условиях ма. диаметра исследуемого артериального сегмента является вес высоким показателем (Ar'.ojir' е. а. 1987). Более того, если 12°/с разцов опытной группы необработанные гепарином к 1 ме( затромбпровалиеь, то образцы, модифицированные гепари даже через 3 месяца были абсолютно проходимыми, что, вер нее всего, связано с действием фиксированного на внутреш стенку протеза гепарина. Это подтверждает проведенный р, опыт «ex VjVo», и свидетельствует, что эффективность гепар исключительно высока в ранние сроки функционирования с днстого биопротеза (А. С. Криковцов, 1988). Вместе с тем, в стоящем исследовании установлено, что уже к 6 мес. после плантации все протезы, обработанные ГА, затромбпровалиеь Экспериментально-морфологическое изучение ксенососу, обработанных 5% ДЭС, показала, что применение эпоксисо нения позволяет получить достаточную структурную усто вость коллагеиоэластинового каркаса ткани (что прослежено отологическим изучением ткани в течение 1 года). По резул там проходимости такие биопротезы более тромбоустойчивы, ксенососуды, обработанные ГА. Несмотря на то, что после/ сохраняет морфоструктуру ткаип, уже к третьему месяцу п имплантации в них гистологически были выявлены очаги мин лизацин — что является неблагоприятным фактором и подт ждает накопленные ранее данные (Л. С. Барбараш с соавт., 1S Полученные результаты морфологических исследоваш оценки проходимости эпокспобработанных ксенососудов, мс фнцированных гепарином, свидетельствуют, что данный тип судистого заменителя может быть рекомендован для клиниче го использования в реконструкции артерий малого и сред калибра.

7. Результаты оценки токсических и стерилизующих эффектов эпоксисоединения

Установлено, что как па этапах консервации, так и в nef всего срока (1—6 мес.) хранения ксенососудов, обработан описанным выше методом, не наблюдалось роста микрофл аэробного и анаэробного характера.

Биопротезы сосудов не оказывают токсического воздейг па организм и соответствуют требованиям, предъявляемы\

?лням медицинского назначения, контактирующими с в отними средами организма.

8. Клиническая апробация ксенобиопротезов

Результаты оперативных вмешательств с использованием по-сосудистых биопротезов, изготовленных из внутренней груд-артерии быка, представлены в табл. 5.

Таблица 5

ультаты клинического использования бпопротезов (12 мес.).

Виды операции Общее количество Состояние проходим протеза тромбир.

1артерэктомля из бедренной арте-

, заплата из Онопротеза 1 1 —

,реп но-прокспмалыюподко ленное

1тпрованис 7 6 1

фенио-дисталыюподколешюе 3

иированне 5 2

>то-коропариое шунтирование пра-

короиарпоп артерии 1 1 -

Летальных исходов и гнойных осложнений после операции не ечено. В одном случае наблюдали умеренную лимфоррею из астн пахового послеоперационного рубца, которая в послед-ин прекратилась без дополнительного вмешательства.

В ближайшем послеоперационном периоде тромбозов био-|тс:юв не зарегистрировано. Во всех случаях имплантации 'протезов в бедрсиио-нодколеииую позицию перед выпиской ьчых !п стационара выполнено дуплексное ультразвуковое ис-доваиие, которое установило проходимость бпопротезов. В х случаях хороший результат был подтвержден в отдален-I послесперациониом периоде артерпографиеп.

В структуре осложнении отдаленного послеоперационного пега основное место занимают тромбозы ксенобиопротезов, они ;лн место в 3 (1"1,4%). случаях. Основной причиной их оказии явилось нарушение путей оттока при прогресспровании роег.тероза. этот ф.т.л очевидно связан с тем, что имплаита-[ бпопротезов пгивиднлась в сложных гемодинамических ус-Iнях (при поражении нескольких берцовых артерий), кроме то-бнопротсы применялись при повторных артериальных рекоп-укцп"х. гггда собственный пластический материал использо-ь было невозможно.

Результаты первого опыта клинической апробации биопроте-■ — функционирование в сроки до 1 года 78,6% бпопротезов из й имплантируемой группы — позволяют надеяться, что ксено-щротезы из внутренней грудной артерии быка, обработанные

новым сшивающим агентом, явятся разумной альтернативой вестным в настоящее время сосудистым заменителям,для арте малого и среднего диаметров.

Полученные клинические результаты свидетельствуют о I епективиости практического использования сосудистых биопр( зов из внутренней грудной артерии быка, обработанных эпо! соединением, однако окончательное суждение о практической I пости предложенных новых биологических сосудистых замеш лей будет возможным лишь при накоплении опыта пмплапта при более длительных сроках клинических наблюдений.

ВЫВОДЫ:

1. Па основании комплексного подхода к изучению струю пой стабильности биологических имплантатов обоснован, раз ботан и экспериментально подтвержден новый эффективный с соб консервации ксепососудов, изготовленных из внутренней г дной. артерии быка для реконструкции артерий малого и ср него диаметров.

2. Определены оптимальные параметры процесса коисерва: внутренней грудной артерии быка с использованием 5% раств! диглицидилового эфира этиленгликоля, позволяющие сохран морфологическую структуру стенки сосуда и получить достат иую структурную стабильность обрабатываемого биоматериа

3. При проведении аминокислотного анализа ксеноткани, работанпой эпокснсоединеннем, доказано достоверное измене содержания метнонина, тирозина и гистидина по сравнению с работкой биоматерпала глутаральдегидом.

4. Пред тягаемый способ консервации обеспечивает повьп пне эластичности биоткани в 1,5 раза по сравнению с традици пым способом обработки глутаральдегидом.

5. В опытах ех ^'¡У'о установлено, что применение эпоксис дипення в среднем на 30% повышает тромборезистентность б материала. Усиление на 15% данного эффекта достигается до лннтельной иммобилизацией на ткань гепарина.

6. В опыте 'п доказана адекватная морфофункциопа пая адаптация сосудистого биопротеза разработанной модели бассейне артерии равноценного диаметра проходимость проте: составляет 78% в сроки до 12 мес.

7. При клинической апробации сосудистых биопротезов г реконструкции бедренно-подколенного сегмента и коронарш русла общая проходимость через 1 год составила 78,6%.

8. Ксенобиопротезы из внутренней грудной артерии быка ] гут быть рекомендованы для клинического применения прп

:трукщш артерий малого и среднего диаметра в качестве аль-■атнвного пластического материала.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для комплексной опенки структурной стабильности бпо-:риала, консервированного сшивающим агентом, необходимо зедение аминокислотного анализа, исследования устойчивости чтлагеназному перевариванию, изучения прочностных характе-гнк консервированного биоматериала.

2. При изготовлении бнопротезов из внутренней грудной эрги быка необходимо учитывать следующие требования:

A. Первичную обработку внутренней грудной артерии следу-фоиодпть не позднее 12 часов с .момента забора материала на окомбинате.

Б. Обработку эпокснсоединеппем 5% концентрации необхо-

0 проводить в стационарном режиме в течение 21 суток при ватной температуре при рН 7,4 и при соотношении объемов ш и раствора не менее 1:15.

B. Модификацию биопротезов гепарином, для повышения мборезнстентпых свойств ДЭС — обработанной ткани, следу-троводнть после 21 суток консервации при рН 7,4 при ком->пй температуре водным раствором гепарина в концентрации ЕД/мл.

3. Хранение биопротезов рекомендуется в специальных кон-1ера.х, заполненных 2% или 5% растворами ДЭС, в защшиен-

от света месте при комнатной температуре. Биопротезы год-для использования в течение года после консервации.

4. Перед использованием биопротез должен быть отмыт от серванта стерильным физиологическим раствором при еоотно-[ин об'ьемов биоткань (раствор не мопсе 1) 30—50 при по-ич'ом помешивании и трех- пятикратной смене фнзпологпчес-

1 раствора.

5. Все мяннпуляппн во время имплантации должны прово-ься с минимальной травматпзанпей стенки биопротеза. Не дует накладывать" па пего зажимы, захватывать интиму пинами. При выполнении сосудистого шва следует применять авматпчеекую пить 5/00 —в''00, вкол иглы следует произво-ь со порргы просвета протезя, добиваясь тщательного сопо-вления ичтимлльион поверхности биопротеза и реконструпру-1ГО сосу та.

6. Во время п после операции в сроки до 3 мое. всем боль-,1 рекомендовано назначение дезагрегантов (аспирин 0.25 мг 3 раза в сутки).

7. После имплантации ксепобнопротезов, подготовлснны; новой технологии, больные должны находиться под диспансер наблюдением. В сроки 1,3 и 6 мес. после операции необход ультразвуковое исследование для контроля проходимости ( протезов.

8. Разработанные технология и методика изготовления с днетого биопротеза нз внутренней грудной артерии быка позв! ют организовать серийное производство биопротезов кровенос сосудов из данного субстрата.

Список работ по теме диссертации

1. Экспериментальная оценка сосудистых ксснобиопротсзов, обработанных 1Ксисоедипением. // Тез. докл. II Всесоюзного съезда сердечно-сосудистых >ургов, Санкт-Петербург, 1993, (соавт. Л. С. Барбараш, А. С. Криковцов, П. Новикова, 11.10. /Куравлева, Я. Л. Эльгудин).

2. Экспериментальная разработка сосудистых ксснобиопротезов, обработан-

энокснсоединением. // Сборник научных трудов Минздрава и Медпрома

1 и Кемеровского мединститута, 1993, (соавт. Л. С. Барбараш, А. С. Крико-)в, С. П. Новикова, II. Ю. /Куравлева, Я. Л. Эльгудин).

3. Экспериментальное исследование сосудистых ксенобнопротезов. // Тез. сл. к научной конференции «Актуальные вопросы восстановительной и ре-[структивной хирургии», Иркутск, 1993, (соавт. Л. С. Барбараш, А. С. Крико-)в, И. 10. Журавлева, Я. Л. Эльгудин).

!. Новая модель сосудистых биопротезов для реконструкции артерий мао и среднего диаметров. // Тез. докл. к итоговой научной конференции покузнецкого ГИДУВа, Новокузнецк, 1993 (в печати), (соавт. Л. С. Барба-и, А. С. Криковцов, И. 10. Журавлева, Я. Л. Эльгудин, С. П. Новикова).

5. Экспериментальная оценка структурной стабильности сосудистых ксено-¡протезов, обработанных зпоксисоединением. // Грудная и сердечно-сосудн-я хирургия, 1992 (в печати), (соавт. Л. С. Барбараш, А. С. Криковцов, II. Ю. ,'равлева Я. Л. Эльгудин, С. П. Новикова).

6.

7.

8. Рац. предложение КГМИ № 612. 1987, «Контейнер для консервации, энепня и подготовки к операции биологических протезов кровеносных сосу-1», (соавт. Л. С. Барбараш, A.C. Криковцов).

9. Рац. предложение КГА1И Л'з 1 ООО, 1987, «Решетка-подстил для содержат экспериментальных животных», (соавг. К. В. Крикуновскпй, Д. И. Борисов).

6.The usage of vascular sated with epoxycorapound. // ess, Berlin, September 6-9, rash, A • S. Kril;ovtsov, S-P. vleova, G-V. Moisseinkov)-/•First clinical application lar foioprostheses in Russia-t. L-S- ~ Elgudin)

xenobioprostheses 43rcJ International 1994,(соавт- L-S-Hoviliova, I-Yu.

of

Barbarash, A-S- Kr il;ovtsov, "s*. V

nevj generation "Eurochap"-94 -Ivanov,

Топкинский цех КемПК. 1995 г. Заказ № 222