Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Использование реакции флуоресцентной in situ гибридизации при раке мочевого пузыря

005010973

На правах рукописи

Хачатурян Александр Владимирович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕАКЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ ПРИ РАКЕ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ

14.01.12 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

-1 цдр Ш

Москва — 2012

005010973

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени

Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (директор — академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Матвеев Всеволод Борисович

доктор медицинских наук, профессор Карселадзе Аполлон Ирадионович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Немцова Марина Вячеславовна

доктор медицинских наук Иванов Сергей Анатольевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «_16_»_____марта_ 2012 года в_____часов на

заседании Диссертационного Совета Д.001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, Каширское шоссе, 24.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан « 30 »___января____2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета

д.м.н. профессор Ю.А. Барсуков

Актуальность темы

Рак мочевого пузыря является распространенным заболеванием и среди всей онкологической патологии в России в 2007 году находился на 7-м месте у мужчин и 18-м - у женщин. Ежегодно в нашей стране диагностируют порядка 13 тыс. новых случаев рака мочевого пузыря (М.И. Давыдов, Е.М. Аксель, 2009) в Соединенных Штатах - около 60 тыс. и приблизительно 500 тыс. человек живут с этим диагнозом (B.R. Konety et al., 2007).

Заболеваемость раком мочевого пузыря увеличивается примерно на 13% в год, однако, показатель смертности неуклонно снижается благодаря ранней диагностике заболевания и повышению эффективности его лечения. Высокая распространенность рака мочевого пузыря и длительный период наблюдения с регулярным обследованием больных для своевременного выявления рецидивов опухоли сделали рак мочевого пузыря одним из наиболее дорогостоящих онкологических заболеваний (Hong Y.M.et al.,2008).

По данным литературы, среди больных, у которых рак мочевого пузыря установлен впервые, 70% имеют поверхностно расположенную опухоль, растущую в пределах слизистого и подслизистого слоев (рТа-Т]), 25% - инвазивную, распространяющуюся на мышечный слой стенки мочевого пузыря (рТг-О, и 5% - диссеминированный рак. Ввиду высокого риска рашития метастазов, основным методом лечения инвазивного рака, как правило, является радикальная цистэктомия. У пациентов с поверхностным раком данный вид лечения используют относительно редко: при наличии низкодифференцированной быстро рецидивирующей опухоли и рака in situ, не поддающегося внутрипузырной БЦЖ-терапии (Smith J.A. Jr et al.,1999; Матвеев Б.П. и соавт., 2003; Jemal A. et al., 2007 и др.).

Основным и обязательным методом инструментальной диагностики рака мочевого пузыря и его рецидивов до настоящего времени остается цистоскопия. Наиболее простым в исполнении и недорогим неинвазивным методом, доступным для многократного повторения, является цитологическое исследование мочи. По данным литературы, этот метод

отличается высокой специфичностью, то есть, имеет низкую степень ложноположительных результатов, однако, его чувствительность (высокая частота ложно-отрицательных результатов) не всегда удовлетворяет исследователей (Hailing К.С. et al., 2007).

В связи с этим возникает необходимость в совершенствовании методов ранней диагностики первичных опухолей мочевого пузыря, а также оптимизации процедур мониторинга больных с акцентом на раннюю диагностику рецидива опухоли.

В настоящее время ведется поиск методов лабораторной диагностики, обладающих более высокой чувствительностью, чем цитологическое исследование мочи, и не уступающих ему по специфичности. Одним из таких методов, активно разрабатываемых в последние годы, является флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) - разновидность цитогенетического исследования, позволяющая выявить специфические генетические нарушения, присущие раку мочевого пузыря - гиперплоидию 3, 7, 17 пар хромосом,делецию локуса 9р21 (Sarosdy M.F. et al., 2002; Hailing K.C. et al., 2008; Kipp B.R. et al., 2009 и др.)

С помощью этого метода стало возможным повышение эффективности ранней диагностики рака мочевого пузыря благодаря выявлению степени хромосомной нестабильности в единичных опухолевых клетках, выделенных из мочи пациента.

Кроме исследования осадка мочи, метод используется в уточнении степени дифференцировки опухолей мочевого пузыря путем изучения хромосомной нестабильности в отпечатках кусочков опухолей, удаленных при трансуретральных резекциях.

Эта особенность метода способствует определению прогноза у больных раком мочевого пузыря. Таким образом, внедрение метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) в медицинскую практику врачей онкоурологов является актуальной задачей в совершенствовании диагностики как первичного рака мочевого пузыря, так и его рецидивов.

Цель исследования

Улучшение диагностики и прогнозирования клинического течения рака мочевого пузыря с использованием метода флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).

Задачи исследования

1. Определить частоту полисомии 3, 7 и 17 хромосом, а также Локуса 9р21 в клетках уротелия больных переходноклеточным раком мочевого пузыря, а также в клетках уротелия больных мочекаменной болезнью (МКБ) из контрольной группы, с использованием метода флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).

2. Определить значимость нарушений в каждой отдельной взятой хромосоме - 3, 7, 17 и Локуса 9р21 и влияние их на дальнейший прогноз заболевания.

3. Провести мониторинг больных раком мочевого пузыря с использованием метода флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) для ранней диагностики рецидива.

4. Изучить прогноз заболевания у больных раком мочевого пузыря с использованием метода флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).

Научная новизна

В настоящей работе впервые в отечественной медицине разработан новый подход к ранней диагностике рака мочевого пузыря и его рецидивов путём определения полисомии 3,7, 17 хромосом и Локуса 9р21 в клетках уротелия больных раком мочевого пузыря. Проведено сравнение полученных данных с результатами реакции FISH, проведённой на образцах уротелия больных МКБ из контрольной группы, полученных при выполнении «холодной» биопсии слизистой мочевого пузыря. Изучен прогноз заболевания у больных раком мочевого пузыря, с учётом обнаруженных генетических нарушений.

Практическая значимость

Данные, полученные в настоящем исследовании, могут использоваться для проведении мониторинга больных раком мочевого пузыря для раннего выявления рецидива опухоли по сравнению со стандартной схемой -цистоскопия + цитологический анализ мочи. Результаты методики позволяют составить более точный прогноз заболевания, и соответственно подобрать оптимальную адъювантную терапию.

Апробация работы

Материалы диссертации обсуждены 27.05.2011 г. на совместной научной конференции урологического отделения, патологоанатомического отделения, лаборатории молекулярной патологии, лаборатории клинической онкогенетики НИИ КО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 научные работы.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами, 37 рисунками. Состоит из введения, четырех разделов, обсуждения и выводов. Список использованных источников содержит 72 наименования, из них 67 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включено 130 человек: 100 больных опухолями мочевого пузыря, получавших лечение в отделении урологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (96 больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря (РМП), 3 - плоскоклеточным раком мочевого пузыря, 1 - папилломой мочевого пузыря), из них 77 (77%) мужчин и 23 (23%) женщины в возрасте от 38 до 90 лет. Группу контроля составили 30 больных мочекаменной болезнью без опухолевых образований в мочевом пузыре, получавших

лечение в урологическом отделении ГКБ №7, из них 12 (40%) мужчин и 18 (60%) женщин в возрасте от 17 до 89 лет. Средний возраст пациентов контрольной группы составил 61,13±19,69 лет и статистически значимо не отличался от среднего возраста больных опухолями мочевого пузыря.

Всем больным опухолями мочевого пузыря проведено обследование, включавшее в себя сбор и анализ анамнестических данных, клинический осмотр, общий и биохимический анализы крови, ультразвуковое обследование органов брюшной полости и малого таза. Всем больным из данной группы на первом этапе лечения проводилась трансуретральная резекция (ТУР) мочевого пузыря, полученный материал использовался для проведения гистологического анализа, отпечатки с опухолевой ткани использовались для проведения Р18Н-реакции. У 8 больных этой группы вторым этапом лечения была выполнена цистэктомия.

Таблица 1

Распределение больных в зависимости от стадии рака мочевого пузыря

рТЫМ-стадия опухоли Число больных (N=99)

Абс. %

ТШОМО 78 78,8

Т2аИ0М0 10 10,1

Т2ЬМ)М0 6 6,1

ТЗаЮМО 1 1,0

ТЗЬШМО 2 2,0

ТЗЬШМО 1 1,0

Т4ШМ0 1 1,0

Всем пациентам из контрольной группы проводилась цистоскопия, при которой выполнялась «холодная» биопсия неизменённого уротелия, отпечатки с фрагментов неизменённого уротелия использовались для проведения РКН-реакции.

При проведении Р18Н-реакции полученный материал подвергали специфической обработке реактивами из диагностического набора многоцветных ДНК-тестов «игоУузюп» (фирма АЬЬой Ууз^з, США).

Использование «игоУуБюп» обеспечивает визуализацию цитогенетических транслокаций в 3, 7, 17 хромосомах и выявляет локус-специфический ген 9р21.

Данный набор содержит центромерные ДНК-зонды к 3, 7, 17 парам хромосом, окрашенные соответственно в красный, зеленый и голубой цвета, а также локус-специфический ДНК-зонд к хромосоме 9р21, окрашенный в золотистый цвет.

Цитогенетические изменения, характерные для рака мочевого пузыря, регистрировали с помощью флюоресцентного микроскопа, оснащеннного соответствующими фильтрами для визуализации флуоресцентных сигналов красного, зеленого, голубого и золотистого цветов.

Согласно рекомендациям фирмы-производителя, результаты исследования считали Р18Н-положитглъными в тех случаях, когда при анализе всего образца (отпечаток с опухоли или неизменённого уротелия) обнаруживали

4 аномальные клетки с одновременным увеличением числа 2-х и более хромосом 3, 7, 17 или 12 клеток с гомозиготной потерей локуса 9р21 (рис. 1).

Рис. 1.

Для удобства интерпретации и проведения количественного анализа полученных результатов мы выделили 4 группы аномальных клеток в зависимости от частоты их встречаемости:

• 1 группа - 1 -4% клеток,

• 2 группа-5-30%,

• 3 группа - 31 -60%,

• 4 группа-61-100%.

Методы лечения больных опухолями мочевого пузыря

В отделении онкоурологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН всем 100 больным опухолями мочевого пузыря на первом этапе лечения проведена ТУР опухоли мочевого пузыря; у 8 (8%) из них на следующем этапе выполнена цистэктомия.

Адьювантное лечение получили 69 (69%) больных: 53 (53%) -внутрипузырную иммунотерапию вакциной БЦЖ в дозе 50 мг в 50 мл физиологического раствора 1 раз в неделю в течение 6 нед.; 10 (10%) больных - внутрипузырную химиотерапию доксорубицином в дозе 50 мг в 50 мл физиологического раствора 1 раз в неделю в течение 8 нед.

5 (5%) больных - получили системную полихимиотерапию по схеме вС: гемцитабин 1000 мг/м2 внутривенной инфузией в 1, 8 дни, цисплатин 70100 мг/м2 внутривенной инфузией в 1 день; каждые 28 дней).

1 (1%) больной - лучевую терапию (РОД 2 Гр, СОД 66 Гр) и 1(1%) -лучевую терапию и системную полихимиотерапию по схеме вС.

Результаты лечения больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря

В исследование включено 96 больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря (74 мужчины и 22 женщины). Средний возраст пациентов составил 59,89±11,08 лет и колебался от 38 до 90 лет; 47 (48,96%; 47/96) человек были в возрасте 60 и более лет.

Проведенный нами анализ результатов лечения 96 больных переходноклеточным раком мочевого пузыря показал, что за время наблюдения у 29 (30,21%; 29/96) пациентов диагностирован рецидив опухоли. Отдаленных метастазов ни у кого не было.

В связи с рецидивом опухоли всем 29 больным в период наблюдения выполнены повторные хирургические вмешательства в объеме ТУР. У одного больного оперативное лечение дополнено системной полихиотерпией.

Общая 1-летняя выживаемость 96 больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря составила 98,51±1,47%, 2-летняя - 97,06±2,49%, 3-летняя - 93,26±4,43%, 4-летняя - 88,90±7,22%.

Медина безрецидивной выживаемости составила 30,3 мес.; 1-летняя выживаемость без признаков рецидива - 76,38±5,0%, 2-летняя - 56,94±7,36%, 3-летняя - 45,55±8,32% (рис. 2).

1.0

0,9

0.8

ь 0|'

о

а>

2 0.6

х

3

ш 0.5 0.4 0,3 0,2

-> Умер/рецидив Жкв/а-ез прогресскро&аиия

" 1--,

\ а:-: . г>. Общая выжата еиость

%- с:- :■ , ОН

о- 1-* 1 V- Безпешшивная выживаемость

гч ✓

(„ .<>. |

•: 1

12 24 З1

Время наблюдения, мес.

Рис. 2.

Как отмечено выше, за время наблюдения у 29 (30,21%) из 96 больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря диагностированы рецидивы опухоли (Группа 1). Для того чтобы выявить особенности течения заболевания у таких пациентов, мы проанализировали частоту встречаемости у них основных клинико-морфологических факторов прогноза развития рецидива и сравнили её с аналогичными показателями 67 пациентов, у которых во время периода наблюдения не было рецидивов опухоли (Группа 2).

В анализ включены следующие факторы (табл. 2): пол пациентов, их возраст, статус курильщика, наличие гидронефроза, количество опухолевых очагов, их размеры, рТ-стадия опухоли, наличие инвазии мышечного слоя мочевого пузыря и метастазов в лимфатические узлы, общая стадия опухоли и степени её дифференцировки, наличие адьювантного лечения.

Проведенный нами статистический анализ выявил значимое (р=0,03) увеличение частоты развития рецидивов у больных в возрасте 60 и более лет. Все остальные различия частоты встречаемости основных клиникоморфологических факторов прогноза развития рецидива не имели статистической достоверности (табл. 2).

Уровень безрецидивной выживаемости больных в зависимости от наличия различных клинико-морфологических факторов прогноза развития рецидива рака мочевого пузыря представлен в таблице 3.

Проведенный нами статистический анализ свидетельствует о достоверном (р=0,009) снижении безрецидивной выживаемости больных в возрасте 60 и более лет. 1-летняя безрецидивная выживаемость 47 пациентов в возрасте 60 и более лет составила 67,32±8,46%, 2-летняя - 32,91 ±10,71%, 3-летняя - 18,81±9,77% при медиане выживаемости 17,5 мес. Аналогичные показатели у 49 больных моложе 60 лет были существенно выше: соответственно 83,78±6,05%, 78,54±7,61%, 40,91 ±9,41%; медиана

выживаемости не достигнута.

Частота встречаемости клинико-морфологических факторов

прогноза развития рецидива переходно-клеточного РМП

Группа 1 Группа 2 Всего

Фактор (N=29) (№ 67) (№ =96)

Абс. % Абс. % Абс. %

Пол: мужской 25 86,21 49 73,13 74 77,08

женский 4 13,79 18 26,87 22 22,92

Возраст: <60 лет 10 34,48 39 58,21 49 51,04

> 60 лет 19 65,52 28 41,79* 47 48,96

Курение: нет 18 62,07 37 55,22 55 57,29

есть 11 37,93 30 44,78 41 42,71

Гидронефроз: нет 26 89,66 58 . 86,57 84 87,5

есть 3 10,34 9 13,43 12 12,5

Кол-во опух.очагов:

единич. 13 44,83 38 56,72 51 53,13

множественные 16 55,17 29 43,28 45 46,88

Размер

опухоли: <5см 21 72,41 52 77,61 73 76,04

> 5см 8 27,59 15 22,39 23 23,96

рТстадия: 1 25 86,21 53 79,1 78 81,25

2 3 10,34 11 16,42 14 14,58

3 1 3,45 2 2,99 3 3,13

4 0 0 1 1,49 1 1,04

Инвазия

мышечн. слоя: нет 25 86,21 53 79,1 78 81,25

есть 4 13,79 14 20,9 18 18,75

N0 28 96,55 64 95,52 92 95,83

N1+2 1 3,45 3 4,48 4 4,17

Стадия опухоли: I 25 86,21 53 79,1 78 81,25

II 3 10,34 И 16,42 14 14,58

IV 1 3,45 3 4,48 4 4,17

о, 5 17,24 14 20,9 19 19,79

о2 12 41,38 33 49,25 45 46,88

Оз 12 41,38 20 29,85 32 33,33

Адьювантное

лечение: нет 4 13,79 22 32,84 26 27,08

есть 25 86,21 45 67,16 70 72,92

* различия достоверны (р<0,05) по сравнению с Группой 1

Выживаемость больных без признаков рецидива РМП

в зависимости от клинико-морфологических факторов прогноза

Факторы N Ме- Выживаемость (%) ± 5

диана (мес.) 1-летняя 2-летняя 3-летняя Р

Пол: мужской 74 26,1 73,21±5,91 55,35±8,26 40,91±9,41

женский 22 - 87,5±8,26 62,5±16,06 53,57±18,06

Возраст: 49

<60 лет - 83,78±6,05 78,54±7,61 71,06±9,90 0,009

>60 лет 47 17,5* 67,32±8,46 32,91±10,71 18,81±9,77

Курение:

нет 55 20,8 75,61±6,71 50,41±10,23 36,96±11,07

есть 41 34,4 77,41 ±7,51 65,03±10,21 56,36±11,97

Г идронефроз:

нет 84 28,6 77,6±5,27 55,42±8,02 42,63±8,94

есть 12 - 68,42±15,08 57,02±19,35 42,76±22,7

Кол-во опухолевых очагов:

единичные 51 32,5 78,38±6,76 66,77±9,52 44,51±12,26

множественные 45 20,8 74,28±7,38 47,75±10,63 43,78±11,36

Размер опухоли:

< 5см /3 34,7 79,63±5,48 58,39±8,44 49,74±9,14

>5 см 23 14,7 59,64±13,04 35,78±18,4 17,89±15,64

рТстадия:

1 78 31,1 76,07±5,57 52,92±8,26 44,45±8,84

2 14 76,92±12,88 56,98±19,94 25,32±19,98

3 3 44,44±31,3*** - -

4 1 — - -

Инвазия мышечного слоя:

нет 78 31,1 76,07±5,57 52,91 ±8,26 44,45±8,84

есть 18 23,9 70,38±13,36 52,13±18,84 23,17±18,04

N0 92 31,8 76,98±5,04 57,39±7,42 45,91±8,38

N1+5 4 48,61±32,1*** - -

Стадия опухоли:

I 78 зм 76,07±5,57 52,92±8,26 44,45±8,84

II 14 76,93±12,88 56,98±19,94 25,32±19,98

IV 4 - 48,61±32,1 *** - -

С|+2 64 36,96 80,85±5,73 63,83±8,81 53,62±9,93

Сз 32 18,8** 65,18±10,32 38,34±13,5 28,75±13,1 0,09

Адьювантное лечение:

нет 26 - 77,77±9,97 69,13±14,44 55,3±20,96

есть 70 23,5 75,92±5,81 52.81±8,33 40,14±8,99

* различия достоверны (р<0,05); ** тенденция к достоверности различий (0,05<р<0,1); *** 6-месячная выживаемость

Выявлена тенденция (р=0,09) к более низкой выживаемости без прогрессирования заболевания у больных с высокозлокачественными опухолями 03 (рис. 3). Так, медиана безрецидивной выживаемости пациентов, имеющих опухоли вз, составила 18,8 мес., 1-летняя выживаемость - 65,18±10,32%, 2-летняя - 38,34±13,5%, 3-летняя - (

28,75±13,1%. При опухолях медиана безрецидивной выживаемости была практически в 2 раза выше - 36,96 мес. 1-, 2- и 3-летняя выживаемость больных без признаков рецидива опухолей составила соответственно, |— 80,85±5,73%, 63,83±8,81% и 53,62±9,93%.

о Рецидив Без рецидива

Время наблюдения, мес.

Рис. 3.

Результаты применения реакции флуоресцентной in situ гибридизации у больных раком мочевого пузыря

Учитывая, тот факт, что клинико-морфологические факторы не позволяют полноценно прогнозировать развитие рецидива рака мочевого пузыря, мы провели анализ молекулярно-цитогенетических маркеров данной опухоли с использованием флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) у 96 больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря и сравнили их с

показателями аналогичных маркеров у 30 больных мочекаменной болезнью без опухолевых образований в мочевом пузыре, составивших группу контроля, а также у 3 больных плоскоклеточным раком мочевого пузыря и 1 пациента с папилломой мочевого пузыря.

Полисомию пар 3, 7 и 17 хромосом определяли у всех 96 больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря, включенных в исследование, локус 9р21 - у 66 пациентов.

В зависимости от частоты встречаемости аномальных клеток мы выделили 4 группы: 1) 1-4% клеток, 2) 5-30%, 3) 31-60%, 4) 61-100%. Частота выявленных нами хромосомных аномалий представлена в таблице 4.

Таблица 4

Клетки с Абс. %

гиперплоидией 3 хром.: 0% 13 13,54

1-4% 12 12,5

5-30% 21 21,88

31-60% 11 11,46

61-100% 39 40,63

Всего 96 100

гиперплоидией 7 хром.: 0% 17 17,71

1-4% 12 12,5

5-30% 21 21,88

31-60% 11 11,46

61-100% 35 36,46

Всего 96 100

гиперплоидией 17 хром.: 0% 20 20,83

1-4% 7 7,29

5-30% 31 32,29

31-60% 4 4Д7

61-100% 34 35,42

Всего 96 100

с делецией 9р21: 0% 12 18,18

1-4% 9 13,64

5-30% 9 13,64

31-60% 5 7,58

61-100% 31 46,97

Всего 66 100

Гиперплоидию 3 хромосомы наблюдали у 86,46% (83/96) больных, 7 хромосомы - у 82,29% (79/96), 17 хромосомы - у 79,17% (76/96), потерю локуса 9р21 - у 81,81% (54/66).

У многих пациентов частота встречаемости аномальных клеток превышала 60%. Так, 61-100% клеток с гиперплоидией 3 хромосомы отмечены у 40,63% больных, с гиперплоидией 7 хромосомы - у 36,46%, с гиперплоидией 17 хромосомы - у 35,42% и с делецией 9р21 - у 46,97%

БИН-положительные результаты по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом получены у 72,92% (70/96) больных, Р13Н-отрицатсльные - у 27,08% (26/96).

С учетом делеции 9р21 частота Р18Н-положительных результатов оказалась достоверно (р=0,04) выше по сравнению Р18Н-положительными результатами только по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом и составила 86,36% (57/66), Р18Н-отрицательные результаты отмечены у 13,64% (9/66) пациентов.

Необходимо отметить, что по данным статистического анализа, достоверные различия РКН-статуса, определенного по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом, касались только размеров опухолевых образований и степени дифференцировки опухоли (табл. 5). Так, у больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря с Р18Н-положительным статусом практически в 10 раз чаще встречались опухоли размерами 5 и более см (31,43% уэ. 3,85%) и почти в 4 раза чаще - низкодифференцированные опухоли Оз (41,43% ув.

11,54%).

¥1БН- РІ8Н-

Фактор положительныи статус (N=70) отрицательныи статус (N=26) Р

Абс. % Абс. %

Пол: мужской женский 52 18 74,29 25,71 22 4 84,62 15,38

Возраст: <60 лет 37 52,86 12 46,15

> 60 лет 33 47,14 14 • 53,85

Курение: нет 42 60 13 50

есть 28 40 13 50

Гидронефроз: нет 60 85,71 24 92,31

есть 10 14,29 2 7,69

Опухоль: первичная рецидивная 48 22 68,57 31,43 17 9 65,38 34,62

Кол-во опух, очагов: единич. 41 58,57** 10 38,46 0,07

множественные 29 41,43 16 61,54

Размер опухоли: <5см > 5см 48 22 68,57 31,43* 25 1 96,15 3,85 0,005

рТстадия: 1 54 77,14** 24 92,31 0,09

2 12 17,14 2 7,69

3 3 4,29 0 0

4 1 1,43 0 0

Инвазия мышечн.

слоя: нет 54 77,14 24 92,31

есть 16 22,86** 2 7,69 0,09

N0 66 94,29 26 100

м1+2 4 5,71 0 0

Стадия опухоли: I 54 77,14** 24 92,31 0,09

II 12 17,14 2 7,69

IV 4 5,71 0 0

(З1+2 41 58,57 23 88,46

03 29 41,43* 3 11,54 0,006

\дыовантное лечение: нет 16 22,86 10 38,46

есть 54 77,14 16 61,54

* различия достоверны (р<0,05) по сравнению с Р18Н-оп \р и цат ел ь н ым статусом; ** тенденция к достоверности различий по сравнению с Р/.?//-

отрицателъным статусом

Анализ ИБН-статуса, оцененного по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом и делеции 9р21, выявил достоверные различия только по одному параметру. Так, опухоли размером 5 и более см встречались лишь у пациентов с ИБН-положительным результатом (33,33%; табл. 6).

Таблица 6

Фактор ИБН-положительный статус (N=57) ИБН-отрицательный статус (N=9) р

Абс. % Абс. %

Пол: мужской 43 75,44 8 88,89

женский 14 24,56 1 11,11

Возраст: <60 лет 30 52,63 3 33,33

> 60 лет 27 47,37 6 66,67

Курение: нет 35 61,4 3 33,33

есть 22 38,6 6 66,67

Гидронефроз: нет 49 85,96 8 88,89

есть 8 14,04 1 11,11

Опухоль первичная 36 63,16 8 88,89

рецидивная 21 36,84 1 11,11

Кол-во опух.очагов:

единич. 33 57,89 6 66,67

множественные 24 42,11 3 33,33

Размер опухоли: <5см 38 66,67 9 100

> 5см 19 33,33 0 0 0,04

рТстадия: 1 44 77,19 8 88,89

2 10 17,54 1 11,11

3 2 3,51 0 0

4 1 1,75 0 0

Инвазия мышечн. слоя:

нет 44 77,19 8 88,89

есть 13 22,81 1 11,11

N0 54 94,74 9 100

N,,2 3 5,26 0 0

Стадия опухоли: I 44 77,19 8 88,89

II 10 17,54 1 11,11

IV 3 5,26 0 0

Оц-2 35 61,4 6 66,67

03 22 38,6 3 33,33

\дьювантное лечение:

нет 15 26,32 6 66,67 0,02

есть 42 73,68 3 33,33

* различия достоверны (р<0,05 по сравнению с Р18Н-отрицателъным

статусом

Для определения прогностической значимости молекулярноцитогенетических маркеров рака мочевого пузыря мы сравнили частоту встречаемости хромосомных аномалий у 29 больных с рецидивом опухоли, развившимся в период наблюдения (Группа 1), и 67 пациентов (Группа 2), у которых в это время не было рецидива заболевания (табл. 7)

Таблица 7

Клетки с гиперплоидией Группа 1 (N=29) Группа 2 (N=67)

Абс. % Абс. %

3 хромосомы: 0 0 0 13 19,4

1-4% 3 10,34 9 13,43

5-30% 4 13,79 17 25,37

31-60% 2 6,9 9 13,43

61-100% 20 68,97 19 28,36*

7 хромосомы: 0 3 10,34 14 20,9

1-4% 3 10,34 9 13,43

5-30% 5 17,24 16 23,88

31-60% 1 3,45 10 14,93

61-100% 17 58,62 18 26,87*

17 хромосомы: 0 6 20,69 14 20,9

1-4% 0 0 7 10,45

5-30% 5 17,24 26 38,81*

31-60% 0 0 4 5,97

61-100% 18 62,07 16 23,88*

* различия достоверны (р<0,05) по сравнению с Группой 1

Полученные результаты свидетельствуют, что у больных с рецидивом опухоли достоверно чаще встречалась высокая частота аномальных клеток. Так, гиперплоидия 3 хромосомы в 61-100% клеток наблюдалась у 68,97% больных,7 хромосомы - у 58,62%, 7 хромосомы - у 62,07%.

Аналогичные показатели при отсутствии прогрессирования опухоли оказались почти в 2,5 раза ниже и составили 28,36%, 26,87% и 23,88% соответственно. •

Следует отметить, что у 10,34% больных с рецидивом опухоли обнаружены клетки с нормальной 7 хромосомой и у 20,69% - с нормальной 17 хромосомой, ни у кого из больных этой группы не было нормальной 3 хромосомы.

В отличие от гиперплоидии хромосом, представленность клеток с потерей локуса 9р21 статистически значимо не зависела от течения заболевания в период наблюдения.

У больных с рецидивом опухоли и у пациентов с благоприятным течением заболевания наблюдалось практически аналогичное распределение частоты клеток с делецией 9р21 (табл. 8).

Таблица 8

Клетки с делецией 9р21 Группа 1 (N=14) Группа 2 (N=52)

Абс. % Абс. %

0 4 28,57 8 15,38

1-4% 1 7,14 8 15,38

' 5-30% 2 14,29 7 13,46

31-60% 0 0 5 9,62

61-100% 7 50 24 46,15

Время до развития рецидива у пациентов с ИКН-положительными результатами по гиперплоидии хромосом было несколько выше (12,76±11,25 мес.; медиана 7,5 мес.) по сравнению с больными с ИБН-отрицательным статусом (15,58±13,96 мес.; медиана 10,03 мес.), однако, полученные различия не достигли статистической достоверности.

Результаты анализа сроков развития рецидива в зависимости от Р18Н-статуса с учетом локуса 9р21 аналогичны. Время до развития рецидива у больных с РКН-положительным статусом составило 7,71±8,59 мес. (медиана 5,57 мес.). Р18Н-отр]щательный результат наблюдался только у одного больного, и время до развития рецидива у этого пациента составило 9,53 мес.

Проведенный нами анализ безрецидивной выживаемости больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря в зависимости от Р18Н-статуса

по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом показал достоверное преимущество Р18Н-отрицательного статуса (рис. 4).

о Рецидив > без рецидива

Рис. 4.

Так, 1-летняя безрецидивная выживаемость больных с Р18Н-отрицательным результатом составила 85±7,98%, 2-летняя - 76,5±10,8% и 3-летняя - 71,04±12,49% (медиана выживаемости не достигнута). Показатели больных с Р15 Н - поло ж ите л ьн ым статусом были достоверно (р=0,018) хуже: 73,07±6,15%, 48,02±9,22% и 30,01±10,04%, соответственно, при медиане выживаемости 21,6 мес. (табл. 9).

Таблица 9

Выживаемость РШН-положительный статус (N=70) РКН-отрицательный статус (N=26) Р

Медиана 21,6 мес. - р=0,018

1 -летняя 73,07±6,15 85±7,98

2-летняя 48,02±9,22 76,5±10,8

3-летняя 30,01±10,04 71,04±12,49

Для выявления молекулярно-цитогенетических и клиникоморфологических факторов, статистически значимо влияющих на вероятность развития рецидива у больных переходно-клеточным раком

мочевого пузыря, включенных в исследование, мы использовали многофакторный анализ.

На подготовительном этапе провели корреляционный анализ основных 19 молекулярно-цитогенетических и клинико-морфологических факторов, способных влиять на вероятность развития рецидива, и выбрали статистически значимые - р<0,05.

Корреляционный анализ выявил следующие статистически значимые факторы, влияющие на вероятность развития рецидива: частота

встречаемости анеусомии (гиперплоидии) 3 хромосомы (г = 0,3762; р=0,0002), частота встречаемости анеусомии 17 хромосомы (г = 0,2592; р=0,011), частота встречаемости анеусомии 7 хромосомы (г = 0,2459; р=0,016), возраст пациентов (<60 и >60 лет) (г = 0,21; р=0,033).

Все эти факторы включены в многофакторный анализ и построена статистически значимая (р=0,00055) логистическая регрессионная модель, которая позволила нам установить, во сколько раз каждый из факторов способен увеличить вероятность развития рецидива у больных переходноклеточным раком мочевого пузыря (табл. 10).

Таблица 10

Фактор Р Стандиртизированный коэффициент логистической регрессии (Р) 95,0%- доверительный интервал

пип шах

Возраст пациентов (<60 и >60 лет) 0,032 2,964 1,100 7,990

Частота встречаемости гиперплоидии 3 хромосомы 0,005 2,064 1,245 3,420

Частота встречаемости гиперплоидии 7 хромосомы 0,645 0,882 0,518 1,503

Частота встречаемости гиперплоидии 17 хромосомы 0,641 1,116 0,703 1,771

Данная модель позволяет предсказать: появление рецидива с

точностью 41,4% (12/29), отсутствие рецидива с точность 89,6% (60/67).

Нами проведено сравнение ПБН-статуса больных опухолями мочевого пузыря и контрольной группы.

22

Частота выявленных хромосомных аномалий у 100 больных опухолями мочевого пузыря и 30 пациентов контрольной группы, вошедших в исследование, представлена в таблице 11,

Таблица 11

Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3,7,17 хромосом и делециеи 9р21 у больных опухолями мочевого пузыря

и контрольной группы

Клетки с Больные опухолями мочевого пузыря Контрольная группа Р (<0,0 5)

Абс. % Абс. %

гиперплоидией 3 хром.: 0% 13 13 13 43,3 0,0007

1-4% 13 13 10 33,3 0,01

5-30% 22 22 7 23,3

31-60% 12 12 0 0

61-100% 40 40 0 0 0,0001

Всего 100 100 30 100

гиперплоидией 7 хром.: 0% 17 17 12 40 0,01

1-4% 12 12 8 26,7

5-30% 24 24 4 13,3

31-60% 12 12 1 3,33

61-100% 35 35 5 16,7 0,04

Всего 100 100 30 100

гиперплоидией 17 хром.: 0% 20 20 3 10

1-4% 7 7 12 40 0,0001

5-30% 33 33 14 46,7

31-60% 6 6 1 3,33

61-100% 34 34 0 0 0,0002

Всего 100 100 30 100

с делецией 9р21: 0% 13 18,6 15 50 0,0001

1-4% 10 14,3 6 20

5-30% 10 14,3 6 20

31-60% 6 8,57 1 3,33

61-100% 31 44,3 2 6,67 0,004

Всего 70 100 30 100

Сравнение основной и контрольной групп показало достоверно более частую встречаемость аномальных клеток у больных опухолями мочевого пузыря.

Р18Н-отрицательные результаты по гиперплоидии 3 хромосомы получены у 43,3% пациентов контрольной группы и лишь у 13% больных опухолями мочевого пузыря (р=0,0007). При этом частота встречаемости аномальных клеток, превышающая 30%, наблюдалась исключительно при опухолях мочевого пузыря: 31-60% - у 12% больных и 61-100% - у 40% (р=0,0001). Средняя частота встречаемости клеток с аномалией 3 хромосомы у больных опухолями мочевого пузыря составила 46,4±41,8%, в группе контроля - лишь 3,9±7,1% (р=0,0000002).

Р18Н-отрицательные результаты по гиперплоидии 7 хромосомы в контрольной группе также достоверно превышали показатели больных опухолями и составили соответственно 40% и 17% (р=0,01), при этом частота встречаемости аномальных клеток 61-100% при опухолях мочевого пузыря была значительно выше (35% уэ. 16,7%, р=0,04). Средняя частота встречаемости клеток с аномалией 7 хромосомы у больных опухолями мочевого пузыря составила 41,39±41,63%, в группе контроля - лишь 16,№30,3% (р=0,002).

Что касается полисомии 17 пары хромосом, то средняя частота её встречаемости при опухолях мочевого пузыря достигла 39,54±41,29%, в то время как в группе контроля составила только 6,53±7,66% (р=0,00003). У больных опухолями преобладали аномалии 61-100% клеток. У пациентов контрольной группы такой патологии не было,

Средняя частота делеции 9р21 у больных опухолями мочевого пузыря также статистически значимо превышала показатели контроля: 47,27±41,9% и 9,8±20,7%, соответственно (р=0,00001). При этом частота аномальных клеток 61-100% наблюдалась у 44,3% больных опухолями (р=0,004). У пациентов контрольной группы, напротив, достоверно чаще встречались Р18П-отрицательные результаты (50% против 18,6%, р=0,0001).

Проведенный нами корреляционный анализ у больных опухолями мочевого пузыря показал: статистически значимые корреляции уровня аномалий 3 и 7 хромосом (г = 0,78; р=0,00000000000000000001), 3 и 17 хромосом (г = 0,69; р=0,0000000000000001), 7 и 17 хромосом (г = 0,46; р=0,00000000000000000002), уровня гиперплоидии 3 хромсомы и делении 9р21 (г = 0,31; р=0,009), 7 хромосомы и делеции 9р21 (г = 0,36; р=0,002), 17 хромосомы и делеции 9р21 (г = 0,42; р=0,0003).

При оценке чувствительности, специфичности, точности и эффективности метода флуоресцентной in situ гибридизация (FISH) для диагностики рака мочевого пузыря на первом этапе мы установили количество истинно-положительных/отрицательных и ложноположительных/отрицательных FISH-результатов.

Истинно-положительные FISH-результаты по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом были у 73 из 130 пациентов, ложно-положительные - у 7, ложноотрицательные - у 26, истинно-отрицательные - у 24.

Совокупная оценка гиперплоидии 3, 7, 17 хромосом и делеции 9р21 FISH-результаты показала следующие результаты: истинно-положительные -у 60 из 100 пациентов, ложно-положительные - у 9, ложно-отрицательные -у 9, истинно-отрицательные - у 22 (табл. 12).

Таблица 12

FISH-результат FISH-исследование гиперплоидии хромосом (N=130) FISH-исследование гиперплоидии хромосом и делеции 9р21 (N=100)

Истинно-положительные 73 60

Ложно-положительные 7 9

Ложно-отрицательные 26 9

Истинно-отрицательные 24 22

Проведенное нами исследование показало, что для диагностики рака мочевого пузыря по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом чувствительность РІБН-метода составляет 73,7%, специфичность - 77,4%, точность - 74,6%, эффективность - 75,6%.

Для Р18Н-диагностики рака мочевого пузыря по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом и делеции 9р21 показатели были следующими: чувствительность -86,9%, специфичность - 70,9%, точность - 82%, эффективность - 78,9%.

Таблица 13

Признак FISH-исследование гиперплоидии хромосом FISH-исследование гиперплоидии хромосом и делеции 9р21

Чувствительность 73,7% 86,9%

Специфичность 77,4% 70,9%

Точность 74,6% 82%

Эффективность 75,6% 78,9%

Дополнительно мы определили, с какой чувствительностью, специфичностью, точностью и эффективностью результаты метода флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) могут быть использованы в качестве предиктора рецидива рака мочевого пузыря.

В исследование включили 99 больных раком мочевого пузыря. Распределение истинно-положительных/отрицательных и ложноположительных/отрицательных FISH-результатов пациентов при прогнозировании рецидива заболевания было следующим: истинноположительные FISH-результаты по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом - у 24 человек, ложно-положительные - у 49, ложно-отрицательные - у 5, истинноотрицательные - у 21.

При суммарной оценке гиперплоидии хромосом и локуса 9р21 FISH-результаты распределились следующим образом: истинно-положительные -у 13 из 69 больных, ложно-положительные - у 47, ложно-отрицательные - у

1, истинно-отрицательные - 8.

Проведенное нами исследование показало, что для прогнозирования рецидива рака мочевого пузыря: чувствительность FISH-метода

(определение гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом) составляет 82,8%, специфичность - 30%, точность - 45,5%>, эффективность - 56,4%.

При FISH-прогнозировании рецидива рака мочевого пузыря по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом и делеции 9р21 показатели были следующими: чувствительность - 92,9%, специфичность - 14,5%, точность -30,4%, эффективность - 53,7%.

Сопоставляя полученные нами результаты с данными литературы, следует отметить их идентичность. Так, в исследовании K.Halling et al. (Hailing K.C. et al., 2000) чувствительность реакции FISH для диагностики рака мочевого пузыря составила 81%. Последующие работы авторов (Hailing К.С. et al., 2006) подтвердили эти результаты. T.Hajdinjak et al. (Hajdinjak T. et al., 2008) приводят данные мета-анализа, согласно которым чувствительность и специфичность теста «UroVysion» составляют соответственно 72%) (от 69% до 75%) и 83% (82% до 85%).

В исследовании J.Laudadio et al. (Laudadio J. et al, 2006) чувствительность FISH-реакции составила 73%. В исследование

S.Gudjonsson et al. (Gudjonsson S. et al., 2007) - 70%. J.Placer et al. (Placer J. et al 2002) проанализировали чувствительность и специфичность FISH-диагностики у больных, перенесших биопсию или резекцию опухоли мочевого пузыря. Общая чувствительность реакции FISH составила 80,4%, специфичность - 85,3%.

В настоящее время реакция флуоресцентной in situ гибридизации начинает внедряться в широкую диагностическую практику крупных онкологических центров, проведённое нами исследование подтвердило широкие возможности для диагностики рака мочевого пузыря, раннего выявления его рецидивов и прогноза течения заболевания.

выводы

1. Гиперплоидии 3, 7, 17 хромосом и делеция 9р21 локуса достоверно чаще наблюдаются при опухолях мочевого пузыря по сравнению с неопухолевыми изменениями (средняя частота соответственно 46% vs. 4%; 41%) vs. 16%; 39,5% vs. 6,5% и 47% vs. 10%). Для опухолей мочевого пузыря характерна высокая частота аномальных клеток (61-100%) и сочетанные гиперплоидии 3, 7,17 хромосом с делецией 9р21 локуса.

2. Гиперплоидия 3 хромосомы встречается у 86% больных переходноклеточным раком мочевого пузыря, 7 хромосомы - у 82%, 17 хромосомы - у 79%, делеция 9р21 локуса - у 82%. Частота хромосомных аномалий наиболее высока у пациентов с низкодифференцированным раком и при размерах опухоли более 5 см.

3. Одновременное использование 4-х ДНК-зондов, выявляющих аномалии 3, 7, 17 хромосом и делецию 9р21 локуса, повышает диагностические возможности FISH-реакции у больных раком мочевого пузыря.

4. Гиперплоидии 3, 7, 17 хромосом в 61-100%) клеток являются неблагоприятными факторами прогноза рака мочевого пузыря и могут служить предикторами рецидива заболевания.

5. FISH-положительный статус у больных мышечно-неинвазивным переходно-клеточным раком мочевого пузыря достоверно ухудшает 3летнюю безрецидивную выживаемость с 71%) до 30%).

6. Для диагностики рака мочевого пузыря чувствительность реакции флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) составляет 87%, специфичность - 71%, точность - 82%, эффективность - 79%.

7. Для прогнозирования рецидива рака мочевого пузыря чувствительность реакции флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) составляет 93%, специфичность - 14,5%, точность - 30%, эффективность - 54%.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации I. В журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ:

1. Хачатурян, А.В. Возможности применения флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) в диагностике рака мочевого пузыря и его рецидивов. /

A.М.Строганова, А.В. Хачатурян // Журн. Архив патологии. - 2006. - № 5. -С.43-46.

2. Хачатурян, А.В. Возможности применения метода флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) в диагностике рака мочевого пузыря и его рецидивов /

B.Б. Матвеев, А.И. Карселадзе, А.П. Казарян, А.В. Хачатурян, Б.Ш. Камолов, О.В. Гигиадзе, С.А. Калинин // Журн. Онкоурология. -2011. -№ 4. - С.90-95.

II. Тезисы докладов:

1. Хачатурян, А.В. Опыт применения реакции флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) в диагностике рака мочевого пузыря / А.В. Хачатурян, А.И. Карселадзе, В.Б. Матвеев, Б.Ш. Камолов // Материалы I конгресса Российского общества онкоурологов. - М., 2006.

2. Хачатурян, А.В. Возможности применения флуоресцентной in situ гибридизации для прогнозирования развития рецидива у больных переходно-клеточным раком мочевого пузыря. / В.Б. Матвеев, А.И. Карселадзе, А.В. Хачатурян, Б.Ш. Камолов, В.А. Романов // Материалы VI Конгресса Российского общества онкоурологов. - М., 2011. -

C. 180

Подписано в печать 25.01.12 Формат 60><84/16 Бумага офисная ».5уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ №155 Отпечатано на участке множительной техиники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24