Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Флуоресцентная in situ гибридизация в диагностике рецидивов поверхностного рака мочевого пузыря после трансуретральной резекции у лиц пожилого и старческого возраста

На правах рукописи

005054818

ПУШКИН Александр Сергеевич

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИЯ В ДИАГНОСТИКЕ РЕЦИДИВОВ ПОВЕРХНОСТНОГО РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ПОСЛЕ ТРАНСУРЕТРАЛЬНОЙ РЕЗЕКЦИИ У ЛИЦ ПОЖИЛОГО И СТАРЧЕСКОГО

ВОЗРАСТА

14.0130 - геронтология и гериатрия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 к НОЯ 2012

Санкт-Петербург - 2012

005054818

Работа выполнена в лаборатории возрастной клинической патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и СПб ГБУЗ «Городская многопрофильная больница № 2»

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Рыжак Галина Анатольевна

Официальные оппоненты:

Хейфец Владимир Хононович, доктор медицинских наук Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (СПбИБГ СЗО РАМН), руководитель лаборатории патологии мочеполовой системы.

Эмануэль Владимир Леонидович, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СПбГМУ им. акад. Павлова МЗ РФ), заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития Российской Федерации (ГБОУ ВПО «СамГМУ» МЗСР РФ).

Защита диссертации состоится «30» ноября 2012 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3).

Автореферат разослан «26» октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Козина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Во многих развитых странах за последнее время значительно возросла численность пожилого населения. В результате сокращения рождаемости и увеличения продолжительности жизни население все большего числа стран будет стремительно стареть. В период с 2005 года по 2050 год половина прироста численности населения в мире будет являться результатом роста численности населения в возрасте старше 60 лет. Кроме того, в более развитых регионах, согласно предположениям, население в возрасте старше 60 лет увеличится практически в два раза (с 245 миллионов человек в 2005 году до 406 миллионов в 2050 году). Например, в Российской Федерации в 2000 г. в возрасте старше 65 лет было около 18 миллионов человек, а в 2020 г., по прогнозам, их будет уже 21 миллион человек [World population prospects, 2001]. В Германии на 82 миллиона населения приходится 17% людей в возрасте старше 60 лет, а к 2020 г. их численность повысится до 22% от ожидаемой общей численности населения. В США к 2020 г. ожидается увеличение численности людей старших возрастных групп на 5 миллионов человек [Millions walk as WHO launches a global movement for active ageing World Health Organization, 1999].

В последние годы всё большее внимание специалистов привлекают гериатрические исследования, что обусловлено, во-первых, увеличением в популяции количества лиц пожилого и старческого возраста, во-вторых, тенденцией к возрастанию средней продолжительности жизни человека, в-третьих, усилением гериатрической направленности медицины.

В структуре онкологических заболеваний населения России рак мочевого пузыря (РМП) занимает 8-е место среди мужчин и 18-е среди женщин. Ежегодно в России регистрируется 11267 больных с впервые выявленным диагнозом РМП [Чиссов В. И. и соавт., 2008]. РМП занимает седьмое место в мире среди общего количества онкологических заболеваний [Eble J.N. et al., 2004] и четвёртое - среди общего количества злокачественных новообразований, диагностируемых у мужчин в США и европейских странах [Ferlay J. et al., 2002]. Опухоли мочевого пузыря превалируют среди новообразований мочевого тракта и составляют 70% от их числа. Около 80% пациентов относятся к возрастной группе 50-80 лет, а пик заболеваемости приходится на 7-ое десятилетие жизни. В России в 1995-2005 г.г. средний возраст мужчин, страдающих РМП, составил 65,265,6 лет, женщин - 68,9-69,7 лет [Аполихин О.И. и соавт., 2008]. Уровень смертности от этого заболевания во многих индустриально развитых странах составляет от 3% до 8,5% [Чиссов В.И., 2000].

Цистоскопия и цитологическое исследование остаются стандартными рутинными диагностическими инструментами для обнаружения и контроля РМП. Однако, цистоскопия имеет ряд значимых минусов: может быть не эффективна на ранних стадиях и стадиях рецидивирования, трудно переносима пациентами, особенно лицами пожилого возраста, также высока , \ /

'з

вероятность осложнений, в частности, инфекционного генеза [Almallah Y.Z. et al., 2000]. Цитологическая методика осталась единственным альтернативным и доступным атравматичным методом обнаружения РМП [Raab S.S. et al., 2007]. Данное исследование мочи имеет высокую чувствительность только при низкодифференцированном раке мочевого пузыря [Гориловский JI.M., 2002; Su С.С. et al., 2007]. Недостаточная чувствительность данной методики при дифференцированном раке заставляет разрабатывать новые методы с использованием опухолевых маркеров, содержащихся в моче. Более чувствительные и неинвазивные методы являются объектом поиска для ранней диагностики первичного заболевания, а также мониторинга рецидивирования. Разработано большое количество биохимических и молекулярных методов, включая анализ ВТА, ВТА stat, NMP 22 и immunocyt в моче и сыворотке крови, более чувствительных, чем цитология для обнаружения РМП, однако все они дают много ложноположительных результатов, что говорит об их низкой специфичности и требует назначения уточняющей цистоскопии [Tiguert R. et al., 2002; Dey P. 2004].

Генетические нарушения появляются уже на начальных стадиях развития опухоли и являются основными определяющими факторами малигнизации. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) является цитогенетической технологией, которая используется для анализа хромосомных нарушений в исследуемых клетках. FISH использует флуоресцентные метки в исследовании ДНК, которые крепятся к центромерам хромосом или уникальным участкам для обнаружения клетки с числовыми, структурными нарушениями, показательными для злокачественного развития [Bridge J. A., Allison М., 2011]. В настоящее время применяется FISH-методика с высокой чувствительностью и специфичностью для обнаружения РМП, использующая четыре флуоресцентные метки, выявляющие цитогенетические транслокации в хромосомах 17, 3 и 7 и локус-специфический ген 9р21 - ген из семейства опухолевых супрессоров, в 9-й хромосоме [Sarosdy M.F. et al., 2002; Hailing K.C., Kipp B.R. 2008; Kipp B.R. et al, 2009].

Лечение поверхностного РМП начинают с трансуретральной резекции (ТУР) мочевого пузыря (за исключением больных с тотальным поражением мочевого пузыря, которым показана цистэктомия). В 40-80% случаев после ТУР в течение 6-12 месяцев развивается рецидив, а у 10-25% больных -инвазивный рак. После ТУР мочевого пузыря пациентам рекомендуется проходить динамическое наблюдение, включающее ряд регулярных диагностических исследований, в том числе цистоскопическое исследование с цитологическим анализом мочи, УЗИ органов малого таза в первые 2 года 1 раз в 3 месяца [Чиссов В.И., Дарьялова C.JI. 2009].

В настоящее время имеется приказ Минздравсоцразвития РФ от 07.12.2004 г. № 303 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным злокачественным новообразованием мочевого пузыря», в котором не упоминается о цитогенетическом исследовании клеток эпителия мочевого

пузыря.

Ввиду распространения методики FISH в медицинской практике, возникает вопрос о целесообразности включения её в стандарт диагностики РМП, в частности для лиц пожилого и старческого возраста.

Цель исследования

Цель исследования заключалась в определении целесообразности включения методики флуоресцентной in situ гибридизации в стандартный алгоритм диагностики рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после трансуретральной резекции мочевого пузыря применительно к лицам пожилого и старческого возраста.

В рамках данной цели определены задачи диссертационного исследования:

1. Изучить диагностическую ценность методики флуоресцентной in situ гибридизации в условиях городского стационарного отделения урологии у лиц пожилого и старческого возраста.

2. Оценить молекулярно-цитогенетическую и морфологическую ценность методики флуоресцентной in situ гибридизации для диагностики рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после трансуретральной резекции мочевого пузыря применительно к лицам пожилого и старческого возраста.

3. Выявить молекулярно-цитогенетические закономерности при прогнозировании степени злокачественности рака мочевого пузыря у лиц пожилого и старческого возраста.

4. Сопоставить полученные данные о целесообразности включения методики флуоресцентной in situ гибридизации в диагностический алгоритм диагностики рецидива рака мочевого пузыря с имеющимися результатами, опубликованными в отечественной и зарубежной литературе.

5. Обосновать алгоритм диагностики рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после трансуретральной резекции мочевого пузыря у лиц пожилого и старческого возраста, предусматривающий использование молекулярно-цитогенетической методики флуоресцентной in situ гибридизации.

Научная новизна исследования

В настоящей работе впервые разработан новый подход к ранней диагностике рецидивов поверхностного рака мочевого пузыря у лиц пожилого и старческого возраста путём дополнения стандартных методов обследования определением полисомии 3, 7, 17 хромосом и делеции локуса 9р21 в клетках уротелия после трансуретральной резекции поверхностного рака мочевого пузыря. Установлено, что диагностика хромосомных аберраций, таких как гиперплоидия 3,7,17 хромосом и делеция 9р21 локуса, является надёжным методом выявления рецидивов поверхностного рака мочевого пузыря, подтверждая рецидив заболевания в 94,2 % случаев.

Доказано, что количество клеток с гиперплоидией 3,7,17 хромосом и делецией локуса 9р21 достоверно больше и чаще встречается у лиц

старческого возраста с рецидивом поверхностного рака мочевого пузыря по сравнению с пациентами среднего и пожилого возраста: именно среди пациентов в возрасте от 75 до 86 лет более чем в 45% случаев число аномальных клеток составляет 61-100%.

Показано, что с учетом хромосомных аберраций в виде делеции локуса 9р21 чувствительность методики флуоресцентной in situ гибридизации значимо выше по сравнению с результатами исследования только гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом.

По итогам исследования разработан алгоритм диспансерного наблюдения за пациентами пожилого и старческого возраста, перенесшими трансуретральную резекцию мочевого пузыря по поводу поверхностного рака мочевого пузыря, что способствует достоверно более ранней диагностике рецидивов рака мочевого пузыря, чем при использовании только классических методов.

Практическая значимость

Разработан и внедрен в клиническую практику алгоритм диспансерно-динамического наблюдения за пациентами пожилого и старческого возраста, перенесшими трансуретральную резекцию мочевого пузыря по поводу поверхностного рака, предусматривающий дополнение стандартного обследования включением методики флуоресцентной in situ гибридизации.

Внедрение молекулярно-цитогенетических методов в урологическую практику будет способствовать ранней диагностике рака мочевого пузыря, окажет существенную помощь при мониторинге заболевания, значительно повысит эффективность выявления рецидивов рака мочевого пузыря, особенно у лиц пожилого и старческого возраста. Использование молекулярно-цитогенетических маркеров позволяет расширить общепринятую систему клинико-морфологических маркеров прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря, в первую очередь у лиц старших возрастных групп.

Разработанный комплекс исследований показал высокую эффективность и прогностическую значимость, что позволило на более ранних сроках заболевания оказать пациентам пожилого и старческого возраста адекватное медицинское пособие.

Положения, выносимые на защиту

1. Применение цитогенетической методики UroVysion® в наблюдении за пациентами после трансуретральной резекции мочевого пузыря по поводу поверхностного рака дает достоверную информацию о стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли, а также о её рецидивирующем потенциале. Это достижимо только с учетом использования дополнительных параметров теста (числа аномальных клеток и количества копий отдельных хромосом).

2. Количество клеток с гиперплоидией 3,7,17 хромосом и делецией локуса 9р21 достоверно больше и чаще встречается у лиц старческого

возраста с рецидивом поверхностного рака мочевого пузыря по сравнению с пациентами среднего и пожилого возраста.

3. Включение флуоресцентной in situ гибридизации для обследования больных пожилого и старческого возраста на наличие рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после трансуретральной резекции значительно повышает качество диагностики рака мочевого пузыря.

Связь работы с планом НИР

Диссертация выполнена по плану научно-исследовательской работы Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Апробация и реализация результатов работы

Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Межрегиональной научно-практической конференции «Медицинские проблемы пожилых» (Йошкар-Ола, 2011), международной научно-практической конференции «Ускоренное старение: механизмы, диагностика, профилактика» (Киев, 2012), VIII научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2012).

По результатам работы в лечебный процесс урологических отделений СПб ГБУЗ «Городская многопрофильная больница № 2» и СПб ГБУЗ «Клиническая больница Святителя Луки» внедрен новый алгоритм обследования больных поверхностным раком мочевого пузыря пожилого и старческого возраста после трансуретральной резекции.

Личный вклад автора

Автором лично определены цель и задачи исследования, проанализирована отечественная и зарубежная литература по изучаемой проблеме, разработаны методические подходы к проведению исследования. Автор непосредственно производил сбор данных, выполнение всех этапов методики флуоресцентной in situ гибридизации, обработку и обобщение полученных материалов, подготовку основных публикаций по выполненной работе, написание и оформление рукописи.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ, 4 тезиса докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований и наблюдений, заключения, выводов, библиографического указателя,

содержащего ссылки на 179 работ, в том числе 39 отечественных и 140 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 17 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования

Клинической базой для проведения настоящего исследования явилось Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Городская многопрофильная больница № 2».

Основу проведенного исследования составило обследование 103 больных, проходящих диспансерное наблюдение по поводу поверхностного рака мочевого пузыря (РМП), после трансуретральной резекции (ТУР) в урологическом отделении Городской многопрофильной больницы № 2. Обследуемые лица по результатам наблюдения в течение 24 месяцев после ТУР мочевого пузыря были разделены на 3 группы:

1 - пациенты в возрасте от 35 до 59 лет (средний возраст), 31 человек;

2 - пациенты в возрасте 60-74 лет (пожилой возраст), 37 человек;

3 - пациенты в возрасте 75-86 лет (старческий возраст), 35 человек.

Всем пациентам в течение 24 месяцев после ТУР мочевого пузыря

каждые 3 месяца было проведено однотипное обследование, включающее:

• цистоскопию;

• гистологическое исследование;

• FISH-методику.

Методы исследования Цистоскопия

Цистоскопию проводили с использованием уретроцистоскопов и резектоскопов фирмы «KARL STORZ» под внутривенной или спинномозговой анестезией, учитывая следующий возможный за эндоскопией этап — ТУР-биопсию. После осмотра полости мочевого пузыря производили «холодную» биопсию опухоли и слизистой оболочки у ее основания. Затем в случае обнаружения опухолеподобного образования выполняли ТУР-биопсию. Использовали следующую методику ТУР-биопсии: вначале резецировали экзофитную часть опухоли, затем стенку мочевого пузыря вокруг зоны резекции (12, 3, 6 и 9 часов условного циферблата). Последнюю пробу брали из основания опухоли с целью определения глубины инвазии и степени радикальности удаления новообразования. Кроме того, осуществляли рандомную биопсию из других участков мочевого пузыря: места первичной ТУР мочевого пузыря, верхушки, контралатеральной стенки, шейки мочевого пузыря и треугольника Льето, простатического отдела уретры. Общее количество биоптатов у одного больного составляло от 8 до 12.

Подобная схема эндоскопического обследования и биопсии позволяла «картировать» мочевой пузырь, определить глубину инвазии опухоли, выявить опухолевое поражение кровеносных и лимфатических сосудов стенки мочевого пузыря, поражение простатического отдела уретры. С целью минимизации побочных действий электрохирургии применяли биполярные резектоскопы фирмы «KARL STORZ», работу проводили с использованием физиологического раствора.

Гистологическое исследование

Гистологическое исследование биопсийного материала производили по стандартному алгоритму. Выполнены микропрепараты с окраской гематоксилином и эозином, результаты интерпретированы согласно Международной гистологической классификации злокачественных опухолей:

• переходноклеточный рак;

• плоскоклеточный рак;

• недифференцированный рак;

• аденокарцинома.

Кроме этого, проводили оценку соотношения возраста пациента и степени инвазии и дифференцировки опухоли. Для определения стадии заболевания использовали международную классификацию TNM, предложенную Международным Противораковым Союзом (2004 г.) с определением степени дифференцировки (G) и гистологического строения опухоли. Преимуществом данной классификации является выделение pTis, более точная градация степени инвазии опухоли и возможность определения такой важной категории, как гистопатологическая характеристика новообразования (G).

TNM - классификация рака мочевого пузыря

В нашей стране применяют адаптированный перевод последнего издания классификации. Ее можно использовать только при соблюдении следующих условий.

Классификация относится только к эпителиальным опухолям мочевого пузыря. Папиллома исключается, но может быть описана как категория GO. Должна быть гистологическая или цитологическая верификация заболевания. Папиллярные неинвазивные карциномы следует обозначать символом Та. Регионарными лимфатическими узлами для мочевого пузыря являются тазовые, расположенные ниже бифуркации общих подвздошных артерий, юкстарегионарными — паховые, общие подвздошные и парааортальные.

FISH-методика

Методику FISH осуществляли на реагентах компании ABBOTT (США). Набор UroVysion™ Multi-color FISH Probe Mixture включал флуоресцентные

ДНК-зонды для определения анеуплоидии хромосом 3, 7 и 17 и утраты локуса 9р21 в образцах мочи больных раком мочевого пузыря (СЕР 3 SpectrumRed™, СЕР 7 SpectrumGreen, СЕР 17 SpectrumAqua, LSI 9р21 (р16) SpectrumGold™). Производили забор утренней мочи (первая, около 7 ч. 30 мин.) в стеклянную емкость (объем 50 мл). После сбора 33 мл мочи добавляли в 50 мл пробирку, содержащую 17 мл CarboWax, и перемешивали, переворачивая пробирку. Хранили образцы при температуре 2-8 °С, пока продолжался процесс подготовки. Далее из полученной смеси выделяли клеточную суспензию путем центрифугирования при скорости вращения 1000 об/мин. (600 g) согласно протоколу.

Для приготовления препаратов использовали стекла с 3-мя лунками, количество клеточной суспензии от 10-30 мкл в зависимости от осадка, хранение препаратов осуществляли при температуре -20 °С; предварительную обработку препаратов проводили согласно лабораторному протоколу для прямомеченных зондов. Денатурацию и гибридизацию осуществляли на приборе «Thermobrite» (Abbott Molecular, США); постгибридизационную обработку - по протоколу. Анализ готовых препаратов производили на микроскопе ZEISS АХЮ Imager.M2 (Германия) с использованием световых фильтров компании ABBOTT Vysis® (США): SpectrumRed, SpectrumGreen, SpectrumAqua, SpectrumGold. Препараты анализировали сканирующим методом. Критерии отбора морфологически аномальных (предположительно злокачественных) клеток: большой размер ядра; неправильная форма ядра; «пятнистость» DAPI окраски. Клеточные кластеры (клетки в кластере, при наложении клеток друг на друга не учитывались). Результат считали FTSH-положительным, если в 4 из 25 аномальных клеток обнаруживали увеличение количества сигналов по 2-м и более хромосомам (3, 7 или 17) в одной и той же клетке, или более чем в 12 из 25 аномальных клетках отсутствовал сигнал 9р21. Если это условие не соблюдалось, то препарат анализировали до тех пор, пока не было обнаружено 4-х клеток с увеличенным количеством сигналов по 3, 7 и 17 хромосомам или 12 клеток с отсутствием сигнала 9р21.

Методы статистической обработки результатов исследования

Математическую обработку полученных данных производили различными статистическими методами на компьютере IBM Pentium - 4 при помощи пакета программ статистической обработки «SPSS Statistics 17.0».

Полученные результаты исследований были подвергнуты статистической обработке с использованием методов параметрической и непараметрической статистики. Вычисляли средние, медианы, критерий х2_ Пирсона, критерии Манна-Уитни и Спирмана. О достоверности отличий средних величин при нормальном распределении показателей судили по критерию Стьюдента (t). Различия считали значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Общая характеристика больных

Первая часть проведенных исследований представлена в виде данных анализа историй болезни пациентов среднего, пожилого и старческого возраста, госпитализированных в отделение урологии СПб ГБУЗ «Городской многопрофильной больницы № 2» и включенных в исследование.

Таблица 1

Распределение больных по возрасту и полу_

Пол Возраст больных, лет Всего

35-59 60-74 75-86

Мужчины 26 32 29 87(84,5%)

Женщины 5 5 6 16(15,5%)

Всего 31 37 35 103

Среди обследованных больных мужчин было 87 (84,5%), женщин 16 (15,5%). Соотношение мужчин и женщин - 5,4:1. Возраст пациентов находился в диапазоне от 35 до 86 лет с медианой 70 лет и квартилями 52 года и 69 лет, среднее значение возраста пациентов ± а составляло (65,1 ± 12,7) лет. Распределение больных по полу и возрасту представлено в таблице 1.

Распределение больных по стадиям поверхностного рака мочевого пузыря и возрастным группам представлено в таблице 2.

Таблица 2

Распределение больных по степени инвазии рака мочевого пузыря, выявленного при эндоскопическом обследовании до трансуретральной резекции мочевого пузыря

Стадия заболевания Группа 1 35-59 лет, п=31 Группа 2 60-74 лет, п=37 Группа 3 75-86 лет, п=35 Всего

абс. % абс. % абс. % абс. %

рТа 9 32,3 12 32,5 12 34,3 33 32,0

рТ15 8 25,8 11 29,7 10 28,6 29 29,2

рТ1 13 41,9 14 37,8 13 37,1 40 38,8

Рис. 1. Распределение больных по степени дифференцировки опухоли.

Среди обследованных больных до ТУР мочевого пузыря высокодифференцированные опухоли (в1) диагностированы у 68 (66,0%), опухоли средней степени дифференцировки (И2) - у 21 (20,4%), низкодифференцированные (йЗ) - у 14 (13,6%) больных (рис. 1).

В зависимости от возраста и степени дифференцировки опухоли распределение больных было следующим (табл. 3).

Таблица 3

Распределение больных в зависимости от возраста и дифференцировки __опухоли__

Степень дифференцировки (О) Возраст пациента, лет Всего

35-59 60-74 75-86

абс. % абс. % абс. % абс. %

15 48,4 28 75,7 25 71,4 68 66,0

02 7 22,6 6 16,2 8 22,9 21 20,4

ОЗ 9 29 3 8,1 2 5,7 14 13,6

Всего 31 37 35 103

7

89%

и Недифференцированн ый рак

И Аденокарцинома

В Переходноклеточный рак

□ Плоскоклеточный рак

Рис. 2. Распределение больных по гистологическому строению опухоли.

Во всех возрастных группах преобладали пациенты с высокодифференцированными опухолями (С1). Однако с увеличением возраста отмечалась тенденция к снижению количества пациентов с низкодифференцированными опухолями (СЗ).

После цистоскопии с последующей биопсией проводили гистологическое исследование всего операционного материала с интерпретацией результатов в соответствии с Международной гистологической классификацией злокачественных опухолей. Было произведено и проанализировано 598 биопсий (в среднем 5,8 биопсий на одного пациента). Распределение больных по гистологическому строению РМП представлено на рисунке 2.

Основное количество пациентов имели поражения переходноклеточным - 44 (45%) больных и плоскоклеточным раком - 35 (36%) больных. Реже всего пациенты были поражены аденокарциномой мочевого пузыря - 4 (4%) человека.

Количество пациентов с одиночными и множественными (2 и более) участками поражения мочевого пузыря представлены в таблице 4.

Больные с множественными поражениями мочевого пузыря несколько превосходят количественно больных с одиночными опухолями - 57 (55,3%) и 46 (44,7%) человек, соответственно.

Таблица 4

Распределение пациентов с учетом количества опухолевых очагов

Количество опухолевых очагов Возраст пациента, лет Всего

35-59 60-74 75-86

абс. % абс. % абс. % абс. %

Одиночные 13 41,9 17 45,9 16 45,7 46 44,7

Множественные 18 58,1 20 54,1 19 54,3 57 55,3

Всего 31 37 35 103

Результаты гистологического исследования

По результатам гистологического исследования общая однолетняя и двухлетняя безрецидивная выживаемость пациентов, перенесших ТУР мочевого пузыря по поводу поверхностного рака мочевого пузыря, составила 83,5% и 52,4%, соответственно. К 12 месяцам после ТУР рецидив заболевания развивался чаще у пациентов пожилого возраста (2 группа, 60-74 лет, п=37) - у 8 (21,6%) человек (р<0,05). Однако к 24 месяцу значимого различия в количестве пациентов с рецидивом заболевания в разных возрастных группах не выявлено. Анализ распределения рецидивов рака мочевого пузыря по группам и срокам выявления представлен в таблице 5.

Таблица 5

Количество рецидивов рака мочевого пузыря по результатам гистологического исследования спустя 12 и 24 месяца после _трансуретральной резекции мочевого пузыря_

Срок исследования Группа 1 35-59 лет, п=31 Группа 2 60-74 лет, п=37 Группа 3 75-86 лет, п=35

12 мес. после ТУР мочевого пузыря 5(16,1%) 8(21,6%) 4(11,4%)

24 мес. после ТУР мочевого пузыря 16(51,6%) 17(45,9%) 16(45,7%)

Анализ частоты рецидивирования поверхностного РМП в зависимости от степени инвазии новообразования показал, что при стадии заболевания рТа рецидивы опухоли возникали достоверно реже, чем при стадии рТ1 и Tis. Опухоль рецидивировала у 6 (30,4%) из 33 больных в стадии рТа, у 30 (53,6%) из 56 больных в стадии рТ1 (р<0,001) и у 21 (51,3%) из 41 больного в стадии pTis (р< 0,001) (табл. 6).

Таблица 6

Частота рецидивирования поверхностного рака мочевого пузыря в

зависимости от стадии заболевания

Стадия заболевания Группа 1 35-59 лет, п=31 Группа 2 60-74 лет, п=37 Группа 3 75-86 лет, п=35 Всего

абс. % абс. % абс. % абс. %

рТа 2 6,4 3 8.1 1 2,8 6 18,2

pTis 6 19,4 7 18,9 7 20 20 68,9

рТ1 8 25,8 7 18,9 8 22,9 23 57,5

Всего 16(51,6%) 17(45,9%) 16(45,7%) 49(47,6%)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Gl G2 G3

Рис. 3. Анализ распределения количества рецидивов поверхностного рака мочевого пузыря в зависимости от степени дифференцировки опухоли.

14,3

85 7 й ®ез Рецидива а Рецидив РМП

Группа 1 35-59 лет, Группа 2 60-74 лет, ГруппаЗ 75-86 лет, п=31 п=37 п=35

Рис. 4. Распределение количества рецидивов опухоли в зависимости от возраста пациентов.

При анализе распределения количества рецидивов поверхностного рака мочевого пузыря в зависимости от степени дифференцировки опухоли выявлена значимая зависимость. Высокодифференцированные (С1) опухоли рецидивировали достоверно реже, чем опухоли средней (в2) и низкой (ОЗ) степени дифференцировки. Так, рецидивы при 01 возникли в 38,2% случаев (26 из 68), при в2 - в 52,4% (11 из 21) случаев, а при ОЗ рецидивы выявлены у 85,7% (12 из 14) оперированных больных (р01-02,3, р<0,001) (рис. 3).

Анализ частоты рецидивирования опухоли в зависимости от возраста показал, что в исследуемой группе из 103 человек имелась тенденция снижения частоты рецидивирования с увеличением возраста. В первой группе (35-59 лет, п=31) было 16 (51,6%) рецидивов, во второй группе (60-74 лет, п=37) - 17 (45,9%) и в третьей группе (75-86 лет, п=35) - 16 (45,7%) пациентов с рецидивом опухоли рака мочевого пузыря (рис. 4).

Результаты нашего исследования совпадают с данными других авторов, свидетельствующих о способности поверхностного рака мочевого пузыря к прогрессии при рецидивировании. Из 33 пациентов после операции по поводу РМП в стадии рТа прогрессия опухоли до стадии рТ1 диагностирована у 2 (%) больных. Инвазивные (рТ2) рецидивы обнаружены у 5 (%) из 40 больных, оперированных по поводу РМП в стадии рТ1. Анализ частоты прогрессии опухоли в зависимости от характера рецидива (первичный или вторичный) показал, что из 34 больных с вторичным рецидивом прогрессия опухоли обнаружена у 9 (26,5%), а из 69 пациентов с первичным рецидивом - только у 5 (7,2%) (р<0,01). Эти данные приведены в таблице 7.

Таблица 7

Характер прогрессии первичных и вторичных рецидивов поверхностного __рака мочевого пузыря_

Характер рецидива Число больных Прогрессия опухоли Р

абс. %

Первичный 69 5 7,2 <0,01

Вторичный 34 9 26,5

Результаты исследования с использованием методики флуоресцентной

in situ гибридизации

Учитывая тот факт, что клинико-морфологические факторы не позволяют полноценно прогнозировать развитие рецидива рака мочевого пузыря, а количество поздних выявлений остается высоким, в том числе у лиц пожилого и старческого возраста, мы провели анализ молекулярно-цитогенетических маркеров данной опухоли с использованием флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) параллельно с цистоскопией и гистологическим исследованием.

После приготовления, согласно протоколу, микропрепараты для FISH-диагностики анализировали сканирующим методом. Нормальные клетки имели правильную «овоидную» форму, равномерно распределенную окраску DAPI на ядре, парное расположение флуоресцентных сигналов соответствующих цветов в ядре.

Из 103 пациентов в течение 24 месяцев, по данным гистологического исследования, у 49 (47,6%) человек развился рецидив заболевания. Из 103 пациентов в течение 24 месяцев, по данным FISH-методики, у 51(49,5%) человека развился рецидив заболевания, однако в четырех случаях FISH-методика дала неверные ответы: 3 ложноположительных и 1 ложноотрицательный результаты, тем самым показав чувствительность методики - 94,2%, специфичность - 98,2% и точность - 96,3%. В таблице 8 приведены условные обозначения параметров расчета сравнительных характеристик (р<0,05).

Таблица 8

Условные обозначения параметров сравнительных характеристик

Условное обозначение Рецидив по результатам применения «золотого стандарта диагностики» (морфологическое исследование)

« + » «-»

Методика « + » Истинно положительный (а) Ложно положительный (Ь)

«-» Ложно отрицательный (с) Истинно отрицательный (d)

Чувствительность (sensitivity) = a/(a+b) Определение: доля лиц с положительным результатом теста среди больных или вероятность положительного результата теста среди больных.

Специфичность (specificity) = d/(c+d) Определение: доля лиц с отрицательным результатом теста среди здоровых или вероятность отрицательного результата теста среди здоровых.

Точность (accuracy) = (a+d)/(a+b+c+d) Определение: доля правильных результатов теста (истинно положительного и истинно отрицательного) в общем количестве полученных результатов.

В результате сравнения уровня чувствительности, специфичности и точности методики в зависимости от стадии и дифференцировки опухоли выявлены значимые различия, результаты анализа которых представлены в таблице 9 (р<0,04).

Таблица 9

Зависимость чувствительности, специфичности и точности FISH-методики от

стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли

Стадия заболевания и степень дифференцировки опухоли Сравнительные характеристики

Чувствительность,% Специфичность^ Точность,%

pTaGl 85,7 94,7 88,2

pTaG2 88,6 95,8 92,1

pTaG3 90,7 96,2 93,8

pTis G1 93,8 98,3 96,5

pTis G2 94,3 98,7 98,7

pTis G3 96,5 100 98,4

pTIGl 98,4 100 99,2

pTlG2 99,4 100 99,5

pTlG3 100 100 100

Необходимо отметить, что уже на самых начальных стадиях и самой высокой степени дифференцировки опухоли ИБН-методика показала положительные результаты; так, у больных на стадии рТав1 чувствительность метода составила 85,7%, специфичность - 94,7% и точность - 88,2%.

Полисомию пар 3, 7 и 17 хромосом определяли у 51 больного, у которых БИН-методика дала положительный результат на рецидив рака мочевого пузыря, делецию локуса 9р21 - у 37(72,5%) пациентов. В зависимости от частоты встречаемости аномальных клеток выделили 4 группы: 1) 1-4% клеток, 2) 5-30%, 3) 31-60%, 4) 61-100%. Частота

выявленных нами хромосомных аномалий представлена в таблице 10 (р<0,05).

Таблица 10

Вид хромосомной аберрации Количество клеток в препарате с хромосомными аберрациями, абс./%

Группа клеток 1-4% Группа клеток 5-30% Группа клеток 31-60% Группа клеток 61-100% Всего

абс. %

Гиперплоидия 3 хромосомы 5/10,9 12/26,1 7/15,2 22/47,8 46 90,2

Гиперплоидия 7 хромосомы 4/10,2 9/23,1 9/23,1 17/43,6 39 76,5

Гиперплоидия 17 хромосомы 4/9,6 13/30,9 6/14,3 19/45,2 42 82,4

Деления локуса 9р21 6/16,2 6/16,2 10/27,3 15/40,5 37 72,5

У большой части пациентов аномалии по 3, 7, 17 и 9 хромосомам встречались более чем в 60% клеток. Так, 61-100% клеток с гиперплоидией по 3 хромосоме выявлены у 22 (47,8%) человек, по 7 хромосоме - 17 (43,6%) и по 17 хромосоме - у 19 (45,2%) человек, а с делецией локуса 9р21 - у 15 (40,5%) больных.

При сравнении возрастных групп выявлено большее количество пациентов с числом аномальных клеток 61-100% в третьей группе (75-86 лет, п=35) - более чем в 45% случаев, в то время как в первой (35-59 лет, п=31) и во второй (60-74 лет, п=37) группах - до 35% случаев. Распределение пациентов с числом аномальных клеток 61-100% по возрастным группам представлено в таблице 11 (р<0,05).

Таблица 11

Распределение пациентов с числом аномальных клеток 61-100% по

возрастным группам

Стадия Группа 1 35-59 лет, п=31 Группа 2 60-74 лет, п=37 Группа 3 75-86 лет, п=35 Всего

Гиперплоидия 3 хромосомы 5(22,7%) 7(31,8%) 10(45,5%) 22

Гиперплоидия 7 хромосомы 4(23,5%) 5(29,4%) 8(47,1) 17

Гиперплоидия 17 хромосомы 5(26,3%) 5(26,3%) 9(47,4%) 19

Рис. 6. Количество Р18Н-положительных результатов с учетом делеции 9р21 и без учета данного параметра.

С учетом делеции 9р21 частота Р18Н-положительных результатов оказалась достоверно (р=0,04) выше по сравнению с Р18Н-положительными результатами только по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом - 51 и 46 случаев, соответственно, что составило разницу почти в 10%. Количество Р18Н-положительных результатов с учетом делеции 9р21 и без учета данного параметра представлено на рисунке 6 (р<0,02).

о Полиплоидия 3 хромосомы и Полиплоидия 7 хромосомы

и Полиплоидия 17 хромосомы □ Делеция локуса 9р21

Рис. 7. Распределение частоты и глубины генетических аномалий с увеличением стадии и степени дифференцировки опухоли.

При анализе дополнительных параметров FISH диагностики в настоящей работе выявлено увеличение частоты (среднего числа клеток с хромосомными аномалиями) и глубины (среднего числа копий хромосом 3, 7 и 17 и локуса 9р21) генетических аномалий с увеличением стадии и степени дифференцировки опухоли. Обращает на себя внимание ступенчатое увеличение частоты аномалий при переходе от степени дифференцировки опухоли Gl, G2 к степени G3. Результаты этих наблюдений представлены на рисунке 7 (р<0,05). Сравнительный анализ ранней диагностики рецидивов рака мочевого пузыря гистологическим методом и методикой флуоресцентной in situ гибридизации у пациентов старших возрастных групп Основу сравнительного анализа составило обследование 103 больных, проходящих диспансерное наблюдение по поводу поверхностного рака мочевого пузыря (РМП), после ТУР.

Всем пациентам в течение 24 месяцев после ТУР мочевого пузыря каждые 3 месяца было проведено однотипное обследование, включающее:

• цистоскопию;

• гистологическое исследование;

• FISH-методику.

Таблица 12

Результаты обследования пациентов среднего возраста, перенесших

трансуретральную резекцию мочевого пузыря

Методика исследования Сроки после ТУР мочевого пузыря, мес. Всего, чел. Средний срок выявления рецидива, мес.

3 6 9 12 15 18 21 24

Группа 1. 35-59 лет, п=31

FISH (+) 1 2 2 3 3 2 1 1 15 13,0±0,7

HSH (-) 16 -

Гистологическое исследование (+) 0 1 2 2 3 4 3 1 16 15,8±1,0

Гистологическое исследование (-) 15 -

Примечание: в таблицах 12-14: FISH (+) - количество пациентов, у которых по результатам FISH методики выявлен положительный результат; FISH (-) - количество пациентов, у которых по результатам FISH методики выявлен отрицательный результат; гистологическое исследование (+) - количество пациентов, у которых по результатам гистологического исследования выявлен рецидив рака мочевого пузыря; гистологическое исследование (-) - количество пациентов, у которых по результатам гистологического исследования не выявлен рецидив рака мочевого пузыря.

По истечении 24 месяцев наблюдения за пациентами полученные данные в результате регулярных обследований собраны в сводную таблицу и распределены на три группы в соответствии с границами среднего, пожилого и старческого возраста. В таблице 12 представлены результаты обследования группы 1 - пациентов среднего возраста (35-59 лет, п=31).

В группе пациентов среднего возраста выявлен 1 ложноотрицательный результат FISH-методики. Средний срок выявления рецидива рака мочевого пузыря в этой группе составил: по результатам гистологического исследования 15,8±1,0 мес., а по результатам методики FISH - 13,0±0,7 мес., с разницей по срокам в 2,8 мес. (р<0,05).

Во второй группе пациентов (60-74 лет, п=37) по результатам FISH-исследования выявлено 2 ложноположительных результата. Средний срок выявления рецидива рака мочевого пузыря в этой группе составил: по результатам гистологического исследования 14,3±0,9 мес., а по результатам методики FISH - 11,6±1,2 мес., с разницей по срокам в 2,6 мес. (р<0,05). Результаты по второй группе представлены в таблице 13.

В группе пациентов старческого возраста (75-86 лет, п=35) по результатам FISH-исследования выявлен 1 ложноположительный результат. Средний срок выявления рецидива рака мочевого пузыря в этой группе составил: по результатам гистологического исследования 16,5±1,0 мес., а по результатам методики FISH - 12,6±1,2 мес., с разницей по срокам в 3,9 мес. (р<0,05), что составило максимальную разницу в сроке диагностики рецидива рака мочевого пузыря по трем возрастным группам.

Таблица 13

Результаты обследования пациентов пожилого возраста, перенесших _трансуретральную резекцию мочевого пузыря _

Методика исследования Сроки после ТУР мочевого пузыря, мес. Всего, чел. Средний срок выявления рецидива, мес.

3 6 9 12 15 18 21 24

Группа 2. 60-74 лет, п=37

FISH (+) 2 4 5 3 2 2 1 0 19 11,6±1,2

FISH (-) 18

Гистологическое исследование (+) 0 2 3 3 2 4 2 1 17 14,3+0,9

Гистологическое исследование (-) 20

Таблица 14

Результаты обследования пациентов старческого возраста, перенесших _ трансуретральную резекцию мочевого пузыря_

Методика исследования Сроки после ТУР мочевого пузыря, мес. Всего, чел. Средний срок выявления рецидива, мес.

3 6 9 12 15 18 21 24

Группа 3. 75-86 лет, п=35

FISH (+) 1 2 5 4 2 1 1 17 12,6±1,2

FISH (-) 18

Гистологическое исследование (+) 0 1 1 2 4 3 3 2 16 16,5±1,0

Гистологическое исследование (-) 19

Такие результаты дают основание полагать, что наиболее целесообразно совместное использование методики флуоресцентной in situ гибридизации наряду с гистологическим методом и цистоскопией, в первую очередь, у пациентов старческого возраста, так как это будет способствовать более ранней диагностике рецидивов рака мочевого пузыря, чем при использовании только классических методов. Данные по третьей группе представлены в таблице 14.

Необходимо обратить внимание на то, что наличие ложноположительных результатов при использовании метода флуоресцентной in situ гибридизации не всегда является таковым. Неоднократно было замечено в ходе исследования, что у пациентов, у которых на ранних сроках после ТУР мочевого пузыря методика FISH давала положительный результат наряду с отрицательными данными цистоскопии и гистологического исследования, спустя месяц или два выявлялся рецидив заболевания, подтвержденный морфологическими исследованиями.

ВЫВОДЫ

1. Диагностика молекулярно-цитогенетических признаков, таких как гиперплоидия 3, 7, 17 хромосом и делеция 9р21 локуса, является надёжным методом верификации рецидивов поверхностной уротелиальной карциномы, подтверждая рецидив заболевания в 94,2 % случаев.

2. Количество клеток с гиперплоидией 3, 7, 17 хромосом и делецией локуса 9р21 достоверно больше и чаще встречается у лиц старческого возраста с рецидивом поверхностного рака мочевого пузыря по сравнению с пациентами среднего и пожилого возраста: именно среди

пациентов в возрасте от 75 до 86 лет более чем в 45% случаев число аномальных клеток составляет 61-100% (р<0,05).

3. С учетом делеции локуса 9р21 чувствительность методики флуоресцентной in situ гибридизации значимо выше (р=0,04) по сравнению с результатами исследования только гиперплоидии 3,7 и 17 хромосом.

4. Гиперплоидия 3,7, 17 хромосом и делеция 9р21 локуса являются неблагоприятными факторами прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря: наблюдается увеличение частоты (среднего числа клеток с хромосомными аномалиями) и глубины (среднего числа копий хромосом 3, 7 и 17 и локуса 9р21) генетических аномалий по мере увеличения стадии и степени дифференцировки опухоли (р<0,04).

5. Наиболее целесообразно совместное использование методики флуоресцентной in situ гибридизации наряду с гистологическим методом и цистоскопией, особенно у пациентов старческого возраста, так как это способствует более ранней диагностике рецидивов рака мочевого пузыря, чем при использовании только классических методов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Внедрение молекулярно-цитогенетических методов в урологическую практику будет способствовать ранней диагностике рака мочевого пузыря, окажет существенную помощь при мониторинге заболевания, значительно повысит эффективность выявления рецидивов РМП, особенно у лиц старческого возраста. Использование молекулярно-цитогенетических маркеров позволяет расширить общепринятую систему клинико-морфологических маркеров прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.

2. Данный комплекс исследований, показывая высокую эффективность и прогностическую значимость, позволяет осуществлять раннее выявление рецидивов уротелиальной карциномы и даёт возможность оказать пациентам пожилого и старческого возраста своевременное и адекватное медицинское пособие.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ

1. Рыжак Г. А. Флуоресцентная in situ гибридизация в ранней диагностике рецидива рака мочевого пузыря в первые 12 месяцев после трансуретральной резекции мочевого пузыря у лиц старческого и пожилого возраста/ Г.А. Рыжак, A.C. Пушкин // Научные Ведомости Белгородского государственного университета. Серия Медицина. Фармация. - 2012. - Вып. 20/2. - С. 64-67.

2. Рыжак ГА. Ранняя диагностика рецидива рака мочевого пузыря методом флуоресцентной in situ гибридизации в первые 24 месяца

после трансуретральной резекции мочевого пузыря у лиц старческого и пожилого возраста/ Г.А. Рыжак, A.C. Пушкин /Успехи геронтологии. -2012. - Т. 25, № 4. - С. 693-696.

3. Пушкин A.C. Технология флуоресцентной in situ гибридизации в ранней диагностике рецидива рака мочевого пузыря у лиц пожилого и старческого возраста/Л.С. Пушкин, Г.А. Рыжак, Ю.А. Парфенов// Фундаментальные исследования. - 2012. - № 10 (часть 2). - С. 72-75.

Тезисы докладов

4. Ахмедов Т.А. Преждевременное старение и повышенный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний у лиц, профессионально связанных с воздействием малых доз ионизирующего излучения/ Т.А. Ахмедов, A.C. Пушкин, С.А. Рукавишникова/Междунар. научн.-практ. конф. «Ускоренное старение: механизмы, диагностика, профилактика», Киев, 2012//Проблемы старения и долголетия. - 2012. - Т. 21, Приложение. -С. 99.

5. Пушкин A.C. Анализ распределения количества и характера рецидивов опухоли поверхностного рака мочевого пузыря по стадиям в течение первых 12 месяцев после трансуретральной резекции у лиц пожилого и старческого возраста с применением диагностики флуоресцентной in situ гибридизации/А.С. Пушкин, С.А. Рукавишникова, Т.А. Ахмедов // VIII научно-практическая геронтологическая конференция с международным участием «Пушковские чтения», Санкт-Петербург, 2012.-С. 66.

6. Пушкин A.C. Анализ частоты рецидивирования рака мочевого пузыря после трансуретральной резекции у лиц пожилого и старческого возраста с применением диагностики флуоресцентной in situ гибридизации/А.С. Пушкин, С.А. Рукавишникова, Т.А. Ахмедов//УШ научно-практическая геронтологическая конференция с международным участием «Пушковские чтения», Санкт-Петербург, 2012. - С. 57.

7. Пушкин A.C. Необходимость включения методики флуоресцентной in situ гибридизации в стандартный алгоритм диагностики рака мочевого пузыря применительно к лицам пожилого и старческого возраста/А.С. Пушкин, Г.А. Рыжак// Межрегиональная научно-практическая конференция «Медицинские проблемы пожилых». Йошкар-Ола, 2011. -С. 64-65.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Аполихин О.И., Какорнна Е.П., Сивков А.В. и др. Состояние урологической заболеваемости в Российской Федерации по данным официальной статистики // Урология. 2008. №3. С.3-7; Чиссов В.И., Старинский В.В., Ковалев Б.Н. и др. Злокачественные новообразования в России: статистика, научные достижения, проблемы // Казан-, мед. журн. 2000. Т. 81, №4. С. 241-248; Гориловский JI.M. Рак мочевого пузыря у больных пожилого и старческого возраста // Тезисы, научно-практической конференции «Диагностика и комбинированное лечение больных раком мочевого пузыря». М., 2002. С. 38-41; Чиссов В. И., Старинский В. В., Петрова Г. В. Злокачественные новообразования в России в 2006 г. // М.: Антиф. 2008; Чиссов В.И., Дарьялова СЛ. Клинические рекомендации. Онкология. 2-е издание // М.: «ГЭОТАР-Медиа». 2009. 925 с; Almallah Y.Z., Rennie C.D., Stone J., Lancashire M J. Urinary tract infection and patient satisfaction after flexible cystoscopy and urodynamic evaluation // Urology. 2000. V.56. P. 37-39; Bridge J.

A., Allison M. Cushman-Vokoun Molecular Diagnostics of Soft Tissue Tumors // Archives of Pathology & Laboratory Medicine: May 2011, Vol. 135, No. 5, pp. 588-601; Dey P. Urinary markers of bladder carcinoma // Clin. Chim. Acta. 2004. Vol. 340. p. 123-126; ЕЫе J.N., Sauter G., Epstein J.I., Sesterhenn LA. In World Health Organization Classification of Tumors // Volume 7 (Third Edition) IARC Press; 2004. Pathology and genetics of tumors of the urinary system and male genital organs, pp. 90-157; Ferlay J., Bray F., Pisani P., Parkin D.M. IARC Cancer Base no. 5 // IARC Press; 2004. GLOBOCAN 2002: Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide. Version 2.0. pp. 65-69 // Hailing K.C., Kipp B.R. Bladder cancer detection using FISH (UroVysion assay). Adv. Anat. Pathol. 2008 Sep; 15(5): 279-86; Kipp

B.R., Tanasescu M., Else T.A. et al. Quantitative fluorescence in situ hybridization and its ability to predict bladder cancer recurrence and progression to muscle-invasive bladder cancer // J. Mol. Diagn. 2009; 11 (2): 148-54; Millions walk as WHO launches a global movement for active ageing World Health Organization // Geneva: World Health Organization, Office of Press and Public Relations, 1999. 3 p.; Raab S.S., Grzybicki D.M., Vrbin C.M., Geisinger K.R. Urine cytology discrepancies: frequency, causes, and outcomes // Am. J. Clin. Pathol. 2007. Vol.127. N.6. p. 946-953; Sarosdy M.F., et al. Clinical evaluation of a multi-target fluorescent in situ hybridization assay for detection of bladder cancer // J. Urol. 2002. V. 168, N.5. P. 1950-1954; Su C.C., Мак C.W., Huan S.K. Diagnosis of primary ureteral small cell carcinoma in instrumented urine cytology // Pathology. 2007. Voh39. N.3. p. 365-367 // Tiguert R., Lessard A., So A. Prognostic markers in muscle invasive bladder cancer. World J. Urol. 2002. Vol. 20(3). p. 190-195; World population prospects. The 2000 revision // New York: United Nations, Department of Economic and Social Affairs, 2001. 13 p.

ПУШКИН Александр Сергеевич ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИЯ В ДИАГНОСТИКЕ РЕЦИДИВОВ ПОВЕРХНОСТНОГО РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ПОСЛЕ ТРАНСУРЕТРАЛЬНОЙ РЕЗЕКЦИИ У ЛИЦ ПОЖИЛОГО И СТАРЧЕСКОГО ВОЗРАСТАУ/Автореф. дис. канд. мед. наук: 14.01.30. -СПб., 2012.-26 с.

Подписано в печать «22» октября 2012. Формат 60484 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0.

_Тираж 100 экз. Заказ 73._

Отпечатано с готового оригинал-макета.

ЗАО «Принт-Экспресс» 197101, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А.

Актуальность исследования

Во многих развитых странах за последнее время значительно возросла численность пожилого населения. В результате сокращения рождаемости и увеличения продолжительности жизни население все большего числа стран будет стремительно стареть. В период с 2005 года по 2050 год половина прироста численности населения в мире будет являться результатом роста численности населения в возрасте старше 60 лет. Кроме того, в более развитых регионах, согласно предположениям, население в возрасте старше 60 лет увеличится практически в два раза (с 245 миллионов человек в 2005 году до 406 миллионов в 2050 году). Например, в Российской Федерации в 2000 г. в возрасте старше 65 лет было около 18 миллионов человек, а в 2020 г., по прогнозам, их будет уже 21 миллион человек [World population prospects, 2001]. В Германии на 82 миллиона населения приходится 17% людей в возрасте старше 60 лет, а к 2020 г. их численность повысится до 22% от ожидаемой общей численности населения. В США к 2020 г. ожидается увеличение численности людей старших возрастных групп на 5 миллионов человек [Millions walk as WHO launches a global movement for active ageing World Health Organization, 1999].

В последние годы всё большее внимание исследователей всего мира привлекают гериатрические исследования, что обусловлено, во-первых, увеличением в популяции количества лиц пожилого и старческого возраста, во-вторых, тенденцией к возрастанию средней продолжительности жизни человека, в-третьих, усилением гериатрической направленности медицины.

В структуре онкологических заболеваний населения России рак мочевого пузыря (РМП) занимает 8-е место среди мужчин и 18-е среди женщин. Ежегодно в России регистрируется 11267 больных с впервые выявленным диагнозом РМП [Чиссов В. И. и соавт., 2008]

РМП занимает седьмое место в мире среди общего количества онкологических заболеваний [ЕЫе J.N. et al., 2004] и четвёртое - среди общего количества злокачественных новообразований, диагностируемых у мужчин в США и европейских странах [Ferlay J. et al., 2002]. Опухоли мочевого пузыря превалируют среди новообразований мочевого тракта и составляют 70% от их числа. Около 80% пациентов относятся к возрастной группе 50-80 лет, а пик заболеваемости приходится на 7-ое десятилетие жизни. В России в 1995-2005 г.г. средний возраст мужчин, страдающих РМП, составил 65,2-65,6 лет, женщин - 68,9-69,7 лет [Аполихин О.И. и соавт., 2008]. Уровень смертности от этого заболевания во многих индустриально развитых странах составляет от 3% до 8,5% [Чиссов В.И., 2000].

Цистоскопия и цитологическое исследование остаются стандартными рутинными диагностическими инструментами для обнаружения и контроля РМП. Однако, цистоскопия имеет ряд значимых минусов: может быть не эффективна на ранних стадиях и стадиях рецидивирования, трудно переносима пациентами, особенно лицами пожилого возраста, также высока вероятность осложнений, в частности, инфекционного генеза [Almallah Y.Z. et al., 2000]. Цитологическая методика осталась единственным альтернативным и доступным атравматичным методом обнаружения РМП [Raab S.S. et al., 2007]. Данное исследование мочи имеет высокую чувствительность только при низкодифференцировапном раке мочевого пузыря [Гориловский JI.M., 2002; Su С.С. et al., 2007]. Недостаточная чувствительность данной методики при дифференцированном раке заставляет разрабатывать новые методы с использованием опухолевых маркеров, содержащихся в моче. Более чувствительные и неинвазивные методы являются объектом поиска для ранней диагностики первичного заболевания, а также мониторинга рецидивирования. На сегодняшний день разработано большое количество биохимических и молекулярных мочевых и сывороточных методов, включая анализ ВТА, ВТА stat, NMP 22 и immunocyt, более чувствительных, чем цитология для обнаружения РМП, однако все они дают много ложноположительных результатов, что говорит об их низкой специфичности и требует назначения уточняющей цистоскопии [Tiguert R. et al., 2002; Dey P. 2004].

Генетические нарушения появляются уже на начальных стадиях развития опухоли и являются основными определяющими факторами малигнизации. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) является цитогенетической технологией, которая используется для анализа хромосомных нарушений в исследуемых клетках. FISH использует флуоресцентные метки в исследовании ДНК, которые крепятся к центромерам хромосом или уникальным участкам для обнаружения клетки с числовыми, структурными нарушениями, показательными для злокачественного развития [Julia A. et al., 2011]. В настоящее время применяется FISH-методика с высокой чувствительностью и специфичностью для обнаружения РМП, использующая четыре флуоресцентные метки, выявляющих цитогенетические транслокации в хромосомах 17, 3 и 7 и локус-специфический ген 9р21 - ген из семейства опухолевых супрессоров, в 9-й хромосоме [Sarosdy M.F. et al., 2002; Hailing K.C., Kipp B.R. 2008; Kipp B.R., et al, 2009].

Лечение поверхностного РМП начинают с трансуретральной резекции (ТУР) мочевого пузыря (за исключением больных с тотальным поражением мочевого пузыря, которым показана цистэктомия). В 40-80% случаев после ТУР в течение 6-12 месяцев развивается рецидив, а у 10-25% больных -инвазивный рак. После ТУР мочевого пузыря пациентам рекомендуется проходить динамическое наблюдение, включающее ряд регулярных диагностических исследований, в том числе цистоскопическое исследование с цитологическим анализом мочи, УЗИ органов малого таза в первые 2 года 1 раз в 3 месяца [Чиссов В.И., Дарьялова C.JT. 2009].

На сегодняшний день имеется приказ Минздравсоцразвития РФ от 07.12.2004 г. № 303 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным злокачественным новообразованием мочевого пузыря», в котором не упоминается о цитогенетическом исследовании клеток эпителия мочевого пузыря.

Ввиду распространения методики FISH как в Российской Федерации, так и в мировой практике, возникает вопрос о целесообразности включения её в стандарт диагностики РМП, в частности для лиц пожилого и старческого возраста.

Цель исследования

Цель исследования заключалась в определении целесообразности включения методики флуоресцентной in situ гибридизации в стандартный алгоритм диагностики рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после трансуретральной резекции мочевого пузыря применительно к лицам пожилого и старческого возраста.

В рамках данной цели определены задачи диссертационного исследования:

1. Изучить диагностическую ценность методики флуоресцентной in situ гибридизации в условиях городского стационарного отделения урологии у лиц пожилого и старческого возраста.

2. Оценить молекулярно-цитогенетическую и морфологическую ценность методики флуоресцентной in situ гибридизации для диагностики рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после трансуретральной резекции мочевого пузыря применительно к лицам пожилого и старческого возраста.

3. Выявить молекулярно-цитогенетические закономерности при прогнозировании степени злокачественности рака мочевого пузыря у лиц пожилого и старческого возраста.

4. Сопоставить полученные данные о целесообразности включения методики флуоресцентной in situ гибридизации в диагностический алгоритм диагностики рецидива рака мочевого пузыря с имеющимися результатами, опубликованными в отечественной и зарубежной литературе.

5. Обосновать алгоритм диагностики рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после трансуретральной резекции мочевого пузыря у лиц пожилого и старческого возраста, предусматривающий использование молекулярно-цитогенетической методики флуоресцентной in situ гибридизации.

Научная новизна исследования

В настоящей работе впервые разработан новый подход к ранней диагностике рецидивов поверхностного рака мочевого пузыря у лиц пожилого и старческого возраста путём дополнения стандартных методов обследования определением полисомии 3, 7, 17 хромосом и делеции локуса 9р21 в клетках уротелия после трансуретральной резекции поверхностного рака мочевого пузыря. Установлено, что диагностика хромосомных аберраций, таких как гиперплоидия 3,7,17 хромосом и делеция 9р21 локуса, является надёжным методом выявления рецидивов поверхностного рака мочевого пузыря, подтверждая рецидив заболевания в 94,2 % случаев.

Доказано, что количество клеток с гиперплоидией 3,7,17 хромосом и делецией локуса 9р21 достоверно больше и чаще встречается у лиц старческого возраста с рецидивом поверхностного рака мочевого пузыря по сравнению с пациентами среднего и пожилого возраста: именно среди пациентов в возрасте от 75 до 86 лет более чем в 45% случаев число аномальных клеток составляет 61-100%.

Показано, что с учетом хромосомных аберраций в виде делеции локуса 9р21 чувствительность методики флуоресцентной in situ гибридизации значимо выше по сравнению с результатами исследования только гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом.

По итогам исследования разработан алгоритм диспансерного наблюдения за пациентами пожилого и старческого возраста, перенесшими трансуретральную резекцию мочевого пузыря по поводу поверхностного рака мочевого пузыря, что способствует достоверно более ранней диагностике рецидивов рака мочевого пузыря, чем при использовании только классических методов.

Практическая значимость

Разработан и внедрен в клиническую практику алгоритм диспансерно-динамического наблюдения за пациентами пожилого и старческого возраста, перенесшими трансуретральную резекцию мочевого пузыря по поводу поверхностного рака, предусматривающий дополнение стандартного обследования включением методики флуоресцентной in situ гибридизации.

Внедрение молекулярно-цитогенетических методов в урологическую практику будет способствовать ранней диагностике рака мочевого пузыря, окажет существенную помощь при мониторинге заболевания, значительно повысит эффективность выявления рецидивов рака мочевого пузыря, особенно у лиц пожилого и старческого возраста. Использование молекулярно-цитогенетических маркеров позволяет расширить общепринятую систему клинико-морфологических маркеров прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря, в первую очередь у лиц старших возрастных групп.

Разработанный комплекс исследований показал высокую эффективность и прогностическую значимость, что позволило на более ранних сроках заболевания оказать пациентам пожилого и старческого возраста адекватное медицинское пособие.

Положения, выносимые на защиту

1. Применение цитогенетической методики UroVysion® в наблюдении за пациентами после трансуретральной резекции мочевого пузыря по поводу поверхностного рака дает достоверную информацию о стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли, а также о её рецидивирующем потенциале. Это достижимо только с учетом использования дополнительных параметров теста (числа аномальных клеток и количества копий отдельных хромосом).

2. Количество клеток с гиперплоидией 3,7,17 хромосом и делецией локуса 9р21 достоверно больше и чаще встречается у лиц старческого возраста с рецидивом поверхностного рака мочевого пузыря по сравнению с пациентами среднего и пожилого возраста.

3. Включение флуоресцентной in situ гибридизации для обследования больных пожилого и старческого возраста на наличие рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после трансуретральной резекции значительно повышает качество диагностики рака мочевого пузыря.

Связь работы с планом НИР

Диссертация выполнена по плану научно-исследовательской работы Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМИ.

Апробация и реализация результатов работы

Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Межрегиональной научно-практической конференции «Медицинские проблемы пожилых» (Йошкар-Ола, 2011), международной научно-практической конференции «Ускоренное старение: механизмы, диагностика, профилактика» (Киев, 2012), VIII научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2012).

По результатам работы в лечебный процесс урологических отделений СПб ГБУЗ «Городская многопрофильная больница № 2» и СПб ГБУЗ «Клиническая больница Святителя Луки» внедрен новый алгоритм обследования больных поверхностным раком мочевого пузыря пожилого и старческого возраста после трансуретральной резекции.

Личный вклад автора

Автором лично определены цель и задачи исследования, проанализирована отечественная и зарубежная литература по изучаемой проблеме, разработаны методические подходы к проведению исследования. Автор непосредственно производил сбор данных, выполнение всех этапов методики флуоресцентной in situ гибридизации, обработку и обобщение полученных материалов, подготовку основных публикаций по выполненной работе, написание и оформление рукописи.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ, 4 тезиса докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований и наблюдений, заключения, выводов, библиографического указателя, содержащего ссылки на 179 работ, в том числе 39 отечественных и 140 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 17 таблицами.

ВЫВОДЫ

1. Диагностика молекулярно-цитогенетических признаков, таких как гиперплоидия 3, 7, 17 хромосом и делеция 9р21 локуса, является надёжным методом верификации рецидивов поверхностной уротелиальной карциномы, подтверждая рецидив заболевания в 94,2 % случаев.

2. Количество клеток с гиперплоидией 3, 7, 17 хромосом и делецией локуса 9р21 достоверно больше и чаще встречается у лиц старческого возраста с рецидивом поверхностного рака мочевого пузыря по сравнению с пациентами среднего и пожилого возраста: именно среди пациентов в возрасте от 75 до 86 лет более чем в 45% случаев число аномальных клеток составляет 61-100% (р<0,05).

3. С учетом делеции локуса 9р21 чувствительность методики флуоресцентной in situ гибридизации значимо выше (р=0,04) по сравнению с результатами исследования только гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом.

4. Гиперплоидия 3,7, 17 хромосом и делеция 9р21 локуса являются неблагоприятными факторами прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря: наблюдается увеличение частоты (среднего числа клеток с хромосомными аномалиями) и глубины (среднего числа копий хромосом 3, 7 и 17 и локуса 9р21) генетических аномалий по мере увеличения стадии и степени дифференцировки опухоли (р<0,04).

5. Наиболее целесообразно совместное использование методики флуоресцентной in situ гибридизации наряду с гистологическим методом и цистоскопией, особенно у пациентов старческого возраста, так как это способствует более ранней диагностике рецидивов рака мочевого пузыря, чем при использовании только классических методов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Внедрение молекулярно-цитогенетических методов в урологическую практику будет способствовать ранней диагностике рака мочевого пузыря, окажет существенную помощь при мониторинге заболевания, значительно повысит эффективность выявления рецидивов РМП, особенно у лиц старческого возраста. Использование молекулярно-цитогенетических маркеров позволяет расширить общепринятую систему клинико-морфологических маркеров прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.

2. Данный комплекс исследований, показывая высокую эффективность и прогностическую значимость, позволяет осуществлять раннее выявление рецидивов уротелиальной карциномы и даёт возможность оказать пациентам пожилого и старческого возраста своевременное и адекватное медицинское пособие.