Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Использование моноклональных антител к липиду А в лечении эндотоксемии у детей

Министерство здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации Научно-исследовательский институт детской гематологии

Р - - ¡1 1

На правах рукописи

ОД

° • ДУБРОВИНА Екатерина Сергеевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЛИПИДУ А В ЛЕЧЕНИИ ЭНДОТОКСЕМИИ У ДЕТЕЙ.

14. 00.09 - педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1994

Работа выполнена в НИИ детской гематологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор РУМЯНЦЕВ АЛЕКСАНДР ГРИГОРЬЕВИЧ;

кандидат медицинских наук, доцент БЛОХИН БОРИС МОИСЕЕВИЧ ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор. Кисляк Наталья Сергеевна;

доктор медицинских наук, профессор Кошель Игорь Васильевич ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт педиатрии и детской хирургии Минздравмедпрома РФ.

Защита диссертации состоится " _ " _ 1994г.

в_ час. на заседании специализированного Совета Д.084.61.01.

НИИ детской гематологии Минздравмедпрома РФ по адресу: 117513. Москва, Ленинский проспект, д.117

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " _ " _ 1994г.

Ученый секретарь специализированного Совета Д. 084.61.01 доктор медицинских наук, профессор А.Ф.Бухны

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние годы проблема диагностики и лечения зндотоксемии становится все более актуальной. Повышенное поступление эндотоксина в кровоток сопровождает течение очень многих заболеваний с высокой частотой развития эндо-токсического шока ( Martin М.А. et al. 1992). Одной из наиболее частых причин развития зндотоксемии являются грам-отрица-тельные инфекции. Установлено, что повышение уровня эндотоксина в крови может быть вызвано кишечной инфекцией (Aoki К., 1978). гнойным перитонитом (Baumgartner J.D. et.al., 1985), кишечной непроходимостью (Garthlram Р., 1986). гепатитом (Блю-гер А.Ф., 1975), тяжелой травмой (Hammer-Hodges D., 1974), а также при токсичном воздействии цитостатиков (Cohen J. et al., 1984; TengN.N. et.al., 1985), радиации (GafflnS.L. etal., 1985). При этом эндотоксемия является результатом нарушения функций многих органов и систем, осуществляющих инактивацию эндотоксина в организме в физиологических условиях.

Антибактериальная терапия и традиционное проведение симптоматической детоксикации, включая экстракорпоральные методы лечения (плазмоферез, гемодиализ, гемосорбция), существенно не влияют на течение зндотоксемии и не являются патогенетическими в купировании этого состояния (Будагов Т.Я., 1992).

Наиболее современным" подходом в лечении зндотоксемии является поиск иммунокоррегирующих препаратов, специфически связывающих эндотоксин и блокирующих его активность (Appelmelk В.J.. 1987). Полученные методом генной инженерии моноклональ-

ные антитела к липиду А грам-отрицательных бактерий в экспериментах in vitro эффективно связывают эндотоксин (Appelmelk В.J.. 1987). В проведенных различными исследователями клинических испытаниях препаратов мышиных Е5 и человеческих НА-1-А моноклональных антител к липиду А (МоАТ) не представлено данных, позволяющих объективно судить о механизме протективного действия моноклональных антител в купировании эпизодов эндо-токсемии.

Высокий риск развития у детей эндотоксемии, приводящей к шоку и летальному исходу (Венцель А.Ф.. 1990), диктует необходимость проведения динамического изучения терапевтической эффективности моноклональных антител к липиду А и выявления ла-бораторно подтвержденных механизмов их взаимодействия с эндотоксином.

В связи с этим данное исследование является актуальным для педиатрической практики.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Целью настоящего исследования является проведение клинико-лабораторной оценки эффективности использования специфической антиэндотоксической иммунотерапии в лечении грам-отрицательных инфекций у детей и изучение влияния моноклональных антител к липиду А на различные звенья патогенеза эндотоксемии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести унификацию наиболее информативных клинико-диагностических показателей тяжести эндотоксемии при грам-отри-цательной инфекции у детей.

2. На экспериментальной модели ишемии тонкой кишки изучить динамическую взаимосвязь основных медиаторов эндотоксического шока, таких как фактор некроза опухоли, интерлейкин-1, простагландин Г, 6-кето-простагландин-1-альфа и влияние мо-ноклональных антител к липиду А на их синтез.

3. Оценить терапевтическую эффективность применения препарата моноклональных антител к липиду А в рандомизированном исследовании у детей.

4. Выявить этиотропный и патогенетический механизм действия моноклональных антител к липиду А на течение эндотоксемии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Впервые проведена патогенетическая классификация степеней тяжести эндотоксемии. Показано, что степень тяжести коррелирует с прогнозом и может характеризовать стадию развития эндотоксемии.

Установлено, что тяжесть течения зависит от уровня эндотоксина. состояния антиэндотоксического иммунитета и реактивности организма. Выявлены патологические состояния, которые с наибольшей вероятностью приводят к развитию тяжелой эндотоксемии у детей. Определены прогностические факторы эндотоксемии.

К неблагоприятным прогностическим признакам отнесены следующие показатели: низкий уровень фактора некроза опухоли (ФНО), интерферона-гамма (ИНФ-У) и белков системы комплемента в сочетании с высоким уровнем липополисахарида (ЛПС), низким титром антител (ТА) к эндотоксину и тяжелым состоянием больных. Показано, что прогностические факторы отражают чувствительность пациента к направленной иммунотерапии эндотоксемии.

Впервые на экспериментальной модели эндотоксемии. вызванной ишемией тонкой кишки, изучен динамический взаимосвязанный

синтез медиаторов эндотоксического шока. Показана способность моноклональных антител к ЛПС ингибировать синтез ФНО и интер-лейкина-1 (ИЛ—1) при экспериментальной эндотоксемии.

Впервые проведено рандомизированное исследование по применению МоАТ к липиду А в лечении эндотоксемии у детей. Показано, что моноклональные антитела к липиду А являются безопасным и высокоэффективным методом терапии эндотоксемии в педиатрической практике.

Выявлено, что препарат МоАТ к липиду А является этиотроп-ным и патогенетическим методом лечения.

Установлено, что введение МоАТ позволяет осуществлять экстренную пассивную иммунизацию больных и приводит к повышению уровня антиэндотоксической защиты. Образование комплексов между антиэндотоксическими антителами и ЛПС является непременным условием для осуществления антиэндотоксической защиты и предотвращения развития эндотоксического шока.

Изучен динамический синтез ФНО. ИНФ-У, белков системы комплемента при персистирующей эндотоксемии у детей. Выявлен суточный ритм продукции ФНО и ИНФ-<У.

Показано, что введение МоАТ к липиду А прерывает цикличный синтез ФНО и ИНФ-<Г.

Выявлен различный тип реагирования интенсивности синтеза ФНО на введение моноклональных антител к ЛПС у больных с эндо-токсемией различной степени тяжести, что характеризует активность макрофагального ответа и реактивность организма хозяина.

Продемонстрирована способность моноклональных антител ингибировать эстеразную активность кинин-калликреиновой системы и предотвращать истощение белков системы комплемента. Установлено, что активность ответной реакции компонентов иммунной

системы организма обуславливает эффективность проводимой специфической иммунокоррекции и благоприятный прогноз.

Благодаря проведенному исследованию определены показания к использованию МоАТ к липиду А в плане базисной терапии эндо-токсемии у детей и предложен эффективный дозовый режим их введения.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ: Результаты проведенного исследования имеют важное значение для решения практических вопросов педиатрии.

Установлены дифференциально-диагностические признаки тяжести эндотоксемии. Показано, что эффективное лечение больных с гнойно-воспалительными заболеваниями, осложненными эндо-токсемией, возможно лишь на основании комплексного динамического контроля различных иммунологических, бактериологических и биохимических показателей.

Установлена взаимосвязь между уровнем антиэндотоксических антител, ЛПС, активацией различных звеньев патогенеза эндотоксемии ( ФНО, ИНФ-У, кинин-калликреиновой системы и системы комплемента) и тяжестью состояния. Научно обоснован, разработан и внедрен в практику способ проведения направленной иммунотерапии путем использования МоАТ к липиду А в комплексной терапии эндотоксемии. Разработана тактика и режим введения МоАТ к липиду А. Установлены терапевтические концентрации антител к ЛПС в кровотоке, позволяющие предотвратить развитие эндотоксического шока.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ: Методы диагностики эндотоксемии и применения моноклональных антител к липиду А грам-отрицательных бактерий внедрены в практику работы ожоговых отделений, отделений абдоминальной хирургии, интенсивной терапии РДКБ, ДКБ N1. ДКБ N9 г.Москвы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Основные положения диссертации доложены на заседании гематологической секции общества детских врачей г.Москвы 13.09.94г., на научной конференции НИИ детской гематологии, кафедры поликлинической педиатрии РГМУ, сотрудников РДКБ и ДКБ 1 г.Москвы 15.09.94г.

По материалам диссертации опубликовано И работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ: Диссертация изложена на 227 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трёх глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 39 отечественных и 170 иностранных публикаций. Работа.иллюстрирована 20 таблицами. 27 графиками и 1 рисунком

Работа выполнена в НИИ Детской Гематологии МЗ и МП РФ (директор - член-корр.РАЕН, профессор А.Г.Румянцев), лаборатории клеточной инженерии ИЭК КНЦ РАМН (зав.лаб,- к.м.н. Т. Н. Власик). лаборатории клинической микробиологии ЦКБ (зав.лаб.- д.м.н. В.И.Минаев), лаборатории молекулярной иммунологии ЦНИИ туберкулеза (зав.лаб,- профессор А.М.Мороз), лаборатории молекулярной иммунологии НИИ эпидемиологии и микро-

биологии им.Г.Н.Габричевского (зав.лаб.- профессор Л.В.Козлов), биохимической лаборатории НИИ эндокринологии МЗ и МП РФ (зав. лаб.- к.м.н. Л.Д.Чиркова). ПНИЛ экспериментальной хирургии РГМУ ( зав. сектором - профессор А.П.Эттингер). лаборатории молекулярной биологии Университета Ганнимана. Филадельфия, США (зав.лаб. - профессор Л.Крюгер), отдела гнойной хирургии НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ (зав. отделом - к.м.н. Иванова М.Н.), на базе отделений реанимации (зав.отделением -Р.С.Кцоев) и абдоминальной хирургии (зав. отделением - А.К.Коновалов), ДКБ N9 (глав.врач - к.м.н. П.П.Продеус), отделения реанимации (зав.отделением - Л.М.Коробко), ДКБ N1 (глав.врач -к.м.н. М.А.Корнюшин), отделения онкогематологии (зав. отделением - А.И.Карачунский) и общей гематологии (зав:отделением -к.м.н. И.С.Тиганова) РДКБ (глав.врач - к.м.н. В.А.Дроздов).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Клинический раздел работы основан на наблюдении, обследовании и лечении 134 детей в возрасте от 2 месяцев до 14 лет с различной хирургической, гематологической, педиатрической и инфекционной патологией, с высокой вероятностью приводящей к развитию эндотоксемии.

В процессе наблюдения за больными у 124 детей на фоне основного заболевания отмечались клинические признаки, характеризующие присоединение вторичной инфекции: наличие выявляемого или возможного очага инфекции, гипертемия с тенденцией к лихорадке, общая интоксикация (слабость, адинамия, бледность кожных покровов). У иммунокомпроментированных больных наличие лихорадки на фоне лейкопении и агранулоцитоза без очевидного очага инфекции являлось маркером развития инфекционного процесса, носящего в этом случае септический характер. С целью лабораторного мониторинга состояния больных всем детям рутинно проводилось динамическое исследование клинического анализа периферической крови, биохимических показателей функции жизненно важных органов и систем, концентраций воспалительных острофазных белков, параметров кислотно-основного состояния крови. Для подтверждения наличия инфекционного процесса и идентификации флоры больным проводилось бактериологическое обследование.

Результаты бактериологического исследования учитывались в течение 1-2 суток и сопровождались антибиотикограммой, которая

отражала чувствительность данного возбудителя к проводимой антибактериальной терапии.

С целью выявления наиболее информативных клинико-лабора-торных показателей тяжести эндотоксемии было обследовано 67 детей мужского и женского пола (44 мальчика и 23 девочки) в возрасте от 4 месяцев до 15 лет с клиникой эндотоксемии.

Критериями отбора являлись слеЭующие признаки:

1) наличие у больного органной патологии, предрасполагающей к развитию эндотоксемии;

2) присоединение вторичной грам-отрицательной инфекции, подтвержденной результатами бактериологического исследования;

3) стойкая гипертермия, не поддающаяся коррекции антибактериальной терапией;

4) клинические признаки эндогенной интоксикации (бледность кожных покровов, акроцианоз, вялость, слабость, ано-рексия);

5) нарушение функций сердечно-сосудистой и дыхательной систем, явления нейротоксикоза.

С целью лабораторной диагностики эндотоксемии у данной группы больных измерялся уровень ЛПС в плазме. Для определения концентрации эндотоксина использовался LAL-тест (стандартная методика с использованием наборов реактивов фирмы "Sigma").

С прогностической и диагностической целью больные обследовались на титр антител к ЛПС, который объективно отражал состоятельность антиэндотоксического иммунитета на фоне эндотоксемии. Титр антител определялся методом иммуноферментного анализа (ELISA).

В ходе исследования' изучалась корреляционная связь между тяжестью эндотоксемии и степенью активации системы фагоцитиру-

ющих мононуклеаров. системы комплемента и кинин-калликреиновой системы (ККС).

Активность кинин-калликреиновой системы оценивалась по активности калликреина (метод Пасхиной Т. С. и Кринской Л. В..1974г.), уровню прекалликреина (ПК), ингибитора калликреина (ИК), суммарной эстеразной активности (СЭА) (метод Колмана) и уровнюо(2-макроглобулина U2- МГ) и <¿1 -антитрипсина Ul- AT) (метод Нартиковой В.Ф.и Пасхиной Т.е. 1979г.).

Комплементарная активность оценивалась по титру комплементарных белков с помощью стандартной методики в модификации Козлова Л.В. в лаборатории молекулярной иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского.

Уровень фактора некроза опухоли (ФНО) и интерферона-гамма (ИНФ-Л характеризовал активность ответа макрофагов/моноцитов на стимуляцию ЛПС. Для их определения использовались стандартные наборы реактивов фирмы "Genzyme Corporation" (США) для ELISA (лаборатория молекулярной иммунологии НИИ туберкулеза).

Оценка терапевтической эффективности применения монокло-нальных антител к липиду А в лечении эндотоксемии у детей, а также изучение их этиотропного и патогенетического механизма действия проводилась в рандомизированном исследовании. В исследование были включены 30 больных обоего пола-в возрасте от 4 месяцев до 14 лет, имевших клинически и лабораторно подтвержденную эндотоксемию, осложнявшую течение основного заболевания на фоне вторичной инфекции.

С целью выявления патогенетического механизма действия препарата в 0,2,6,24 часа после каждого введения проводился мониторинг показателей уровней эндотоксина, антител к ЛПС, ФНО, ИНФ-сГ, белков системы комплемента, компонентов кинин-кал-

- и -

ликреиновой системы в плазме больных обеих групп. Результаты исследования обрабатывались с помощью Стьюдент-Т-теста.

Динамическая взаимосвязь основных медиаторов эндотокси-ческого шока и роль МоАТ к липиду А в ингибировании их синтеза изучались на экспериментальной модели ишемии тонкой кишки у собак.

Исследование проводилось на 25 беспородных собаках обоего пола с массой тела 14-16 кг.

Ишемия создавалась путем лигирования а. и v. mesenterica superior.

Эффективность наведенной ишемии и жизнеспособность кишки оценивались по данным электромиограммы, которые регистрировались с помощью Мингографа-82.

Степень повышения проницаемости слизистой оболочки для эндотоксина и других веществ под действием ишемии тонкой кишки характеризовалась изменением калиевой активности на мукозе. Регистрация активности калия проводилась с помощью четырехка-нального прибора Fa. Sigert С-шЬН (Германия), который основан на принципе ионселективных измерений.

Запись показателей состояния центральной гемодинамики (частота сердечных сокращений (ЧСС), артериальное давление (АД) пульсовое давление (ПД), скорость портального кровотока (Упк)) осуществлялась на полиграфе HP 7758D и одновременно на компьютере LABTAM 3015 AD в течение 8 часов от момента создания ишемии тонкой кишки. Данные регистрировались в 0-2-4-6-6,5-8 часов в процессе наблюдения.

Динамическое наблюдение за развивающейся эндотоксемией осуществлялось в течение 6 часов с момента наложения лигатуры на кишку. В дальнейшем на 6 часу ишемии животным эксперимен-

тальной группы (14 особей) вводились МоАТ к липиду А в дозе 1мг/кг внутривенно капельно в течение 20 минут.

Тяжесть эндотоксемии и эффективность терапии моноклональ-ными антителами оценивались по гемодинамическим параметрам, уровню эндотоксина и антител к ЛПС, сывороточной концентрации основных цитокинов, участвующих в патогенезе развития эндо-токсического шока (ФНО, ИЛ-1, ПГФ, 6-кето-ПГФ-1 ). КЩС крови.

Уровень эндотоксина определялся с помощью стандартного LAL-теста (llmulus amoebocyte lysate - тёст) фирмы "Sigma" по стандартной методике выявления липополисахарида.

Концентрации ФНО и ИЛ-1 измерялись методом ELISA с использованием стандартных наборов фирмы "Gensyme Corporation" (США) для идентификации ФНО и ИЛ-1 в сыворотке собак.

Для определения уровней ПГФ и 6-кето-ПГФ-1 методом РИА (радиоиммунного анализа). применялись стандартные коммерческие наборы фирм "New England Nuclear" и "Clinical Essays" (США).

Титр антител (ТА) к ЛПС определялся дифференцированно в портальном кровотоке и кровотоке нижней полой вены. Для оценки уровня антител к ЛПС проводилась реакция иммобилизации бактериальных колоний (РИБК).

Исследуемые в работе МоАТ к липиду А грам-отрицательных бактерий были получены путем создания асцита у мышей (Koher G, 1975) группой клеточной инженерии ИЭК КНЦ РАМН.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.Использование экспериментальной модели эндотоксемии у собак дало возможность изучить динамическую взаимосвязь основных медиаторов эндотоксического шока и роль МоАТ к липиду А в ингибированнии их синтеза. Животным экспериментальной группы на фоне наведенной эндотоксемии вводились МоАТ к липиду А в дозе 1 мг/кг, которые связывали эндотоксин. Снижение уровня ЛПС сопровождалось уменьшением концентрации ФИО и ИЛ-1 (таблица N1). У животных контрольной группы регистрировались нарушения гемодинамики на фоне повышения уровня ЛПС, ФИО и ИЛ-1, и снижения ТА к эндотоксину. При этом ФИО оказывал прямое и опосредованное цитотоксическое действие, индуцируя синтез ИЛ-1. Это приводило к развитию клиники эндотоксического шока и гибели собак. Образование в кровотоке экспериментальных животных иммунных комплексов между антителами и ЛПС приводило к блокированию последовательности патофизиологических реакций организма на поступление больших доз эндотоксина, что в данном случае регистрировалось как предотвращение развития эндотоксического шока. Более высокие концентрации антител к ЛПС в образцах крови, взятых из v.portae по отношению к их содержанию в v. cava подтверждают значительную роль купферовских клеток печени в осуществлении клиренса ЛПС из организма.

2. Вариабельность течения эндотоксемии и звеньев её патогенеза побудили нас провести унифицированную оценку тяжести эндотоксемии.

При обследовании 134 детей с заболеваниями, приводящими с

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЭНДОТОКСЕМИИ, ВЫЗВАННОЙ ИШЕМИЕЙ ТОНКОЙ КИШКИ В ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ У СОБАК.

Таблица 1

липияу А

р<0,05

в числителе - показатели в экспериментальной группе собак, получивших на 6 часу ишемии введение моноклональных антител к в знаменателе - показатели контрольной группы собак

I

наибольшей вероятностью к развитию эндотоксемии, мы выявили у 124 из них клинические признаки присоединения вторичной инфекции. Результаты бактериологического обследования были положительны у 90 больных. При этом у 78 детей из различных сред высевалась грам-отрицательная флора. Из них в 23 случаях она выявлялась в ассоциации с грам-положительными бактериями. Клиника эндотоксемии сопровождала течение грам-отрицательной инфекции у 67 детей. При проведении лабораторной специфической диагностики эндотоксемии ЬАЬ-тест был положительным у 49 из них. Эти дети обследовались в дальнейшем на титр антител к эндотоксину, уровень ФИО, ИНФ-<Г, титр белков системы комплемента, показатели активности кинин-калликреиновой системы. На основании сопоставления клинических и лабораторных показателей были выделены патогенетически обоснованные три степени тяжести эндотоксемии: 1 степень тяжести (лихорадка до 38,5+0,47° с, ЧД=30+4,3 дых. в мин., индекс Алговера < 0.8. ЦВД=120-60 мм.вонд. ст., отсутствие выраженных отклонений в КЩС крови, адекватный диурез 60-50 мл/час, ЛИИ=5.9+0.84, уровень ЛПС=0.09+0.017 ЕИ/мл, относительный ТА к ЛПС=87.77+5.75%. уровень ФН0=265±25пг/мл, ИНФ-<^=87.5±7.68ПГ/МЛ, повышение суммарной эстеразной активности плазмы и калликреина на фоне снижения ингибитора калликреина, прекалликреина иЛ-АТ и повышение о<2-МГ, снижение гемолитической активности белков системы комплемента на 35% от нормы); 2 степень тяжести (лихорадка 39.0+0.3°С, тахипноэ 39+2.7 или неэффективное самостоятельное дыхание, индекс Алговера - 0.9-1.2, ЦВД=50-10 мм.водн.ст.. по данным КЩС крови - компенсированный ацидоз, ЛИИ - 6.2±0.9. снижение диуреза до 50-30 мл/час, уровень ЛПС в плазме -0.17+0.03 ЕИ/МЛ, ТА К ЛПС - 71.42±9.73%, ФШМ43.48±10. 8пг/МЛ,

ИНФ-<!Г =123. 33±2.89 ' пг/мл. характер изменений показателей ки-нин-калликреиновой системы был тот же, только с-большей степенью активности, титр белков системы комплемента снижен на 16.7% от нормы); 3 степень тяжести (1=39.5+0.27°С. ЧД=60+6.4 дых. в мин. или отсутствие самостоятельного дыхания, индекс Ал-говера > 1.3, ЦВД=10-0 мм.водн.ст.. ЛИИ=6.4±0.7, по данным КЩС декомпенсированный смешанный ацидоз, резко выраженная протеаз-ная активность кинин-калликреиновой системы и снижение титра комплементарных белков на 75% от нормы, уровень ЛПС в плазме -0.29±0.05 ЕИ/мл, ТА к ЛПС - 42.04+5,41%, ФН0=66.67±10 пг/мл, ИНФ-у=67. 5±3.4 пг/мл.

При этом наиболее тяжелые формы течения эндотоксемии развивались в результате резорбции эндотоксина из брюшной полости или с раневой поверхности на фоне таких заболеваний, как острый перитонит, инфицированные ожоги, синдром длительного раздавливания. Степень- тяжести эндотоксемии коррелировала дозоза-висимым образом с уровнем ЛПС в плазме больных и находилась в обратной зависимости от ТА к ЛПС. ТА отражал состоятельность антиэндотоксического иммунитета организма и являлся важным показателем необходимости проведения экстренной специфической иммунокоррекции. Комплексная оценка таких показателей, как ФНО, ИНФ-У, белки системы комплемента и компоненты кинин-кал-ликреиновой системы, позволила патогенетически обосновать вариабельность течения эндотоксемии и прогнозировать исход данного заболевания. Индукция или ингибирование синтеза изученных показателей не только характеризует токсичные эффекты ЛПС, но и выявляет восприимчивость к нему организма, его реактивность при столкновении с эндотоксином. Полученные результаты позволили сделать вывод, что к плохим прогностическим признакам при

эндотоксемии на фоне тяжелого состояния больного относятся высокий уровень ЛПС в сочетании с низким титром антител, низкой концентрацией ФНО и ИНФ-У, сниженным титром комплементарных белков и высокой эстеразной активностью плазмы.

3. Изучение терапевтической эффективности МоАТ к липиду А и механизма их влияния на течение и исход эндотоксемии проводилось в рандомизированном исследовании.

В исследование были включены 30 детей с эндотоксемией 1 степени тяжести (5 человек), 2 степени тяжести (15 человек), 3 степени тяжести (10 человек). У всех больных выявлялась вторичная грам-отрицательная инфекция. Клинически диагносцирован-ная эндотоксемия подтверждалась результатами ЬАЬ-теста и снижением относительного титра антител. Клинически отмечалась астения, стойкая лихорадка, не поддающаяся коррекции антибиотиками, тахикардия, тахипноэ, снижение АД,. смешанный ацидоз. Этому соответствовало повышение эстеразной активности ККС и признаки потребления комплементарных белков на фоне повышения продукции ФНО и ИНФ-У.

Всем больным проводилась инфузионная терапия, политерапия антибактериальными препаратами, которые корректировались в соответствии со спектром чувствительности выявляемог.о..возбуди-теля; коррекция метаболического ацидоза; экстракорпоральная детоксикация. На фоне проводимой терапии 15 больным вводились МоАТ к липиду А в дозе 1 мг/кг/день внутривенно капельно каждые 24 часа в течение 3 дней, другие 15 больных получали в адекватном режиме введения 5% раствор человеческого альбумина в качестве плацебо из расчета 1 мл/кг/день, что соответствовало объему вводимых антител. Группы больных формировались ран-домизированно. препараты вводились двойным слепым методом. Мо-

ниторирование состояния больных осуществлялось в 0,2,6 часов после каждого введения МоАТ к ЛПС или плацебо. Нами выявлено, что в результате проведенной терапии МоАТ состояние больных улучшалось к 3-4 дню от начала лечения, нормализовалась температура, стабилизировались показатели гемодинамики. Большая эффективность лечения была выявлена у больных с эндотоксемией 1 и 2 степени тяжести. У одного больного с эндотоксемией 3 степени тяжести отмечалось затяжное течение эндотоксемии с постепенным переходом к 1 степени тяжести. У детей, получавших плацебо, состояние ухудшалось. У 5 человек (33%) развился эндо-токсический шок, который явился причиной смерти этих больных (таблица N2).

Таким образом, применение МоАТ к ЛПС в лечении эндотоксемии у детей приводило к улучшению состояния больных, предотвращало развитие эндотоксического шока и летальность при этом состоянии.

Положительный терапевтический эффект использования МоАТ к ЛПС в лечении эндотоксемии коррелировал с ингибированием основных звеньев патогенеза эндотоксического шока и специфической нейтрализацией эндотоксина.

Введение МоАТ приводило к снижению уровня ЛПС в плазме больных. На фоне многократного введения МоАТ отмечались пики концентрации эндотоксина, отражающие эпизодическое повышение его уровня. Однако, каждый последующий пик концентрации эндотоксина был меньше предыдущего. Итоговое снижение плазменного уровня ЛПС< 0.05 ЕИ/мл свидетельствовало о достаточности суммарной дозы МоАТ к ЛПС для связывания эндотоксина. У больных плацебо группы уровень ЛПС прогрессивно наростал.

Исследование ТА к ЛПС показало наличие тесных взаимосвя-

зей между ТА и уровнем эндотоксина. Снижение ТА на фоне высокого содержания ЛПС характеризовало истощение антиэндотокси-ческого иммунитета в данных условиях. Введение МоАТ приводило к повышению ТА и снижению уровня эндотоксина в этот момент. Конечное стабильное повышение ТА до 98% являлось маркером создания терапевтической концентрации антиэндотоксических антител при выбранном режиме введения. У больных другой-группы введение плацебо не влияло на ТА к ЛПС. Их концентрация оставалась низкой и сочеталась со стабильно высоким уровнем ЛПС и тяжелым состоянием больных.

Выявленная закономерность позволила сделать вывод о том. что введение МоАТ к ЛПС позволяет провести экстренную иммунизацию больных и повысить уровень антиэндотоксической защиты организма.

В связи с ведущей ролью ФИО в реализации токсических эффектов эндотоксина мы изучали влияние МоАТ к липиду А на активность синтеза этого медиатора при эндотоксемии у детей.

Активность синтеза ФИО у больных с эндотоксемией различной степени тяжести варьировала. При эндотоксемии 1 степени тяжести последующие пики концентрации ФИО были намного ниже первоначального, их формирование легко ингибировалось троект-ратным введением МоАТ. При эндотоксемии 2 степени тяжести каждый последующий пик концентрации ФИО был в 2 раза выше предыдущего и третье введение МоАТ также обрывало синтез цитокина. При 3 степени тяжести эндотоксемии пики концентрации ФНО превышали исходный уровень в 9 раз. В этом случае цикличность синтеза ФНО плохо ингибировалась введением МоАТ к липиду А. что, возможно, в некоторой степени обуславливало неблагоприятный прогноз при этой степени тяжести эндотоксемии.

Таблица N 2

Динамика клинико-лабораторных показателей состояния больных

с эндотоксемией

Показатели

Время (час) от момента введения МоАТ к липиду АII

О

24

48

72

39. 2±0. 4 || 38.8+0.3 39, 0±0, 7 || 39, 3+0. 2

37.8+0.1 II 36.0i0.15 || 39,5+0,17 || 39,7+0,31 ||

ЧСС

ударов в мин.

160±7.5 || 143+9.1 145+5,5 || 155±7,8

118+5.3 || 92±8.4 И 164±3,9 || 176±9,7 ||

ЧД

дых. в мин.

40+8.3 II 36+3. 1 42±5,4 II 40±4, 9

32±6.3 1 " 28+2. 2 39±7,2 || 42+4,3

II

105/70 | 80/40 ||

АД

мм.рт. ст.

90/50 || 95/60 85/55 || 85/50

100/65 90/45

ЛПС Еи/мл

0. 18±0. 003110. 12+0. 007 0,14±0, 01 ||0,164+0,017

0.09+0.00311 < 0.05 II

0,169±0, 013И0,186±0,022||

Титр антител к ЛПС (%)

68.67+3.8 || 73.16+4.27 69±4,3 || 68±3.7

82. Ю±3.7 || 98±2.9 || 60,18±2,8 || 60+1,3 ||

е—=——а

11.72+1. 1 II О | 299±15,2 II 450±16,7 |

ФНО пг/мл

196. 3±7.3 || 122.4+5.7 143, 9±.5, 2 || 80±3, 8

ИНФ-У ПГ/МЛ

120±5.8 || 80±4.9 126+7,1 || 250±6, 7

68.75±4.4 78±6,3

50+6.7 130±9,78

р < 0, 05

в числителе - показатели состояния больных, получавших мо-ноклональные антитела к липиду А, в знаменателе - состояние больных из плацебо-группы

При введении плацебо у больных второй группы мы наблюдали динамическое повышение уровня ФИО, которое сочеталось с высоким содержанием ЛПС в плазме больных и их тяжелым состоянием.

Синтез ФИО при персистирующей эндотоксемии осуществлялся с суточной цикличностью. Это. возможно, связано с периодом восстановления активности макрофагов/моноцитов в ответ на действие ЛПС. Первоначальный уровень ФИО отражает активность макрофагального ответа и является одним из прогностических факторов течения и исхода эндотоксемии. Введение МоАТ к ЛПС позволяет разорвать цикл выработки ФИО и, в итоге, снизить его уровень в сыворотке крови, что сочетается с улучшением состояния больных.

Таким образом сопоставление данных, отражающих динамический синтез ФНО при эндотоксемии на фоне введения МоАТ к ли-пиду А и плацебо, позволило предположить, что персистирующая эндотоксемия обуславливает суточную цикличность выработки этого медиатора. Введение МоАТ к липиду А обрывает этот цикл. Пики концентрации ФНО совпадали с пиками температурной кривой.

Одновременно с определением уровня ФНО у больных изучалась динамика ИНФ-Упри эндотоксемии на фоне терапии МоАТ к липиду А.

Введение МоАТ оказывало на ИНФ-Увлияние, аналогичное таковому на ФНО.

В течение первых двух часов его уровень снижался до 67,5+2.7 пг/мл (р<0,05), а потом вырастал в 4,5 раза (до 272+7,19 пг/мл) (р<0,05). Этот первый пик концентрации ИНФ-У совпадал с повышением ЛПС и ФНО. Второе введение МоАТ сопровождалось появлением второго пика концентрации ИНФ-^', который, однако, в 2,69 раза меньше первого и достигал 101,25+3,4 пг/мл

(р<0,05). По времени этот пик также соответствовал возрастанию уровня ФИО и ЛПС. Третье введение МоАТ приводило к стойкому снижению концентрации ИНФ-Удо 50+4,13 пг/мл.

У больных, получавших плацебо, показатели ИНФ-ЗГколебались с периодическим повышением и снижением его уровня в сыворотке больных. При этом на момент окончания наблюдения за больными сохранялась тенденция к повышению его концентрации до 120-130 пг/мл. Состояние детей оставалось тяжелым на фоне плавно нарастающего уровня ЛПС.

Очевидных различий в динамике уровня ИНФ-У между больными с различными степенями тяжести не было.

Таким образом,' введение МоАТ к липиду А сопровождалось циклической выработкой ИНФ-Уи приводило, в итоге, к стабильному снижению его концентрации в сыворотке крови больных, при котором наблюдалось улучшение их состояния.

Активация ККС при эндотоксемии приводит к развитию различных нарушений.ЛПС активирует ККС через протеолитические ферменты и плазмин. Ограничение протеазной активности является важной и сложной задачей при лечении эндотоксемии.

Мы изучали показатели ККС у больных эндотоксемией на фоне терапии МоАТ к липиду А в 1,2,3,4 дни от начала лечения.

Первичный анализ показал, что на высоте тяжести эндотоксемии происходит активация ККС, которая выражается в повышении суммарной эстеразной активности плазмы (СЭА) до 21,75+4,25 мкмоль/мл/час (на 64%) с одновременным повышением активности калликреина в 3-6 раз (до 311+0,74Ед/л) и снижением уровня прекалликреина (ПК) в 2,8 раз (24,5+0,96мкмоль/мл/час) по сравнению с нормой. Содержание ингибитора калликреина (ИК) Ио<1 -антитрипсина (о41-АТ) (0,44+0,24 ИЕ и 14,28±1.02 ИЕ/л соот-

ветственно) было снижено,а с<2-макроглобулина и2-МГ) - повышено по отношению к норме в 2 раза. Каждое введение МоАТ приводило к последовательному снижению СЗА плазмы, которая в итоге составляла 2,26+0,38 мкмоль/мл/час (при норме 13.2+0,9 мкмоль/мл/час). Этому сопутствовало снижение активности КК в 2 раза. Не исключено, что такое снижение протеазной активности было связано с потреблением ингибиторов протеаз. в результате чего отмечено уменьшение^-АТ ио<2-МГ в 2 раза каждого. Ингиби-рование протеаз при этом оставалось эффективным, что характеризовалось повышением содержания ИК также в 2 раза. Уровень ПК при этом снижался незначительно. Такое увеличение содержания ИК, возможно, было связано с активацией системы комплемента, первый компонент которой С1 и описывается как С1-ингибитор калликреина (Со1-тпп, 1983). Не исключена ведущая роль ИК в подавлении протеазной активности плазмы на фоне его высокого содержания в крови. При этом потребление других ингибиторов может снижаться.

Дальнейшее введение МоАТ сопровождалось увеличением содержания ПК до 34,44±0,9 мкмоль/мл/час ' на фоне дальнейшего роста ИК до 1,37+0,26 ИЕ. Возможно, что в этой ситуации ИК препятствовал расходованию ПК на образование КК. Однако, к третьему дню активность КК возросла до прежнего уровня одновременно с повышением содержания»<2-МГ до 5,03±0,06 ИЕ/л. Скорее всего, их одновременное повышение было связано с разрушением комплексов '^2-МГ+КК" и высвобождением отдельных компонентов этой системы. С другой стороны, сами образующиеся иммунные комплексы МоАТ с ЛПС могут активировать кинин-калликреиновую систему. На фоне этого содержаниеЛ-АТ продолжало плавно снижаться.

У больных, получавших плацебо, также отмечалась высокая протеолитическая активность ККС в начале наблюдения. В дальнейшем на фоне введения плацебо КК резко возрастал до 389,48+79 Ед/л и сохранялся на этом уровне в течение всего периода наблюдения. Увеличению активности КК сопутствовало снижение уровня ПК до 14,32+1,4 мкмоль/мл/час, который, очевидно, расходовался в процессе активации. Содержание ИК несколько увеличивалось, однако, оставалось ниже нормы (0,8±0,36 ИЕ). Высокое содержание р(1-АТ (58,07±1,87 ИЕ/л) и<<2-МГ (6.23±.0,06 ИЕ/л) обеспечивало снижение СЭА плазмы до 4,88±0,9 мкмоль/мл/час.

Резюмируя вышесказанное, представляется очевидным, что введение МоАТ к ЛПС снижает протеолитическую активность ферментов ККС и может являться опосредованным специфичным методом коррекции нарушений гемостаза на фоне ДВС-синдрома.

Система комплемента, тесно связанная с различными явлениями патогенеза эндотоксического шока, также подвергалась воздействию МоАТ. Их введение приводило к активации потребления комплементарных белков С1, С2, СЗ, С4, С5, ИВ в 1,5 раза в первые часы после инфузии препарата. Однако, в дальнейшем происходило повышение их титра в 1,8 раза, которое могло быть объяснено как снижением их потребления, так и активацией их синтеза, что представляется более вероятным. Улучшение состояния больных сочеталось с высокой реактивностью системы комплемента при действии МоАТ, повышением синтеза ее белков и отсутствием признаков истощения альтернативного пути активации, что характеризовало благоприятный исход...... —

Тип реагирования комплементарных белков у больных с эндо-токсемией 1 и 2 степени тяжести идентичен, но у детей со 2

степенью носит более активный характер и коррелирует с благоприятным прогнозом.

Отсутствие мобильности в реактивности данной системы у детей с эндотоксемией 3 степени тяжести в ответ на введение МоАТ к липиду А сочеталось с неблагоприятным прогнозом течения эндотоксемии.

Введение плацебо не оказывало заметного влияния на титр комплементарных белков. Их содержание постепенно снижалось до 0-1 и сочеталось с тяжелым состоянием больных.

На основании комплексного анализа полученных данных можно сделать вывод о перспективности использования МоАТ к липиду А в лечении эндотоксемии у детей.

Проведение унифицированной 'патогенетически обоснованной характеристики степеней' тяжести эндотоксемии может лечь в основу разработки адаптированных доз, режимов и сроков введения препаратов с повышенным содержанием антител к ЛПС в соответствии с реактивностью организма, состоятельностью антиэндо-токсической защиты, уровнем ЛПС, давностью возникновения и вероятностью развития эндотоксемии при данной патологии.

ВЫВОДЫ!

1. Комплексная клинико-лабораторная диагностика эндотоксемии у больных тяжелыми формами грам-отрицательной инфекции указывает на многофакторность звеньев ее патогенеза. В развитии клинических симптомов эндотоксемии в равной степени участвуют такие медиаторы инфекционного процесса, как фактор некроза опухоли, интерлейкин-1, интерферон-,*", белки системы комплемента, компоненты кинин-калликреиновой системы.

2. Вариабельность течения и исход эндотоксемии дозозависимым образом коррелируют с уровнем ЛПС в плазме больных и находятся в прямой зависимости от титра антител к ЛПС, а также интенсивности неспецифического иммунного ответа организма на поступление эндотоксина (титр белков системы комплемента, уровень ФИО и ИНФ-Л.

3. Наиболее тяжелые формы эндотоксемии развиваются в результате резорбции эндотоксина из брюшной полости или с раневой поверхности на фоне таких заболеваний как острый перитонит, инфицированные ожоги, синдром длительного раздавливания.

4. Экспериментальная модель эндотоксемии продемонстрировала взаимосвязанный синтез медиаторов эндотоксического шока при ишемии тонкой кишки. Моноклональные антитела к липиду А, связывая эндотоксин, обладают ингибирующим действием на синтез ФНО и ИЛ-1 и предотвращают развитие эндотоксического шока у собак.

5. Рандомизированное клиническое исследование эффективности моноклональных антител к липиду А грам-отрицательных бактерий при эндотоксемии у детей выявило их способность связывать ЛПС и. тем самым, опосредованно подавлять основные звенья патогенеза эндотоксемии: активацию синтеза цитокинов макрофагами, потребление белков системы комплемента, повышение активности кинин-калликреиновой системы.

6. Тип реагирования отдельных компонентов иммунной системы, таких как ФНО, ИНФ-У, белки системы комплемента, на проведение направленной иммунотерапии характеризует протективную способность организма хозяина и коррелирует со степенью тяжести и прогнозом эндотоксемии.

7. Использование МоАТ к липиду А грам-отрицательных бактерий -безопасный и эффективный метод лечения эндотоксемии при тяжелых инфекциях у детей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. При диагностике эндотоксемии с целью прогнозирования ее течения и исхода рекомендуется проводить выделение степеней тяжести на основании следующих критериев: уровня ЛПС в плазме больных, титра антиэндотоксических антител в сыворотке больных, концентрации ФНО и ИНФ-У, а также степени активации кинин-калликреиновой системы и интенсивности потребления белков системы комплемента в сочетании с тяжестью клинических проявлений эндотоксемии на фоне первичной патологии.

2. Отсутствие эффекта базисной терапии грам-отрицательной инфекции. выявление ранних признаков эндотоксемии на фоне сниженного более чем до 80% от контрольного пула титра антител к ЛПС являются показаниями для немедленного включения моноклональных антител к липиду А в комплекс лечебных мероприятий.

3. Курсовая доза моноклональных антител к липиду А в 3 мг/кг массы тела больного позволяет достичь терапевтической концентрации антиэндотоксических антител в сыворотке больных.

4. Введение моноклональных антител к липиду А рекомендуется проводить внутривенно капельно в течение 20 минут по 1 мг/кг массы тела больного с интервалом 24 часа в течение 3 последовательных дней с момента установления диагноза эндотоксемии.

5. Положительная динамика клинико-иммунологических показателей состояния больного является критерием эффективности проведенной направленной иммунотерапии.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Использование моноклональных антител к липополисахари-ду при эндотоксическом шоке у детей. - Тезисы к докладу. Конференция "Актуальные вопросы химиотерапии бактериальных инфекций", ЦНИИ эпидемиологии , г.Москва. 1991г., стр.554-555, ( с соавт.).

2. Эндотоксин в клинике и эксперименте (литобзор). -"Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии", 1992г., N8. (с соавт.).

3. Использование моноклональных антител к липиду А для коррекции гемодинамических нарушений при эндотоксемии. -Ж."Гематология и трансфузиология", 1992г.,N12.(с соавт.).

4. Клинико-патогенетическая характеристика эндотоксемии -Ж."Материнство и детство", 1992г., N10-11, стр.11-14. ( с соавт.).

5. Эндотоксемия при краш-синдроме. - Ж."Хирургия".(принято в печать). ( с соавт.).

6. Use of МоАВ to the LPS In the Treatment of Endotoxemia In the Patients with the Crush-Syndrom. - 18th international Congress of Chemotherapy, Stockholm, Sweden. 1993, p.308. (with coauthor).

7. Изменения активности калликреин-кининовой системы крови у больных с грам-отрицательной инфекцией. - Ж."Материнство и детство", (принято в печать). ( с соавт.).

8. Роль интерлейкинов в патогенезе эндотоксемии. (литобзор). - Ж. "Материнство и детство" (принято в печать), (с соавт.).

9. Использование моноклональных антител к липиду А как нового метода терапии у больных с синдромом длительного сдавле-ния. - Ж."Материнство и детство", (принято в печать), (с соавт.).

10. Использование моноклональных антител к липополисаха-риду с целью коррекции цитокиновой активности при эндотокси-ческом шоке в остром эксперименте. - Ж. "Материнство и детство", (принято в печать), (с соавт.).

11. Monoclonal Antibodies to lipid A as a New Compound of Postoperative Therapy In Pediatric Acute Peritonitis. International Conference on Pharmacoepidemiology. 1994, Stockholm, Sweden. ( with coauthor).

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ:

АД - артериальное давление ИК - ингибитор калликреина ИЛ-1 - интерлейкин-1 ИНФ-И - интерферон-гамма КК - калликреин

ККС - кинин-калликреиновая система ""

КЩС - кислотно-щелочное состояние

ЛИИ - лейкоцитарный индекс интоксикации

ЛПС - липополисахарид

МоАТ - моноклональные антитела

ПК - прекалликреин

ПГФ - простагландин Ф

б-кето-ПГФ-1о<. - б-кето-простагландин-1-альфа ПД - пульсовое давление РИА - радиоиммунный анализ

РИБК - реакция иммобилизации бактериальных колоний

СЭА - суммарная эстеразная активность

ТА - титр антител

ФНО - фактор некроза опухоли

ЦВД - центральное венозное давление

ЧД - частота дыхания

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЬАЬ-тест - Пгш1из ашоеЬосу1е lysate - тест ы. 1-АТ - альфа-1-антитрипсин о(.2-МГ - альфа-2-макроглобулин Упк - скорость портального кровотока.