Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Использование метода полимеразной цепной реакции в системе санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами

На правах рукописи

ЛАВРОВА ДАРЬЯ ВИЛЬЯМОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В СИСТЕМЕ САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ РАЗЛИЧНЫХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ ЭНТЕРОВИРУСАМИ

14.00.07 - гигиена

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (лаборатория санитарной микробиологии и паразитологии).

Научный руководитель:

Кандидат медицинских наук

Недачин Александр Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Мамонтова Лилия Михайловна

доктор медицинских наук, профессор

Журков Вячеслав Серафимович

Ведущая организация:

ГУ Научный центр медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН г. Иркутск

Защита состоится 10 ноября 2005г. в 11 часов на заседании

Диссертационного Совета Д 001.009.01 в ГУ НИИ экологии человека и

гигиены окружающей среды им. А.НСысина РАМН по адресу: 119992, г Москва, ул Погодинская, 10/15, стр.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН

Автореферат разослан " 2005г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук

Н.Н.Беляева

2006 - <

Af-^^1/

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема обеспечения эпидемической безопасности населения России при различных видах водопользования является приоритетной государственной задачей в системе предупредительного санитарно-эпидемиологического надзора (Рахманин Ю.А., 2005, Онищенко Г.Г., 2005). Будучи одним из ведущих в реализации кишечных вирусных инфекций, водный путь передачи в настоящее время является одним из основных в формировании спорадической и вспышечной заболеваемости (НедачинА.Е., 2005, Савилов Е.Д., Мамонтова JI.M., 2005).

Согласно действующим в нашей стране нормативным документам водно-санитарного законодательства, эпидемическая безопасность водных объектов в отношении кишечных вирусных инфекций обеспечивается отсутствием патогенных вирусов в воде Отсутствие до настоящего времени мер специфической профилактики в отношении большинства кишечных вирусных инфекций диктует необходимость совершенствования неспецифических мер, ограничивающих циркуляцию вирусов в объектах окружающей среды, важной составляющей которых является контроль за циркуляцией вирусов в окружающей среде.

Для индикации цитопатогенных вирусов, распространяющихся водным путем, в практической лабораторной службе используется метод их выделения на чувствительных культурах клеток. Однако данный метод имеет ряд недостатков, снижающих его практическую значимость: длительность процесса (3-4 недели), невозможность выделения нецитолитических и поврежденных вирусных агентов, не способных вызывать продуктивную цитолитическую инфекцию в системе in vitro, но, тем не менее, представляющих эпидемическую опасность для живого организма (Амвросьева ТВ., 2002). Эти проблемы, возникающие при изучении вирусологического качества вод различных водных объектов, могут быть решены путем использования метода детекции РНК энтеровирусов, представляющего собой полимеразную цепную реакцию с

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР), который позволяет в течение 12-24 часов обнаружить в исследуемом материале энтеровирусную РНК (Reynolds К .А., 2004).

Цель работы: разработка научно обоснованной схемы санитарно-вирусологического контроля качества воды водных объектов на основе индикации вирусов с помощью метода полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).

Основные задачи диссертационной работы:

1. Разработать оптимальные режимы элюции энтеровирусов с целью обеспечения высокой эффективности их последующей индикации методом ОТ-ПЦР из проб воды;

2 Разработать эффективный метод выделения РНК энтеровирусов из концентратов проб поверхностных и сточных вод;

3. Отработать методику ОТ-ПЦР, интегрированной с культурой клеток (ИКК ОТ-ПЦР), для индикации РНК цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды;

4. Провести сравнительную оценку методов индикации вирусного загрязнения воды при ее обеззараживании с использованием культурального, ОТ-ПЦР, ИКК ОТ-ПЦР и метода выделения колифагов;

5. Апробировать используемые методы на натурных объектах в условиях вспышечной заболеваемости и в межэпидемический период;

6. Разработать схему санитар но-вирусологического контроля с использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР.

Научная новизна работы. Впервые

разработан эффективный метод выделения РНК энтеровирусов из концентратов проб поверхностных и сточных вод;

- разработана комплексная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами с использованием метода ИКК ОТ-ПЦР;

- разработана комплексная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды энтеровирусами при ее обеззараживании с использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР;

- проведена сравнительная оценка методов индикации вирусного загрязнения воды при ее обеззараживании с использованием культурального, ОТ-ПЦР, ИКК ОТ-ПЦР и метода выделения колифагов.

Практическая значимость работы: материалы исследований использованы при разработке: МУК 4.2 2005 "Методические указания по санитарно-вирусологическому контролю водных объектов окружающей среды" и МУК 2.1.5 2005 "Санитарно-вирусологический контроль эффективности обеззараживания питьевых и сточных вод УФ-облучением".

Основные положения, выносимые на защиту

-разработанная схема санитарно-вирусологического контроля с использованием метода ИКК ОТ-ПЦР для индикации РНК цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды различных водных объектов;

- разработанная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды энтеровирусами при ее обеззараживании с использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР;

- разработанный метод выделения РНК из концентратов проб поверхностных и сточных вод для эффективного устранения ингибиторов ОТ-ПЦР;

- экспериментальное обоснование применения метода ИКК ОТ-ПЦР при санитарно-вирусологическом анализе проб воды, обработанных дезинфектантами.

Апробация работы: материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях молодых ученых "Развитие научного творчества молодежи -объект постоянного внимания В.А.Рязанова", (Москва, 2003) и "Окружающая среда и здоровье" (Суздаль, 2005), на международном конгрессе ЭКВАТЕК-2004 "Вода: экология и технология" (Москва, 2004), на пленуме

"Современные проблемы медицины окружающей среды" (Москва, 2004), на II форуме "Питьевые воды России 2005" (Москва, 2005) и на международном форуме "Мир чистой воды - 2005" (Москва, 2005).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 11 печатных работ и 3 приняты в центральную печать.

Объем и структура диссертации: диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав собственных исследований, главы обсуждения и выводов. Список использованной литературы содержит 155 источников, из них 36 отечественных и 119 иностранных авторов. Диссертация включает 11 таблиц, 10 рисунков и 2 приложения.

ОБЪЕМ МАТЕРИАЛОВ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При проведении экспериментальных исследований были использованы модельные штаммы полиовируса I типа (штамм LSc2ab), полученный в НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.И. Чумакова РАМН и РНК-содержащий колифаг MS-2 (штамм РН 1505), в качестве лизабельной бактериальной культуры использовали E.coli 3254 (штамм К 12 F+ Str8), полученные в ГНИИ Генетика - Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов. Тест-микроорганизмы использовали, в зависимости от задач исследований, в следующих концентрациях: вирус полиомиелита: 101 - 103 ТЦД50/мл и фаг MS-2: 101 - 104 БОЕ/мл.

Объектами исследования были дехлорированная водопроводная, речная, подземная и сточная воды из различных климато-географических зон РФ. Пробы водопроводной воды отбирали из водоразборного крана московской городской водопроводной сети в стерильные широкогорлые бутыли и оставляли при комнатной температуре на 24 часа для удаления свободного хлора. Пробы поверхностных, подземных и питьевых вод отбирали в городах Домодедово, Ступино, Чехов, Подольск, Калуга, Рязань, Тольятти, Серпухов и Протвино. Пробы сточной воды отбирали на Курьяновской станции аэрации.

Пробы исследовали на наличие энтеровирусов в культуре клеток, РНК энтеровирусов методом ОТ-ПЦР, РНК энтеровирусов методом ИКК ОТ-ПЦР, РНК ВГА методом ОТ-ПЦР и колифагов.

Концентрирование вирусов из вод различного вида осуществляли на макропористом стекле (МПС-1000 ВГХ), на ионообменной смоле АВ 17-8 и фильтрующей мембране ММК (Брок Т, 1987, Санамян А., 2005).

Выделение цитопатогенных вирусов из концентратов исследуемых проб проводили заражая перевиваемые линии культуры клеток RD и BGM по общепринятым вирусологическим методикам Количественное определение вирусов проводили, заражая культуру клеток, используя метод конечного разведения по Риду и Менчу (1982) При качественной оценке по ЦПД проводили 3 пассажа на культуре клеток Результат считался отрицательным, если в 3-х пассажах отсутствовал цитопатический эффект.

Выделение и количественный учет колифагов проводили в соответствии с МУК 1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".

Наличие РНК энтеровирусов методом ОТ-ПЦР в элюатах определяли, используя коммерческие тест-системы "АмплиСенс Enterovirus-20T\ производимые Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии МЗ РФ Наличие РНК определяли методом афинной сорбции на частицах силикагеля (Boom R, 1990), используя для выделения РНК комплект "РИБО-сорб" и методом гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции (Chomczynski, Р.,1987), используя комплект для выделения "РИБО-золь".

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ STATISTICA for Windows. Объем проведенных исследований представлен в Таблице 1.

Таблица 1

Объемы выполненных санитарно-вирусологических исследований

Направление исследования Объекты и методы Объем исследований

К-ра клеток ОТ-ПЦР икк ОТ-ПЦР ВГА Фа ги Все го

Чувствительности используемых методов РУI 140 88 88 - - 316

Оценка элюирующих растворов Водопров. вода 192 864 - - - 1056

Отработка метода выделения РНК Поверхнос тные воды 144 - - - 288

Сточные 144 - - -

ОТ-ПЦР- анализ воды, обработанной дезинфектантами Водопрово дная вода 532 144 200 180 1056

Апробация методов в натурных условиях Поверхн 204 272 340 272 340 1428

Подземные 330 440 550 440 550 2310

Сеть 120 160 200 160 200 840

Итого 1518 2256 1378 872 1270 7294

Примечание: "-" - исследование не проводилось

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Использование метода ОТ-ПЦР, интегрированной с культурой клеток, для индикации РНК цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды

В настоящее время стандартный метод для определения энтеровирусов в образцах окружающей среды (ОС) включает культуральный анализ, который является очень дорогостоящим и длительным. Для выявления энтеровирусов на культуре клеток требуется проведение 3-7 циклов пассажей. Это приводит к позднему проведению профилактических гигиенических мероприятий, в результате чего последние не достигают необходимого эффекта. Альтернативным методом для индикации энтеровирусов в пробах ОС является

ОТ-ПЦР. Нами была проведена сравнительная оценка чувствительности культурального метода (культура клеток BGM) и ОТ-ПЦР. Результаты исследования показали, что чувствительность культурального метода при индикации полиовирусов совпадает с таковой для детекции РНК полиовирусов методом ОТ-ПЦР. Однако выявление РНК методом ОТ-ПЦР в классической постановке не свидетельствует о цитопатогенной природе вирусов, контаминирующих воду.

Для определения цитопатогенности энтеровирусов, выделяемых из воды, мы предлагаем за основу взять метод ОТ-ПЦР, интегрированный с культурой клеток (ИКК ОТ-ПЦР), разработанный. Reynolds А.,1996.

3

Сутки

Индикация энтеоовируов методом ИКК ОТ-ПЦР

Индикация энтеровируов методом заражения культуры клеток

Рис.1 Сравнительная чувствительность культурального метода и ИКК ОТ-ПЦР.

В экспериментальных условиях мы провели сравнительную оценку чувствительности культурального метода и ИКК ОТ-ПЦР (рис.1).

Было установлено, что использование ИКК ОТ-ПЦР (черная полоса) позволяет обнаружить РНК энтеровирусов уже на 1 -й лепт, после заражения при концентрации энтеровирусов 10°п - 103п ТЦДбо/мл и на 2-й день при концентрации 10"'п ТЦД50/МЛ, в то время как на культуре клеток (серая полоса) индикация энтеровирусов наблюдалась на 2-й день при концентрации 102п -103п ТЦД50/МЛ и на 4-й день при концентрации 10°п - Ю'п ТЦД50/мл.

При использовании метода ИКК ОТ-ПЦР энтеровирусы были обнаружены методом ОТ-ПЦР-анализа лизата клеток культуры как до, так и после проявления цитопатического эффекта (ЦПЭ).

Таким образом, показано, что комбинированная (ИКК ОТ-ПЦР) методика позволяет быстрее (2 сут.), чем только на культуре клеток (4 сут.), определить наличие энтеровирусов в низких концентрациях в пробах воды. Быстрота такого анализа представляет особую значимость при работе на вспышках инфекций, передающихся водным путем, для определения их этиологии и быстрого применения гигиенических неспецифических мероприятий. Метод ИКК ОТ-ПЦР явился также и более чувствительным, чем культуральный метод. Как показали результаты эксперимента (рис.1), чувствительность ИКК ОТ-ПЦР на порядок превышает таковую культурального метода.

Отработка метода выделения РНК из концентратов сточных вод и вод поверхностных водоисточников

На втором этапе исследований нами была проведена модификация метода выделения РНК из концентратов сточных вод и вод поверхностных водоисточников.

При ОТ-ПЦР-анализе проб воды с высокой степенью загрязнения источником ингибирования ОТ-ПЦР является концентрат такой пробы, содержащий в концентрированном виде вещества, ингибирующие ОТ-ПЦР. Классические методы выделения РНК часто не позволяют избавиться от ингибиторов ОТ-ПЦР.

При использовании фенол-хлороформной экстракции, как метода выделения РНК, на электрофореграмме наблюдалось отсутствие как специфических полос кДНК энтеровирусов, так и специфических полос кДНК внутреннего контроля, что говорит о полном ингибировании ОТ-ПЦР в каждой пробе.

При выделении РНК методом сорбции на частицах силикагеля отчетливый сигнал амплификации наблюдался только в 20% проб воды. Мы объединили 2 этих метода. На примере анализа сточных вод и вод поверхностных водоисточников было показано, что такая комбинация является более эффективной в отношении устранения ингибиторов ОТ-ПЦР, чем оба метода, используемые по отдельности Так, при использовании комбинированного метода на электрофореграмме в дорожках положительного контрольного образца и внутреннего контрольного образца отмечаются четкие полосы кДНК энтеровирусов, свидетельствующие о наличии в пробах энтеровирусов и отсутствии ингибирования ОТ-ПЦР во всех пробах.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что при санитарно-вирусологическом исследовании проб с высокой степенью загрязнения методом ОТ-ПЦР оптимальным является этап выделения РНК, представляющий собой комбинацию 2-х классических методик (фенол-хлороформной экстракции и сорбции на частицах силикагеля).

Изучение оптимальных режимов элюции энтеровирусов для обеспечения высокой эффективности их последующей детекции методом ОТ-ПЦР

Органические и неорганические комплексы элюентов могут содержать ингибирующие вещества, которые должны быть удалены в процессе подготовки пробы к проведению реакций ОТ и ПЦР. Поэтому необходимо использовать такие элюенты, чтобы ОТ-ПЦР проводилась наиболее эффективно.

При изучении процессов десорбции вирусных частиц с сорбентов и мембран был апробирован целый ряд элюирующих растворов' фосфатный

буфер (рН 8,2), 3 % мясной экстракт на трис-буфере (рН 9,5), 0,05 М глициновый буфер (рН 11), физиологический раствор (рН 8,3) и мясо-пептонный бульон (МПБ) (рН9,5) Данные элюенты были выбраны нами исходя из того, что все они широко применяются в вирусологической практике, и ни один из них не проявляет токсического действия на культуру клеток. Для определения эффективности различных элюентов применительно к ОТ-ПЦР мы использовали 2 метода концентрирования воды, зараженной полиовирусом: на колонках с ионообменной смолой АВ 17-8 и на фильтрационном аппарате с мембранным фильтром ММК Первый метод мы выбрали как наиболее простой и доступный санитарно-эпидемиологическим службам, второй - как наиболее эффективный в отношении концентрирования вирусов (Санамян А.Г , 2005).

Эффективность элюции при концентрировании полиовирусов на колонках с ионообменной смолой АВ 17-8 и на фильтрационном аппарате с мембранным фильтром ММК представлена в табл.2

Табл. 2.

Эффективность элюции при концентрировании полиовирусов на колонках с ионообменной смолой АВ 17-8 и на фильтрационном аппарате с мембранным фильтром ММК

Элюент Эффективность элюции, %

ионообменная смола АВ 17-8 Мембранный фильтр ММК

0,5М фосфатный буфер (рН8,2) 39,1 40,0

3 % мясной экстракт на трис-буфере (рН9,5) 27,6 85,7

0,05М глициновый буфер (РН11,0) 20,7 85,7

Физиологический раствор (РН8,3) 34,5 28,5

МПБ (рН9,5) 20,7 71,4

Во всех сравниваемых парах статистически достоверных различий по критерию Манна-Уитни в эффективности элюции, проводимой данными элюентами с ионообменной смолы, не наблюдалось (р>0,05). При

концентрировании на мембранном фильтре выявлены статистически достоверные различия в эффективности элгоции (р<0,05) фосфатным буфером, мясным экстрактом, глициновым буфером и МПБ.

Для выявления элюента, проявляющего наименьший ингибирующий эффект в отношении ОТ-ПЦР, был проведен ОТ-ПЦР-анализ элюатов, полученных после концентрирования на ионообменной смоле и на мембранном фильтре. На электрофореграмме во всех элюатах наблюдался четкий сигнал кДНК энтеровирусов, что свидетельствует об отсутствии ингибиторов в используемых элюентах, и все они в равной мере могут быть использованы для индикации энтеровирусного загрязнения воды методом ОТ-ПЦР. Поэтому нами предложено для дальнейших исследований использовать 3% мясной экстракт на трис-буфере (рН 9,5), так как данный элюент обладает наиболее высокой эффективностью элюции и щадящими свойствами в отношении вируса и, что особенно важно при проведении вирусологических исследований, в отношении культуры клеток и ОТ-ПЦР.

Сравнительная оценка методов индикации вирусного загрязнения воды при ее обеззараживании с использованием культурального, ОТ-ПЦР, ИКК ОТ-ПЦР и метода выделения колифагов

Задачей этого исследования было оценить возможность использования метода ОТ-ПЦР, ИКК ОТ-ПЦР, культурального метода и колифагов при обеззараживании воды для индикации вирусного загрязнения на примере использования УФО, хлора, и УФО в сочетании с хлором.

Исследования проводились с использованием полиовируса I типа (штамм Ь8с2аЬ) и РНК-содержащего фага М8-2 В первой серии экспериментов пробы водопроводной дехлорированной воды облучали УФ в дозах 16, 25, 45, и 60 мДж/см2. Во второй серии пробы воды, обработанные хлором в концентрации 0,5 мг/л свободного остаточного хлора (время контакта 30 минут), облучали УФ в дозах 16, 25 и 45 мДж/см2. В третьей серии экспериментов пробы

дехлорированной водопроводной воды обрабатывали хлором в дозах 0,5; 1,0 и 1,5 мг/л свободного остаточного хлора (время контакта 30 минут).

Результаты исследования показали, что во всех сериях эксперимента с хлором (хлор и УФО, и хлор в различных дозах) всеми используемыми методами была показана инактивация энтеровируса, фага МБ-2 и отсутствие РНК полиовируса.

В вариантах опыта с УФО (табл.3) в ОТ-ПЦР РНК полиовируса определялась при воздействии доз от 16 до 45 мДж/см2.

ТаблицаЗ.

Инактивация фага МБ-2 и полиовируса I типа при различных дозах УФ излучения

№ Доза УФ Фаг РУв РУ в пассажах РНКРУ

в МБ-2 тщы

мДж/см2 в БОЕ/ 100мл 100мл

I II III ОТ-ПЦР ИКК ОТ-ПЦР

1 Контроль 203 9,8x102 + + + + +

2 415 8,1х102 + + + + +

3 16 16 69 + + + + +

4 18,3 43 + + + + +

5 25 0 0 - - + + +

6 6 0 - - + + +

7 45 0 0 - - + + +

8 0 0 - - + + +

9 60 0 0 - - - - -

10 0 0 - - - - -

Для подтверждения цитолитической активности полиовируса проводили ИКК ОТ-ПЦР-анализ, который показал наличие цитопатогенного полиовируса в этих пробах (время анализа 3 дня). Эти данные были подтверждены также и анализом на культуре ткани, но только после проведения 3-х пассажей (21

день). Было также показано, что фаги вегетировали в пределах от 16 до 25 мДж/см2.

Таким образом, нами показано, что метод ИКК ОТ-ПЦР может быть использован при контроле эффективности действия дезинфектантов на энтеровирусы, содержащиеся в воде.

Апробация методов ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР на натурных объектах в условиях вспышечной заболеваемости и в межэпидемический период

Был проведен санитарно-вирусологический анализ поверхностных, подземных и питьевых вод в городах Домодедово, Ступино, Чехов, Подольск, Калуга, Челябинск, Адлер и Туапсе в отсутствие вспышечной заболеваемости населения кишечными вирусными инфекциями.

Исследование проб воды распределительной сети на культуре клеток показало отсутствие энтеровирусов, в этих пробах также не была обнаружена РЖ методом ОТ-ПЦР (рис.2). Тем не менее, методом ИКК ОТ-ПЦР, обладающим более высокой чувствительностью, в пробах воды распределительной сети удалось обнаружить РНК энтеровирусов (в 2-х пробах из 20). Частота обнаружения колифагов для всех типов водоисточников была выше, чем для энтеровирусов.

Кроме того, в пробах воды из р Лопасни (г.Чехов) и в скважине №3 (г.Подольск) была обнаружена РНК ВГА за 1 месяц до начала вспышки заболеваемости вирусным гепатитом А среди населения в гг. Серпухов и Протвино (Недачин А.Е. с соавт., 2001).

80 i 70 -60 50 -

30 20 -10 -0

Культура ОТ-ПЦР ИКК ОТ-ПЦР Колифаги клеток

■ Сеть ■ Подземный □ Поверхностный

Рис.2 Частота обнаружения энтеровирусов и колифагов в пробах воды в межэпидемический период.

Известно, что контаминация питьевой воды кишечными вирусами может стать причиной возникновения эпидемической ситуации. Примером этого послужил^ вспышка вирусного гепатита А в городах Серпухов и Протвино в 2001г. При этом прирост заболеваемости вирусным гепатитом А по сравнению с предыдущим годом составил 91%. На втором этапе исследования был проведен анализ воды поверхностных, подземных водоисточников, а также воды распределительной сети городов Протвино и Серпухов в период вспышки вирусного гепатита А среди населения.

Из данных литературы известно, что высокая выделяемость энтеровирусов из проб воды (Bosch А., 2001, Divizia М., 1999, Hejkal Т. 1982), как правило, сопровождает вспышки заболеваемости населения вирусным гепатитом А.

Исследование проб воды распределительной сети представляло наибольший интерес, т.к. именно в ней могли содержаться патогенные вирусные агенты, вызвавшие подъем заболеваемости населения. Из 20 проб воды распределительной сети в 5 была обнаружена РНК цитопатогенных энтеровирусов методом ИКК ОТ-ПЦР В 3-х пробах РНК энтеровирусов была

обнаружена в элюатах (методом ОТ-ПЦР), что указывает на контаминацию воды энтеровирусами в высоких концентрациях в этих пробах. Процент положительных проб на энтеровирусы в воде распределительной сети в ИКК ОТ- ПЦР составил 25,0, а в ОТ-ПЦР в классической постановке - 15,0% (рис

3).

Культура клеток

ОТ-ПЦР ИКК ОТ-ПЦР Колифаги

■ Сеть И Подземный □ Поверхностный

Рис.3 Частота обнаружения энтеровирусов и колифагов в пробах воды в период заболеваемости вирусным гепатитом А.

По усредненным данным по всем видам водоисточников на культуре клеток энтеровирусы обнаруживались в 19,6% проб. При ОТ-ПЦР-анализе частота обнаружения энтеровирусов составляет 17,6%, а при использовании метода ИКК ОТ-ПЦР она возрастает до 39,2%.

Показано, что частота обнаружения энтеровирусов в водах всех видов водопользования в условиях вспышечной заболеваемости населения вирусным гепатитом А выше, чем в межэпидемический период Также показано, что самая высокая частота обнаружения колифагов, энтеровирусов и РНК энтеровирусов наблюдается в поверхностных водоисточниках. Этот показатель снижается для

подземных водоисточников; в воде распределительной сети частота обнаружения энтеровирусов еще более низкая.

Для определения статистически достоверной связи между использованными методами был использован критерий Спирмена. Показано, что статистически достоверная связь существует (р<0,01) между всеми использованными методами (культуральтый метод, ОТ-ПЦР, ИКК ОТ-ПЦР, анализ колифагов).

Разработка схем санитарно-вирусологического контроля с использованием методов ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР

На основании проведенных исследований были разработаны комплексные системы санитарно-вирусологического контроля воды с использованием методов ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР.

Исследование проб воды поверхностных, подземных водоисточников, питьевых и сточных вод проводится по схеме путем анализа воды методом ИКК ОТ-ПЦР для обнаружения РНК цитопатогенных энтеровирусов (рис.4). При отрицательном результате ИКК ОТ-ПЦР-анализа проводится 3 последовательных пассажа на культуре клеток Пробы воды считаются положительными: при наличии РНК энтеровирусов методом ИКК ОТ-ПЦР (ОТ-ПЦР в лизатах культуры клеток через 2 суток после заражения) или при наличии ЦПД на культуре клеток в одном из 3-х последовательных пассажей.

Анализ проб воды, прошедшей обработку дезинфектантами, проводится по схеме (рис.5). Пробы воды исследуются на наличие колифагов и методом ОТ-ПЦР на наличие РНК энтеровирусов. Полученный на этом этапе результат считается положительным, если в пробе содержатся колифаги и РНК энтеровирусов. При отсутствии в пробе колифагов и наличии РНК или при наличии колифагов и отсутствии РНК энтеровирусов проводится заражение культуры клеток и ИКК ОТ-ПЦР. При отрицательных результатах анализа проводится три последовательных пассажа с целью выделения энтеровирусов.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что метод ИКК ОТ-ПЦР, внедренный в систему санитарно-вирусологического контроля, является более чувствительным, экспрессным и специфичным, чем используемые ранее методы, что позволяет быстро принимать управленческие решения по внедрению гигиенических мер по профилактике энтеровирусных инфекций.

Рис.4 Схема вирусологического контроля воды поверхностных и подземных водоисточников, питьевых и сточных вод

Положительный результат

Рис. 5. Схема вирусологического контроля воды после обеззараживания УФ-обработкой

* Л

а

21

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований по совершенствованию метода санитарно-вирусологического контроля воды, включающего определение РНК энтеровирусов методом ИКК ОТ-ПЦР, показано, что чувствительность метода ИКК ОТ-ПЦР выше культурального метода и составляет соответственно 10_1п ТЦД50/мли 10°п ТЦД50/мл.

2. Показано, что применяемые при различных методах концентрирования элюенты: фосфатный буфер (рН 8,2), 3 % мясной экстракт на трис-буфере (рН 9,5), 0,05 М глициновый буфер (рН 11), физиологический раствор (рН 8,3) и мясо-пептонный бульон (рН 9,5) не оказывали влияния на эффективность метода ОТ-ПЦР и не вызывали ингибирования ОТ-ПЦР, что позволяет использовать этот метод для индикации энтеровирусов, после элюирования всеми видами элюентов.

3. Разработан комбинированный метод выделения РНК из концентратов проб воды с использованием методов фенол-хлороформной экстракции и сорбции на частицах силикагеля с целью наиболее эффективного устранения факторов ингибирования ОТ-ПЦР при анализе проб воды с высоким уровнем загрязнения (поверхностных и сточных).

4. Показано, что использование метода ИКК ОТ-ПЦР позволяет сократить время анализа на наличие энтеровирусов в воде до 3 суток по сравнению с общепринятым методом выделения энтеровирусов на культуре клеток (21 сутки), что обеспечивает своевременное проведение профилактических гигиенических мероприятий.

5. На основании исследований, проведенных в натурных условиях, показано, что частота обнаружения цитопатогенных энтеровирусов, определенных методом ИКК ОТ-ГТЦР, превышает частоту обнаружения энтеровирусов при определении на культуре клеток и составляет 39,2 и 19,6% соответственно, что свидетельствует о более высокой эпидемиологической значимости метода ИКК ОТ-ПЦР по сравнению с культуральным методом.

6. Разработаны комплексные схемы санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами с использованием методов ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР, позволяющие сократить сроки проведения анализа и своевременно принимать профилактические противоэпидемические мероприятия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Недачин А.Е., Шипулин Г.А., Дмитриева P.A., Подколзин А.Т., Лаврова Д.В. Использование метода ПЦР для выявления гомологии между штаммами вируса гепатита А, выделенными из проб воды и клинических проб // Материалы Съезда Всерос. научно-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва 2002 , т.2, с. 138.

2.Недачин АЕ., Артемова Т.З., Талаева ЮГ., Иванова Л.В., Лаврова Д В Обоснование микробиологических показателей и критериев оценки качества воды источников питьевого водоснабжения // Материалы Междунар. Конгресса ЭКВАТЕК-2002, Москва, стр. 701.

3. Недачин А.Е., Доскина Т.В., Дмитриева P.A., Лаврова Д.В. Оценка значимости колифагов как косвенных показателей вирусного загрязнения воды подземных водоисточников // Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиене окружающей среды, Москва, 2002 - с. 162-167

4. Лаврова Д В.. Подколзин А.Т. Изучение циркуляции вирусной микрофлоры в воде различного вида водопользования // Материалы конференции "Развитие научного творчества молодежи - объект постоянного внимания В.А Рязанова", Москва 2003 - с.338-341

5. Недачин А.Е., Доскина Т.В., Дмитриева P.A., Санамян А.Г., Лаврова Д.В. Повышение качества питьевой воды и ее эпидемиологической безопасности в отношении вируса гепатита А и других энтеротропных вирусов. Закономерности циркуляции и современные методы индикации

вирусного загрязнения водных объектов // П Форум "Питьевые воды России - 2003" Москва, 2003 - с.67-68.

6. Лаврова ДВ.. Недачин А.Е. Изучение возможности использования ПЦР для контроля инфекционных энтеровирусов в пробах воды, прошедшей обработку УФО // II международная научно-практическая конференция аспирантов и молодых ученых "Экология и научно-технический прогресс", Пермь, 2003 - с. 128-129.

7. Недачин А.Е., Лаврова Д В.. Дмитриева P.A., Доскина Т.В , Шипулин Г.А., Чуланов В.П. Изучение циркуляции энтеровирусов в воде различного типа // VI Междунар. Конгресс ЭКВАТЕК-2004 (Вода' экология и технология), 2004 - часть 2, стр.786.

8. Лаврова Д.В. Новые подходы к индикации инфекционных энтеровирусов в пробах воды // ВНПК молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье" г.Суздаль, 19-22 мая 2005 - с.363

9. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Дмитриева P.A., Доскина Т.В., Иванова Л.В., Буторина Н.Н , Лаврова Д В . Санамян А Г, Ли Ю.В., Загайнова А В , Алешня В.В., Журавлев П.В., Головина C.B., Панасовец О.П., Савилов Е.Д., Мамонтова Л.М., Анганова Е.В. Обеспечение эпидемической безопасности питьевого водопользования населения России // Материалы пленума "Современные проблемы медицины окружающей среды" п/ред. академика РАМН Ю.А.Рахманина, Москва, 16-17 декабря 2004 - с. 29-33.

10. Недачин А Е., Дмитриева P.A., Доскина Т.В , Лаврова Д В . Санамян А.Г. Проблемы нормирования, контроля вирусного загрязнения воды как основа профилактики кишечных вирусных инфекций // VI-я научно-практическая конференция Международный форум "Мир чистой воды-2005" Москва 2005 - с.75-76.

11. Недачин А.Е., Дмитриева P.A., Доскина Т.В., Лаврова Д.В.. Санамян А Г Проблемы циркуляции, нормирования, санации и контроля питьевой воды в отношении вирусного загрязнения // II Форум "Питьевые воды России 2005" Москва, 2005 - с. 42-43.

Санамян А.Г., Дмитриева P.A., Доскина Т.В., Лаврова Д.В.. Недачин А.Е. Использование мембранного модуля МФМ 0142 для концентрирования вирусов при санитарно-вирусологическом контроле водных объектов // "Гигиена и санитария" (в печати)

Недачин А.Е., Артемова Т.З., Дмитриева P.A., Доскина Т.В., Талаева Ю Г., Иванова Л В., Буторина H H , Лаврова Д В.. Санамян А Г , Загайнова A.B., Алешня В.В., Журавлев П.В., Головина C.B., Панасовец О П., Савилов Е.Д., Мамонтова Л.М., Анганова Е.В. Основы эпидемической безопасности питьевого водопользования населения России // "Гигиена и санитария" (в печати).

Дмитриева P.A., Недачин А.Е., Лаврова Д.В.. Санамян А.Г., Доскина Т В Методы концентрирования воды при санитарно-вирусологическом контроле ее качества // "Гигиена и санитария" (в печати).

Список сокращений, использованных в работе

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с этапом обратной транскрипции

ИКК ОТ-ПЦР - ОТ-ПЦР, интегрированная с культурой клеток

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТЦД50/МЛ - тканевая цитопатогенная доза в миллилитре

ЦПД - цитопатогенное действие

Ш) - культура клеток из рабдомиосаркомы человека

В вМ - культура клеток из почек зеленой мартышки Буффало

ВГА - вирус гепатита А

к ДНК - комплементарная ДНК

РУ - полиовирус

Для заметок

Для заметок

Заказ Na 12-b Подписано в печать 05.10.05 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 0,92

/f^V. ООО "Цифровичок", тел. (095) 797-75-76 " www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

V1 8 288

РНБ Русский фонд

2006^4 15389

\

Актуальность проблемы Проблема обеспечения эпидемической безопасности населения России при различных видах водопользования является приоритетной государственной задачей в системе предупредительного санитарноэпидемиологического надзора (Рахманин Ю.А., 2005, Онищенко Г.Г., 2005). Будучи одним из ведущих факторов в реализации фекальноорального механизма передачи кишечных вирусных инфекций, водный путь передачи в настоящее время является одним из основных в формировании спорадической и вспышечной заболеваемости (Савилов Е.Д., Мамонтова Л.М., 2005, Недачин А.Е., 2005).Согласно действующим в нашей стране нормативным документам водно-санитарного законодательства, эпидемическая безопасность водных обьектов в отношении кишечных вирусных инфекций обеспечивается отсутствием патогенных вирусов в воде.Отсутствие до настоящего времени мер специфической профилактики в отношении кишечных вирусных инфекций диктует необходимость совершенствования неспецифических мер, ограничивающих циркуляцию вирусов в объектах окружающей среды, важной составляющей которых является контроль за циркуляцией вирусов в окружающей среде.Для индикации цитопатогенных вирусов, распространяющихся водным путем в практической лабораторной слз^ жбе используется метод их выделения на чувствительных культурах клеток. Однако данный метод имеет ряд недостатков, снижающих его практическую значимость: длительность процесса (3-4 недели), невозможность выделения нецитолитических и поврежденных вирусных агентов, не способных вызывать продуктивную цитолитическую инфекцию в системе in vitro, но, тем не менее, представляющих эпидемическую опасность для живого организма (Амвросьева Т.В., 2002). Эти проблемы, возникающие при изучении вирусологического качества вод различных водных объектов, могут быть решены путем использования метода детекции РНК энтеровирусов - полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР), который позволяет в течение 12-24 часов обнаружить в исследуемом материале энтеровирусную РНК (Reynolds К.А., 2004).Целью работы является разработка научно обоснованной схемы санитарно-вирусологического контроля качества воды водных объектов на основе индикации вирусов с помощью метода полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).Основные задачи диссертационной работы: 1. Разработать оптимальные режимы элюции энтеровирусов с целью обеспечения высокой эффективности их последующей индикации методом ОТ-ПЦР из проб воды; 2. Разработать эффективный метод выделения РНК энтеровирусов из концентратов проб поверхностных и сточных вод; 3. Отработать методику ОТ-ПЦР, интегрированной с культурой клеток (ИКК ОТ-ПЦР), для индикации РНК цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды; 4. Провести сравнительную, оценку методов индикации вирусного загрязнения воды при ее обеззараживании с использованием культурального, ОТ-ПЦР, ИКК ОТ-ПЦР и метода выделения колифагов; 5. Апробировать используемые методы на натурных объектах в условиях вспышечной заболеваемости и в межэпидемический период; 6. Разработать схему санитарно-вирусологического контроля с использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР. Научная новизна работы. Впервые - разработан эффективный метод выделения РНК энтеровирусов из концентратов проб поверхностных и сточных вод; - разработана комплексная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами с использованием метода ИКК ОТ-ПЦР; - разработана комплексная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды энтеровирусами при ее обеззараживании с использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР; - проведена сравнительная оценка методов индикации вирусного загрязнения воды при ее обеззараживании с использованием культурального, ОТ-ПЦР, ИКК ОТ-ПЦР и метода выделения колифагов.Основные положения, выносимые на защиту - разработанная схема санитарно-вирусологического контроля с использованием метода ИКК ОТ-ПЦР для индикации РНК цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды различных водных объектов; разработанная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды энтеровирусами при ее обеззараживании с использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР; - разработанный метод выделения РНК из концентратов проб поверхностных и сточных вод для эффективного устранения ингибиторов ОТ-ПЦР; - экспериментальное обоснование применения метода ИКК ОТ-ПЦР при санитарно-вирусологическом анализе проб воды, обработанных дезинфектантами.ЧАСТЫ

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований по совершенствованию метода санитарно-вирусологического контроля воды, включающего определение РНК энтеровирусов методом ИКК ОТ-ПЦР, показано, что чувствительность метода ИКК ОТ-ПЦР выше культурального метода и составляет соответственно 101п ТЦД5о/мл и 100пТЦД50/мл.

2. Показано, что применяемые при различных методах концентрирования элюенты: фосфатный буфер (рН 8,2), 3 % мясной экстракт на трис-буфере (рН 9,5), 0,05 М глициновый буфер (рН 11), физиологический раствор (рН 8,3) и мясо-пептонный бульон (рН 9,5) не оказывали влияния на эффективность метода ОТ-ПЦР и не вызывали ингибирования ОТ-ПЦР, что позволяет использовать этот метод для индикации энтеровирусов, после элюирования всеми видами элюентов.

3. Разработан комбинированный метод выделения РНК из концентратов проб воды с использованием методов фенол-хлороформной экстракции и сорбции на частицах силикагеля с целью наиболее эффективного устранения факторов ингибирования ОТ-ПЦР при анализе проб воды с высоким уровнем загрязнения (поверхностных и сточных).

4. Показано, что использование метода ИКК ОТ-ПЦР позволяет сократить время анализа на наличие энтеровирусов в воде до 3 суток по сравнению с общепринятым методом выделения энтеровирусов на культуре клеток (21 сутки), что обеспечивает своевременное проведение профилактических гигиенических мероприятий.

5. На основании исследований, проведенных в натурных условиях, показано, что частота обнаружения цитопатогенных энтеровирусов, определенных методом ИКК ОТ-ПЦР, превышает частоту обнаружения энтеровирусов при определении на культуре клеток и составляет 39,2 и 19,6% соответственно, что свидетельствует о более высокой эпидемиологической значимости метода ИКК ОТ-ПЦР по сравнению с культуральным методом.

6. Разработаны комплексные схемы санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами с использованием методов ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР, позволяющие сократить сроки проведения анализа и своевременно принимать профилактические противоэпидемические мероприятия.