Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Разработка и гигиеническая оценка метода концентрирования вирусов с использованием позитивно-заряженных фильтрующих мембран для санитарно-вирусологического исследования воды различных водных объектов

На правах рукописи

САНАМЯН АЛЛА ГЕОРГИЕВНА

I I I

РАЗРАБОТКА И ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МЕТОДА КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЗИТИВНО-ЗАРЯЖЕННЫХ ФИЛЬТРУЮЩИХ МЕМБРАН ДЛЯ САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДЫ РАЗЛИЧНЫХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ

14.00.07 - Гигиена

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН

Научные руководители:

кандидат медицинских наук доктор медицинских наук, профессор

Мчедлишвили Борис Викторович

Недачин Александр Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук кандидат биологических наук

Михайлова Руфина Иринарховна Еремеева Татьяна Петровна

Ведущая организация: НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. JI Пастера, Санкт-Петербург

Защита состоится 10 ноября 2005 года в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.009.01 в ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН по адресу: 119992, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10/15, строение 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н Сысина РАМН

Автореферат разослан « » октября 2005 года.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, доктор биологических наук

Беляева Наталия Николаевна

Z006

olSF-tOélJ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Проблема обеспечения населения России доброкачественной питьевой водой - безопасной в эпидемическом отношении, является одной из актуальных в системе предупредительного санитарно-эпидемиологического надзора. Это обусловлено общим ухудшением состояния поверхностных водоисточников в результате продолжающегося постоянного воздействия хозяйственно-бытовых сточных вод, поступающих водоёмы без необходимой очистки и обеззараживания и являющихся основным источником вирусного загрязнения водных объектов (Г.Г. Онищенко, 2005; Ю.А. Рахманин, Р.И. Михайлова, 2005; А.Е. Недачин и соавт., 2005; O.E. Иванова, Т.П Еремеева и соавт, 2005)

В настоящее время в документах водно-санитарного законодательства- СанПиН 1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества», СанПиН 2 1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод», СанПиН 2.1.2.1188-03 «Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества» - основным требованием, предъявляемым к качеству воды, является полное отсутствие вирусов в единице контролируемого объема водного объекта.

Для контроля воды различных водных объектов по этому показателю необходимо наличие методического обеспечения, позволяющего осуществление быстрой, адекватной и, что очень важно, точной количественной оценки реального вирусного загрязнения питьевой воды.

Наиболее полно необходимым требованиям отвечает технология мембранной фильтрации, которая является очень перспективной для индикации вирусного загрязнения воды, т.к. даёт возможность разработки простого, точного, легко воспро иного метода

определения вирусов в воде, основанного на использовании высококачественных мембран отечественного производства, стандартизированных и сертифицированных для вирусологического анализа (Ю.А.Рахманин, А.Е. Недачин и соавт., 2001)

Это диктует необходимость разработки и внедрения в практику контроля качества воды мембранных методов, основанных на использовании наиболее эффективных фильтрующих мембран и фильтровальных установок отечественного производства.

Целью работы является разработка и гигиеническая оценка метода санитарно-вирусологического контроля качества воды различных водных объектов на основе метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации с использованием позитивно-заряженных мембран.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи'

1.В экспериментальных условиях оценить эффективность различных позитивно-заряженных фильтрующих мембран, изготовленных на различной сырьевой и технологической основе и отработать оптимальные условия сорбции и элюции энтеровирусов для наиболее эффективных.

2.Провести сравнительную оценку эффективности фильтровальных установок различного типа для концентрирования энтеровирусов из воды разных водных объектов.

3.Разработать метод концентрирования энтеровирусов из воды различных водных объектов на основе метода мембранной фильтрации с использованием наиболее эффективных фильтрующих мембран и эффективной фильтровальной установки.

4.Апробировать разработанный метод концентрирования вирусов в натурных условиях.

5. Провести сравнительную оценку эффективности разработанного нами метода с существующими методами концентрирования вирусов из воды в экспериментальных условиях.

Научная новизна. Впервые:

- проведена оценка эффективности 9 позитивно-заряженных фильтрующих мембран отечественного производства различной сырьевой и технологической основы с размером пор 0,2 мкм и выявлена наиболее эффективная для санитарно-вирусологических исследований, позволяющая осуществлять фильтрование воды в режиме микрофильтрации для концентрирования вирусов из воды;

- дана сравнительная оценка эффективности фильтровальных установок различного типа в комплекте с мембранами типа ММК 1 и определена наиболее эффективная для концентрирования вирусов из воды различных водных объектов;

- установлены оптимальные режимы сорбции и элюции для эффективного концентрирования энтеровирусов на установке МФМ 0142 с мембраной ММК 1 при санитарно-вирусологическом исследовании воды;

- экспериментально обоснован и разработан унифицированный для различных типов вод (питьевой, подземной, речной и сточной) метод концентрирования энтеровирусов.

- Практическая значимость

Материалы исследований использованы при разработке.

- МУК 4 2 2005 «Методические указания по санитарно-вирусологическому контролю водных объектов окружающей среды»;

- МУК 2.1 5 2005 «Санитарно-вирусологический контроль эффективности обеззараживания питьевых и сточных вод УФ-облучением».

Основные положения, выносимые на защиту

• оценка эффективности 9 положительно-заряженных фильтрующих мембран отечественного производства, изготовленных на различной сырьевой и технологической основе с различными модификациями с размером пор 0,2 мкм для концентрирования энтеровирусов из воды;

• оценка эффективности фильтровальных мембранных установок различного типа для их использования при проведении санитарно-вирусологических исследований;

• экспериментальное обоснование метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации для концентрирования вирусов из воды различных водных объектов на установке МФМ 0142 с мембраной ММК 1;

•разработка унифицированного метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации для индикации вирусов в различных водных объектах с использованием установки МФМ 0142 с мембраной ММК 1.

Апробация диссертации проведена на заседании межотдельческой комиссии по апробации докторских и кандидатских диссертаций ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им А.Н.Сысина РАМН 28 июня 2005 года.

Материалы исследования доложены на V Международном конгрессе: «Вода: экология и технология» (Москва, 2002г.); конференции молодых ученых «Развитие научного творчества молодежи - объект постоянного внимания В А. Рязанова», посвященной 100-летию со дня рождения академика В.А. Рязанова (Москва, 2003г.), на Форуме «Питьевые воды России 2003» (Москва, 2003г.), на 1-ой Международной научно-практической конференции «Современные полимерные материалы в медицине и медицинской технике» (Санкт-Петербург, 2005г.); на II Форуме «Питьевые воды России 2005» (Москва, 2005г.); на международном форуме «Мир чистой воды - 2005» (Москва,2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ и 3 приняты в центральную печать.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 151 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Фактический материал представлен 26 таблицами, 9 рисунками и 6 приложениями. Указатель литературы содержит 183

источника, в том числе 78 работ отечественных и 105 иностранных авторов.

НАПРАВЛЕНИЯ, ОБЪЕКТЫ, ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Направления, объекты, объем и методы исследований представлены в таблице 1.

Исследования выполнялись с использованием современных гигиенических, бактериологических, вирусологических, и статистических методов, позволивших реализовать решение поставленных задач.

При проведении экспериментальных исследований по изучению эффективности концентрирования вирусов на различных фильтрующих были использованы модельные штаммы полиовируса I типа (штамм LSc2ab), полученный в НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.И Чумакова РАМН и РНК- содержащий колифаг MS-2 (штамм РН 1505), в качестве лизабельной бактериальной культуры использовали Е coli 3254 (штамм К 12 F+ Str1*), полученные в ГНИИ Генетика - Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов

Тест-микроорганизмы использовали, в зависимости от задач исследований, в следующих концентрациях: вирус полиомиелита 101 - 103 ТЦДзо/мл и фаг MS-2 10' - 104 БОЕ/мл

Объектами исследования являлись дехлорированная водопроводная, речная, подземная и сточная воды из различных климато-географических зон РФ Пробы водопроводной воды отбирали из водоразборного крана московской городской водопроводной сети в стерильные широкогорлые бутыли и оставляли при комнатной температуре на 24 часа для удаления свободного хлора Пробы речной воды отбирали в реках Москва, Туапсе, Аше, Псезуапсе и др, которые получены и исследованы в

Таблица 1

Направления, объекты, объем и методы исследований

Направления исследований Объекты и методы исследова-ний Объем исследований

На фагах MS-2 На полио-Вирусах

1 Изучение эффективности сорбции на различных фильтрующих мембранах Водопроводная вода 254 288

542

2 Оценка эффективности различных элюирующих растворов Водопроводная вода 150 236

386

3. Изучение эффективности сорбции на различных фильтрующих мембранах Водопроводная вода 238 408

646

4. Оценка эффективности различных фильтрующих установок в отношении концентрирования вирусов АФ-142 «К» 164 424

АМУ-1 52 100

МФМ 0142 306 196

1242

5. Оценка эффективности МФМ 0142 в комплекте с ММК в условиях, приближенных к натурным Водопроводная, подземная, речная, сточная воды 221 500

721

6 Апробация разработанного метода концентрирования вирусов в натурных условиях Водопроводная, подземная, речная, сточная воды 242 336

578

метод ПЦР* 230

7. Сравнительная оценка разработанного метода с другими методами концентрирования вирусов Смола АВ 17-8, МПС, «Ловушечное устройство» БР, МФМ 0142 с ММК 86 272

358

Итого 4703

* - совместно с Лавровой Д.В.

весенне-летний период Пробы сточной воды отбирали на Курьяновской станции после этапа биологической очистки и на станции очистки сточных вод ЗАО «Стайер» в Южном Бутово.

В экспериментальных исследованиях изучали эффективность сорбции вирусов на следующих, производящихся на территории России (НЛП "Технофильтр" г. Владимир, ТУ 3697-002-10471723-2003) позитивно-заряженных фильтрующих мембран с размером пор 0,2 мкм:

- Микропористая мембрана капроновая (ММК) - исходная;

- ММК 1 - модифицированная 0,5% соединениями аминов;

-ММК 2- модифицированная 1% соединениями аминов;

-ММК 3 - модифицированная 1% соединениями пиридина;

- Трековая мембрана (ТМ) - исходная;

- ТМ 1 - модифицированная гемоглобином;

- ТМ 2- модифицированная бифэкстрактом;

- Металло-керамическая мембрана (МКМ) - исходная;

- МКМ 1 - модифицированная 1% соединениями аминов.

Наряду с фильтрами проводилась оценка эффективности различных фильтровальных установок, в которых можно использовать фильтрующие мембраны:

- установки типа АФ-142 «К» производства ЗАО «Владисарт» (ТУ 9479-003-00212038-00);

- аналитического мембранного устройства - АМУ 1;

- проточного мембранного фильтрующего модуля с тангенциально-радиальным движением жидкости МФМ 0142, производства-ООО НЦ «Полимерсервис» (ТУ 3614-005-32915592-2005).

Также в экспериментальных исследованиях проведена сравнительная оценка эффективности разработанного нами метода, унифицированного для различных водных объектов с методами, рекомендуемыми в настоящее время для концентрирования вирусов при проведении санитарно-вирусологического контроля:

- метод сорбции на макропористом стекле (МПС-1000 ВГХ);

- метод сорбции на ионообменной смоле (Анионит АВ 17-8; АВ-17-8чс, ГОСТ 20301-74) производства Кемеровское ОАО «Азот» 650099

- набора для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды в системе децентрализованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, поверхностных и сточных вод производства ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ Республики Беларусь, г. Минск.

Исследование полученных элгоатов на энтеровирусы проводили на перевиваемых культурах тканей RD (рабдомиосаркома человека) и BGM (почки зеленой мартышки Буффало), в соответствии с «Руководством по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде Женева-2003»

Выделение и количественный учет фагов проводили однослойным методом в соответствии с документами МУК 4 2 1018-01 - «Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды» и МУК 4 2.188404 - «Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов»

Данные, полученные в результате экспериментальных, методических и натурных исследований подвергались статистической обработке с использованием программного обеспечения Microsoft Windows, Microsoft Excel 2000 и пакета статистических программ - Statistic for WINDOWS.

Вклад автора в проведение исследований составил 80 % Формирование базы данных, анализ информации и обобщение материала по изучаемой проблеме выполнены лично автором в полном объеме.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При проведении экспериментальных исследований соблюдался принцип максимального приближения к натурным условиям в отношении выбора водных объектов, спектра модельных микроорганизмов и их концентраций.

Первым этапом работы являлось изучение эффективности сорбции 9 позитивно заряженных фильтрующих мембран отечественного производства, изготовленных на различной сырьевой и технологической основе с различными модификациями и размером пор 0,2 мкм (больше размера вирусных частиц), что обеспечивает фильтрацию воды с большей скоростью.

В результате проведенной оценки по изучению сорбции вирусов на модели фага МБ-2 из водопроводной воды выявлено, что выше названные мембраны обладают различной степенью сорбции (таблица 2).

Таблица 2

Оценка сорбционной способности различны* фильтрующих мембран в отношении концентрирования фага М8-2

Вид Мембраны Эффективность сорбции в % при различных исходных концентрациях

102 БОЕ/ 100 мл 103 БОЕ/ 100 мл 104 БОЕ/ 100 мл

ММК (исходная) 94,6 + 0,6 98,2 + 0,2 99,5 ±0,3

ММК1 (мод. 0,5% соед. аминов) 100 100 100

ММК2 (мод. 1 % соед. аминов) 99 ±0,8 98,8 ± 0,2 95,5 ±1,2

ММКЗ (мод. 1 % пиридином) 97,7 ± 0,5 96,7 ±0,6 99,7 + 0,2

ТМ (исходная) 8,9 ±3,2 12,4 ±1,7 13,1 ±2,1

ТМ1 (модиф. Гемоглобином) 38,7 ±0,3 25,8 ±1,4 41,3 ±3,6

ТМ2 (модиф. Бифэксирактом) 65,4 ±1,4 50,21 ±2,9 45,3 ±1,8

МКМ (исходная) 24,5 +.1,5 24,7 +.1,9 26,3 ±0,7

МКМ1 (мод. 1 % соед. аминов) 26,5 +.2,4 38,7 ±.1,7 40,1 ±2,1

Статистическая обработка данных показала, что максимальная степень сорбции наблюдается у капроновых микропористых мембран типа

ММК исходной и модифицированных (Ч > 2) по сравнению с другими типами фильтрующих мембран, и установлено, что независимо от уровней вирусного загрязнения в пределах исследуемых концентраций эффективность сорбции для ММК исходной составила 97,4 + 2 %, для ММК, модифицированных 1% соединениями аминов - 97,8 + 1,5, для ММК, модифицированных 1% соединениями пиридина - 98 + 1,2, и для ММК, модифицированных 0,5% соединениями аминов, во всех случаях составила 100 %.

Важнейшим этапом в исследованиях, направленных на отработку метода концентрирования вирусов из больших объемов воды с использованием мембранной фильтрации являлось создание оптимальных условий десорбции вирусов с мембран.

Изучение десорбирущей способности 6 элюирующих растворов наиболее широко применяемых в санитарно-вирусологических исследованиях буферных растворов - 0,05 М глициновый буфер (рН 11,5), 3 % бифэкстракт на трисбуфере (рН 9,1-9,5), мясопептонный бульон (рН 9,1-9,5), мясопептонный бульон на фосфатном буфере (рН 9,1-9,5), 0,5 М фосфатный буфер (рН 8,2), физиологический раствор (рН 8,3) - показало, что модельные штаммы эффективно десорбируются органическими элюентами - 71,4-95,1 %. Максимальная эффективность элюции выявлена при использовании 0,05 М глицинового буфера и 3 % бифэкстракта на трисбуфере, между которыми не выявлена статистически достоверная разница (1 < 2). Учитывая то, что при использовании 0,05 М глицинового буфера вирус может быстрее инактивироватся, в дальнейших исследованиях использовали 3 % бифэкстракт на трисбуфере с рН 9,19,5, эффективность которого для элюции фага МБ-2 составила 95,1 + 0,7 %, а для полиовируса - 85,7 + 0,2 % .

Элюирующая способность данного буфера в отношении изучаемых фильтрующих мембран на модели фага МБ-2 представлена в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительная оценка элюцни фага М8-2 с различных фильтрующих мембран

Вид Мембраны Эффективность элюции в % при различных исходных концентрациях

102 БОЕ/ 100 мл 10" БОЕ/ 100 мл 104 БОЕ/ 100 мл

ММК (исходная) 88,5 ± 0,3 51,4 ¿2,7 59 ¿1,3

ММК 1 (мод. 0,5% соед. аминов) 95 ± 1,2 91,4 ±2,9 85,3 + 4,1

ММК2 (мод. 1 % соед. аминов) 17 ±2,7 22,3 ¿0,6 25,8 ¿1,1

ММКЗ (мод. 1 % соед. пиридина) 45,8 + 0,7 51,1 ¿1,3 48,3 ± 0,2

ТМ (исходная) 42,8 + 0,3 39 ¿2,1 27,8 ¿1,7

ТМ1 (модиф. Гемоглобином) 19,3 ¿1,1 20,4 ¿0,9 19 + 0,6

ТМ2 (модиф. Бифэкстрактом) 34,2 ¿3,1 11 ¿0,4 8,8 + 1,1

МКМ (исходная) 3 + 2,2 6,5 ¿0,3 8,7 ¿1,3

МКМ1 (мод 1 % перв. аминами) 5,1 ±3,2 19,3 ¿0,5 12,4 ¿2,7

Как видно из представленных данных, степень элюции с фильтрующих мембран была также различной Статистическая обработка данных показала, что по сравнению другими типами фильтрующих мембран максимальная степень элюции (85,3-95%.) наблюдалась у мембранных фильтров, типа ММК, модифицированных 0,5 % соединениями аминов 0 > 2).

Таким образом, в результате исследований по оценке эффективности различных фильтрующих мембран, изготовленных на различной сырьевой и технологической основе с различными модификациями выявлено, что наиболее эффективной из них является фильтрующая мембрана, типа ММК, модифицированная 0,5 % соединениями аминов, обладающая

высокой как сорбционной способностью (100%), так и элюирующей способностью (90,6 + 4 %) (рис1) при концентрировании вирусов из больших объемов воды. Это определяет перспективность использования этих мембран для санитарно-вирусологического контроля воды водных объектов в отношении вирусного загрязнения.

Рис. 1. Эффективность различных мембран в отношении выделения вирусов.

Следующим этапом работы являлась оценка эффективности 3 фильтровальных установок: аналитического мембранного устройства АМУ-1, установки типа АФ-142 «К» и проточного мембранного фильтрующего модуля с тангенциально-радиальным движением жидкости МФМ 0142 - с использованием выявленной эффективной фильтрующей мембраны типа ММК 1 для концентрирования вирусов из больших объемов воды. Исследования проводили на водопроводной воде.

В результате исследований по оценке эффективности выше названных установок для мембранной фильтрации выявлена низкая эффективность элюции сконцентрированных вирусов (5,7 + 0,9 %) для аналитического мембранного устройства, хотя и была показана 100% сорбция вирусов, что

очевидно объясняется фильтрованием воды через две мембраны, расположенных друг под другом, но обладает Кроме того, недостатком для практического использования является невысокая скорость фильтрации' время фильтрования для 10 л водопроводной воды составляло 140 мин.

На установке типа АФ-142 «К» эффективность сорбции достигала 97,2 ± 1,8 %, а эффективность элюции - 58,3 + 3,3 % Время фильтрации на данной установке составляло 100 минут. Определенным недостатком данной установки является трудоемкость процесса элюции (механический смыв) и зависимость результатов анализа от индивидуальных усилий исследователя (тщательности проведения механического смыва)

При изучении эффективности проточного мембранного фильтрующего модуля с тангенциально- радиальным движением жидкости МФМ 0142 установлено, что эффективность сорбции соствляет 100 %, а эффективность элюции - 83,3 % и по сравнению с 2-мя предыдущими установками время фильтрации 10 л воды значительно ниже - 42 минуты.

а) Подаваемая жидкость

ОООООООООООООО

Свободный от вирусов фильтрат

б)

О и и О О О о

>

1=>

Подаваемая жидкость

Концентрат

Свободный от вирусов фильтрат

Рис.2. Различия между обычной фильтрацией (а) и фильтрацией методом тангенциального потока (б).

Существенным преимуществом фильтровальной установки МФМ 0142 (рис.2) является то, что при тангенциально-радиальном потоке жидкость, проходящая по касательной к поверхности мембраны, смывает частицы и предохраняет мембрану от забивания, что позволяет осуществлять фильтрацию больших объемов воды с большей скоростью, чем при обычной фильтрации в тупиковом режиме

Обобщенные данные по оценке эффективности фильтровальных установок представлены в таблице 4.

Таблица 4

Оценка эффективности различных фильтровальных установок

Фильтровальная установка Эффективность в % Время фильтрации 10 л воды

Сорбции Элюции

АМУ-1 100 5,7 + 0,9 140 мин.

АФ-42 «К» 97,2 ± 1,8 58,3 ± 3,3 100 мин.

МФМ 0142 100 83,3 ±1,9 42 мин.

Таким образом, учитывая выше указанные преимущества и недостатки, а также в результате статистической обработки данных по оценке эффективности различных фильтровальных установок в отношении выделения вирусов выявлен наиболее эффективный фильтрующий мембранный модуль - МФМ 0142 для концентрирования вирусов из воды 0 > 2) (рис 3).

у Сорбция Элюция

Рис. 3. Эффективность различных фильтровальных установок в

Далее проводили оценку эффективности установки МФМ 0142 с мембраной ММК 1 в условиях, приближенных к натурным. Для исследований использовали водопроводную, подземную, речную и сточную воды, инфицированные модельными микроорганизмами. Результаты исследований показали высокий процент выделения фага МЯ-2 и полиовируса из водопроводной воды - 83,3 + 0,9 % и 84,8+ 4,3 % соответственно; из воды подземного водоисточника - 85,8 + 2,6 % и 83,6 + 3,4 %; для речной воды эффективность составила - 86,8 + 0,8 % и 84,6 + 2,7 % ; из сточной воды - 84,6 + 1,3 % и 85,9 + 1,7 % соответственно (Рис.4).

В экспериментальных исследованиях определена прямая зависимость эффективности элюции от объема элюирующего раствора и кратности проводимых смывов. Также изучена зависимость эффективности сорбции от параметров давления, скорости фильтрации и мутности исследуемой воды. В результате проведенных исследований отработаны оптимальные режимы для более эффективной сорбции и элюции тест-микрорганизмов в пределах исследуемых концентраций вирусов:

отношении выделения вирусов из воды.

- эффективность сорбции и элюции не зависит от исходной концентрации тест-микроорганизмов;

- эффективность сорбции не зависит от скорости фильтрации и давления (в пределах 1-2 б);

- скорость фильтрации не зависит от типа воды (в пределах нормируемых объемов) и ее мутности;

- оптимальным минимальным объемом элюента является 60 мл (по 20 мл в трех последовательных смывах).

|ИМ5-2 ИРУ]

Рис. 4. Эффективность МФМ 0142 в отношении концентрирования вирусов из нативных вод.

Данные, полученные в результате экспериментальных исследований по оценке эффективности различных фильтрующих мембран и различных фильтровальных установок дали основание для разработки унифицированного метода концентрирования вирусов из воды различного вида водопользования с применением метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации.

При разработке метода впервые была предложена и применена позитивно заряженная фильтрующая мембрана типа ММК с размером пор 0,2 мкм, позволяющая осуществлять процесс микрофильтрации, для санитарно-вирусологических исследований выше указанных вод, впервые был предложен и апробирован проточный мембранный фильтрующий модуль с тангенциально-радиальным движением жидкости МФМ 0142

Результатами исследований показано, что кратность физического концентрирования составляет 167 раз, а биологического на три порядка Для обнаружения вируса на культуре ткани необходимо, чтобы его концентрация в элгоате была не ниже 1 ТЦД50 в 0,8 мл элюата (1,25 ТЦД5о/мл), следовательно, учитывая кратность концентрирования, минимальная концентрация, определяемая данным методом должна составлять не менее 0,001 ТЦД50/мл (0,1 ТЦД50/100 мл) исходной воды, но учитывая среднюю эффективность, равную 84,7 %, минимальная концентрация определяемая данным методом составляет 0,08 ТЦД50/ЮО мл. Таким образом, теоретически чувствительность метода составляет 8 ТЦД50/Ю л исследуемой воды

Разработанный метод эффективен, прост в исполнении, технически доступен и обладает рядом преимуществ по сравнению с используемыми санитарной службой в настоящее время методами концентрирования- время концентрирования вирусов на данной установке сокращается до 42 минут, вместо 18 часов на ионообменной смоле;

- метод позволяет проводить санитарно-вирусологический анализ как водопроводной, так и подземной, речной и сточных вод, что дает возможность стандартизировать санитарно-вирусологический контроль воды.

Апробацию разработанного метода на натурных объектах (таблица 5) проводили в межэпидемический период и в условиях спада вспышечной заболеваемости населения вирусным гепатитом А (Тверская область,

г.Ржев, 2005 г.). Исследовано 18 проб воды источников различного типа (поверхностные, подземные и вода распределительной сети).

Таблица 5

Частота выделения энтеровирусов в натурных водных объектах с использованием разработанного метода концентрирования

Тип воды Кол-во проб Частота выделения в %

Фаг МБ-2 Энтеровирусы

Водопроводная 6 10 33,3

Подземная 5 40 50

Речная 4 75 60

Сточная 3 100 66,6

Представленные данные подтверждают эффективность разработанного метода концентрирования на установке МФМ 0142 с мембраной ММК 1

Заключительным этапом исследований явилось проведение сравнительной оценки разработанного нами метода и методов, используемых в настоящее время в санитарной практике - сорбции на макропористом стекле (в модифицированном варианте) и ионообменной смоле АВ 17-8 и концентрирования вирусов с помощью «Ловушечного устройства» (БР).

Сравнительную оценку проводили в экспериментальных условиях на водопроводной воде, путем ее инфицирования полиовирусом I типа в концентрации 104 ТЦД50/Ю л.

Результаты сравнительной оценки наглядно демонстрируют (рис.5), что разработанный нами метод является наиболее эффективным - 86,3 ± 1,7 % по сравнению с применяемыми в настоящее время в санитарной практике методами (I > 2), эффективность которых составила 53,8 + 0,2 %, 38,5 ± 0,7 и 55,5 ±1,6 соответственно.

90

80 70 60 50

%

40 30

МПС Смола АВ17-8 Ловушечнов ус-во МФМ с ММК1

Рис. 5. Сравнительная оценка эффективности различных методов концентрирования вирусов.

Таким образом, разработан и апробирован унифицированный метод концентрирования вирусов с использованием позитивно-заряженных фильтрующих мембран для санитарно-вирусологического исследования воды различных водных объектов. Применение единого унифицированного метода для концентрирования вирусов из воды разной степени загрязнения позволяет получать сравнимую оценку уровней вирусного загрязнения.

ВЫВОДЫ

1. Оценка эффективности 9 позитивно-заряженных фильтрующих мембран различной сырьевой и технологической основы с различными модификациями и размером пор 0,2 мкм, обладающие высокой пропускной способностью за короткий промежуток времени при фильтрации воды показала, что наибольшей эффективностью обладает позитивно-заряженная фильтрующая мембрана типа ММК 1,

ИМИшшишшишшшшшшшшяшшшщшщ

ш .. . 53,8 . .. 55 5

модифицированная 0,5% соединениями аминов, обладающая 100 % сорбционной способностью не зависимо от концентрации вируса, что позволяет рекомендовать ее для широкого применения при санитарно-вирусологическом контроле качества воды различных водных объектов.

2. Показано, что для элюции энтеровирусов с фильтрующих мембран типа ММК 1 из широко используемых в практике санитарно-вирусологических исследований десорбирующих растворов: 0,05 М глициновый буфер (рН 11,5), 3 % бифэкстракт на трисбуфере (9,1-9,5), мясопептонный бульон (рН 9,1-9,5), мясопептонный бульон на фосфатном буфере (рН 9,1-9,5), 0,5 М фосфатный буфер (рН 8,2), физиологический раствор (рН 8,3) - наибольшей эффективностью обладает 3 % бифэкстракт на трисбуфере (рН 9,1-9,5), элюирующая способность которого - 90,6 + 4 %.

З.Оценка эффективности фильтровальных установок' аналитического мембранного устройства АМУ-1; установки типа АФ-142 «К» и проточного мембранного фильтрующего модуля с тангенциально-радиальным движением жидкости - МФМ 0142 - в комплекте с фильтрующими мембранами типа ММК 1 показала, что наибольшей эффективностью в отношении концентрирования вирусов обладает мембранный модуль МФМ 0142.

4. Выявлена, на основании проведенных санитарно-вирусологических исследований, зависимость эффективности концентрирования вирусов от режимов сорбции и элюции. Разработаны оптимальные режимы сорбции и элюции для эффективного концентрирования вирусов на модуле МФМ 0142 в комплекте с мембраной ММК 1 - сорбция при давлении 1-2 бара, при котором эффективность сорбции не зависит от исходной концентрации вируса, элюция 3 % бифэкстрактом на трисбуфере при рН 9,1-9,5, объем элюента 60 мл (по 20 мл в трех последовательных смывах).

5. Обоснованы и апробированы в экспериментальных и натурных исследованиях оптимальные режимы концентрирования энтеровирусов из

вод различных водных объектов, что позволяет получить эффективность выделения энтеровирусов для питьевых вод - 84,8 + 4,3 %, подземных -83,6 + 3,4 %, речных - 84,6 + 2,7 % и сточных вод - 85,9 + 1,7 %. Показано, что эффективность не зависит от типа воды в пределах нормируемых объемов воды и ее мутности (t<2).

6.Разработан унифицированный метод мембранной фильтрации для концентрирования энтеровирусов из вод различных водных объектов в режиме микрофильтрации на модуле МФМ 0142 в комплекте с мембраной ММК 1. Метод обладает высокой эффективностью, технической доступностью, позволяет сократить время концентрирования до 42 минут и может быть использован для концентрирования энтеровирусов из вод разной степени загрязнения (питьевой, подземной, речной и сточной в пределах нормируемых объемов). Эффективность физического концентрирования составляет 168 раз, а биологического концентрирования - на три порядка.

7.Сравнительная оценка эффективности методов концентрирования, рекомендованных к использованию в настоящее время в практике санитарно-вирусологического контроля - метод сорбции на макропористом стекле МПС-1000 ВГХ и ионообменной смоле Анионит AB 17-8 и метода концентрирования вирусов с помощью «Ловушечного устройства» (БР) с методом, разработанным нами показала более высокую эффективность последнего (86,3+1,7%) в отношении концентрирования энтеровирусов из воды.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

Санамян А.Г . Р А. Дмитриева, Т.В. Доскина, А.Е. Недачин, A.B. Тарасов, Ю.А.Федотов Мембрана и мембранный модуль для вирусологического анализа воды // Критические технологии -Мембраны № 3 (27) 2005г. - с. 28-33.

Санамян А.Г. Сравнительная оценка эффективности различных фильтрующих мембран отечественного производства в отношении

концентрирования вирусов // Материалы конференции «Развитие научного творчества молодежи - объект постоянного внимания В .А. Рязанова» в сборнике Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха Москва , 2003 г -346-349.

Санамян А .Г. Оценка эффективности концентрирования вирусов из воды различного вида водопользования с использованием мембранной фильтрации // Использование мембранной технологии, Санкт-Петербург, 2005 г. - с. 72-73.

Санамян А.Г. Колбасникова И.А. Оценка эффективности концентрирования вирусов на мембранном фильтрующем элементе МФЭ 0142 // Материалы всеросийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», Суздаль, 2005 г. - с. 190-191.

Недачин А.Е., Санамян А Г. К вопросу о возможности использования различных фильтрующих мембран и мембранного модуля «ММ 0142» для концентрирования вирусов // 1-ая Международная научно-практическая конференция «Современные полимерные материалы в медицине и медицинской технике» г Санкт-Петербург, 2005 г. - с. 177-179.

Недачин А.Е., Санамян А.Г.. Дмитриева P.A., Нечаев А.Н. Сравнительная оценка эффективности выделения вирусов из воды с использованием метода мембранной фильтрации // V Международный конгресс: «Вода: экология и технология», Москва, 2002 г - с.720-721.

Колбасникова И.А., Санамян А.Г Метод мембранной фильтрации для микробиологического контроля питьевой воды с использованием трековых мембран // Материалы всеросийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», Суздаль, 2005 г. - 355-357.

Недачин А.Е., Доскина Т.В., Дмитриева P.A., Санамян А.Г.. Лаврова Д.В. Повышение качества питьевой воды и ее эпидемиологической безопасности в отношении вируса гепатита А и других энтеротропных вирусов. Закономерности циркуляции и современные методы индикации вирусного загрязнения водных объектов. // Сборник Тезисов Форума «Питьевые воды России - 2003» Москва, 2003 - с.67-68.

Недачин А.Е., Дмитриева P.A., Доскина Т.В., Санамян А.Г.. Нечаев А.Н Оценка различных фильтрующих мембран в отношении выделения вирусов из воды // Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды, Москва, 2002 г. - с.236-247.

Недачин А.Е., Дмитриева P.A., Доскина Т.В., Лаврова Д.В.. Санамян А.Г. Проблемы циркуляции, нормирования, санации и контроля питьевой воды в отношении вирусного загрязнения // II Форум "Питьевые воды России 2005" Москва, 2005 - с. 42-43.

Недачин А Е , Дмитриева P.A., Доскина Т.В , Лаврова Д В Санамян А.Г. Проблемы нормирования, контроля вирусного загрязнения воды как основа профилактики кишечных вирусных инфекций // VI -я научно-практическая конференция Международный форум «Мир чистой воды-2005» Москва 2005 - с.75-76.

Недачин А.Е., Артемова Т.З., Дмитриева P.A., Доскина Т.В., Иванова Л.В, Буторина НН, Лаврова Д.В., Санамян А Г.. Ли * Ю.В.,Загайнова A.B., Алешня В.В, Журавлев П.В., Головина C.B.,

Панасовец О.П., Савилов Е.Д., Мамонтова Л.М., Анганова Е.В. Обеспечение эпидемической безопасности питьевого водопользования населения России // Материалы пленума "Современные проблемы медицины окружающей среды" п/ред. академика РАМН Ю А.Рахманина, Москва, 2004 г. - с 29-33.

Санамян А Г , P.A. Дмитриева, Доскина Т.В., Лаврова Д.В., Недачин А.Е Использование мембранного модуля МФМ 0142 для концентрирования вирусов при санитарно-вирусологическом контроле водных объектов // Гигиена и санитария (в печати)

Дмитриева РА., Недачин А.Е., Лаврова Д.В., Санамян А.Г, Доскина Т.В. Методы концентрирования вирусов из воды при санитарно-вирусологическом контроле ее качества // Гигиена и санитария (в печати)

Недачин А.Е., Артемова Т.З , Дмитриева Р А., Доскина Т.В., Талаева Ю.Г., Иванова Л.В., Буторина H.H., Лаврова Д.В., Санамян А.Г.. Загайнова A.B., Алешня В.В., Журавлев П.В , Головина С.В , Панасовец О.П., Савилов ЕД., Мамонтова Л.М., Анганова Е.В. Основы эпидемической безопасности питьевого водопользования населения России // Гигиена и санитария (в печати)

Список сокращений, используемых в тексте

ММК - Микропористая мембрана капроновая

ММК 1 - Микропористая мембрана капроновая, модифицированная 0,5 % соединениями аминов ^ ТМ - Трековая мембрана

МКМ - Металло-керамическая мембрана АФ-142 «К» - Аппарат фильтрационный марки «К» Ц АМУ-1 - Аналитическое мембранное устройство

МФМ 0142 - Мембранный фильтрующий модуль с тангенциально-

радиальным движением жидкости

МПС - макропористое стекло

AB 17-8 - Ионообменная смола (Анионит)

PV - полиовирус I типа

MS-2 - РНК-содержащий колифаг

ТЦД50 - тканевая цитопатогенная доза

Для заметок

Заказ № 13-Ь Подписано в печать 0510.05 Тираж 100 экз. Уст п.л 0,96

ООО "Цифропичок", тел (095) 797-75-76 V/ www.qfr.ru ; е-тай:info@cfr.ru

И 8 287

РНБ Русский фонд

2006-4 15388

Актуальность проблемы:

Проблема обеспечения населения России доброкачественной питьевой водой - безопасной в эпидемическом отношении, является одной из актуальных в системе предупредительного санитарно-эпидемиологического надзора. Это обусловлено общим ухудшением состояния поверхностных водоисточников в результате продолжающегося постоянного воздействия хозяйственно-бытовых сточных вод, поступающих водоёмы без необходимой очистки и обеззараживания и являющихся основным источником вирусного загрязнения водных объектов (Г.Г. Онищенко, 2005; Ю.А. Рахманин, 2005; А.Е. Недачин и соавт., 2005).

Благодаря достижениям отечественной санитарной вирусологии, в последние годы установлена широкая циркуляция вирусов в объектах окружающей среды, выявлена тесная связь между их содержанием в питьевой воде и заболеваемостью населения кишечными вирусными инфекциями.

Отсутствие до настоящего времени мер специфической профилактики в отношении кишечных вирусных инфекций диктует необходимость совершенствования неспецифических мер, ограничивающих циркуляцию вирусов в объектах окружающей среды. Важнейшей составной частью неспецифических мер профилактики является предупредительный эпидемиологический надзор за состоянием водных объектов, контроль за эффективностью работы очистных сооружений и водопроводных станций по санитарно-вирусологическим показателям.

В настоящее время в документах водно-санитарного законодательства- СанПиН 1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества», СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод», СанПиН 2.1.2.1188-03 «Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества» -основным требованием, предъявляемым к качеству воды, является полное отсутствие вирусов в единице контролируемого объема водного объекта.

Для контроля питьевой воды по этому показателю необходимо наличие методического обеспечения, дающего возможность осуществления быстрой, адекватной и, что очень важно, точной количественной оценки реального вирусного загрязнения питьевой воды.

Используемые в настоящее время в нашей стране методы концентрирования вирусов из больших объемов воды обладают рядом недостатков, связанных с длительностью концентрирования (от нескольких дней до 24 часов), низкой пропускной способностью (не более 10 л чистой воды), нестандартностью и т.д., что значительно влияет на частоту обнаружения вирусов в водных объектах.

Наиболее полно необходимым требованиям отвечает технология мембранной фильтрации. Он является очень перспективным для индикации вирусного загрязнения воды, т.к. даёт возможность разработки простого, точного, легко воспроизводимого количественного метода определения вирусов в воде, основанного на использовании высококачественных мембран отечественного производства, стандартизированных и сертифицированных для вирусологического анализа (Ю.А.Рахманин, А.Е. Недачин и соавт., 2001).

Это диктует необходимость разработки и внедрения мембранных методов, основанных на использование наиболее эффективных фильтрующих мембран и фильтровальных установок отечественного производства.

В связи с выше изложенным, целью работы является разработка и гигиеническая оценка метода санитарно-вирусологического контроля качества воды различных водных объектов на основе метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации с использованием позитивно-заряженных мембран.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1.В экспериментальных условиях оценить эффективность различных позитивно-заряженных фильтрующих мембран, изготовленных на различной сырьевой и технологической основе и отработать оптимальные условия сорбции и элюции энтеровирусов для наиболее эффективных.

2.Провести сравнительную оценку эффективности фильтровальных мембранных установок различного типа для концентрирования энтеровирусов из воды разных водных объектов.

3.Разработать метод концентрирования энтеровирусов из воды различных водных объектов на основе метода мембранной фильтрации с использованием наиболее эффективных фильтрующих мембран и эффективной фильтровальной установки.

4.Апробировать разработанный метод концентрирования вирусов в натурных условиях.

5.Провести сравнительную оценку эффективности разработанного метода с существующими методами концентрирования вирусов из воды в экспериментальных условиях.

Научная новизна. Впервые:

- проведена оценка эффективности 9 позитивно- заряженных фильтрующих мембран отечественного производства различной сырьевой и технологической основы с размером пор 0,2 мкм и выявлена наиболее эффективная для санитарно-вирусологических исследований, позволяющая фильтрование воды в режиме микрофильтрации в отношении концентрирования вирусов из воды;

- дана сравнительная оценка эффективности фильтровальных мембранных установок различного типа в комплекте с мембранами типа ММК 1 и выявлена наиболее эффективная для концентрирования вирусов из воды различных водных объектов;

- определены оптимальные режимы сорбции и элюции для эффективного концентрирования энтеровирусов на установке МФМ 0142 с мембранами ММК 1 при санитарно-виру со логическом исследовании воды;

- экспериментально обоснован и разработан унифицированный метод концентрирования энтеровирусов из питьевых, подземных, речных и сточных вод с использованием метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации.

Практическая значимость. Материалы исследований использованы при разработке:

- МУК 4.2. 2005 «Методические указания по санитарно-вирусологическому контролю водных объектов окружающей среды»;

- МУ 2.1.5. 2005 «Санитарно-вирусологический контроль эффективности обеззараживания питьевых и сточных вод УФ-облучением».

Основные положения, выносимые на защиту

• оценка эффективности 9 положительно-заряженных фильтрующих мембран отечественного производства, изготовленных на различной сырьевой и технологической основе с различными модификациями с размером пор 0,2 мкм для концентрирования энтеровирусов из воды;

• оценка эффективности фильтровальных мембранных установок различного типа для их использования при проведении санитарно-вирусологических исследований;

• экспериментальное обоснование метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации для концентрирования вирусов из воды различных водных объектов на установке МФМ 0142 с мембраной ММК 1;

• разработка унифицированного метода мембранной фильтрации в режиме микрофильтрации для индикации вирусов в различных водных объектах с использованием установки МФМ 0142 с мембраной ММК 1.

ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Оценка эффективности 9 позитивно-заряженных фильтрующих мембран различной сырьевой и технологической основы с различными модификациями и размером пор 0,2 мкм, обладающие высокой пропускной способностью за короткий промежуток времени при фильтрации воды показала, что наибольшей эффективностью обладает позитивно-заряженная фильтрующая мембрана типа ММК ^ модифицированная 0,5% соединениями аминов, обладающая 100 % сорбционной способностью не зависимо от концентрации вируса, что позволяет рекомендовать ее для широкого применения при санитарно-вирусологическом контроле качества воды различных водных объектов.

2. Показано, что для элюции энтеровирусов с фильтрующих мембран типа ММК 1 из широко используемых в практике санитарно-вирусологических исследований десорбирующих растворов: 0,05 М глициновый буфер (рН 11,5), 3 % бифэкстракт на трисбуфере (9,1-9,5), мясопептонный бульон (рН 9,1-9,5), мясопептонный бульон на фосфатном буфере (рН 9,1-9,5), 0,5 М фосфатный буфер (рН 8,2), физиологический раствор (рН 8,3) - наибольшей эффективностью обладает 3 % бифэкстракт на трисбуфере (рН 9,1-9,5), элюирующая способность которого - 90,6±4 % .

З.Оценка эффективности фильтровальных установок: аналитического мембранного устройства АМУ-1; установки типа АФ-142 «К» и проточного мембранного фильтрующего модуля с тангенциально-радиальным движением жидкости - МФМ 0142 - в комплекте с фильтрующими мембранами типа ММК 1 показала, что наибольшей эффективностью в отношении концентрирования вирусов обладает мембранный модуль МФМ 0142.

4. Выявлена, на основании проведенных санитарно-вирусологических исследований, зависимость эффективности концентрирования вирусов от режимов сорбции и элюции. Разработаны оптимальные режимы сорбции и элюции для эффективного концентрирования вирусов на модуле МФМ 0142 в комплекте с мембраной ММК 1 - сорбция при давлении 1-2 бара, при котором эффективность сорбции не зависит от исходной концентрации вируса, элюция 3 % бифэкстрактом на трисбуфере при рН 9,1-9,5, объем элюента 60 мл (по 20 мл в трех последовательных смывах).

5. Обоснованы и апробированы в экспериментальных и натурных исследованиях оптимальные режимы концентрирования энтеровирусов из вод различных водных объектов, что позволяет получить эффективность выделения энтеровирусов для питьевых вод - 84,8 + 4,3 %, подземных - 83,6 ± 3,4 %, речных - 84,6 ± 2,7 % и сточных вод - 85,9 + 1,7 %. Показано, что эффективность не зависит от типа воды в пределах нормируемых объемов воды и ее мутности (t<2).

6.Разработан унифицированный метод мембранной фильтрации для концентрирования энтеровирусов из вод различных водных объектов в режиме микрофильтрации на модуле МФМ 0142 в комплекте с мембраной ММК 1. Метод обладает высокой эффективностью, технической доступностью, позволяет сократить время концентрирования до 42 минут и может быть использован для концентрирования энтеровирусов из вод разной степени загрязнения (питьевой, подземной, речной и сточной в пределах нормируемых объемов). Эффективность физического концентрирования составляет 168 раз, а биологического концентрирования - на три порядка.

7.Сравнительная оценка эффективности методов концентрирования, рекомендованных к использованию в настоящее время в практике санитарно-вирусологического контроля - метод сорбции на макропористом стекле МПС-1000 ВГХ и ионообменной смоле Анионит АВ 17-8 и метода концентрирования вирусов с помощью «Ловушечного устройства» (БР) с методом, разработанным нами показала более высокую эффективность последнего (86,3+1,7%) в отношении концентрирования энтеровирусов из воды.