Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Использование иммунологических и протеомных методов исследований для диагностики осложнений инфекционных заболеваний, проявляющихся аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями.

На правах рукописи

005001579

ФЕДЬКИНА Юлия Алексеевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ И ПРОТЕОМНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОСЛОЖНЕНИЙ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ПРОЯВЛЯЮЩИХСЯ АКСОНАЛЬНО-ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИМИ ПОЛИНЕВРОПАТИЯМИ

14.01.09 — инфекционные болезни 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 О НОЯ 2011

Москва-2011

005001579

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московском государственном медико-стоматологическом университете» Министерства здравоохранения и социального развития Российской

Федерации

Научные руководители:

академик РАМН, д.м.н., профессор ЮЩУК

Николай Дмитриевич д.м.н., профессор БАЛМАСОВА

Ирина Петровна

Научный консультант:

д.м.н., профессор ПИРАДОВ

Михаил Александрович

Официальные оппоненты:

д.м.н., профессор КРАВЧЕНКО

Алексей Викторович д.м.н., профессор КАЛЮЖИН

Олег Витальевич

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится «21» ноября 2011 г. в « 1200 » часов на заседании диссертационного совета Д 208.131.01 в ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «21» октября 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

д.м.н. Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В клинике инфекционных болезней одним из тяжелых осложнений бактериальных и вирусных инфекций являются аутоиммунные аксонально-демиелинизирующие полиневропатии, которые характеризуются множественным поражением периферических нервов [Скрипченко Н.В., Команцев В.Н., 2006].

Известно, что инфекционные агенты могут вызывать демиелинизацию нервного волокна как в виде прямого повреждающего действия, так и опосредованно вследствие развития каскада иммунных реакций, возникающих во время или после стихания клинических проявлений инфекционного процесса [Бамбеева Р.Ц., Дунаевская Г.Н., Нанкина И.В., 2008; Цинзерлинг В.А., Чухловина M.JL, 2005]. В последнем случае в основе патогенеза демиелинизации лежит феномен молекулярной мимикрии микробных возбудителей, запускающий аутоиммунные процессы [Guerry Р., Szymanski С.М., Prendergast М.М. et al., 2002]. В результате возникают перекрестные иммунологические реакции между структурными элементами миелиновой оболочки периферических нервов и структурными элементами клеточной оболочки микроорганизмов, причем в последние годы некоторые исследователи выявили возможность выработки антител даже к структурам аксона [Goodfellow J.A. et al., 2005; Greenshields K.N., Halstead S.K., 2009].

Одним из наиболее тяжелых заболеваний периферической нервной системы и самой частой причиной острых периферических параличей аутоиммунной природы, ассоциированных с инфекционными заболеваниями, является синдром Гийена-Барре (СГБ), актуальность изучения которого определяется тем, что данный синдром встречается повсеместно во всех возрастных группах [Бамбеева Р.Ц., Дунаевская Г.Н., Нанкина И.В, 2008; Arami М.А., Yazdchi М., 2006]. Пик заболеваемости регистрируется в основном у лиц трудоспособного возраста - в 3050 лет. Частота встречаемости колеблется от 0,4 до 4,0 случаев на 100 тыс. населения, составляя в среднем 1-2 случая на 100 тыс. населения ежегодно [Пирадов М.А., Супонева H.A., 2007]. Описано развитие синдрома Гийена-Барре

после введения вакцин, что еще больше подчеркивает актуальность данной проблемы [TishlerM., Shoenfeld Y., 2004].

Помимо СГБ, к числу приобретенных аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий принадлежит хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДП), в состав которой включают все случаи воспалительного повреждения периферических нервов, которые имеют подострое начало и хроническое (более 2 месяцев) течение, характеризующееся обострениями и ремиссиями, а в части случаев монотонно прогрессирующее [Левин О.С., 2006; Меркулова Д.М., Никитин С.С., 2007]. При ХВДП неврологическая симптоматика нарастает медленней (8 недель и более), чем при СГБ [Гусев Е.И., Коновалов А.Н., Гехт А.Б., 2007]. Однако в 16-20% случаев ХВДП имеет острое начало с нарастанием мышечной слабости в течение первых недель болезни, чем напоминает СГБ [Супонева H.A., Никитин С.С., Пирадов М.А., Меркулова Д.М., 2007]. Основными специфическими методами лечения СГБ являются программный плазмаферез и внутривенная пульс-терапия IgG, которые в равной степени способны ускорять процессы реиннервации, сокращая срок периода восстановления более чем на треть [Черний В.И., Шраменко Е.К., Бувайло И.В., 2007]. Препаратами же выбора при ХВДП являются кортикостероиды, назначение которых больным СГБ противопоказано [Пирадов М.А., Супонева H.A., 2007]. Учитывая столь разные подходы к лечению, дифференциальная диагностика СГБ и ХВДП с острым началом представляет актуальную проблему современной медицины.

Следует отметить, что используемые в настоящее время диагностические критерии, включая электронейромиографию, не позволяют четко дифференцировать СГБ и ХВДП с острым началом, что создает еще одно актуальное направление научного поиска в области клинико-лабораторной диагностики и формирования современных подходов к прогнозированию осложнений распространенных инфекционных заболеваний.

Цель исследования:

Оптимизация дифференциальной клинико-лабораторной диагностики аксонально-демиелинизирующих полиневропатий, ассоциированных с инфекционными заболеваниями, на основе протеомных технологий и методов иммунологического исследования.

Задачи исследования:

1. Установить этиологическую роль инфекционных агентов в развитии аксонально-демиелинизирующих полиневропатий.

2. Определить значение рутинных клинико-лабораторных и инструментальных данных обследования больных СГБ и ХВДП в качестве дифференциально диагностических признаков этих заболеваний.

3. Осуществить идентификацию протеомного профиля сывороток крови больных аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями с использованием времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии.

4. Разработать критерии протеомной дифференциальной диагностики синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии.

5. Выявить характер иммунологических сдвигов со стороны основных субпопуляций лимфоцитов крови, а также субпопуляций и функционального состояния естественных киллеров (ЕК) и ЕКТ при аксонально-демиелинизирующих полиневропатиях, в том числе в соответствии с этиологией ассоциированного инфекционного процесса.

6. Разработать иммунологические дифференциально-диагностические критерии аксонально-демиелинизирующих полиневропатий с учетом этиологии инфекционного процесса, предшествующего развитию демиелинизации.

Научная новизна работы.

На основе широкого спектра современных клинико-инструментальных, клинико-лабораторных, протеомных и иммунологических методов исследований в процессе выполнения диссертационных исследований впервые:

• Установлены количественные различия по содержанию форменных элементов крови, степени роста активности ферментов и уровню падения цинка в крови при СГБ и ХВДП, подтверждающие перспективность использования протеомной диагностики при аксонально-демиелинизирующих полиневропатиях.

• Выявлены качественные различия влияния этиологического фактора предшествующего инфекционного процесса на содержание лимфоцитов в крови больных синдромом Гийена-Барре, а также при ХВДП, подтверждающие перспективность использования иммунодиагностики при этих заболеваниях.

• Определены уникальные наборы пиков масс-спектров сывороток крови больных синдромом Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатией с определенными значениями соотношения молекулярной массы к заряду (ш/z), которые могут являться биомаркерами данных заболеваний.

• Разработан алгоритм включения масс-спектрометрического анализа сыворотки крови в дифференциальную диагностику острых и хронических аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий.

• Расшифрованы неизвестные ранее стороны иммунопатогенеза аксонально-демиелинизирующих полиневропатий с участием CD56+ клеток крови и установлены иммунопатогенетические особенности синдрома Гийена-Барре, ассоциированного с некоторыми инфекционными агентами.

• Разработан набор вспомогательных иммунологических критериев дифференциальной диагностики аксонально-демиелинизирующих полиневропатий, обладающих высокой специфичностью, умеренной диагностической точностью при относительно невысоких показателях чувствительности.

• Разработан набор вспомогательных иммунологических критериев для оценки роли инфекционного агента в развитии синдрома Гийена-Барре, обладающий умеренной чувствительностью при высокой специфичности и диагностической точности.

Практическая значимость.

Оценка иммунологических сдвигов на основе типовых иммунограмм, а также углубленный анализ комплекса иммунологических показателей, основанных на оценке субпопуляционного состава и функционального состояния СБ56+ клеток периферической крови, позволили на основе вновь полученных данных уточнить иммунопатогенез аксонально-демиелинизирующих полиневропатий. Было установлено, что при синдроме Гийена-Барре наблюдается снижение активационных процессов у СБ56+ клеток крови и падение числа естественных киллеров, осуществляющих реакции естественной цитотоксичности, особенно выраженные при ассоциации заболевания с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией. Иммунопатогенетической особенностью ХВДП служило снижение в крови числа СБ56+ клеток, осуществляющих реакции антителозависимой цитотоксичности.

На основе масс-спектрометрического исследования предложен способ дифференциальной диагностики аксонально-демиелинизирующих

полиневропатий с использованием протеомных технологий, что позволяет с достаточно высокими показателями специфичности и чувствительности различать синдром Гийена-Барре и хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию (в том числе с острым началом).

На основе иммунологических исследований установлены критерии вспомогательной дифференциальной диагностики хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии и синдрома Гийена-Барре как осложнения инфекционных процессов различной этиологической структуры.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клинические, инструментальные и лабораторные методы исследования позволяют подтвердить развитие у больного аксонально-демиелинизирующей полиневропатии, но малоинформативны при дифференциальной диагностике синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии с острым началом, а также при определении связи синдрома Гийена-Барре с предшествующим инфекционным процессом.

2. Времяпролетная МАЛДИ-масс-спектрометрия позволяет выявлять протеомные профили сыворотки крови больных аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями, на основе которых с высокой чувствительностью и специфичностью можно дифференцировать синдром Гийена-Барре и хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию с острым началом.

3. Иммунологическое исследование крови больных аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями с определением субпопуляционного состава и функциональной активности СБ56+ клеток способствует выявлению дополнительных дифференциально-диагностических критериев этих заболеваний.

4. Иммунологическое исследование крови больных синдромом Гийена-Барре с определением субпопуляционного состава и функциональной активности СБ56+ клеток позволяет установить категориальные иммунологические критерии этого заболевания в зависимости от предшествующего инфекционного процесса.

Внедрение результатов работы в клиническую практику и учебный процесс.

Новые сведения о роли ЕК и ЕКТ в иммунопатогенезе аксонально-демиелинизирующих полиневропатий используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета (МГМСУ).

Предложенный протеомный способ дифференциальной диагностики аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий используется в научно-диагностических исследованиях лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГУ НИИ ФХМ ФМБА России (руководитель лаборатории - профессор, д.м.н. В.М. Говорун).

Разработанные иммунологические тесты применяются для дифференциальной диагностики острых аксонально-демиелинизирующих

полиневропатий в работе лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России.

На способ дифференциальной диагностики острых аксонально-демиелинизирующих полиневропатий получено разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения на применение медицинской технологии «Метод выделения наборов пептидов из сыворотки крови человека на базе магнитных микрочастиц с различной поверхностной функциональностью при аксонально-демиелинизирующих заболеваниях нервной системы» (ФС № 2010/407 от 03.12.2010 г.).

Апробация результатов исследования и публикации.

Основные положения работы заслушаны и обсуждены на II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010); III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2011); Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2009); Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2010 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2010); ХХХП1 Итоговой конференции молодых ученых МГМСУ (Москва, 2011); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011); Обществе молодых ученых МГМСУ (Москва, 2011); заседании кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ (Москва, 2011, протокол №109).

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе: в центральной печати и изданиях, рекомендуемых ВАК РФ - 3.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 187 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 44 рисунками. Список литературы содержит 184 источников, из которых 39 отечественных и 145 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Под нашим наблюдением в период с 2008 по 2011 год находилось 84 больных аутоиммунными аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями в возрасте старше 16 лет без ограничения по полу и тяжести болезни, госпитализированных в Научный центр неврологии РАМН (директор - академик РАМН, профессор, д.м.н. З.А.Суслина), а также 32 практически здоровых человека, составившие контрольную группу.

На основании результатов комплексного клинико-лабораторного обследования синдром Гийена-Барре был диагностирован у 42 пациентов, хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия - у 26 человек. У 16 больных с предварительным диагнозом аксонально-демиелинизирующей полиневропатии после проведенного обследования были диагностированы другие заболевания (рассеянный склероз, спинальная амиотрофия, васкулит и др.), в связи с чем они были исключены из исследования.

Согласно дизайну исследования критериями включения больных в основную группу наблюдения были: верифицированный диагноз демиелинизирующей полиневропатии (СГБ, ХВДП); возраст старше 16 лет; информированное согласие пациента на обследование. Критериями исключения пациентов из исследования являлись: полиомиелит; ботулизм; дифтерия; ВИЧ-инфекция; миастения; токсическая полиневропатия; сахарный диабет; нарушение обмена порфиринов; хронический алкоголизм и/или

наркомания; органические поражения ЦНС; диагностированная ВИЧ-инфекция при обследовании в катамнезе; отказ от исследования.

Половые и возрастные характеристики пациентов СГБ, ХВДП, а также контрольной группы примерно соответствовали друг другу.

Диагноз «синдром Гийена-Барре» устанавливался на основании диагностических критериев ВОЗ, предложенных в 1993 году. Диагноз «хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия» устанавливался на основании критериев Американской академией неврологии, а также критериев Заревет и ИЧСАТ, предложенных группой по изучению причин и лечению воспалительных невропатий. В схему клинического исследования входили учет анамнестических данных по взаимосвязи заболевания с инфекционными процессами, регистрация неврологических симптомов, оценка тяжести двигательного дефицита по Североамериканской шкале, а также силы отдельных групп мышц по специальной шкале баллов.

Всем больным и лицам группы контроля проводилось комплексное лабораторное обследование, включающее клинический анализ крови, клинический анализ мочи, биохимический анализ крови, определение антител классов М и в к кампилобактеру, вирусам простого герпеса I и II типов, цитомегаловирусу, Эпштейна-Барр вирусу, микоплазме пневмонии, хламидофиле пневмонии, определение маркеров гепатитов В (HBsAg) и С (анти-НСУсумм.), антител к ВИЧ, определение суммарных аутоантител к ганглиозидам периферических нервов и к миелин-ассоциированному гликопротеину, исследование иммунологических показателей крови (типовая иммунограмма, определение субпопуляционного состава и функционального состояния СБ56+ клеток), протеомное исследование сывороток крови. В последнем случае осуществлялось фракционирование сывороток крови на магнитных микрочастицах со слабой катионно-обменной поверхностью с последующей времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрией и анализом полученных данных с использованием пакета компьютерных программ и разработкой математических классификационных моделей СГБ и ХВДП. Кроме этого, всем больным проводились: клинический анализ цереброспинальной жидкости,

электронейромиографическое исследование (ЭНМГ), МРТ и/или KT головного и спинного мозга.

Иммунологические и гематологические исследования осуществлялись в лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний НИМСИ МГМСУ (зав. лабораторией - д.м.н., профессор И.П. Балмасова; исполнители -к.м.н. М.М. Гультяев; к.м.н. Е.В. Шмелева), общеклинические исследования - на клинической базе кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России (зав. кафедрой - академик РАМН, д.м.н., профессор Н.Д. Ющук). Протеомное исследование сывороток крови проводилось в лаборатории института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (руководитель работ - д.м.н., профессор В.М. Говорун; исполнители - д.б.н. E.H. Ильина, к.х.н. Р.Х. Зиганшин, к.х.н. Л.Н. Икрянникова).

Для статистической обработки полученных результатов математический и статистический анализ проводился при помощи пакета статистических программ SPSS (17-ая версия, допустимая ошибка Е=5%). При этом осуществлялась предварительная многофакторная подготовка полученных результатов исследований с созданием блоков электронных таблиц. После контроля нормальности распределения данных применялись методы непараметрической статистики с использованием критериев Манна-Уитни для сравнения средних величин и критерия у? для сравнения показателей частот. Оценка взаимосвязи разных категорий параметров осуществлялась с помощью корреляционного анализа с использованием коэффициента корреляции Спирмена и определением достоверности силы связей. Для подтверждения информативности полученных данных проводился дискриминантый анализ. Для статистической обработки результатов протеомных исследований использовали программное обеспечение фирмы Bruker Daltonics (Германия), включающее программы FlexControl 2.4 (Build 38), FlexAnalysis 2.4 (Build 11) и ClinProTools 2.2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одной из первых задач исследования служило выявление влияния предшествующего инфекционного процесса на клинические проявления и

лабораторно-диагностические признаки аксонально-демиелинизирующих полиневропатий. Было показано, что в большинстве случаев развитию синдрома Гийена-Барре предшествовало развитие острой кишечной или острой респираторной инфекций. Наиболее многочисленную группу составили больные, у которых СГБ был ассоциирован исключительно с кампилобактериозом (31%) как это представлено на рисунке 1, что в полной мере соответствует данным литературы о ведущей роли возбудителей в патогенезе синдрома Гийена-Барре [Israeli Е., Agmon-Levin N., Blank М. et al., 2010; Taylor B.V., 2004]. Второе место по частоте занимала цитомегаловирусная инфекция (14%). На третьем месте была Эпштейна-Барр вирусная инфекция (12%). В одном случае заболевание было связано с вакцинацией, в 22% случаев была подтверждена этиологическая роль вирусов простого герпеса 1 и 2 типа, хламидий, микоплазм, а также их ассоциаций. В 19% случаев этиологию СГБ установить не удалось.

Рисунок 1. Частота обнаружения антител класса М к исследуемым инфекционным агентам у больных СГБ и ХВДП

_2% _

□ кампилобактер с цитомегаловирус о вирус Эпштейна-Барр □ вакцинация в прочие возбудители_и этиология не установлена

Необходимо отметить, что обнаружение ^М-антител к названным микробным агентам при наличии или отсутствии манифестных проявлений инфекционного процесса не могло служить диагностическим критерием синдрома Гийена-Барре, поскольку названные антитела регистрировались и при ХВДП, хотя частота их встречаемости в последнем случае не превышала 27% по каждому возбудителю.

Следующей задачей исследования служило определение значения рутинных клинико-лабораторных и инструментальных результатов обследования больных СГБ и ХВДП в качестве дифференциально-диагностических признаков этих заболеваний.

Было установлено, что в остром периоде клинические признаки синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии, как и электронейромиографическое исследование, не позволяют провести их четкую дифференциальную диагностику.

Тем не менее, детальный анализ клинико-лабораторных проявлений аксонально-демиелинизирующих полиневропатий позволил выявить некоторые особенности данных заболеваний. Так, в частности, у больных синдромом Гийена-Барре тяжесть двигательного дефицита при оценке по североамериканской шкале и снижение силы мышц в проксимальных отделах нижних конечностей проявлялись в большей степени, чем при ХВДП. При СГБ, как правило, наблюдались более выраженные сдвиги в содержании форменных элементов крови, росте активности ферментативных систем и падении уровня цинка в крови, однако в большинстве случаев различия показателей носили количественный, но не качественный характер, что затрудняло их использование как дифференциально-диагностических признаков СГБ и ХВДП. В то же время было обнаружено одно качественное различие при выполнении гемометрии в виде разнонаправленных изменений со стороны содержания лимфоцитов в крови при СГБ и ХВДП, что делало перспективным иммунологические исследования при данных заболеваниях, а наличие значительных биохимических сдвигов со стороны белковых компонентов крови подтвердило целесообразность использования протеомных технологий.

В связи с вышеизложенным одной из задач нашего исследования стала идентификация протеомного профиля сывороток крови больных аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями с использованием времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии и разработкой критериев дифференциальной диагностики СГБ и ХВДП. При этом был использован подход, основанный на сравнении протеомных профилей сывороток крови больных и здоровых людей без идентификации отдельных биомаркеров.

В результате такого подхода с помощью генетического алгоритма была создана протеомная классификационная модель «СГБ-контроль», в которой были идентифицированы несколько пиков, в наибольшей степени

характеризующих отличие белкового-пептидного состава сыворотки крови больных СГБ от такового у здоровых людей. Значения масса/заряд (m/z) выявленных дискриминантных пиков приведены в таблице 1.

Таблица 1. Значения m/z пиков, вошедших в классификационную модель сывороток крови «СГБ-контроль»

Порядковые номера пиков Значения m/z пиков Значения m/z, соответствующие началу пиков Значения m/z, соответствующие концу пиков Статистические веса пиков

34 1945 1937 1950 2,006001001

60 2787 2780 2796 1,787940192

102 4478 4463 4482 1,349909864

87 3985 3976 3990 0,928244527

62 2844 2834 2851 0,738832543

45 2240 2234 2245 0,678443885

219 11784 11774 11797 0,266230980

Полученная классификационная модель сывороток крови «СГБ-контроль» со 100% специфичностью и чувствительностью (чувствительность в данном случае -процент правильно идентифицированных сывороток крови больных СГБ, специфичность - процент правильно идентифицированных сывороток крови практически здоровых лиц контрольной группы) различала масс-спекгры двух экспериментальных групп (кросс-валидация по двум группам - 94%).

Аналогичным образом, с помощью генетического алгоритма, были определены особенности протемных профилей в модели «ХВДП-контроль» и выявлены шесть статистически значимых масс-спектрометрических пиков. Значения масса/заряд (m/z) выявленных дискриминантных пиков для данной классификационной модели приведены в таблице 2.

Таблица 2. Значения m/z пиков, вошедших в классификационную модель сывороток крови «ХВДП-контроль»

Порядковые номера пиков Значения m/z пиков Значения m/z, соответствующие началу пиков Значения m/z, соответствующие концу пиков Статистические веса пиков

34 1945 1940 1950 2,051317454

32 1886 1883 1891 1,923997493

19 1490 1486 1497 1,749895004

86 3985 3975 3989 1,454915710

23 1553 1549 1558 1,090828045

77 3401 3399 3412 1,082192700

222 11784 11768 11797 0,265484282

Полученная классификационная модель «ХВДП-контроль» с 94% специфичностью и 100% чувствительностью различала масс-спектры двух экспериментальных групп (кросс-валидация по двум группам - 100%).

Таким образом, наличие в масс-спектре сыворотки крови больного набора пиков со следующими значениями соотношения молекулярной массы к заряду (m/z): 1945,3; 2877,2; 4477,8; 3985,3; 2843,6; 2239,5, позволяет диагностировать у пациента СГБ, наличие пиков со следующими значениями соотношения молекулярной массы к заряду(ш/г): 1945,3; 1886,2; 1490,0; 3985,3; 1552,5; 3401,4, позволяет диагностировать у пациента ХВДП, а отсутствие указанных наборов пиков в масс-спектре сыворотки крови свидетельствует об отсутствии у пациента аксонально-демиелинизирующей полиневропатии.

Помимо протемных, выявлялся характер иммунологических сдвигов со стороны основных субпопуляций лимфоцитов крови, а также субпопуляций и функционального состояния естественных киллеров и ЕКТ (CD56+ клеток) при аксонально-демиелинизирующих полиневропатиях, в том числе в соответствии с этиологией ассоциированного инфекционного процесса.

При исследовании типовых иммунограмм были обнаружены признаки, позволяющие по-разному характеризовать иммунные процессы у больных СГБ и ХВДП. Если у больных СГБ основные иммунологические сдвиги проявлялись падением числа естественных киллеров в крови, то у больных ХВДП основные изменения наблюдались со стороны Т-клеточного звена иммунной системы крови. В последнем случае наиболее значимым было снижение такой категории Т-клеток, как ЕКТ, число которых у больных ХВДП было более чем в 10 раз ниже по сравнению с аналогичным показателем у здоровых людей. Сдвиги со стороны ЕКТ сопровождались значительным ростом CD4+ субпопуляции этих клеток, регулирующей соотношение Т-хелперов 1 и 2 типов, который происходил за счет падения числа ЕКТ с супрессорными свойствами (CD8+). Аналогичные изменения со стороны субпопуляционного состава этих клеток наблюдались и при СГБ, но они не сопровождались падением общего числа данной категории Т-лимфоцитов в крови. Что касается активности Т-клеток, то она была снижена и у больных СГБ, и

у больных ХВДП, что проявлялось падением показателя поздней активации Т-клеток (СБЗ+/НЬА-БЯ+).

Учитывая полученные данные и интерпретируя наблюдаемые сдвиги, необходимо подчеркнуть, что основным иммунопатогенетическим звеном при синдроме Гийена-Барре следует признать популяцию естественных киллеров. Снижение их числа в крови больных с данной патологией предполагает неоднозначную оценку, поскольку может быть связано не только с нарушением дифференцировки и поступления в кровоток этих клеток, но и с возможностью их миграции в нервную ткань, где они принимают участие в повреждении нервных волокон механизмами естественной или антителозависимой цитотоксичности. В связи с этим для проверки этого предположения и выявления ведущего механизма повреждения нервных волокон при СГБ с участием естественных киллеров желательно было бы установить соотношение клеток, участвующих в реакциях естественной и антителозависимой цитотоксичности. С этой целью анализировалась экспрессия на мембранах ЕК рецепторов, регулирующих эти реакции. Так, в частности, было установлено значительное снижение экспрессии рецепторов, отвечающих за активацию естественных цитотоксических реакций: СБ 15 8а,И, >ПШ2Б, ЫКр46. При этом экспрессия рецепторов антителозависимой цитотоксичности при СГБ также снижалась, но в значительно меньшей степени, а соотношение рецепторов естественной (ЫКр46) и антителозависимой (СБ 16) цитотоксичности выглядело как 1:1,25, то есть было сдвинуто в пользу последней.

Известно, что реакции антителозависимой цитотоксичности входят в патогенез аутоиммунного повреждения клеток при наличии аутоантител к определенным клеточным компонентам. С этой точки зрения особый интерес представляет определение антител к компонентам миелина нервных волокон у больных СГБ. По нашим данным, с абсолютной частотой у таких больных регистрируются антитела к миелин-ассоциированному гликопротеину, примерно в трети случаев - к ганглиозиду Мь а в 20% - к ганглиозиду Б1Ь. Такой широкий спектр аутоантител у больных СГБ делает вполне вероятным участие естественных киллеров в реакциях антителозависимой цитотоксичности, которые могут претендовать на ведущий механизм

повреждения нервных волокон при данном заболевании, а показатели числа и функционального состояния ЕК - на критерии дифференциальной диагностики СГБ.

Для того чтобы оценить дифференциально-диагностическое значение названных критериев, необходимо проанализировать в сопоставительном аспекте иммунопатогенетические особенности ХВДП. Как указывалось выше, иммунологические сдвиги при ХВДП носят скорее не врожденный, а специфический (приобретенный) характер. Об этом свидетельствует достоверный рост числа Т-лимфоцитов в крови данных больных на фоне падения функционально активности Т-клеток (достоверно снижено число СБЗ+/НЬА-Б1И-и числа ЕКТ СОЗ+/СБ56+). При хронических проявлениях аксонально-демиелинизирукмцих полиневропатий в аутоиммунных реакциях практически не принимали участие естественные киллеры, поскольку в данном случае наблюдалось резкое снижение экспрессии рецепторов антителозависимой цитотоксичности этих клеток - в 5,3 раза. Иными словами, развитие аутоиммунных процессов при ХВДП носит более специфичный характер и сопровождается повреждением нервных волокон с участием реакций адаптивного иммунитета. В связи с этим иммунодиагностические критерии ХВДП при дифференциальной диагностике с СГБ могут быть сориентированы на более значительное снижение в крови ЕКТ и СО 16+ ЕК, а также более высокое содержание в крови ЕК, компенсаторно экспрессирующих рецепторы, активирующие реакции естественной цитотоксичности (МСр46, С0158Ь).

С учетом целесообразности поиска дифференциально-диагностических иммунологических критериев СГБ и ХВДП было установлено, что такие показатели как число ЕКТ в целом и содержание в крови их СБ4+ субпопуляции, число ЕК, а также число клеток, экспрессирующих Жр46 и СБ 16, могут иметь критериальное значение. При этом набор следующих признаков: число СБЗ+/СБ56+/СВ4+ в диапазоне ниже 27,4% или выше 47,1%; число СБ56+/Жр46+ клеток ниже 63,2%; число СБ56+/С016+ клеток выше 20,7%; а также отсутствие аутоантител к ганглиозиду <3ц,, с 50% чувствительностью, 100% специфичностью и 75% диагностической точностью свидетельствует о наличии у

больного синдрома Гийена-Барре. В связи с невысокой чувствительностью иммунологического теста его следует оценивать как вспомогательный дифференциально-диагностический критерий.

При ХВДП набор дифференциально-диагностических признаков был иным и включал: число СБЗ+/С056+ клеток ниже 1,1%, число СБЗ-/СБ56+ клеток выше 12,3%, число СБ56+МКр46+ клеток выше 61,5%, число СВ56+/СБ16+ клеток ниже 30,4%. Чувствительность такого теста была значительно выше - 82%, высокая специфичность соответствовала таковой при СГБ - 100%, а диагностическая точность значительно превышала этот показатель для теста при СГБ - 91%.

Относительно низкая чувствительность иммунологического теста при СГБ по сравнению с высокой чувствительностью такового при ХВДП, заставила проанализировать возможность влияния предшествующего инфекционного процесса на иммунологические сдвиги при СГБ. Можно предположить, что характер антигенной мимикрии, лежащей в основе инициации аутоиммунных процессов при СГБ, может в значительной степени зависеть от антигенной структуры микробного возбудителя, что модулирует иммунный ответ в каждом конкретном случае и снижает чувствительность иммунодиагностического тестирования при данном заболевании. В связи с этим было целесообразно решение задачи по разработке иммунологических дифференциально-диагностических критериев с учетом этиологии инфекционного процесса, предшествующего развитию синдрома Гийена-Барре.

Действительно, оказалось, что разные микробные агенты по-разному влияют на иммунный ответ, что проявляется различием по дифференциально-диагностическим иммунологическим критериям. При СГБ, ассоциированном с кампилобактером, удалось сформировать следующий набор характерных иммунологических признаков: число СБЗ+/СБ4+ клеток в диапазоне от 37% до 51,8%, иммунорегуляторный индекс ниже 1,85%, число СБЗ+/СВ56+ клеток выше 1,22%, число СБЗ+/СВ56+/СБ8+ клеток в диапазоне от 63,8% до 78,5%. Этот тест повысил чувствительность определения данной категории синдрома Гийена-Барре до 67% при специфичности 100% и диагностической точности

84%. В тех случаях, когда СГБ был ассоциирован с цитомегаловирусной инфекцией, диагностически значимыми были два критерия: число СБ56+/СБ94+ клеток выше 50,9%, а число СБ56+/СВ16+ клеток выше 58,3% при 100% чувствительности, 80% специфичности и 90% диагностической точности. Еще большее диагностическое значение приобретало иммунологическое тестирование при СГБ, ассоциированном с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией. Такие критерии, как число СБЗ+/СБ8+ клеток ниже 0,6*109/л, число СОЗ-/СВ56+ клеток ниже 0,1*109/л, число СБ56+/Жр46+ кпеток ниже 16,1% повышали чувствительность иммунологического теста до 100%, специфичность до 90%, диагностическую точность до 95%. Таким образом, по результатам проведенных исследований можно предложить алгоритм диагностики аксонально-демиелинизирующих полиневропатий (рисунок 2).

Соответствие шкале критериальных признаков СГБ с учетом вида причинного микроорганизма

Соответствие шкале критериальных признаков ХВДП

НТ? ¿КГ* 1 'Ь^'Н Г* Г^У

^чгссг^л-.т л;

^шттшп

■[©ЛЯ'!;

•лтяп

Рисунок 2. Алгоритм дифференциальной диагностики СГБ и ХВДП

22

ВЫВОДЫ

1. Включение в число клинико-лабораторных исследований при аксонально-демиелинизирующих полиневропатиях протеомных технологий и иммунологических методов, позволяет проводить дифференциальную диагностику синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии с острым началом.

2. Этиологически значимым при развитии синдрома Гийена-Барре в 31% случаев был исключительно кампилобактер, в 14% случаев -цитомегаловирус и в 12% случаев - Эпштейна-Барр вирус. В 22% случаев наблюдалась микст-инфекция, вызванная сочетанием названных возбудителей с вирусами простого герпеса 1 и 2 типа, хламидиями и микоплазмой.

3. В периоде нарастания неврологической симптоматики клинико-лабораторные признаки и электронейромиографическое исследование не позволяют проводить четкую дифференциальную диагностику синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии с острым началом.

4. Развитие синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии сопровождается изменением белково-пептидных паттернов, регистрируемых в сыворотке крови больных, что может отражать реальные колебания концентраций белков и пептидов, напрямую ассоциированных с данными заболеваниями.

5. С помощью генетического алгоритма на основе масс-спектрометрических профилей образцов сывороток крови больных аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями созданы классификационные модели «СГБ-контроль» и «ХВДП-контроль», которые позволяют с высокими значениями специфичности и чувствительности дифференцировать названные заболевания.

6. Иммунопатогенез синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии различается по ведущим механизмам развития и участию разных категорий лимфоцитов в иммунном процессе, зависит от этиологии и служит основой для разработки дифференциально-диагностических критериев СГБ и ХВДП.

7. Существует 4 категории дифференциально-диагностических иммунологических критериев синдрома Гийена-Барре в соответствии с этиологией предшествующего инфекционного процесса. При СГБ, ассоциированного с кампилобактером: число СБЗ+/СБ4+ клеток в диапазоне 37%-51,8%; ИРИ<1,85; число СВЗ+/СБ56+ клеток >1,22%; СВЗ+/СВ56+/СВ8+ клеток в диапазоне 63,8%-78,5%. При СГБ, ассоциированным с ЦМВ: число СВЗ +/СВ56+/СБ4+ клеток в диапазоне 27,4% - 47,1%, число СВ56+/СВ94+ клеток >50,9%; число СВ56+/СВ16+ >58,3%. При СГБ, ассоциированным с ЭБВ: число СВЗ+/СВ8+ клеток <0,6*10%; число СВЗ+/СВ56+ клеток <0,1*10%; число СВ56+/№Ср46+ клеток <16,1%. При прочей этиологии СГБ: число СБЗ+/СВ56+/СБ4+ клеток в диапазоне 27,4% - 47,1%, число СВ56+/ЫКр46+ клеток <63,2%, число СВ56+/СВ16+ клеток >20,7%. При любой этиологии -отсутствие аутоантител к ганглиозиду 0]ь- Чувствительность теста составляет 50%, специфичность -100%, диагностическая точность - 75%.

8. В дифференциально-диагностические иммунологические критерии хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии входят следующие показатели: число СВЗ+/СВ56+ клеток <1,1%, число СБЗ-/СБ56+ клеток >12,3%, число СБ56+/Жр46+ клеток >61,5%, число СБ56+/СБ16+ клеток <30,4%. Чувствительность теста составляет 82%, специфичность —100%, диагностическая точность - 91%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Первый этап диагностики острых симптомов двигательных и чувствительных нарушений предполагает:

• Выявление анамнестической связи заболевания с предшествующим инфекционным процессом или вакцинацией.

• Оценку клинических данных по диагностическим критериям ВОЗ для синдрома Гийена-Барре или по критериям Американской академии неврологии для хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии.

• Проведение электронейромиографического исследования.

• Постановку предварительного диагноза синдрома Гийена-Барре или хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии с острым началом.

2. На втором этапе диагностики аксонально-демиелинизирующих полиневропатий рекомендуется:

• Проведение времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии с определением протеомных профилей сыворотки крови больных.

• Определение соответствия полученного протеомного профиля сыворотки крови классификационной модели «СГБ-контроль» или «ХВДП-контроль». При соответствии протеомного профиля сыворотки крови одной из классификационной модели у больного диагностируют синдром Гийена-Барре или хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию с острым началом.

• При полном отсутствии соответствия протеомных профилей обеим классификационным моделям у больного исключают наличие аксонально-демиелинизирующей полиневропатии.

• При получении нечеткого соответствия протеомных профилей сыворотки крови классификационным моделям переходят к третьему этапу исследований.

3. На третьем этапе исследования проводят иммунологическое тестирование в соответствии со следующим алгоритмом:

• У больных с предварительным диагнозом синдрома Гиена-Барре методом иммуноферментного анализа определяют наличие: аутоантител к GQib; IgM-антител к Campylobacter jejuni, IgM-антител к ЦМВ; IgM-антител к ЭБВ.

• У больных методом проточной цитофлуориметрии определяют следующие показатели крови: относительное число CD3+/CD4+ клеток; абсолютное число CD3+/CD8+ клеток; иммунорегуляторный индекс; относительное число CD3+/CD56+ клеток; относительное число CD3-/CD56+ клеток; абсолютное число CD3-/CD56+ клеток; процентное содержание среди ЕКТ CD3+/CD56+/CD4+ клеток; процентное содержание среди ЕКТ CD3+/CD56+/CD8+ клеток; процентное содержание среди CD56+ клеток

СБ94+; процентное содержание среди СЭ56+ клеток Жр46+; процентное содержание среди СБ56+ клеток С016+.

• Оценивают результаты иммунологических исследований в соответствии со шкалой критериальных признаков:

Диагноз Иммунологические показатели Диапазоны критериальных значений

СГБ, ассоциированный с кампилобаетером СОЗ+/СБ4+ ИРИ С03+/С056+ С03+/С056+/СР8+ Ап1!-О01Ь 37,0%-51,8% <1,85 >1,22% 63,8%-78,5% Нет

СГБ, ассоциированный с цитомегаловирусом С056+/СР94+ С056+/СБ1б+ Апй-0(31Ь >50,9% >58,3% Нет

СГБ, ассоциированный с Эпштейна-Барр вирусом СОЗ+/СР8+ СОЗ-/СБ56+ С056+/ЫКр46+ Апй-С01Ь <0,60 ♦Ю'кл./л <0,10 *109кл./л <16,1% Нет

СГБ, ассоциированный с прочими патогенами СВЗ+/СБ56+/С04+ С056+/ЫКр46+ С056+/С016+ АШ1-С(31Ь <27,4% или >47,1% <63,2% >20,7% Нет

ХВДП С03+/С056+ СШ-/С056+ С056+/ЫКр46+ С056+/СБ16+ <1,10% >12,3% >61,5% <30,4%

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ющук Ы.Д., Тнмчсико ОЛ., Морозова ЕЛ., Федькина Ю.А. Совершенствование алгоритма диагностики демиелинизирующих полиневропатий // Лечащий врач. - 2009. - №10. - С. 5-9.

2. Балмасова И.П., Гультяев М.М., Климова Е.Д., Федькина Ю.А. и др. Совершенствование алгоритма диагностики и прогнозирования течения демиелинизирующих заболеваний нервной системы на основе определения пептидного состава основного белка миелина в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости больных // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы». Москва. - 2009. - С. 208-209.

3. Ющук Н.Д., Тимченко О.Л., Федькина Ю.А. и др. Протеомные методы в диагностике демиелинизирующих полиневропатий, как осложнений некоторых инфекционных заболеваний // Материалы II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. Москва. - 2010. - С. 381.

4. Балмасова И.П., Гультяев М.М., Климова Е.А., Федькина Ю.А. и др. Совершенствование алгоритма диагностики и прогнозирования течения демиелинизируклцих заболеваний нервной системы на основе определения пептидного состава основного белка миелина в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости больных // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2010 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы». Москва. - 2010.

5. Ющук 11.Д., Морозова Е.А., Тимченко ОЛ., Федькина ЮЛ., Балмасова И.П. // Кластерный подход к определению клинической формы синдрома Гииеиа-Барре // Хирург. - 2010. -№12. - С. 4-9.

6. Зиганшин Р.Х., Араниди Г.П., Азаркин II.В., Федькина Ю.А. и др. // Протеомные технологии для выявления в сыворотке крови потенциальных биомаркеров аутоиммунных демиелинизирующих полииевропатий // Биоорганическая химия. - 2011. - том 37, №1. - С. 36-44.

7. Ющук Н.Д., Тимченко О.Л., Федькина Ю.А. Иммунологические и этиологические особенности аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий инфекционного генеза // Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. Москва. -2011.-С.418.

8. Федькина Ю.А., Тимченко O.JL, Ющук Н.Д. Использование протеомных методов исследования для диагностики постинфекционных аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий // Сборник материалов XVIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - 2011. - С. 288.

9. Федькина Ю.А. Использование протеомных методов исследования для диагностики аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий инфекционного генеза // Труды XXXIII Итоговой конференции молодых ученых МГМСУ. Москва. - 2011.

10. Yushuk N.D., Timchenko O.L., Fedkina Y.A. Diagnostik von axonal-demyelinisierenden Polyneuropathien basierend auf den proteomischen technologien // Internationaler Kongress Fachmesse. Moderne Aspecte der Prophylaxe, Behandlung und Reabilitation. Euromedica Hannover 2011. P.- 160-161.

Выдано разрешение на применение новой медицинской технологии ФС№ 2010/407 от 03 декабря 2010 г. «Метод выделения наборов пептидов из сыворотки крови человека на базе магнитных микрочастиц с различной поверхностной функциональностью при аксонально-демиелинизирующих заболеваниях нервной системы».

Имеется положительное решение о выдаче патента на изобретение №2010126543/14 (037821) от 30.06.2010 «Способ дифференциальной диагностики форм синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии с острым началом».

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения ЭНМГ - электронейромиография

ЦНС - центральная нервная система

ГА - генетический алгоритм

ЕК - естественные киллеры

ИРИ - иммунорегуляторный индекс

ИФА - иммуноферментный анализ

кДа - килодальтон

СГБ - синдром Гийена-Барре

аснало-GM! - ганглиозид аеиало-Mi

GMi - ганглиозид Mi

GM2 - ганглиозид Мг

GDia - ганглиозид Dia

GDib - ганглиозид Dib

GQib - ганглиозид Q)b

ХВДП - хроническая воспалительная

демиелинизирующая полиневропатия

Выражаю глубокую благодарность научным руководителям - академику РАМН, профессору, д.м.н. Ющуку Николаю Дмитриевичу; профессору, д.м.н. Балмасовой Ирине Петровне и научному консультанту профессору, д.м.н. Пирадову Михаилу Александровичу за оказанную помощь при выполнении диссертационной работы.

Выражаю огромную благодарность доценту кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ, к.м.н. Тимченко Ольге Леонидовне за вдохновение, тепло, сердечность и неоценимую помощь в работе.

Выражаю благодарность старшим научным сотрудникам, к.м.н. Гультяеву М.М., к.м.н. Шмелевой Е.В. и всем сотрудникам лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний отдела клинической медицины НИМСИ МГМСУ; старшему научному сотруднику отделения реанимации НЦН РАМН, к.м.н. Супоневой H.A. за оказанную мне практическую, методическую и консультативную помощь при выполнении работы.

Также благодарю сотрудника лаборатории института биоорганической химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова к.х.н. Зиганшина Р.Х. за оказанную помощь в проведении протеомных методов исследований.

Заказ №567. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш» г. Москва, ул. Палиха-2а, тел.250-92-06

В клинике инфекционных болезней одним из тяжелых осложнений бактериальных и вирусных инфекций являются аутоиммунные аксонально-демиелинизирующие полиневропатии, которые характеризуются множественным поражением периферических нервов [26, 32, 36, 75, 80}.

Известно, что инфекционные агенты могут вызывать демиелинизацию нервного волокна как в виде прямого повреждающего действия, так и опо-. средованно, вследствие развития, каскада иммунологических реакций, возникающих во время или после стихания клинических проявлений инфекционного процесса [1, 29, 37, 85]. В последнем случае в основе патогенеза демие-линизации лежит феномен молекулярной мимикрии микробных возбудителей, запускающий, аутоиммунные процессы [40, 51, 78, 144]. В' результате возникают перекрестные иммунологические реакции между структурными элементами- миелиновой) оболочки периферических нервов и структурными элементами клеточной оболочки микроорганизмов, причем в последние годы некоторые исследователи- выявили возможность выработки антител даже к структурам аксона-[55, 74, 77].

Одним из наиболее тяжелых заболеваний периферической нервной системы и самой частой причиной острых, периферических параличей аутоиммунной природы, ассоциированных с инфекционными заболеваниями, является синдром Гийена-Барре (СГБ), актуальность изучения которого определяется тем, что данный синдром встречается повсеместно во всех возрастных группах [1, 7, 32]. Пик. заболеваемости регистрируется в основном у лиц трудоспособного возраста — в 30-50 лет. Частота встречаемости колеблется от 0,4 до 4,0 случаев на 100 тыс. населения, составляя в среднем 1-2 случая на 100 тыс. населения ежегодно [9, 26, 27, 32]. Описано развитие синдрома Гийена-Барре после введения вакцин, что еще больше подчеркивает актуальность данной проблемы [2, 158].

Помимо СГБ, к числу приобретенных аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий принадлежит хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДП), в понятие которой в настоящее время включают все случаи воспалительной демиелинизирующей полиневропатии, которые имеют подострое начало и хроническое (более 2 месяцев) течение, характеризующееся обострениями и ремиссиями, а в части случаев монотонно прогрессирующее [14, 19, 20, 26]. При ХВДП неврологическая симптоматика нарастает более медленно (8 недель и более), чем при СГБ [7, 8, 19, 20, 30]. Однако в 16-20% случаев'ХВДП имеет острое начало, с нарастанием мышечной слабости в течение первых недель болезни, чем напоминает СГБ [35]. Основными специфическими методами лечения СГБ являются*программный плазмаферез и внутривенная пульс-терапия которые в равной степени способны ускорять процессы реиннервации, сокращая срок периода восстановления более чем на треть [38, 105, 136, 137]! Препаратами же выбора при ХВДП являются кортикостероиды, назначение которых больным СГБ противопоказано [8, 14, 27]. Учитывая столь различные подходы к лечению, дифференциальная- диагностика СГБ и ХВДП с острым началом представляет актуальную проблему современной медицины.

В то же время следует отметить, что используемые в настоящее время диагностические критерии, включая электронейромиографическое исследование, не позволяют четко дифференцировать СГБ и ХВДП с острым началом, что создает еще одно актуальное направление научного поиска в области клинико-лабораторной диагностики и формирования современных подходов к прогнозированию осложнений распространенных инфекционных заболеваний [8, 25, 26, 35].

Цель исследования

Оптимизация дифференциальной клинико-лабораторной диагностики аксонально-демиелинизирующих полиневропатий, ассоциированных с инфекционными заболеваниями, на основе протеомных технологий и методов иммунологического исследования.

Задачи исследования

1. Установить этиологическую роль инфекционных агентов в развитии аксонально-демиелинизирующих полиневропатий.

2. Определить значение рутинных клинико-лабораторных и инструментальных данных обследования больных СГБ и ХВДП в качестве дифференциально диагностических признаков этих заболеваний.

3. Осуществить идентификацию протеомного профиля сывороток крови больных аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями с использованием времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии.

4. Разработать критерии протеомной дифференциальной диагностики синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии.

5. Выявить характер иммунологических сдвигов со стороны основных субпопуляций лимфоцитов крови, а также субпопуляций и функционального состояния естественных киллеров и ЕКТ при аксонально-демиелинизирующих полиневропатиях, в том числе в соответствии с этиологией ассоциированного инфекционного процесса.

6. Разработать иммунологические дифференциально-диагностические критерии аксонально-демиелинизирующих полиневропатий с учетом этиологии инфекционного процесса, предшествующего развитию демиелинизации.

Научная новизна

На основе широкого спектра современных клинико-инструментальных, клинико-лабораторных, протеомных и иммунологических методов исследований в процессе выполнения диссертационных исследований впервые:

• Установлены количественные различия по содержанию форменных элементов крови, степени роста активности ферментов и уровню падения цинка в крови при СГБ и ХВДП, подтверждающие перспективность использования протеомной диагностики при аксонально-демиелинизирующих полиневропатиях.

• Выявлены качественные различия влияния этиологического фактора предшествующего инфекционного процесса на содержание лимфоцитов в крови больных синдромом Гийена-Барре, а также при ХВДП, подтверждающие перспективность использования иммунодиагностики при этих, заболеваниях.

• Определены уникальные наборы пиков масс-спектров сывороток крови больных синдромом Гийена-Барре и хронической воспалительной де-миелинизирующей полиневропатией с определенными значениями соотношения молекулярной массы к заряду (m/z), которые могут являться биомаркерами данных заболеваний.

• Разработан алгоритм включения' масс-спектрометрического анализа сыворотки крови в дифференциальную диагностику острых и хронических аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий.

• Расшифрованы неизвестные ранее стороны иммунопатогенеза аксонально-демиелинизирующих полиневропатий с участием CD56+ клеток крови и установлены иммунопатогенетические особенности синдрома Гийена-Барре, ассоциированного с некоторыми инфекционными агентами.

• Разработан набор вспомогальных иммунологических критериев дифференциальной диагностики аксонально-демиелинизирующих полиневропатий, обладающих высокой специфичностью, умеренной диагностической точностью при относительно невысоких показателях чувствительности.

• Разработан набор вспомогальных иммунологических критериев для оценки роли инфекционного агента в развитии синдрома Гийена-Барре, обладающий умеренной чувствительностью при высокой специфичности и диагностической точности.

Практическая значимость работы

Оценка иммунологических сдвигов на основе типовых иммунограмм, а также углубленный анализ комплекса иммунологических показателей, основанных на оценке субпопуляционного состава и функционального состояния СЭ56+ клеток периферической крови, позволили на основе вновь полученных данных уточнить иммунопатогенез аксонально-демиелинизирующих полиневропатий. Было установлено, что при синдроме Гийена-Барре наблюдается снижение активационных процессов у С056+ клеток крови и падению числа естественных киллеров, осуществляющих реакции естественной цито-токсичности, особенно выраженному при ассоциации заболевания с Эпштей-на-Барр вирусной инфекцией. Иммунопатогенетической особенностью ХВДП служило снижение в крови числа СВ56+ клеток, осуществляющих реакции антителозависимой цитотоксичности.

На основе масс-спектрометрического исследования предложен способ дифференциальной диагностики аксонально-демиелинизирующих полиневропатий с использованием протеомных технологий, что позволяет с достаточно высокими показателями специфичности и чувствительности различать синдром^ Гийена-Барре и хроническую воспалительную демиелинизирую-щую полиневропатию (в том числе с острым началом).

На основе иммунологических исследований предложены критерии вспомогательной дифференциальной диагностики хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии и синдрома Гийена-Барре как осложнения инфекционных процессов различной этиологической структуры.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клинические, инструментальные и лабораторные методы исследования позволяют подтвердить развитие у больного аксонально-демиелинизирующей полиневропатии, но малоинформативны при дифференциальной диагностике синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии с острым началом, а также при определении связи синдрома Гийена-Барре с предшествующим инфекционным процессом.

2. Времяпролетная МАЛДИ-масс-спектрометрия позволяет выявлять протеомные профили сыворотки крови больных аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями, на основе которых с высокой чувствительностью и специфичностью можно дифференцировать синдром Гий-ена-Барре и хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию с острым началом.

3. Иммунологическое исследование крови больных аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями с определением субпопуляцион-ного состава и функциональной активности СБ56+ клеток способствует выявлению дополнительных дифференциально-диагностических критериев этих заболеваний.

4. Иммунологическое исследование крови больных синдромом Гийена-Барре с определением субпопуляционного состава и функциональной активности СБ56+ клеток позволяет установить категориальные иммунологические критерии этого заболевания в зависимости от предшествующего инфекционного процесса.

Внедрение результатов работы в практику

Новые сведения о роли ЕК и ЕКТ в иммунопатогенезе аксонально-демиелинизирующих полиневропатий используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней Московского государственного медико-стоматологического • университета (МГМСУ).

Предложенный протеомный способ дифференциальной диагностики аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий используется в научно-диагностических исследованиях лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГУ НИИ ФХМ ФМБА России (руководитель лаборатории - профессор, д.м.н. В.М. Говорун).

Разработанные иммунологические тесты применяются для дифференциальной диагностики острых аксонально-демиелинизирующих полиневропатий в работе лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России.

На способ дифференциальной диагностики острых аксонально-демиелинизирующих полиневропатий получено разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения, на применение медицинской технологии «Метод выделения наборов пептидов из сыворотки крови человека на базе магнитных микрочастиц с различной поверхностной функциональностью при аксонально-демиелинизирующих заболеваниях нервной системы» (ФС № 2010/407 от 03.12.2010 г.).

Апробация работы и публикации

Основные положения работы заслушаны и обсуждены на:

- II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010);

- III Ежегодном Всероссийском. Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2011);

- Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за

2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2009);

- Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за

2010 год в рамках приоритетного направления-«Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2010);

- XXXIII Итоговой конференции молодых ученых МГМСУ (Москва,

2011);

- XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011);

- Обществе молодых ученых МГМСУ (Москва, 2010);

- Обществе молодых ученых МГМСУ (Москва, 2011);

- Заседании кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ (22.06.2011, протокол №109)

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе: в центральной печати и изданиях, рекомендуемых ВАК — 3.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 187 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения и обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 44 рисунками. Список литературы содержит 184 источника, из которых 39 отечественных и 145 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. Включение в число клинико-лабораторных исследований при аксонально-демиелинизирующих полиневропатиях протеомных технологий и иммунологических методов, позволяет проводить дифференциальную диагностику синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии с острым началом.

2. Этиологически значимым при развитии синдрома Гийена-Барре в I

31% случаев был кампилобактер, в 14% случаев — цитомегаловирус и в Л 2% I случаев - Эпштейна-Барр вирус. В 22% случаев наблюдалась микст-инфекция, вызванная сочетанием названных возбудителей с вирусами простого герпеса 1 и 2 типа, хламидиями и микоплазмой.

3. В периоде нарастания неврологической симптоматики клинико-лабораторные признаки и электронейромиографическое исследование не позволяют проводить четкую дифференциальную диагностику синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии с острым началом.

4. Развитие синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии сопровождается изменением4 белково-пептидных паттернов, регистрируемых в сыворотке крови больных, что может отражать реальные колебания концентраций белков и пептидов, напрямую ассоциированных с данными заболеваниями;

5. С помощью генетического алгоритма на основе масс-спектрометрических профилей образцов сывороток крови больных

1 аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями созданы классификационные модели «СГБ-контроль» и «ХВДП-контроль», которые позволяют с высокими значениями специфичности и чувствительности дифференцировать названные заболевания.

6. Иммунопатогенез синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии различается по ведущим механизмам развития и участию разных категорий лимфоцитов в иммунном процессе, зависит от этиологии и служит основой для разработки дифференциально-диагностических критериев СГБ и ХВДП.

7. Существует 4 категории дифференциально-диагностических иммунологических критериев синдрома Гийена-Барре в соответствии с этиологией предшествующего инфекционного процесса. При СГБ, ассоциированного с кампилобактером: число С03+/С04+ клеток в диапазоне ■ 37%-51,8%; ПРИ < 1,85; число СБЗ+/СБ56+ клеток >1,22%; С03+/С056+/СБ8+ клеток в диапазоне 63,8%-78,5%. При СГБ, ассоциированным с ЦМВ: число СБЗ+/СВ56+/С04+ клеток в диапазоне 27,4% - 47,1%, число СБ56+/СБ94+ клеток >50,9%; число СВ56+/СВ16+ >58,3%. При СГБ, ассоциированным с ЭБВ: число СОЗ+/СБ8+ клеток <0,6*109/л; число СБЗ+/СБ56+ клеток <0,1*10%; число СБ56+/ЫКр46+ кпеток <16,1%. При прочей этиологии СГБ: число СБЗ+/С056+/С04+ клеток в диапазоне 27,4% - 47,1%, число С056+/Жр46+ клеток <63,2%, число СБ56+/СБ16+ клеток >20,7%. При любой этиологии — отсутствие аутоантител к ганглиозиду СЬЬ. Чувствительность теста составляет 50%, специфичность -100%, диагностическая точность —75%.

8. В дифференциально-диагностические иммунологические критерии хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии входят следующие показатели: число СБЗ+/СБ56+ клеток <1,1%, число СБЗ-/СБ56+ клеток >12,3%, число СБ56+/ЫКр46+ клеток >61,5%, число С056+/СБ16+ клеток <30,4%. Чувствительность теста составляет 82%, специфичность -100%, диагностическая точность - 91%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Первый этап диагностики острых симптомов двигательных и чувствительных нарушений предполагает:

• Выявление анамнестической связи заболевания с предшествующим инфекционным процессом или вакцинацией.

• Оценку клинических данных по диагностическим критериям ВОЗ для синдрома Гийена-Барре или по критериям Американской академии неврологии для хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии.

• Проведение электронейромиографического исследования.

• Постановку предварительного диагноза синдрома Гийена-Барре или хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии с острым началом.

2. На втором этапе диагностики аксонально-демиелинизирующих полиневропатий рекомендуется:

• Проведение времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии с определением протеомных профилей сыворотки крови больных.

• Определение соответствия полученного- протеомного профиля сыворотки крови классификационной модели «СГБ-контроль» или «ХВДП-контроль».

• При соответствии протеомного профиля сыворотки крови одной из классификационной модели у больного диагностируют синдром Гийена-Барре или хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию с острым началом.

• При полном отсутствии соответствия протеомных профилей обеим классификационным моделям у больного исключают наличие аксонально-демиелинизирующей полиневропатии.

• При получении нечеткого соответствия протеомных профилей сыворотки крови классификационным моделям переходят к третьему этапу исследований.

3. На третьем этапе исследования проводят иммунологическое тестирование в соответствии со следующим алгоритмом:

• У больных с предварительным диагнозом синдрома Гиена-Барре методом иммуноферментного анализа определяют наличие:

- аутоантител к GQib,

- IgM антител к Campylobacter jejuni, IgM антител к Cytomegalovirus,

- IgM антител к Epstein-Barr virus.

• У больных методом проточной цитофлуориметрии определяют следующие показатели крови:

- относительное число CD3+/CD4+ клеток,

- абсолютное число CD3+/CD8+ клеток,

- иммунорегуляторный индекс,

- относительное число CD3+/CD56+ клеток, , - относительное число CD3-/CD56+ клеток,

- абсолютное число CD3-/CD56+ клеток,

- процентное содержание среди ЕКТ CD3+/CD56+/CD4+ клеток,

- процентное содержание среди ЕКТ CD3+/CD56+/CD8+ клеток,

- процентное содержание среди CD56+ клеток CD94+,

- процентное содержание среди CD56+ клеток NKp46+,

- процентное содержание среди CD56+ клеток CD 16+.

• Оценивают результаты иммунологических исследований в соответствии со шкалой критериальных признаков:

Диагноз Иммунологические показатели Диапазоны критериальных значений

СГБ, ассоциированный с кампилобактером СОЗ+/СБ4+ ИРИ СБЗ+/СО 56+ С03+/С056+/С08+ Апй-О01Ь 37,0% -51,8% <1,85 >1,22% 63,8% - 78,5% Нет

СГБ, ассоциированный с цитомегаловирусом СБ56+/СБ94+ СБ56+/С016+ Апй-ОСЛЬ >50,9% >58,3% Нет

СГБ, ассоциированный с Эпштейна-Барр вирусом СБЗ+/С08+ СОЗ-/СБ56+ СБ56+/Жр46+ АпИ-ОС} 1Ь <0,60 *10укл./л <0,10 *109кл./л <16,1% Нет

СГБ, ассоциированный с прочими патогенами СБЗ+/С056+/С04+ С056+/ЫКр46+ С056+/СБ16+ Атызфъ <27,4% или >47,1% <63,2% >20,7% Нет

ХВДП СБЗ+/С056+ СБЗ-/СБ56+ СВ56+/ИКр46+ СЭ56+/СБ16+ <1,10% >12,3% >61,5% <30,4%