Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Иммунопатогенетические особенности синдрома Гийена-Барре, ассоциированного с инфекционным процессом

На правах рукописи

005052137

ТИМЧЕНКО Ольга Леонидовна

ИММУНОПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СИНДРОМА ГИЙЕНА-БАРРЕ, АССОЦИИРОВАННОГО С ИНФЕКЦИОННЫМ

ПРОЦЕССОМ

14.01.09 - инфекционные болезни 14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

18 АПР т

Москва -

2013

005052137

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московском государственном медико-стоматологическом университете им. Л.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России)

Научные консультанты:

академик РАМН, д.м.н., профессор ГОщук Николай Дмитриевич

д.м.н., профессор Балмасова Ирина Петровна

Официальные оппоненты:

ведущий научный сотрудник лаборатории респираторных вирусных инфекций с апробацией лекарственных препаратов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, д.м.н., профессор

заведующая кафедрой инфекционных болезней с курсом эпидемиологии ФГБУ ВПО «Российский университет дружбы народов», д.м.н., профессор,

заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России, д.м.н., профессор

Кравченко Алексей Викторович

Кожевникова Галина Михайловна

Царев Виктор Николаевич

Ведущая организация: ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России

Защита диссертации состоится «15» апреля 2013 г. в «12» часов fia заседании диссертационного совета Д 208.131.01 в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России.

Автореферат разослан марта 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Среди осложнений инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной природы одно из ведущих мест занимают аутоиммунные аксонально-демиелинизирующие полиневропатии, характеризующиеся множественным поражением периферических нервов. В последние годы отмечается тенденция к увеличению частоты этих осложнений и изменению характера их течения [Скрипченко Н.В., Команцев В.Н., 2006; Пирадов М.А., 2011].

При этом повреждение нервных волокон происходит как в результате непосредственного действия инфекционного агента, так и опосредованно, вследствие развития каскада аутоиммунных реакций, спровоцированных молекулярной мимикрией микроорганизмов [Guerry Р., Szymanski С.М., Prendergast М.М. et al., 2002; Бамбеева Р.Ц., Дунаевская Г.Н., Нанкина И.В., 2008]. Развивающиеся перекрестные иммунологические реакции между структурными элементами клеточной стенки микроорганизмов и структурными элементами миелиновой оболочки, а в некоторых случаях, и структурами аксона периферических нервов, запускают и поддерживают процессы демиелинизации [Goodfellow J.A. et al., 2005; Greenshields K.N., Halstead S.K., 2009]. Перечень инфекционных агентов, являющихся триггерами вышеописанных реакций, довольно широк, что придает проблеме взаимосвязи аутоиммунных демиелинизирующих полиневропатий с предшествующими инфекционными процессами значительную актуальность.

Самой частой причиной острых периферических параличей аутоиммунной природы, ассоциированных с инфекционными заболеваниями, является синдром Гийена-Барре (СГБ), считающийся одним из наиболее тяжелых генерализованных заболеваний периферической нервной системы. Повсеместное распространение во всех возрастных группах, а также высокая летальность (от 5 до 33% среди лиц с тяжелыми формами болезни), делают проблему изучения данного синдрома несомненно актуальной [Левин О.С., 2006; Пирадов М.А., 2007; Бамбеева Р.Ц., Дунаевская Г.Н., 2008; Arami М.А., Yazdchi М., 2006]. Частота встречаемости СГБ колеблется от 0,4 до 4,0 случаев на 100 тыс. населения, составляя в среднем 1-2

случая на 100 тыс. населения ежегодно, а пик заболеваемости приходится на возрастную группу 30-50 лет [Пирадов М.А., Супонева H.A., 2011]. Описаны случаи развития синдрома Гийена-Барре после введения противогриппозной, антирабической, противостолбнячной и менингококковой вакцин [Бектемиров Т.А., 2000; Tishler М., Shoenfeld Y., 2004], что в еще большей степени подчеркивает важность изучения данного заболевания.

Процесс диагностического распознавания синдрома Гийена-Барре осложняется тем обстоятельством, что к числу приобретенных аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий относится и хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДП), включающая все случаи воспалительного повреждения периферических нервов с подострым началом и хроническим (более 2 месяцев) течением, которые характеризуются обострениями и ремиссиями или монотонно прогрессируют [Левин О.С., 2006; Меркулова Д.М., Никитин С.С., 2007]. Неврологическая симптоматика при ХВДП нарастает медленней, чем при СГБ [Гусев Е.И., Коновалов А.Н., Гехт А.Б., 2007]. Но в 16-20% случаев возможно острое начало с нарастанием мышечной слабости в течение первых недель болезни, что напоминает течение СГБ [Супонева H.A., Никитин С.С., Пирадов М.А., Меркулова Д.М., 2007] и создает необходимость дифференциальной диагностики этих двух состояний, различающихся, в первую очередь, кардинально противоположными подходами к лечению [Пирадов М.А., Супонева H.A., 2011].

Решение отмеченных выше патогенетически и диагностически значимых аспектов проблемы синдрома Гийена-Барре, является отражением еще одного чрезвычайно важного и актуального направления научного поиска в области клинико-лабораторной диагностики осложнений распространенных инфекционных заболеваний - возможности прогнозировать развитие этих осложнений и, следовательно, предупреждать их, что относится к категории важнейших задач современной медицины.

Цель исследования:

Создание патогенетически обоснованной концепции развития синдрома Гийена-Барре для расшифровки его связи с клинико-этиологическими особенностями предшествующего инфекционного процесса, оценки тяжести течения и прогнозирования исходов, дифференциальной диагностики с другими аутоиммунными аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями.

Задачи исследования:

1. Определить этиологическую структуру и клинические проявления инфекционных процессов, предшествовавших развитию синдрома Гийена-Барре.

2. Обосновать патогенетическое значение аутоантител к ганглиозидам и миелин-ассоциированному гликопротеину при синдроме Гийена-Барре с учетом этиологии и клинических проявлений предшествующего инфекционного процесса.

3. Дать клинико-лабораторную характеристику больных синдромом Гийена-Барре в зависимости от этиологии и клинических проявлений предшествующей инфекции.

4. Дать углубленную иммунологическую характеристику больных синдромом Гийена-Баррев зависимости от этиологии и клинических проявлений ассоциированного инфекционного процесса.

5. Определить зависимость течения синдрома Гийена-Барре от особенностей иммунологического профиля больных.

6. Обосновать патогенетическое значение каталитических антител при синдроме Гийена-Барре путем их обнаружения в сыворотке крови пациентов.

7. Определить протеомный профиль больных синдромом Гийена-Барре как основы его дифференциальной диагностики с хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатией.

8. Идентифицировать белки, оказывающие наибольшее влияние на протеомный профиль больных синдромом Гийена-Барре и определить их патогенетическое значение.

Научная новизна работы

На основе широкого спектра современных клинико-инструментальных,

клшшко-лабораторных, протеомных и иммунологических методов

исследования в процессе выполнения диссертационных исследований впервые:

> Установлено, что на патогенетические механизмы развития синдрома Гийена-Барре может влиять не только этиология ассоциированного инфекционного процесса, но и его клинические проявления.

> Предложен новый методический подход к оценке различных сторон аутоиммунных процессов при синдроме Гийена-Барре в виде определения иммунологических профилей, включающих соотношение различных компонентов иммунного процесса.

> Определена взаимосвязь между набором профильных аутоантител к ганглиозидам нервных волокон и этиологией синдрома Гийена-Барре, а также зависимость между уровнем антител и клиническими проявлениями предшествующего инфекционного процесса.

^ Установлено, что наряду с комплементзависимым поражением нервных волокон в патогенезе синдрома Гийена-Барре ключевую роль могут играть цитотоксические реакции естественных киллеров.

> Зарегистрирована взаимосвязь системы СБ56+ лимфоцитов при синдроме Гийена-Барре с тяжестью течения заболевания вне зависимости от этиологии предшествующего инфекционного процесса.

> Обнаружены каталитические антитела класса ^О с гидролитической активностью в крови больных синдромом Гийена-Барре и описаны феномены их взаимосвязи с характером течения заболевания.

'г- Определены уникальные протеомные профили сывороток крови больных синдромом Гийена-Барре и установлено их дифференциально-диагностическое значение при острой и хронической аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатиях.

> Идентифицирован набор белков, оказывающих наибольшее влияние на протеомный профиль больных синдромом Гийена-Барре и предложена гипотеза их патогенетического значения.

^ Создана гипотетическая схема патогенеза синдрома Гийена-Барре с учетом роли аутоантител, механизмов комплементарного лизиса, ЕК-цитотоксичности и компонентов протеома сыворотки крови больных.

> Предложен способ прогнозирования развития синдрома Гийена-Барре у больных с острыми инфекционными процессами путем определения липидного профиля.

Практическая значимость

В результате выполнения исследований были получены новые сведения о патогенезе синдрома Гийена-Барре, которые включали выявление патогенетически значимых факторов, обладающих потенциальной способностью влиять на развитие заболевания. Среди этих факторов -антиганглиозидный профиль, компоненты системы комплемента, количество и функциональное состояние СЭ56+ лимфоцитов крови, каталитические антитела, протеом сыворотки крови.

Идентификация отдельных белков, входящих в протеомную характеристику СГБ, позволила расшифровать многие неизвестные ранее особенности патогенеза данного заболевания.

На основе создания схем патогенеза синдрома Гийена-Барре предложена гипотеза о взаимодействии указанных патогенетически значимых факторов в процессе развития нарушений функций периферических нервных волокон.

В результате детальной характеристики иммунных процессов у больных синдромом Гийена-Барре удалось установить несколько типов развития аутоиммунных реакций с участием названных факторов, которые влияли на тяжесть течения заболевания и, предположительно, на быстроту их купирования.

Благодаря использованию протеомных технологий, был разработан способ дифференциальной диагностики синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии (в том числе с острым началом).

В результате выполнения биохимических исследований по изучению липидных профилей при синдроме Гийена-Барре с учетом гипотезы о влиянии протеома сыворотки крови на патогенез заболевания получены критерии, которые могут быть предложены как прогностически значимые для развития этого осложнения инфекционных процессов.

Положения, выносимые на защиту

1. Антиганглиозидные профили больных синдромом Гийена-Барре зависят от этиологии и клинических проявлений ассоциированного инфекционного процесса и могут способствовать расшифровке их патогенетической взаимосвязи с клинико-лабораторными признаками болезни.

2. Клинико-лабораторные признаки синдрома Гийена-Барре не позволяют дифференцировать это заболевание от хронической воспалительной полиневропатии с острым началом, а основой для дифференциальной диагностики могут служить протеомные профили сывороток крови больных с данной патологией.

3. Ведущим звеном в патогенезе синдрома Гийена-Барре является состояние протеомных профилей больных, а также отдельных компонентов системы комплемента, механизм активации которой связан с этиологией и клиническими проявлениями предшествующего инфекционного процесса.

4. Ключевую роль в патогенезе синдрома Гийена-Барре, независимо от этиологии и клинических проявлений предшествующего инфекционного процесса, играет функциональное состояние С056+ лимфоцитов в сочетании с особенностями протеомного профиля больных.

Внедрение результатов работы в клиническую практику и учебный процесс

Предложенный протеомный способ дифференциальной диагностики аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий используется в научно-диагностических исследованиях лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГУ НИИ ФХМ ФМБА России (руководитель лаборатории -профессор, д.м.н. В.М. Говорун) и Научного центра неврологии РАМН (директор - академик РАМН, профессор, д.м.н. З.А. Суслина).

Разработанные иммунологические тесты применяются для дифференциальной диагностики острых аксонально-демиелинизирующих полиневропатий в работе лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний ГБОУ ВПО «Московского государственного

медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Новые сведения о роли ЕК и ЕКТ в иммунопатогенезе аксоналыю-демиелинизирующих полиневропатий используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» Минздрава России.

На способ дифференциальной диагностики острых аксонально-демиелинизирующих полиневропатий получено разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения на применение медицинской технологии «Метод выделения наборов пептидов из сыворотки крови человека на базе магнитных микрочастиц с различной поверхностной функциональностью при аксонально-демиелинизирующих заболеваниях нервной системы» (ФС № 2010/407от03.12.2010 г.).

По результатам диссертационной работы получены два патента на изобретения: «Способ дифференциальной диагностики форм синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии с острым началом» (Патент РФ № 2432113 от 27.10.2011 г.) и «Способ диагностики аксонально-демиелинизирующих полиневропатий» (Патент РФ № 2441240 от 27.01.2012 г.).

Апробация результатов исследования н публикации

Основные положения работы заслушаны и обсуждены на:

— Пятой научно-практической конференции "Инфекционные болезни и антимикробные средства" (Москва, 2007 г.);

- Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2009 г.);

- II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010 г.);

- Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2010 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2010 г.);

- III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2011 г.);

- научно-практическом обществе врачей-инфекционистов г. Москвы (Москва, 2011 г.);

- научно-практической конференции неврологов, XVIII Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2011 г.);

- XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011 г.);

- Межрегиональном форуме «Клиническая иммунология и аллергология -междисциплинарные проблемы» (Казань, 2012 г.);

- заседании кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ (26.09.2012, протокол №123).

По материалам диссертации опубликована 21 научная работа, в том числе: в центральной печати и изданиях, рекомендуемых ВАК -11.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 219 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав по материалам и методам исследований, 3 глав собственных исследований, заключения и обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 64 рисунками. Список литературы содержит 294 источника, из которых 57 отечественных и 237 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Под наблюдением в период с 2007 по 2011 год находился 141 пациент с аутоиммунными аксонально-демиелинизирующими полиневропатиями в возрасте старше 16 лет без ограничения по полу и тяжести болезни, госпитализированных в Научный центр неврологии РАМН (директор - академик РАМН, профессор, д.м.н. З.А. Суслина), а также 32 практически здоровых человека, составивших контрольную группу.

На основании результатов комплексного клинико-лабораторного обследования синдром Гийена-Барре был диагностирован у 91 пациента, хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия - у 26 пациентов. Двадцати четырем пациентам с предварительным диагнозом аксонально-демиелинизирующая полиневропатия после проведенного обследования были диагностированы другие заболевания (васкулит, рассеянный склероз, спинальная амиотрофия и др.), в связи с чем данные пациенты из исследования были исключены.

Согласно дизайну исследования, критериями включения больных в основную группу наблюдения были: верифицированный диагноз демиелинизирующей полиневропатии (СГБ, ХВДП); возраст старше 16 лет; информированное согласие пациента на обследование. Критериями исключения пациентов из исследования являлись: полиомиелит; ботулизм; дифтерия; ВИЧ-инфекция; миастения; токсическая полиневропатия; сахарный диабет; нарушение обмена порфиринов; хронический алкоголизм и/или наркомания; органические поражения ЦНС; диагностированная ВИЧ-инфекция при обследовании в катамнезе; отказ от исследования; нарушение больным протокола исследования.

Половые и возрастные характеристики пациентов СГБ, ХВДП, а также контрольной группы примерно соответствовали друг другу.

Диагноз «синдром Гийена-Барре» устанавливался на основании диагностических критериев ВОЗ, предложенных в 1993 году. Диагноз

«хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия» устанавливался на основании критериев Американской академией неврологии, а также критериев Saperstein и INCAT, предложенных группой по изучению причин и лечению воспалительных невропатий. В схему клинического исследования входили учет анамнестических данных по взаимосвязи заболевания с инфекционными процессами, регистрация неврологических симптомов, оценка тяжести двигательного дефицита по Североамериканской шкале, а также силы отдельных групп мышц по специальной шкале баллов.

Всем больным и лицам контрольной группы проводилось комплексное обследование, включавшее рутинные методы лабораторного исследования (клинические анализы крови и мочи и биохимический анализ крови с определением липидного профиля), а также определение антител классов М и G к кампилобактеру, герпесвирусам (вирусам простого герпеса I и П типов, цитомегаловирусу, Эпштейна-Барр вирусу), микоплазме пневмонии, хламидофиле пневмонии, определение маркеров гепатитов В (HBsAg) и С (анти-НСУсумм.), антител к ВИЧ, определение антител к гликопротеидам периферических нервов, исследование иммунологических показателей крови (типовая иммунограмма; определение субпопуляционного состава и функционального состояния CD56+ клеток; определение компонентов системы комплемента); выборочное определение каталитических антител, протеомное исследование сывороток крови. Помимо вышеперечисленных исследований, пациентам также проводились: клинический анализ цереброспинальной жидкости, электронейромиографическое исследование (ЭНМГ), МРТ и/или КТ головного и спинного мозга.

Иммунологические и гематологические исследования осуществлялись в лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний НИМСИ МГМСУ (зав. лабораторией - д.м.н., профессор И.П. Балмасова; исполнители - к.м.н. М,М. Гультяев и к.м.н. Е.В. Шмелева), общеклинические исследования — на клинической базе кафедры инфекционных болезней и

эпидемиологии ГБОУ ВПО МГМСУ Минздрава России (зав. кафедрой -академик РАМН, д.м.н., профессор Н.Д. Ющук). Определение каталитических антител к ОБМ проводили в лаборатории биокатализа (зав. лабораторией -член-корр. РАН, д.х.н, профессор А.Г. Габибов; исполнитель - к.х.н. A.A. Белогуров), протеомные исследования - в лаборатории протеомики (зав. лабораторией - профессор, д.м.н. В.М. Говорун; исполнитель -к.х.н. Р.Х. Зиганшин) Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Для статистической обработки полученных результатов математический и статистический анализ проводился при помощи пакета статистических программ SPSS (17-ая версия, допустимая ошибка Е=5%). При этом осуществлялась предварительная многофакторная подготовка полученных результатов исследований с созданием блоков электронных таблиц. После контроля нормальности распределения данных применялись методы непараметрической статистики с использованием критериев Манна-Уитни для сравнения средних величин и критерия X2 Для сравнения показателей частот. Оценка взаимосвязи разных категорий параметров осуществлялась с помощью корреляционного анализа на основе определения коэффициента корреляции Спирмена и расчетом достоверности силы связей. Для подтверждения информативности полученных данных проводился дискриминантый анализ. Для статистической обработки результатов протеомных исследований использовали программное обеспечение фирмы Bruker Daltonics (Германия), включающее программы FlexControl 2.4 (Build 38), FlexAnalysis 2.4 (Build 11) и ClinProTools 2.2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Учитывая тот факт, что развитие синдрома Гийена-Барре неразрывно связано с предшествующими инфекционными процессами, этиологический фактор и клинические проявления последних послужили основой для

группировки данных, полученных в ходе исследования крови больных СГБ, а в качестве группы сопоставления рассматривались пациенты с ХВДП.

При этом исследования для определения этиологической роли отдельных инфекционных агентов (таблица 1) показали, что в 43% случаев у больных СГБ регистрировалась моноинфекция, в 22% случаев — микст-инфекция. Чаще всего (в 46% случаев) развитию синдрома Гийена-Барре предшествовала инфекция, обусловленная Campylobacter jejuni, в том числе в 19% случаев в виде микст-инфекции. При ХВДП у 23% пациентов к кампилобактеру выявлялись только антитела класса G без нарастания концентрации антител в парных сыворотках.

Таблица 1. Частота обнаружения антител класса М к исследуемым _инфекцнопиым агентам у больных СГБ и ХВДП__

Инфекционные агенты Частота обнаружения IgM к микробным антигенам Р

СГБ (п=91) ХВДП (п=26)

абс.(чел.) % абс. (чел.) %

Campylobacter jejuni 42 46 0 0 ^■ФЯЬі

Herpes simplex virus 1,П 2 2 5 19 iüöftei;

Epstein-Barr virus 17 19 8 31 0,300

Cytomegalovirus 23 25 7 27 0,849

Chlamydophila pneumoniae 15 16 1 4 0,111

Mycoplasma pneumoniae 15 16 6 23 0,671

В т.ч. микст-инфекция 20 22 5 19 0,934

Этиология не установлена 28 35 5 19 -

Примечание: р - вероятность различий показателей больных СГБ и ХВДП, серым цветом обозначена достоверность различий (р<0,05) частот по критерию Манна-Уитни

Следующими по значимости этиологическими факторами, предшествующими развитию СГБ, были цитомегаловирус (25% случаев) и вирус Эпштейна-Барр (19%).

Сочетание нескольких инфекционных процессов наблюдалось у 22% больных СГБ и у 19% больных ХВДП. При синдроме Гийена-Барре преобладали микст-инфекции с участием кампилобактера (65% случаев), несколько реже (в 45-50% случаев) к этиологии синдрома были причастны другие возбудители. При хронической воспалительной демиелинизирующей

полиневропатии наиболее частыми участниками микробных ассоциаций (более чем в 50% случаев) выступали герпесвирусы и микоплазма пневмонии.

У 35% больных СГБ с высоким титром ^М-антител (выше 20 г/л) к кампилобактеру развитию болезни предшествовала клиническая симптоматика острой кишечной инфекции, 24% пациентов отмечали гипертермию, у остальных заболевание дебютировало на фоне полного здоровья. У пациентов с ЭБВ-моноинфекцией в половине случаев развитию болезни предшествовали клинические проявления острого респираторного заболевания, которые также беспокоили 25% больных с моноинфекцией цитомегаловирусом и единственного пациента с микоплазменной моноинфекцией.

У больных СГБ с микст-инфекцией в 20% случаев развитие демиелинизации предваряли проявления ОРЗ, а в 10% - гипертермия. При этом у всех пациентов с микст-инфекцией кампилобактером проявления ОКИ в анамнезе отсутствовали. Следует отметить, что у пациентов с неустановленной этиологией процесса в анамнезе одинаково часто (в 30% случаев) выявлялись признаки ОРЗ или ОКИ, а у одного пациента отмечалась гипертермия.

У больных СГБ с микст-инфекцией учитывалось не только наличие антител к тому или иному возбудителю, но и преобладание титра к инфекционному агенту. В связи с этим группа больных с кампилобактериозом в виде моноинфекции и клиническими проявлениями в виде ОКИ не изменилась и составила 10 человек (группа 1), группа с ОРЗ/температурной реакцией пополнилась и стала включать 13 больных (группа 2), а группа с антителами в высоком титре без клинических проявлений - 19 больных (группа 3).

Больные с высоким титром 1§М-антител к ЭБВ составили отдельную группу из 7 человек (группа 4), у двоих из которых имелись клинические проявления в виде ОРЗ, а у остальных клинические проявления отсутствовали. Среди больных с ЦМВ-инфекцией, включавших 10 человек (группа 5) клиника ОРЗ наблюдалась у двух человек, ОКИ - у одного, а семь пациентов

клинических проявлений не отмечали; все они вошли в единую группу с высокой концентрацией антител к ЦМВ.

Отдельные группы были сформированы из числа больных с неустановленной этиологией процесса, которые служили в данном случае группами сопоставления. При этом у 9 больных СГБ неустановленной этиологии предшествовала ОКИ (группа 6), у 10 человек - ОРЗ или гипертермия (группа 7) и у 13 человек клинических проявлений не отмечалось (группа 8).

Решая одну из поставленных задач, для обоснования патогенетического значения аутоантител к ганглиозидам и МАГ при синдроме Гийена-Барре с учетом этиологии и клинических проявлений предшествующего инфекционного процесса, пациентам всех групп, а также лицам группы контроля проводили исследование сыворотки крови методом иммуноферментного анализа с целью выявления указанных антител.

Следует отметить, что развитие СГБ сопровождает уникальное явление антигенной мимикрии микробных агентов к компонентам нервных волокон с выработкой антител к различным ганглиозидам (вМ,, вМг, вО^, С01Ь, СОи,). Предполагается, что находясь во внешнем слое плазматической мембраны, а также в качестве компонентов миелина ганглиозиды действуют как антигенные мишени при аутоиммунных неврологических расстройствах [Ю.В. Мозолевский, 2001; Д.М. Меркулова, С.С. Никитин, 2007; Д.М. Меркулова, Н.Е. Андреева, Ю.А. Меркулов, 2008]. Помимо ганглиозидов, индукторами аутоиммунных процессов могут выступать антитела к гликопротеинам миелиновой оболочки, в частности, миелин-ассоциированному гликопротеину (анти-МАГ), играющему значительную роль в регуляции роста аксонов и межклеточных взаимодействий в нервной системе [С.С. Никитин, А.Л. Куренков, 2003].

Уровни выработки антител к различным ганглиозидам миелина и миелин-ассоциированному гликопротеину по разному влияют на клинические проявления и прогноз СГБ, в связи с чем им придают особое диагностическое значение [Д.К. Новиков, И.М. Генералов, 1998]. Однако на практике диагностическая точность таких исследований до сих пор не была подтверждена в связи с противоречивостью

получаемых данных [М.А. Пирадов, 2001], которая во многом объясняется установленной зависимостью выработки определенных антиганглиозидных антител и антител к МАГ от этиологии предшествующего инфекционного процесса и его клинических проявлений. В связи с этим возникло предположение, что в данном случае более эффективной была бы интегральная оценка этих показателей в виде антиганглиозидных профилей, которая позволила бы не только определять этиологическую структуру заболевания, но и прогнозировать развитие СГБ при наличии в организме возбудителей, наиболее часто ассоциированных с данным патологическим состоянием (рис. 1).

Как видно на рисунке 1, среди возбудителей предшествующих инфекционных процессов наибольшие отклонения антиганглиозидных профилей при развитии СГБ вызывали кампилобактер и цитомегаловирусы, в то время как влияние клинических проявлений на 95% ДИ показателей было тесно связано с характером возбудителя.

В профилях антител к ганглиозидам при синдроме Гийена-Барре кампилобактерной этиологии преобладали апи-ОМ| и апН-вОц,, уровни которых вместе с количеством апН-аяуа1о-ОМ| проявляли зависимость от клинических проявлений инфекционного процесса. Наибольший титр этих антител наблюдался при острой кишечной инфекции, значительно меньший уровень антител был зарегистрирован при инфекционном процессе, проявляющемся только температурной реакцией. Самым низким уровень антител к ганглиозидам был при отсутствии клинических проявлений, хотя сам факт причастности кампилобактера к индукции аутоиммунного процесса, направленного против периферических нервных волокон, сомнений не вызывает, поскольку уровень антител первичного иммунного ответа (^М) в этой группе хотя и был ниже, чем при наличии клинических проявлений (без клиники - 17,6±1,3 г/л, с клиникой - 48,5±15,2 г/л), но оказался в 1,5 раза выше, чем в контроле.

Anti-asyalo-

Anti-GDlb

Jk СГБ, C. jejuni, острая кишечная инфекции А СГБ, С. jejuni, температурная реакции А СГБ, С. jejuni, без клинических проявлений

Anti-GDib

СГБ, Epstein-Barr virus, ОРВИ или бет клинических проявлений

Anti-

Anti-

GM,

Anti-asyalo-GMj

Anti-MAG

Anti-

GM2

Anti

Anti-

Anti-

MAG

Anti-

GM2

Anti

Anti-GDia

А СГБ, Cytomegalovirus, ОРВИ или бет клинических проявлений

Рис. 1. Антиганглиозидные профили у больных СГБ с различной этиологией и клиническими проявлениями предшествующего инфекционного процесса

Антиганглиозидный профиль при герпесвирусных инфекциях был взаимосвязан с видом возбудителя. СГБ на фоне повышенного уровня IgM-антител к вирусу Эпштейн-Барр - 4,2+2,8 г/л при их отсутствии в контроле включал anti-MAG и anti-GDib, чем значительно отличался от такового при СГБ, спровоцированном C.jejuni. Столь же уникальным был антиганглиозидный профиль при уровне IgM-антител к цитомегаловирусу 0,25+0,18 г/л, не обнаруживаемых в контроле. В последнем случае в

анализируемый профиль входили anti-asyalo-GMt, anti-GMi, anti-GDia, anti-GDlb - набор, не повторяемый в других группах.

На конкретных клинических примерах было показано, что графические изображения индивидуальных профилей при наложении на модель дают возможность оценить этиологию предшествующего инфекционного процесса и прогнозировать течение заболевания.

Помимо модели антиганглиозидных профилей у больных СГБ на основе МАЛДИ масс-спектрометрии были разработаны протеомные классификационные модели аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий, которые позволяли проводить дифференциальную диагностику СГБ и ХВДП (в том числе, с острым началом).

Изучение масс-спектров сывороток крови у больных СГБ, позволило выявить несколько характерных пиков отношения массы к заряду, которые не обнаруживались у здоровых людей (табл. 2).

Таблица 2. Значения m/z пиков, вошедших в классификационную модель сывороток крови «СГБ-коитроль», построенную с использованием

генетического алгоритма

Порядковый помер пика Значения m/z пика Значения m/z, соотвстствую-щис началу пика Значения m/z, соотвстствую-щис концу пика Статистический вес пика

34 1945 1937 1950 2,006001001

60 2787 2780 2796 1,787940192

102 4478 4463 4482 1,349909864

87 3985 3976 3990 0,928244527

62 2844 2834 2851 0,738832543

45 2240 2234 2245 0,678443885

219 11784 11774 11797 0,266230980

Из материалов, приведенных в таблице 2, видно, что модель сывороток крови «СГБ-контроль» имеет 3 пика, дающих наибольший вклад в модель (статистический вес больше единицы).

Характерные изменения масс-спектров были выявлены и при анализе сывороток крови больных ХВДП (табл. 3).

Таблица 3. Значения m/z пиков, вошедших в классификационную модель сывороток крови «ХВДП-контроль», построенную с использованием генетического алгоритма

Порядковые номера пиков Значения m/z пиков Значения m/z, соответствующие началу пиков Значения m/z, соответствующие концу пиков Статистические веса пиков

34 1945 1940 1950 2,051317454

32 1886 1883 1891 1,923997493

19 1490 1486 1497 1,749895004

86 3985 3975 3989 1,454915710

23 1553 1549 1558 1,090828045

77 3401 3399 3412 1,082192700

222 11784 11768 11797 0,265484282

Классификационные модели для массивов масс-спектрометрических данных сывороток крови групп "больные СГБ" - "контроль" и «больные ХВДП» - «контроль» строили с использованием двух математических алгоритмов: генетического алгоритма и обучаемой нейронной сети. Более рациональными оказались модели, построенные на основе генетического алгоритма. В результате была создана дифференциально-диагностическая компьютерная программа, позволяющая на основе анализа сывороток крови больных отличать синдром Гийена-Барре от ХВДП.

Классификационная модель сывороток крови «СГБ-контроль» со 100% специфичностью и чувствительностью (специфичность в данном случае -процент правильно идентифицированных сывороток крови практически здоровых лиц контрольной группы, чувствительность — процент правильно идентифицированных сывороток крови больных СГБ) различала масс-спектры двух тестируемых групп (кросс-валидация по двум группам — 94%). Классификационная модель «ХВДП-контроль» с 94% специфичностью и 100% чувствительностью различала масс-спектры двух групп (кросс-валидация по двум группам - 100%).

Для расшифровки патогенетической роли отдельных белков, входящих в характеристику протеомного профиля сыворотки крови больных синдромом Гийена-Барре, проводилась их идентификация с помощью метода тандемной масс-спеюрометрии, сопряженной с высокоэффективной жидкостной хроматографией с использованием квадрупольно-времяпролетного масс-

анализатора (О-ТОР1).

Карта идентифицированных белков в сыворотке крови больного синдромом Гийена-Барре представлена в таблице 4.

Как следует из таблицы, основную долю среди белков сыворотки крови больных СГБ, дающих значимые по величине пики, составляют аполипопротеины, которые на 82% перекрывают идентифицированные последовательности пептидов.

Таблица 4. Идентифицированные белки сыворотки крови больных синдромом Гийена-Барре

Идентификационный номер белка в базе данных SwissProt Кол-во идентифицирован- ных mm и;! гш па белок Степень перекрытия последовательно сти белка идентнфнциров анными пептидами (%) Молекулярный вес белка Наименование идентифицированного белка

Р02647 30 24% 28078,627 Apolipoprotein Л-Ш-242)

Р02671 22 3% 69756,693 Fibrinopeptide А

Р06396 16 6% 82959,136 Gelsolin (ADF)

PI0909 9 8% 25883,195 Clustcrin alpha chain (Apolipoprotein J)

Р02765 7 12% 30221,95 Alpha-2-HS-giycoprotein chain В

Р00734 3 8% 65308,215 Thrombin heavy chain

Р02768 6 3% 47360,499 Serum albumin

Р04004 4 7% 54305,605 Somatomedin-B

Р01024 4 2% 71316,635 Complement C3c alpha' chain fragment 2

Р02766 4 10% 15887,026 Transthyretin

Q14624 5 2% 101241,082 35 kDa inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4

Р00751 8 1% 83000,832 Complement factor В Bb fragment

Р02753 2 5% 20845,284 Plasma retinol-binding protein(l-176)

Q5K4E3 2 1% 91955,077 Polyserase-2

Р08697 2 2% 54565,78 Alpha-2-antiplasmin (Alpha-2-AP) (Alpha-2-PI)

Q9NS56 1 1% 119197,688 E3 ubiquitin-protein ligase Topors (p53-binding protein 3) (p53BP3)

Р02774 2 2% 52963,664 Vitamin D-binding protein (DBP) (VDB)

Р01008 1 3% 52602,45 Antithrombin-Ш (ATIII)

Р02656 2 11% 10852,306 Apolipoprotein C-III (Apo-CIII) (АроС-Ш)

014981 2 0% 206887,5 TATA-binding protein-associated factor 172 (TAF-172)

Q86V15 1 1% 124788,176 Zinc linger protein castor homolog 1

Р02760 3 3% 38999,487 Trypstatin

Идентификационный номер белка в базе дапвых SwissProt Кол-во вдептифи-цировап- ВЫ1 пептидов на белок Степень перекрытия последовательно сти белка идептяфипиров анпыми пептидами (%) Молекулярный вес белка HaHMCHOBauHe H,U"in McliHunponaiiiio! u 6ejiKa

Р15121 1 2% 35853,407 Aldose reductase (AR)

РОЇ857 1 3% 36105,922 Ig gamma-1 chain C region

Р04217 1 2% 51940,718 Alpha-1 B-glycoprotein

Q9NZJ5 1 1% 125147,238 Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3 (HsPEK)

014791 1 4% 41128,694 Apolipoprotein LI (ApoL-I; Apo-L)

Q8N8X6 1 5% 23142,346 Golgin subfamily A member 2-like protein 4

Q5W0B1 1 1% 81116,47 RING finger protein 219

Р05546 1 4% 54960,036 Heparin cofactor 2 (HC-II) (HLS2)

Q96RL7 1 0% 350902,68 Vacuolar protein sorting-associated protein 13A

Q9Y4A5 1 0% 437600,446 Transformation/transcription domain-associated protein (PAF350/400)

Р02654 1 35% 6630,574 Truncated apolipoprotein C-I (Apo-Cm') (ApoC-IB')

Q5T6C5 1 1% 77180,868 Ataxin-7-like protein 2

075643 1 0% 244507,692 U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase (U5-200KD)

Q05655 1 2% 77505,068 Protein kinase C delta type

Q6WRI0 1 0% 290838,045 Immunoglobulin superfamily member 10 (IgSFlO) (CMF608)

Q86U86 1 1% 182118,226 Protein polybromo-1 (hPBl) (BAF180)

Q9BZC7 1 1% 230563,759 ATP-binding cassette sub-family A member 2 (ATP-binding cassette 2)

Q1MSJ5 1 1% 141750,739 Centrosome and spindle pole-associated protein 1

Q9NSK7 1 5% 16286,217 Uncharacterized protein C19orfl2

Р04114 1 0% 515562,871 Apolipoprotein B-48 (Apo B-48)

095149 1 4% 41142,543 Snurportin-1

060809 1 3% 55062,608 PRAME family member 10

Q00013 1 2% 52296,489 55 kDa erythrocyte membrane protein (p55)

Q9P2A4 1 2% 38975,221 ABI gene family member 3 (Nesh)

Среди аполипопротеинов ведущее место занимают аполипопротеины СІ и АІ, которые являются активаторами лецитинхолестеролацил-трансферазы -фермента, превращающего свободный холестерин липопротеинов высокой плотности в гидрофобные формы. Вместе с аполипопротеином СПІ, способным подавлять липопротеинлипазу, они снижают содержание в сыворотке крови ЛПНП.

Эти данные позволяют предполагать, что развитию СГБ сопутствуют не только дегенеративные изменения со стороны периферических нервных волокон, но и нарушение липидного обмена, патогенетическое значение которых при данном заболевании к настоящему времени в литературе еще не описано.

Было показано, что содержание в крови липопротеинов низкой плотности действительно может служить критериальным признаком СГБ. Однако, низкий уровень этого показателя может регистрироваться при довольно широком спектре заболеваний (декомпенсированный сахарный диабет, гепатоцеллюлярные заболевания, холестаз, нефротический синдром, хроническая почечная недостаточность и др.). В связи с этим мы сочли целесообразным ввести еще один дополнительный параметр, отражающий не только падение ЛПНП, но и сопутствующий ему рост ЛПВП. Подобное соотношение рекомендуется определять, например, с целью прогнозирования атеросклероза, но в этом случае оно имеет вид ЛПНП/ЛПВП, т.е. несколько отличается от использованного нами. Результаты определения соотношения ЛПВП/ЛПНП у больных СГБ в сравнении с контролем представлены на рисунке 2.

3,0

2.5 2,0

1.6 1.0

,5 0,0

ввоир 1,00 2,00 3,00 4,00 5.00 6,00 7,00 8,00 Контроль

Рис. 2. 95% доверительные интервалы соотношения лнпидов низкой и высокой плотности у больных СГБ разных групп и здоровых людей

Как видно на рисунке 2, у больных СГБ, в отличие от здоровых людей, 95% ДИ коэффициента, как правило, превышает 0,65. Только у одного больного СГБ 3-ей группы отношение ЛПВП/ЛПНП составляло 0,52, а у остальных 98% больных соответствовало критериальному диапазону. В связи с этим всем больным кампилобактериозом, острой ЭБВ- или ЦМВ-инфекцией можно рекомендовать в период реконвалесценции определение уровней ЛПНП и ЛПВП. При значениях содержания ЛПНП в крови ниже 2,2 ммоль/л и соотношения ЛПВП/ЛПНП выше 0,65, больных предположительно можно отнести в группу риска развития СГБ.

Расшифровка механизма повреждения нервных волокон при СГБ, как и изучение других его патогенетических особенностей, учитывая аутоиммунный механизм развития заболевания, потребовало детальной характеристики иммунного статуса больных.

Наиболее наглядно выявленные особенности иммунного статуса обнаруживаются при построении графических изображений иммунологических профилей у больных различной групповой принадлежности (рисунок 3).

Так, иммунологический профиль у больных СГБ кампилобактерной этиологии показывал наибольшие отклонения со стороны клеток иммунной системы и компонентов комплемента, когда заболевание сопровождалось температурной реакцией, в несколько меньшей степени эти отклонения зарегистрированы у больных с проявлениями острой кишечной инфекции, а минимальные изменения - при отсутствии клинических проявлений. По всей вероятности, в данном случае ведущее значение имеет «локализованность» инфекционного процесса, как это наблюдается, например, при острой кишечной инфекции, или его распространенный характер, в частности, при общей температурной реакции в отсутствие местных проявлений. В последнем случае иммунологические сдвиги в крови более выражены.

У больных СГБ с ЦМВ-инфекцией в анамнезе отклонения иммунологического профиля были минимальными, а у больных с ЭБВ-инфекцией ведущее дифференциальное значение приобретал рост ЦТЛ а также Сц компонента комплемента.

СГБ, Campylobacter jejuni, острая кишечная инфекция СГБ, Campylobacterjejuni, гипертермия СГБ, Campylobacterjejuni, бессимптомное течение СГБ, Cytomegalovirus,ОРЗ или бессимптомное течение СГБ, Epstein-Barrvirus, ОРЗ или бессимптомное течение

*109/л

КомлонентьСЗЬ комплемента

ЕК *10"/л

Компоненты комплемента

Т-лимфоциты

Т-хелперы

Т-лимфоциты *10'/л

Рис. 3. Иммунологические профили у больных синдромом Гийена-Барре

В то же время, сопоставление профилей показало, что наибольшее дифференциальное значение не только на количественном, но и на качественном уровне, имеет содержание в крови естественных киллеров (ЕК,

СВЗ-/СБ16+/СВ56+), число которых при кампилобактерной этиологии синдрома Гийена-Барре значительно увеличивается, а их соотношение с другими СБ56+ клетками (ЕКТ, СБЗ+/СВ56+) превышает 5,5. При герпесвирусных инфекциях содержание ЕК в крови значительно ниже, а их соотношение с ЕКТ не превышает 2,8.

В связи с тем, что наиболее значительные сдвиги наблюдались со стороны СБ56+ клеток (ЕК и ЕКТ), был детально проанализирован их субпопуляционный состав и функциональное состояние. Было установлено, что развитие СГБ сопровождалось довольно значительными сдвигами со стороны рецепторного аппарата указанных клеток. При этом все наблюдаемые изменения, независимо от этиологии и клинических проявлений, были однонаправленными и включали достоверное падение экспрессии рецепторов иммуноглобулиновой природы (СБ 158а,Ь), отсутствие в большинстве случаев достоверных изменений в содержании киллингингибирующих лектиновых рецепторов (СЭ94+) и значительный рост присутствия на мембранах С056+ клеток активирующих лекетиновых рецепторов (ЫКС2В) и рецепторов естественной цитотоксичности (МСр46). Подобный спектр изменений свидетельствует о том, что у естественных киллеров при СГБ преобладают процессы активации, которые сопровождают контакт ЕК с клетками-мишенями. Это обстоятельство говорит о том, что в патогенезе СГБ один из ведущих механизмов дегенерации нервных клеток может быть связан с цитотоксическими реакциями ЕК в периферической нервной системе.

Корреляционный анализ подтвердил ведущую патогенетическую роль СЭ56+ лимфоцитов, включающих такие клетки врожденного иммунитета, как ЕК и ЕКТ в развитии СГБ. Несомненно патогенетическое значение системы комплемента в этом патологическом процессе. Что касается остальных клеток иммунной системы, то они формируют иммунологический профиль СГБ в соответствии с этиологией предшествующего инфекционного процесса и его клиническими проявлениями. При этом следует подчеркнуть еще одну особенность, выявленную в процессе изучения корреляционных связей: оба ключевых патогенетических механизма — с участием С056+ клеток и

комплемента - формировали наибольшее число корреляционных пар с уровнем антител к азуаІо-ОМі, что показывает влияние процессов сиалирования ганглиозидов на комплементзависимое и ЕК-цитотоксическое повреждение периферических нервных волокон.

Был зарегистрирован еще один интересный феномен. Пятнадцати больным СГБ, сохранившим связь с исследователями после выздоровления, через 3 месяца и через 6 месяцев от начала заболевания был повторно проведен иммунологический анализ клеточного состава лимфоцитов. Достоверная динамика популяционного/субпопуляционного состава лимфоцитов наблюдалась только на уровне числа С016+/СБ56+ клеток, то есть естественных киллеров. При этом все повторно обследованные больные четко разделились на три подгруппы:

1) У 3 из 15 больных (20%) число ЕК было относительно стабильным на протяжении 3-х месяцев и снижалось через 6 месяцев от начала заболевания: острый период - 9,5+1,4%; через 3 месяца - 11,1+0,3%; через 6 месяцев -6,0+2,8%. Интересно отметить, что ни одному из этих пациентов не потребовалась искусственная вентиляция легких (ИВЛ), а бальная оценка двигательных функций по Северо-Американской шкале (САШ) составляла 2,67+1,63, то есть заболевание имело довольно благоприятное течение.

2) У 6 больных (40%) число ЕК на протяжении всего исследования достоверно падало (р<0,05): острый период - 15,5±5,3%; через 3 месяца -7,2±3,7%; через 6 месяцев - 3,1±2,3%. Ни одному из этих пациентов не требовалась ИВЛ, а количество баллов по САШ составляло 3,67+0,52, то есть заболевание протекало несколько тяжелее, чем в первой подгруппе, но все-таки течение его было относительно благоприятным.

3) У 6 больных (40%) число ЕК, наоборот, имело тенденцию к повышению: острый период - 15,5+6,8%; через 3 месяца - 16,6+6,6%; через 6 месяцев - 17,2+6,9%. 4-м из 6 (67%) пациентов этой группы проводилась ИВЛ, баллы по САШ были максимальными - 4,5±0,84, иными словами, у всех этих пациентов отмечалось тяжелое течение болезни.

Основные особенности каждой из групп отражены на рисунке 4.

« А —---- Б

5 ш

; \ 4 гл -1

3

: X я

2

\ 1

0

3 В 6

Острим период (П ЧЦоЗмнц) Червбмяр ЕК без ЕК ЕК колебаний падают растут

—Е<8езкмйаий — ЕК падает — ЕКрхтп

Рис. 4. Динамика числа ЕК (А) в течение б месяцев наблюдения и соответствующие ей баллы по САШ (Б) в острый период заболевания у больных синдромом Гийена-Барре

В состав корреляционных связей с ЕК в разных подгруппах входили: уровни антител к СМ| и компонента комплемента СЗЫ, соотношение субпопуляций ЕК, число ЕКТ в крови.

Подгруппа со стабильным числом ЕК характеризовалась самым низким содержанием в крови субпопуляции ЕК СОббЬ^Ь^ самым высоким содержанием в крови СЗЫ и ЕКТ. Это позволяет предполагать, что как комплементзависимый, так и ЕК-цитотоксический механизм в данной подгруппе реализовались в минимальной степени, а преобладал адаптивный иммунный ответ, запускаемый при участии ЕКТ.

В особенные признаки подгруппы со снижающимся числом ЕК входило очень высокое содержание в крови антител к ОМ] при самом низком уровне ингибитора СЗ компонента комплемента. Это позволяет предположить, что

ведущим повреждающим агентом для периферических нервных волокон в данном случае выступал комплемент.

Наконец, третья - самая неблагоприятная с клинической точки зрения — группа в качестве ведущего признака характеризовалась чрезвычайно низким числом ЕКТ, что не могло не сказаться негативно на качестве специфического иммунного ответа при преобладании врожденных иммунных реакций с активньм участием ЕК.

Правомерность сделанных выводов подтвердило и определение корреляционных связей между динамикой ЕК и наиболее информативным показателем клинического статуса больных СГБ в виде оценки мышечной силы пациентов в баллах по Северо-Американской шкале. Коэффициент корреляции Спирмена оказался довольно высоким (г=0,648) для непараметрической статистики, который статистическая программа оценила как высоко достоверный.

Таким образом, есть все основания считать, что гетерогенности аутоиммунного повреждения нервных волокон при СГБ соответствуют определенные типы иммунного ответа при ключевом значении в этом процессе систем комплемента и естественных киллеров.

Рассматривая синдром Гийена-Барре, как аутоиммунное осложнение предшествующего инфекционного процесса, была учтена возможность еще одного механизма повреждения миелина нервных волокон - с участием каталитических антител (абзимов).

Методом электрофореза в сыворотках крови больных СГБ были выявлены антитела, гидролизующие общий белок миелина.

В ряде сывороток удалось установить и точку приложения гидролитического действия каталитических антител, формируемых при СГБ. Для определения сайт-специфичности гидролиза ОБМ аутоантителами было применено сочетание методов обращенно-фазовой хроматографии, трицинового белкового электрофореза и масс-пектрометрии 5ЕЬ01. Основной точкой приложения гидролиза оказался пептид 7 основного белка миелина, при

этом в большинстве случаев при СГБ наиболее предпочтительным для гидролиза являлся аргининовый сайт (Arg46).

Уровень аутоантител к основному белку миелина, являвшегося модельным при обнаружении каталитических антител, в ходе острого периода СГБ у всех тестированных больных примерно соответствовал таковому у здоровых людей и начинал подниматься только по истечении 3-х месяцев от начала заболевания, когда клинические признаки СГБ уже исчезали. У 2-х больных из трех содержание таких антител в крови продолжало увеличиваться и регистрировалось на более высоких значениях после 6 месяцев от момента первичного обследования (рисунок 5).

^»Контроль ш Острый период СГБ ■ Через 3 месяца после СГБ ■ Через б месяцев после СГБ

Рис. 5. Уровни связывания каталитических аутоантител со специфическим модельным субстратом (ОБМ) у больных СГБ в сравнении с контролем

Данный фрагмент исследований, направленный на обнаружение каталитических антител к основному белку миелина в крови больных синдромом Гийена-Барре, позволил получить положительный результат, но патогенетическое значение этих антител, как и возможные их протективные эффекты, пока остались неясными, хотя некоторые предположения можно сделать на основе клинических примеров.

Было установлено, что при наличии каталитических антител у больных наблюдается более быстрое прогрессирование клинической симптоматики, преобладание среднетяжелого течения болезни и значительное укорочение восстановительного периода с практически полным регрессом неврологической симптоматики. Можно предположить, что это связано именно с протективным действием каталитических антител к основному белку миелина в крови.

На основании полученных данных были составлены схемы патогенеза синдрома Гийена-Барре с участием всех рассмотренных в работе механизмов развития болезни. При этом были выделены два различных варианта аутоиммунных процессов, сопровождающих данный синдром (рис. 6, 7).

ОБРАТНОЕ РАЗВИТИЕ СИМПТОМОВ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Высвобожение растворимых ганглиозидов

Взаимодействие с аутоаитителами Элиминация растворимых иммунных комплексов через фагоцитоз

«Мимикрирующие» микробные антигены

Антитела (АЬ)

Перехват Ранвье

Аполипопро теины С-1, С-Ш, А-І, і

Высвобожение фрагментов МВР Выработка каталитических антител

Рост доступности мембраны

Эндоцитоз иммунных комплексов |

Присоединение к мембране в перехвате Ранвье Лизис мембраны

Потеря Са2+через поры в мембране Нарушение проводящих функций нервного волокна

I

Элиминация иммунных комплексе и блокада

]

(

МОДУЛЯЦИЯ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ

У Формирование везикул в местах

> скопения холестерола

> Эндоцитоз везикул

> Деградация иммунных комплексов

> Ретроградный транспорт антител в

> нервную клетку

> Выход ганглиозидов в мембрану

ОБРАТНОЕ РАЗВИТИЕ СИМПТОМОВ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Рис. 6. Схема патогенеза синдрома Гийена-Барре с участием антител к компонентам миелина и системы комплемента

СП 16

Аксон

Аутоантитела

Аполипопротеины С-1, С-ІІІ, А-1, J

ТЯЖЕЛОЕ ТЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Перехват Ранвье

Швэнновская / клетка

Избыточный

синтез

Демиелинизация

> Синтез , миелина

Аполипопротеин С-ІІІ, гельсолин

▼

Высвобожение растворимых ганглиозидое Нейтрализация аутоантител Ослабление антителозависимой цитотоксичности

I

ОБРАТНОЕ РАЗВИТИЕ СИМПТОМОВ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Соматомедин В

> Взаимодействие с мембраной нервного волокна с участием С0158, N№20 или с ганглиозидами с участием СР16

> Дегрануляция с высвобождением перфо-ринов и гранзимов

> Повреждение нервного волокна перфорином и гранзимами

> Реализация АЗКЦТи ЕК-цитотоксичности

Избыточная активность

> »

Рис. 7. Схема патогенеза синдрома Гийена-Барре с участием естественных киллеров и ЕКТ (СП56+ клеток)

ВЫВОДЫ

1. Характер аутоиммунного компонента у больных с острой постинфекционной аксонапьно-демиелинизирующей полиневропатией (СГБ) зависит от этиологии предшествующего инфекционного процесса и его клинических проявлений.

2. Развитию синдрома Гийена-Барре чаще всего предшествовал инфекционный процесс, вызванный Campylobacter jejuni (46%) при наличии симптоматики острой кишечной инфекции, гипертермии или без клинических проявлений, реже - цитомегаловирусами (10%) или вирусами Эпштейна-Барр (7%) при наличии катарально-респираторных проявлений.

3. Аутоиммунный компонент развития синдрома Гийена-Барре был представлен спектром антител к GMi, GDib и asyalo-GM! при предшествовавшем кампилобактериозе, а при Эпштейна-Барр вирусной и цитомегаловирусной инфекциях спектр аутоантител к ганглиозидам был иным - anti-MAG, anti-GDib и anti-asyalo-GMi, anti-GMi, anti-GDia, anti-GDlb, соответственно.

4. Среди иммунологических механизмов развития синдрома Гийена-Барре ключевыми являются система комплемента, компоненты которой по-разному представлены в сыворотке крови больных в зависимости от этиологии заболевания, и не зависящее от этиологии число CD56+ клеток крови, их субпопуляционный состав и экспрессия рецепторов, регулирующих киллерную активность.

5. Тяжесть течения синдрома Гийена-Барре коррелирует с определенным типом иммунного ответа: (1) при легком течении чаще имелось стабильное число ЕК с низким содержанием в крови субпопуляции CD56bright при высоком уровне C3bi и ЕКТ; (2) при средне-тяжелом течении болезни отмечено падение числа ЕК при высоком уровне антител к GMi и низком содержании C3bi; (3) для тяжелого течения было характерно нарастание числа ЕК, высокий уровень антител к GMi и низкое содержание в крови ЕКТ.

6. При синдроме Гийена-Барре впервые в сыворотке крови были обнаружены каталитические антитела, нарастание уровня которых происходило

по мере исчезновения клинических симптомов болезни, что позволяет рассматривать данный факт с точки зрения протективного действия этих антител в механизме регрессии данной аутоиммунной аксонально-демиелинизирующей полиневропатии.

7. Использование масс-спектрометрии позволяет дифференцировать СГБ от ХВДП по наличию спектра пиков со следующими значениями соотношения молекулярной массы к заряду (m/z): 1945; 2877; 4478; 3985; 2843; 2239 позволяет диагностировать у пациента синдром Гийена-Барре; наличие пиков со следующими значениями соотношения молекулярной массы к заряду(пт/г): 1945; 1886; 1490; 3985; 1552; 3401 - хроническую воспалительную полиневропатию, а отсутствие указанных наборов пиков в масс-спектре сыворотки крови - отсутствие у пациента аксонально-демиелинизирующей полиневропатии.

8. Преобладание в протеоме сывороток крови аполипопротеинов C-I, A-I, C-III, J, гельсолина, соматомедина, тромбина и клюстерина, обладающих способностью к регуляции липидного состава крови и клеточных мембран, обмена сиаловых кислот, регенерации нервных волокон - вскрывает некоторые патогенетические механизмы развития и угасания клиники синдрома Гийена-Барре.

9. Маркерами синдрома Гийена-Барре предположительно могут служить низкий показатель содержания в крови липопротеинов низкой плотности и высокое соотношение липопротеинов высокой и низкой плотности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При кампилобактериозе, цитомегаловирусной и Эпштейна-Барр вирусной инфекциях необходимо динамическое исследование неврологического статуса больных с целью выявления первых признаков поражения периферической нервной системы и своевременной диагностики возможного развития синдрома Гийена-Барре.

2. Для дифференциальной диагностики синдрома Гийена-Барре с хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатией с острым

началом целесообразно проводить масс-спектрометрию сывороток крови больных с использованием специального программного обеспечения на основе разработанных классификационных моделей «СГБ-контроль» и «ХВДП-контроль».

3. Всем больным кампилобактериозом, острыми Эпштейна-Барр вирусной или цитомегаловирусной инфекциями в периоде реконвалесценции необходимо рекомендовать определение уровней ЛПНП и ЛПВП. При значениях содержания ЛПНП в крови ниже 2,2 ммоль/л и соотношения ЛПВП/ЛПНП выше 0,65, больных предположительно можно отнести в группу риска развития синдрома Гийена-Барре.

4. Для прогнозирования тяжести течения синдрома Гийена-Барре рекомендуется динамическое исследование содержания естественных киллеров в крови больного: относительно стабильный уровень ЕК характерен для более легкого течения болезни; снижающийся уровень ЕК — для среднетяжелого течения; нарастающий уровень ЕК - для тяжелого течения.

5. Обнаружение в сыворотке крови больных синдромом Гийена-Барре каталитических антител с гидролитической активностью является прогностически благоприятным фактором и свидетельствует о возможности быстрого регресса неврологической симптоматики независимо от тяжести течения болезни.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тимченко О.Л., Попова Т.П., Петряев В.Г. и др. //Неврологические осложнения Эпштейна-Барр вирусного инфекционного мононуклеоза (клинические случаи) // Сб. докладов Пятой научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства», 2007. - С. 34-36.

2. Тимченко О.Л., Морозова Е.А., Ющук Н.Д. // Основные аспекты клиники, диагностики и лечения синдрома Гийена-Барре на современном этапе // Медицинская помощь. - 2008. - №4. - С. 11-15.

3. Морозова Е.А., Тимченко О.Л., Гультяев М.М., Балмасова И.П., Ющук Н.Д. // Иммунологические аспекты острых и хронических аксоналыю-демиели-низирующих полиневропатий // Материалы 1 Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - М., 2009. - С. 241.

4. Ющук Н.Д., Балмасова И.П., Морозова Е.А., Тимченко О.Л., Гультяев М.М. // К вопросу об иммунологических механизмах формирования острых и хронических аксонально-демиелинизирующих полиневропатий // Сб. трудов X Международного Конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» - Казань, 2009. - С. 328.

5. Ющук Н.Д., Тимченко О.Л., Морозова Е.А., Федькина Ю.А. // Совершенствование алгоритма диагностики демиелинизирующих полиневроиатий // Лечащий врач. - 2009. - №10. - С. 5-9.

6. Балмасова И.П., Гультяев М.М., Тимченко О.Л. и др. // Совершенствование алгоритма диагностики и прогнозирования течения демиелинизирующих заболеваний нервной системы на основе определения пептидного состава основного белка миелина в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости больных // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы». - Москва. - 2009. - С. 208-209.

7. Ющук Н.Д., Балмасова И.П., Тимченко О.Л., Морозова Е.А., Гультяев М.М. // Иммунопатология синдрома Гийена-Барре // Физиология и патология иммунной системы. - Москва. - 2009. - Т. 2 - №6 - С. 8-14.

8. Ющук Н.Д., Тимченко О.Л., Федькина Ю.А. и др. // Протеомные методы в диагностике демиелинизирующих полиневропатий, как осложнений некоторых инфекционных заболеваний // Материалы II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - Москва. - 2010,- С. 381.

9. Балмасова И.П., Тимченко О.Л., Морозова Е.А., Гультяев М.М., Ющук Н.Д. // Иммунологические аспекты патогенеза синдрома Гийена-Барре // Иммунология. - Москва. - 2010. - № 1 (том 31) - С. 38-42.

Ю.Балмасова И.П., Гультяев М.М., Тимченко O.JI. и др. // Совершенствование алгоритма диагностики и прогнозирования течения демиелинизирующих заболеваний нервной системы на основе определения пептидного состава основного белка миелина в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости больных // Сб. тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2010 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». -Москва. - 2010. - С. 79-80. Электронная версия - http://www.eimb.ru/ conference/conf.html

П.ГОщук Н.Д., Тимченко О Л., Морозова Е.А., Федькина Ю.А., Балмасова И.П. // Кластерный подход к определению клинической формы синдрома Гинена-Барре // Хирург. - 2010. - №12. - С. 4-9.

12.3иганшин Р.Х., Арапидн Г.П., Азаркин И.В., Тимченко ОЛ. и др. // Протеомные технологии для выявления в сыворотке крови потенциальных биомаркеров аутоиммунных демиелинизирующих полиневропатий // Биоорганическая химия. - 2011. - том 37, №1. - С. 36-44.

13.Ющук Н.Д., Тимченко O.JL, Федькина Ю.А. // Иммунологические и этиологические особенности аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий инфекционного генеза // Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. Москва. -2011. - С. 418.

14. Федькина Ю.А., Тимченко О.Л., Ющук Н.Д. // Использование протеомных методов исследования для диагностики постинфекционных аутоиммунных аксонально-демиелинизирующих полиневропатий // Сб. материалов XVIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — 2011. - С. 288.

15.Yushuk N.D., Timchenko O.L., Fedkina Y.A. // Diagnostik von axonal-demyelinisierenden Polyneuropathien basierend auf den proteomischen technologien // Internationaler Kongress Fachmesse. Moderne Aspecte der Prophylaxe, Behandlung und Reabilitation. Euromedica Hannover. - 2011. -P. 160-161.

16ЛОщук Н.Д., Тимченко O.JL, Балмасова И.П., Федькина Ю.А., Шмелева Е.В. // Роль CD56+ лимфоцитов в патогенезе синдрома Гийсна-Барре // Аллергология и иммунология. - 2011. - Том 12. № 4. - С. 331-337

17.Ющук Н.Д., Балмасова И.П., Тимченко OJL, Морозова Е.А. и др. // Способ дифференциальной диагностики форм синдрома Гийена-Барре и хронической воспалительной демпелннизирующей полиневропатии с острым началом // Патент РФ № 2432113 от 27.10.2011 г.

18.Балмасова И.П., Тимченко O.JL, Ющук Н.Д., Сепиашвилн Я.Р. // CD56+ лимфоциты в патогенезе демиелинизнрующей полиневроиатии // Аллергология и иммунология. - 2012. - Том 13. -№ 1. -С. 87.

19. Ющук Н.Д., Балмасова И.П., Тимченко O.JI., Пирадов М.А. и др. // Способ диагностики аксоналыю-демиелинизирующих полиневропатий // Патент РФ № 2441240 от 27.01.2012 г.

20.Суионева H.A., Пирадов М.А., Никитин С.С., Тимченко O.JI. и др. // Патогенетическая и прогностическая роль аутоантител к ганглиозндам периферических нервов ири синдроме Гийена-Барре // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. - 2013. - том 7. - №1. - С.

21.Ющук Н.Д., Балмасова И.П., Тимченко O.JI. и др. // Интегральный подход к оценке осложнений и исходов инфекционных процессов // Здоровье населения и среда обитания. - 2013. - № 1 (238) - С.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ГА - генетический алгоритм

ЕК - естественные киллеры

ИФА - иммуноферментный анализ

кДа - килодальтон

ЛПВП - липопротеины высокой плотности ЛПНП — липопротеины низкой плотности МАГ - миелин-ассоциированный гликопротеин ОБМ - общий белок миелина САШ - Северо-Американская шкала СГБ - синдром Гийена-Барре ХВДП - хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия

GMi - ганглиозид Mi GM2 - ганглиозид М2 GDia - ганглиозид D]a GDib - ганглиозид Dib GQib - ганглиозид Q,b

ЦМВ - цитомегаловирус ЦНС - центральная нервная система ЭБВ - Эпштейна-Барр вирус ЭНМГ - электронейромиография asialo-GMi - ганглиозид асиало-Мі

Выражаю глубокую сердечную благодарность заслуженному деятелю науки РФ, академику РАМН, профессору, д.м.н. Ющуку Николаю Дмитриевичу за вдохновение, поддержку и научно-консультативную помощь, оказанную при выполнении диссертационной работы.

Выражаю огромную благодарность заведующей лабораторией патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний отдела клинической медицины НИМСИ МГМСУ, профессору, д.м.н. Балмасовой Ирине Петровне за неоценимую всестороннюю помощь при выполнении данной работы.

Искренне признательна заместителю директора Научного центра неврологии РАМН, член-корреспонденту РАМН, профессору, д.м.н. Пирадову Михаилу Александровичу, профессору кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ, д.м.н. Мартынову Юрию Васильевичу и доценту той же кафедры, к.м.н. Кареткиной Галине Николаевне за оказанную мне методическую и консультативную помощь.

Выражаю благодарность профессору лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний отдела клинической медицины НИМСИ МГМСУ, д.м.н. Ереминой О.Ф. и старшим научным сотрудникам лаборатории -к.м.н. Гультяеву М.М. и к.м.н. Шмелевой Е.В.; старшему научному сотруднику отделения реанимации НЦН РАМН, к.м.н. Супоневой H.A.

Отдельно благодарю научных сотрудников лаборатории биокатализа и лаборатории протеомики Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, а также сотрудников лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГУ НИИ ФХМ ФМБА России.

Подписано в печать 05.03.2013 г.

Усл.п.л. -2.5 Заказ №12614 Тираж: 100 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru