Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Использование аутофибробластов при лечении пациентов с рецессиями слизистой оболочки и дефицитом десны в области зубов и зубных имплантатов

Ю3471775

На правах рукописи

Степанова Инна Игоревна

Использование аутофибробластов при лечении пациентов срецессиями слизистой оболочки и дефицитом десны в области зубов и зубных

имплантатов

14.00.21. - «Стоматология» 14.00.27. - «Хирургия»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2009

003471775

Работа выполнена в ФГУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Росмедтехнологий».

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук,

профессор Кулаков Анатолий Алексеевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,

профессор Балин Виктор Николаевич

Доктор медицинских наук,

профессор Чайлахян Рубен Карпович

Ведущая организация: ФГОУ «Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства России».

Защита состоится «17» июня 2009 года в 10 часов на заседании Диссертационного совета (Д. 208.111.01) в ФГУ «ЦНИИС и 4JIX Росмедтехнологий» по адресу: 119991, Москва, ул. Тимура Фрунзе, д. 16 (конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ЦНИИС и 4JIX Росмедтехнологий» по адресу: 119991, Москва, ул. Тимура Фрунзе, д. 16.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Гусева Ирина Евгеньевна

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Устранение рецессий десны остается одной из важнейших проблем в пародонтологии и имплантологии. Послеоперационное обнажение имплантатов приводит к косметическому дефекту и, зачастую, к необходимости замены ортопедической конструкции. Кроме нарушений косметического характера, обнаженные шейки зубов вызывают различные по интенсивности болевые ощущения.

Учитывая, что первичная рецессия десны встречается по данным различных авторов в 18 - 25 % у лиц даже молодого возраста, а послеоперационная рецессия десны - в 30 - 65 %, понятен масштаб распространенности данного вида нарушений и необходимость эффективных лечебных вмешательств.

Что касается методов устранения рецессий десны, то на сегодня они представлены различными хирургическими методиками, при этом весьма травматичными и, к сожалению, не всегда эффективными. Именно поэтому поиск альтернативных методов, лишенных перечисленных недостатков, является актуальным во всем мире.

В связи со сказанным понятен интерес к изучению возможности использования клеточных культур, в частности фибробластов, для замещения и/или восстановления утраченных мягких тканей.

На сегодня в стоматологии такие работы весьма малочисленны. В основном они освещают возможности применения аллогенных фибробластов в сочетании с различными носителями при лечении пародонтита. В частности, описаны методы трансплантации этих клеток на биополимерных пленках, твердой мозговой оболочке, остеопластических материалах (Саркисов Д.С. и соавт., 1994; Туманов В .П., Дмитриева Л.А., Рунова Г.С., 1998; Рунова Г. С., 2000; Новикова H.A., 2000, 2003; Грудянов А.И., Ерохин А.И., 1999, 2003).

Что же касается применения аутологичных фибробластов, то на сегодня имеются только единичные зарубежные работы по их использованию, в частности, с помощью инъекционного введения в целях восстановления межзубных сосочков

и устранения «черных треугольников» (компания «Изолаген», 2004; McGuire М.К., 2007).

Таким образом, уровень разработки этого направления можно охарактеризовать как самый начальный, в связи с чем требуется тщательное изучение и уточнение целого ряда вопросов, начиная с самой методики приготовления клеточных культур и изучения показаний к их использованию.

Цель исследования

Разработка и оценка эффективности метода устранения рецессий десны за счет использования аутологичных фибробластов человека.

Задачи исследования

1. Определить оптимальный участок для забора исходного материала с целью последующего выращивания культуры аутофибробластов.

2. Отработать клиническую методику инъекционного введения культуры аутофибробластов в зоны рецессий десны.

3. По данным клинического обследования, фотометрии, оптической когерентной томографии и компьютерной системы Florida Probe изучить влияние введения различных доз клеточных культур на состояние массива мягких тканей краевого пародонта.

4. По данным клинических, фотометрических и функционально-диагностических методов изучить эффективность проводимого лечения в зависимости от интервалов между инъекциями и кратности введения аутофибробластов.

5. На основании комплекса клинических и лабораторных исследований разработать рекомендации для использования инъекционного метода введения культуры аутофибробластов в целях устранения рецессий десны.

Научная новнша

Впервые в России отработана методика инъекционного введения аутофибробластов в десну и/или в межзубные десневые сосочки с целью уменьшения и/или устранения рецессий десны и «черных треугольников».

Впервые по данным электронной системы Florida Probe и оптической когерентной томографии изучено влияние инъекционного введения аутофибробластов на состояние мягкотканного массива пародонта. Выявлено, что инъекционное введение аутофибробластов обеспечивает увеличение массива мягких тканей десны, уменьшение «черных треугольников» и рецессии десны. Достигнутые изменения сохраняются на протяжении 9-ти мес., затем полностью или частично возвращаются к исходному состоянию.

Впервые с помощью реопародонтографии и лазерной допплеровской флоуметрии изучено влияние аутофибробластов на состояние гемодинамических процессов в тканях пародонта. Выявлено, что инъекционное введение клеточной культуры сопровождается увеличением интенсивности гемодинамических и микроциркуляторных процессов в месте введения, которое сохраняется до 9-ти мес. и затем возвращается к исходному состоянию.

Впервые на основании комплекса клинических и функциональных методов определено оптимальное количество аутофибробластов в единице объема физиологического раствора для инъекционного введения в десну и/или в межзубные десневые сосочки. Установлено, что для внутритканевого введения оптимальной является концентрация не более 5x106 клеток, а оптимальный объем физраствора 0,3 - 0,4 мл.

Впервые на основании комплекса клинических и функциональных методов изучено влияние различной кратности инъекционного введения аутофибробластов на состояние мягких тканей десны и длительность сохранения достигнутых результатов. Установлено, что нет разницы в клиническом эффекте при введении аутофибробластов с разными временными интервалами, а достигнутые результаты сохраняются до 9-ти месяцев после инъекции клеточных культур.

Практическая значимость

Определены оптимальные участки для забора исходного материала и приготовления культуры аутофибробластов для инъекционного введения в десну и/или в межзубные десневые сосочки с целью уменьшения и/или устранения рецессий десны и «черных треугольников».

Обосновано количество однократно вводимых в десну аутофибробластов.

Обоснована кратность повторных введений аутофибробластов и определены оптимальные временные интервалы между повторными инъекциями в целях максимального увеличения объема мягких тканей десны и достижения косметического эффекта при устранении рецессии десны после проведения имплантологических вмешательств или при патологии пародонта в ходе одного курса лечения.

Научные положения, выносимые на защиту

1. Инъекционное введение аутологичных фибробластов в количестве от 2x106 до 5x106 клеток в один участок обеспечивает увеличение толщины десны, начиная со 2 недели по 9-й месяц (с 200 мкм до 254 мкм), уменьшение «черных треугольников» и рецессии десны на 1,5 - 2 мм в сроке до 9 мес. после первого введения, что подтверждается результатами клинического контроля, фотометрии и OKT.

2. Сравнительное изучение клинико-функциональных изменений в тканях десны показало эффективность применения аутофибробластов как с интервалом в 9 месяцев, так и с однонедельным интервалом. При рецидиве рецессии десны показано проведение повторного курса инъекционного введения клеточных культур.

Апробация диссертации

Основные материалы диссертации доложены на конференции ММА имени И.М. Сеченова, ЦНИИС и ЧЛХ «Учителя и ученики: актуальные вопросы стоматологии» (Москва, 2007), в рамках 5-го Всероссийского стоматологического

форума «Дентал Ревю» (Москва, 2008), на конференции по дентальной имплантации (Москва, 2008), в рамках XIII международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов (Санкт-Петербург, 2008), на V международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», посвященной 250-летнему юбилею ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 2008).

Апробация работы проведена 13 апреля 2009 г. на совместном заседании сотрудников отделений: клинической и экспериментальной имплантологии; ортопедической стоматологии и имплантологии; пародонтологии; амбулаторной хирургической стоматологии; отдела общей патологии ФГУ «ЦНИИС и ЧЛХ Росмедтехнологий».

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 - в центральной печати.

Объем н структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и включает введение, главу «Обзор литературы», главу «Материал и методы исследования», 3 главы результатов собственных исследований, главу «Обсуждение полученных результатов», заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы. Работа иллюстрирована 23 рисунками и содержит 16 таблиц. Библиография включает 200 источников, го них 102 отечественных и 98 зарубежных авторов.

Содержание диссертации Материал и методы исследования

Исследование проведено на 20-ти пациентах, из них 16 женщин и 4 мужчин. Возраст пациентов колебался в интервале от 20 до 45 лет. При этом с патологией пародонта обследовано 14 пациентов; с патологией краевой десны после проведения операции внутрикостной имплантации - 6 пациентов.

У 20-ти пациентов проведено обследование зубов фронтальной группы обеих челюстей. Всего обследовано 120 зубов, из них 18 имплантатов и 102 зуба с рецессиями десны, возникшими после лечения хронического пародонтита (из них пародонтит легкой степени - 59 зубов, средне-тяжелой - 43).

До включения в исследование от каждого пациента было получено письменное согласие на введение аутологичных фибробластов, оформлена специальная медицинская анкета.

На этапах подготовки к инъекции клеточных культур и в период контрольного наблюдения проводили гигиеническое обучение пациентов, контроль, и при необходимости - профессиональную гигиеническую обработку полости рта 1 раз в 3 месяца с целью выработки устойчивой мотивации к соблюдению гигиены полости рта на протяжении всего периода исследования.

При наличии патологии преддверья полости рта либо патологии строения и прикрепления уздечек верхней и нижней губ, а также наличии тяжей слизистой оболочки переходной складки предварительно (не менее чем за 4 месяца до предполагаемой процедуры введения аутофибробластов) устраняли их соответствующими хирургическими методами.

На подготовительном этапе все пациенты проходили стандартное клинико-лабораторное обследование, включающее анализ крови на инфекции: ВИЧ, гепатит В и С, микоплазму, сифилис, туберкулез (согласно приказу МЗ № 325 от 25 июля 2003 г. «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации»).

Критерии исключения пациента из исследования:

1. Отказ пациента от участия в исследовании.

2. Индивидуальная непереносимость проводимых процедур.

3. Инфекции: ВИЧ, микоплазма, гепатиты В и С, сифилис; аутоиммунные заболевания (красная волчанка, ревматоидный артрит, псориаз, склеродермия и др.); любые аллергические проявления в стадии выраженных реакций; онкологические заболевания; трансплантация органов; постоянная гормональная терапия кортикостероидами; острые инфекционные и неинфекционные заболевания;

хронические заболевания в стадии обострения; беременность и кормление грудью; психические заболевания.

Методы исследования:

• Оценка рецессии десны (по классификации Миллера, 1985);

• определение индексов гигиены полости рта (метод Силнеса-Лоэ, 1962; Грин-Вермильона, 1960);

• изучение микроструктуры десны с помощью оптического когерентного томографа (производство ИПФ РАН, г. Нижний Новгород);

• изучение метрических параметров десны (для замера глубины десневых карманов и рецессии исследуемых зубов использовали градуированный пародонтальный зонд и автоматизированную компьютерную диагностическую систему «Флорида Проуб» (США);

• оценка динамики кровотока исследуемого участка десны с помощью лазерной допплеровской флоуметрии (JIAKK-01, НПП «JIA3MA», г. Москва) и реопародонтографии (НТЦ «Медасс», г. Москва);

• фотометрия исследуемых участков десны (с использованием фотоаппарата Canon PowerShot G5 и мерной сетки).

При расшифровке реограмм анализировали значения показателей: ИПС (индекса периферического сопротивления), РИ (реографического индекса), ИЭ (индекса эластичности сосудов), ПТС (показателя тонуса сосудов).

При анализе ЛДФ-граммы учитывали статистические средние значения величины перфузии тканей кровью: М (среднее арифметическое значение уровня микроциркуляции), 5 (среднеквадратичное отклонение амплитуды колебаний кровотока) и Kv (коэффициент вариации).

Контрольные обследования с применением комплекса диагностических методов производили в следующие сроки:

1. Фотографирование участка вмешательства каждый месяц;

2. Изучение толщины десны в динамике (до инъекции, через 2 нед., 2, 5 и 9 мес. после инъекции);

3. ЛДФ, РПГ - до инъекции и через 1, 3, 6 и 9 месяцев после инъекции аутофибробластов;

4. Florida Probe - до инъекции и в последующем 1 раз в месяц на протяжении 9 мес.

Цифровые данные, полученные в ходе исследований, подтверждены статистической обработкой с использованием t-критерия Стьюдента, точного метода Фишера и критерия «хи-квадрат».

В целях отработки оптимального количества аутоклеток для последующего введения в мягкие ткани краевого пародонта в сравнительном аспекте изучали особенности введения раствора при концентрации клеток от 2х10б до 10х106 (из расчета на 1 мл физиологического раствора).

В целях определения максимальной эффективности при различной кратности введения клеточных культур сравнительно оценивали результаты одно-, двух- и трехкратного введения клеток в один участок.

Кроме того, изучали влияние длительности интервалов между инъекциями на выраженность клинического результата:

1) инъекции 1 раз в 9 месяцев;

2) инъекции 1 раз в неделю еженедельно на протяжении 3-х недель.

Забор биоптата. При отрицательных результатах тестирования на инфекционные заболевания у пациента с его согласия под местной инфильтрационной анестезией скальпелем производили иссечение кусочка слизистой оболочки размером 2x2 мм со стороны преддверья полости рта, твердого неба или ретромолярного пространства (при соблюдении правил асептики и антисептики). Полученный биоптат помещали в герметичную стерильную пробирку с питательной средой и антибиотиком, которую хранили в холодильнике и поставляли в лабораторию в транспортном контейнере не позднее 3-х дней с момента забора биоптата.

В лаборатории первичную клеточную культуру фибробластов получали посредством обработки биоптата слизистой оболочки десны протеолитическими

ферментами с последующим культивированием в специально подобранных средах и условиях, способствующих выделению большого количества пролиферативно-активных жизнеспособных фибробластов (патент на изобретение «Биотрансплантат и способ коррекции дефектов мягких тканей, способ получения биотрансплантата» № 2281776 от 20.08.2006г.).

После получения необходимого количества клеток часть из них (3x10б) криоконсервировали для дальнейшего хранения и использования.

Контроль клеточных культур осуществляли ежедневно (фазово-контрастная микроскопия). Отбирали клетки, имеющие типичную фибробластоподобную морфологию. Жизнеспособность оценивали по окраске трипановым синим. При помощи инвертированного микроскопа оценивали морфологию клеток и слоя в целом. При этом известно, что в нормальных условиях фибробласты - это веретенообразные вытянутые клетки с прозрачной цитоплазмой. Отсутствие рисунка на субстрате (фибробласты обладают ориентированным ростом), появление зернистости в цитоплазме, пустые места в слое клеток, а также распластанность клеток свидетельствует об их дегенерации в результате токсических или иных вредных воздействий.

Необходимое для введения количество фибробластов поставляли в клинику в медицинском термоконтейнере в стерильных пробирках в дозе от 2х10бдо 10х10б клеток в 1 ш стерильного физиологического раствора для инъекций (объем вводимой суспензии варьировал в зависимости от используемой концентрации клеток).

Для обеспечения оптимальной жизнеспособности фибробластов клеточный материал использовали в течение 24 часов с момента приготовления клеточной суспензии. До использования клеточный материал хранили в холодильнике при температуре от + 4 °С до + 8°С.

Перед аспирацией клеточной суспензии в шприц пробирки согревали в руках в течение 2-х минут, затем их осторожно переворачивали несколько раз до получения гомогенной взвеси. После проведения аппликационной анестезии клеточный материал аспирировали в инсулиновый шприц и вводили в десну,

прилежащую к шейке зуба и/или в межзубные десневые сосочки на глубину 1 мм. При этом объем вводимой суспензии варьировал от 0,3 до 0,4 мл.

Критерием эффективности введения клеточного материала в ткань десны служило напряжение тканей десны, перифокальное побледнение слизистой оболочки в месте проведенной инъекции и наличие обратного вытекания раствора из места его инъецирования.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Сразу же после введения клеточных культур отмечалось напряжение тканей десны и перифокальное побледнение слизистой оболочки в месте проведенной инъекции, которое сохранялось на протяжении 2-3 часов. Кроме этого на десне имелись следы от вколов, которые исчезали самостоятельно в течение первых суток после проведения процедуры. За весь последующий период наблюдения (до 9 мес.) цвет десны был бледно-розовым и не отличался от окружающих тканей полости рта. Симптомов воспаления десны (гиперемии, кровоточивости) не отмечено. Также не выявлено ни одного случая системных (анафилактическая реакция, реакция «трансплантат против хозяина» и т.п.) и местных осложнений (гематомы, инфекционные осложнения).

Динамика гигиенического состояния была вполне предсказуемой и закономерной в обеих группах пациентов, и уровень гигиены оставался достаточно стабильным на протяжении всего срока наблюдения (2 года); среднее значение индексов Грина - Вермильона (О-\\0 и Силнесса - Лоэ (8-Ь) составило 0,6 ±0,1.

При сравнении изображений цифровых фотографий исследуемых участков десны уменьшение рецессии десны и увеличение высоты межзубных десневых сосочков отмечено нами со 2-го месяца и сохранялось на протяжении 9 месяцев (рис. 1).

а б

Рис. 1. Динамика изменений толщины и структуры кератинизированной десны, высоты десневого сосочка, выраженности десневого контура но данным цифровой фотометрии до инъекции клеток (а) и через 4 месяца после инъекционного введения аутологичных фидробластов (б).

Оценка влияния различных доз клеточных культур на состояние краевой и прикрепленной десны. При сравнительном изучении концентраций клеток от 2x10й до 10x10б, возникала трудность аспирации и введения содержимого пробирок с клеточным материалом в дозе 8x106 и 10x106 аутофибробластов в 1 мл физиологического раствора в шприц - как из-за негомогенности раствора и формирования клеточных конгломератов, так и из-за плотности десны. В этой связи данные дозировки клеточного материала были исключены из эксперимента при всей заманчивости использования их наивысшей концентрации.

Используемые планиметрическое и ОКТ - исследования и полученные на их основании данные не позволили выявить разницы в эффекте при введении любой из концентраций аутофибробластов в диапазоне от 2х10б до 5х106 в 0,3 - 0,4 мл клеточной суспензии. В дальнейшем исследовании дифференцировке концентрации аутофибробластов не придавали значения.

Динамика изменения глубины десневых карманов и рецессии десны.

Инъекции клеточных культур аутофибробластов привели к изменению фенотипа десны, и через 3 месяца в участках с рецессиями десны отмечалось формирование «искусственной борозды» глубиной, равной величине прироста тканей, т. е. 1-2 мм. В последующий период наблюдения (до 9 месяцев) эти значения не изменялись.

В табл. 1 представлены данные, полученные у больных с патологией пародонта. Результаты исследования у пациентов с патологией пародонта легкой и средне-тяжелой степени были одинаковыми. При этом выявлен факт фазности изменения тканевого субстрата после одной инъекции. Незначительное в течение 1-го месяца, более выраженное - к концу 2-го и максимальное увеличение объема - к 3-му мес., с 5-го по 9-й месяцы - замедление прироста тканей, и даже некоторое его снижение.

Таблица 1

Динамика величины рецессии десны до и « разные сроки после введения клеточной культуры с 9-ти месячным интервалом у лиц с заболеваниями

пародонта (1-ая группа наблюдения)

Кратность введения Сроки наблюдения Величина рецессии (мм) Прирост мягких тканей (мм)

Первое введение Исходное значение 3,22 ± 0,26 -

1 мес. 3,13 ±0,15 0,09 ±0,11

2 мес. 3,06 ± 0.32 0,16 ±0,06

3 мес. 1,72 ± 0,54 1,50 ±0,28

5 мес. 2,27 ± 0,36 0,95 ±0,10

6 мес. 2,22 ±0,41 1.00 ±0,15

9 мес. 2,22 ± 0,43 1,00 ±0,17

Второе введение До инъекции 2,22 ± 0,43 -

1 мес. 2.00 ±0.12 1,22 ±0,14

2 мес. 1,86 ±0,30 1,36 ±0,04

3 мес. 1,75 ±0,27 1,47 ±0,01

5 мес. 1,92 ±0,23 1.30 ±0,03

6 мес. 1,94 ±0,24 1,28 ±0,02

9 мес. 1,94 ±0,22 1,28 ± 0,04

Третье введение До инъекции 1,94 ±0.22 -

1 мес. 2,00 + 0,71 1,22 ±0,45

2 мес. 1,93 ± 0,42 1,29 ±0,16

3 мес. 1.72 ±0,63 1,50 ±0,37

5 мес. 1,76 ±0,45 1,46 ±0,19

6 мсс. 1,75 ± 0,36 1,47 ±0,10

9 мес. 1,75 ± 0,38 1,47 ±0,12

Похожая динамика изменения величины рецессий десны как после однократного, так и после повторного введения аутофибробластов отмечалась и в

13

першшплантатных тканях (табл. 2). При этом на протяжении первых трех месяцев после первой инъекции клеток отмечался постепенный прирост околоимплантатных тканей по отношению к исходному показателю на 1,4 мм. В последующие сроки наблюдения (4-9 мес.) отмечалось постепенное снижение достигнутого результата и через 9 мес. прирост околоимплантатных тканей составил 1,02 мм.

Таблица 2

Динамика рецессии десны до и в разные сроки после сведения

клеточной культуры в першшплантатные ткани (2-я группа наблюдения)

Кратность Сроки Величина Прирост мягких

введения наблюдения рецессии (мм) тканей (мм)

Исходное 3,50 ± 0,54 -

значение

Первое 1 мес. 3,20 ± 0.27 0,30 ±0.27

введение 2 мес. 2,91 ± 0,34 0,59 ± 0,20

3 мес. 2.1 ±0,15 1,40 ±0,39

5 мес. 2,5 ±0,34 1,00 ±0,20

6 мес. 2,48 ± 0,43 1.02 ±0.11

9 мес. 2,48 ± 0,37 1,02 ±0,17

До инъекции 2,48 ±0,37 -

1 мес. 2,31 ±0,22 1,19 ±0,32

Второе 2 мес. 2,20 ± 0,26 1,30 ±0,28

введение 3 мес. 2,05 ± 0,34 1,45 ±0,20

5 мес. 2,19 ±0,35 1,31 ±0,19

6 мес. 2,27 ± 0,30 1,23 ±0,24

9 мес. 2,27 ±0,31 1,23 ±0,23

До инъекции 2,27 ±0,31 -

1 мес. 2,35 ± 0,43 1,15 ±0,11

Третье 2 мес. 2,09 ± 0,32 1,41 ±0,22

введение 3 мес. 1,98 ±0,42 1,52 ±0,12

5 мес. 2,04 ± 0,28 1,46 ±0,26

6 мес. 2,05 ± 0,36 1,45 ±0,18

9 мес. 2,05 ± 0,36 1,45 ±0,18

После второй инъекции аутофибробластов степень обнажения имплантатов постепенно уменьшалась с 1-го по 3-й месяцы (с 2,31 ± 0,22 мм до 2,05 ± 0,34 мм соответственно); максимальный прирост тканей отмечался через 3 мес. (1,45 ± 0,2 мм). В дальнейшие сроки наблюдения (5-9 мес.) отмечалось незначительное

14

снижение прироста тканей (с 1,31 ± 0,19 мм до 1,23 ± 0,23 мм), а степень обнажения имплантатов по отношению к показателю, полученному через 3 мес. после повторного введения аутофибробластов, увеличилась и к 9-му месяцу составила 2,27 ± 0,31 мм.

После третьей инъекции аутофибробластов во 2-й исследуемой группе постепенное уменьшение степени обнажения имплантатов отмечалось на протяжении первых 2-х месяцев. Через 3 мес. прирост околоимплантатных тканей по отношению к исходному значению составил 1,52 мм. С 5-го по 9-й месяцы наблюдения прирост десны в области зубных имплантатов колебался с 1,52 ± 0,12 мм до 1,45 ± 0,18 мм соответственно. В последующем отмечалось возвращение околоимплантатных тканей к исходному состоянию.

При регистрации рецессии десны с помощью компьютерной диагностической системы Florida Probe после трехкратного введения клеточных культур с интервалом между инъекциями в 1 неделю в обеих группах наблюдения отмечалась идентичная динамика: в течение 1 месяца после инъекции клеток видимых изменений не происходило; через 1 месяц отмечался прирост тканей в пределах 1,05 мм (табл. 3).

Таблица 3

Динамика изменения рецессии десны до и в разные сроки после трехкратного введения аутофибробластов с интервалом между инъекциями в 1 неделю

Сроки наблюдения Величина рецессии (мм) Прирост мяг ких тканей (мм)

До инъекции 3,25 ± 0,34 -

1 мес. 2,20 ±0,25 1,05 ±0,09

2 мес. 2,04 ±0,35 1,21 ±0,01

3 мес. 1,23 ±0,15 2,02 ±0,19

6 мес. 1,06 ±0,43 2,19 ±0,09

9 мес. 1,06 ±0,37 2,19 ±0,03

Через 2 месяца после трехкратного введения клеточных культур с интервалом между инъекциями в 1 неделю метрические изменения были более выражены - 1,21 мм. Через 3 месяца средний показатель уменьшения рецессий достигал 2 мм. Через 6 мес. прирост тканей достигал максимального значения (2,19 ± 0,09 мм). С 7-го по 9-й мес. полученный прирост тканей сохранялся, а в последующем отмечалось возвращение тканевого субстрата к исходному состоянию.

Динамика плотностных характеристик и микроструктуры десны. При оценке микроструктуры десны с помощью оптического когерентного томографа до введения клеток изображение слизистой оболочки прикрепленной части десны характеризовалось отсутствием слоистой структуры, наличием едва заметной границы между эпителиальным слоем и собственной базальной пластинкой слизистой оболочки (рис. 2А).

После введения аутофибробластов в слизистую оболочку десны (как однократного, так и повторного) было отмечено нарастающее со временем в обеих исследуемых группах появление контрастности изображения, выраженной слоистости, увеличение толщины эпителиального слоя, появление более упорядоченного расположения соединительно-тканных волокнистых структур (рис 2Б, В, Г).

А Б В Г

Рис. 2. ОКТ изображение слизистой оболочки десны в участке N у лиц с заболеваниями пародопта.

А) До введения клеток; Б) 2 недели после инъекции ФБ, В) 6 месяцев после инъекции ФБ; Г) 9 месяцев после инъекции ФБ.

На основании ОКТ-исследования подтверждено нарастающее со временем увеличение толщины мягких тканей в обеих исследуемых группах на протяжении 9-ти мес. после первой инъекции аутофибробластов (табл. 4): толщина десны за этот временной промежуток увеличилась по отношению к исходному показателю на 223,8 ± 0,02 мкм (с 429,4 ± 0,01 мкм до 653,2 ± 0,03 мкм).

После второй инъекции аутофибробластов (с промежутком между инъекциями в 9 месяцев) через 2 мес. отмечалось увеличение толщины десны в среднем на 234,4 ± 0,02 мкм, а через 5 мес. - на 246,8 ± 0,01 мкм. В последующие сроки наблюдения (до 9 мес.) этот показатель не изменялся и составлял 676,2 ± 0,02 мкм. Через 2 мес. после 3-й инъекции клеточных культур (с промежутком между инъекциями в 9 месяцев) зафиксировано увеличение толщины десны на 255,3 ± 0,01 мкм (с 429,4 ± 0,01 мкм до 684,7 ± 0,02 мкм). С 5-го по 9-й месяцы наблюдения этот показатель не менялся и в среднем составил 684,6 ± 0,02 мкм.

Таблица 4

Динамика изменения толщины десны (М ± т) в обеих группах наблюдения до и в разные сроки после введения клеточной культуры с 9-ти

месячным интервалом (мкм)

Сроки обследования Первое введение Второе введение Третье введение

До инъекции 429,4 ± 47,1 653,2 ± 110,1 676,2 ±42,3

2 недели 494,3 ± 92,2 655,2 ± 92,6 675,8 ± 101,5

2 мес. 526,0 ± 95,1 663,8 ± 86,3 684,7 ± 96,4

5 мес. 547,4 ± 104,4 676,2 ± 45,5 684,8 ± 96,6

9 мес. 653,2 ± 110,1 676,2 ± 42,3 684,6 ±9 5,3

Результаты функциональных исследований.

Проведенные реографические исследования показали, что функциональное состояние сосудов пародонта изменялось во всех исследуемых группах: если по результатам исследования у лиц с заболеваниями пародонта легкой степени

тонус периферических сосудов в исследуемых участках десны исходно был повышен (вазоконстрикция), как и уровень микроциркуляции, то через 1 месяц после первой инъекции - ИПС сосудов пародонта снизился (со 131,2±2,02 до 97,5±2,38 %), уровень капиллярного кровотока в исследуемых участках десны также уменьшался (с 17,25±1,29 до 17,08±1,73 перф.ед.). Через 3 месяца после однократного введения аутофибробластов в .этой же группе пациентов тонус сосудов пародонта повысился до 113,3±3,7б %, но оставался сниженным по отношению к исходному значению; капиллярный кровоток резко увеличился в 1,5 раза по сравнению с исходными данными (с 17,25±1,29 до 25,32±4,69 перф.ед.). В последующие сроки наблюдения (с 6-го по 9-й мес.) индекс периферического сопротивления и уровень микроциркуляции в данной группе постепенно возвращались к исходным значениям, что может служить косвенным показателем прекращения пролиферативной активности фибробластов. Причем полученные нами данные согласуются с экспериментальными исследованиями других ученых (Milo, Hart, 1976; Келлер, 2000), доказавших сохранение активности жизнедеятельности фибробластов в сроки от 3 до 6 месяцев.

Через 1 месяц после второй инъекции клеточных культур у пациентов с заболеваниями пародонта легкой степени отмечалось небольшое снижение тонуса сосудов пародонта до 130,6±2,1 %, резкое повышение уровня капиллярного кровотока до 26,21±1,13 перф.ед. Через 3 мес. тонус сосудов пародонта повысился до 138,3±2,89 %, а уровень капиллярного кровотока, напротив, снизился и составил 21,64±1,66 перф.ед. К 9-му мсс. индекс периферического сопротивления в исследуемых участках десны составил 116,7±4,11 %, но оставался сниженным по отношению к исходному значению, в то время как уровень капиллярного кровотока опустился ниже исходного и составил 14,09±0,6 перф.ед.

После третьей инъекции аутофибробластов показатели реопародонтографии у пациентов с заболеваниями пародонта легкой степени имели ту же динамику, что и после второго введения клеточных культур.

При средне-тяжелой степени народонтита в тканях десны отмечались более выраженные гемодинамические и микроциркуляторные расстройства по

сравнению с таковыми при пародонтите легкой степени. С 1-го по 6-й месяцы как после первой, так и после повторной инъекций аутофибробластов прослеживалась фазность изменений основных показателей реопародонтографии и лазерной дошшеровской флоуметрии. При этом через 9 мес. после первою введения клеток уровень микроциркуляции возвращался к исходному значению (18,58±2,65 перф.ед), а индекс периферического сопротивления в данной группе так и не достиг исходного значения и составил 126,8±1,69 %. Однако, через 9 мес. после повторного введения клеточной культуры тонус сосудов пародонта приблизился к исходным значениям (150,8±3,43 %), в то время как уровень капиллярного кровотока оставался сниженным по отношению к исходному значению и составил 14,09±1,15 перф.ед.

Результаты реографическпх исследований до инъекции клеточных культур у пациентов с рецессиями десны в области периимплантатных тканей показали незначительно повышенный тонус сосудов (92,3±7,1 %), снижение уровня капиллярного кровотока (14,59±1,97 перф.ед.). Через 1 мес. после первой инъекции аутофибробластов ИПС в исследуемых тканях снизился до 68,4±2,6 %, а уровень капиллярного кровотока, напротив, повысился до 15,21±1,13 перф.ед. В сроки от 3-х до 9-ти мес. тонус сосудов постепенно увеличивался, но через 9 мес. оставался сниженным по отношению к исходному значению и составил 91,3±3,8 %. Максимальное увеличение уровня микроциркуляции отмечалось через 3 мес. после однократного введения аутофибробластов в периимплантатные ткани (22,37±0,64 перф.ед.), а через 9 мес. уровень капиллярного кровотока возвращался к исходному значению.

Через 1 мес. после повторного (как двух-, так и трехкратного) введения клеток через 9-ти мес. интервал уровень микроциркуляции в периимплантатных тканях почти в 2 раза превышал исходный показатель и составил 23,15±0,92 перф.ед., а тонус сосудов пародонта оставался на исходном уровне. Через 3 мес. ИПС в этой же исследуемой группе увеличивался по сравнению с исходным значением (с 92,3±7,1 до 98,6±4,2 %), как и уровень капиллярного кровотока (с 14,59±1,97 до 18,31±1,22 перф.ед.). С 6-го по 9-й мес. наблюдения тонус сосудов в

периимплантатных тканях колебался в пределах нормы (с 81,4±7,3 но 76,3±5,2 % соответственно), а уровень микроциркуляции снижался, но исходного значения через 9 мес. не достиг и составил 17,42±2,16 перф.ед.

Изучение эффективности трехкратной инъекции аутофибробластов с недельным интервалом между инъекциями в обеих исследуемых группах показало идентичную динамику: до инъекции клеток отмечался повышенный тонус сосудов пародонта, уровень микроциркуляции был снижен. Через 1 мес. ИПС снизился со 141,2±1,67 до 140,34±1,38 %, а уровень капиллярного кровотока, напротив, повысился (с 11,53±2,42 до ]3,83±3,91 перф.ед.). С 3-го по 6-й мес. наблюдения отмечалось постепенное повышение как тонуса сосудов пародонта, так и уровня микроциркуляции, и через 6 мес. после трехкратного введения аутофибробластов с однонедельным интервалом ИПС составил 171,83±3,29 %, а показатель М -17,1±3,91 перф.ед. Через 9 мес. повышенный тонус сосудов пародонта в исследуемых тканях сохранялся (136,4±2,64 %), однако не превышал исходных показателей, а уровень капиллярного кровотока снизился до 12,31±4,33 перф.ед, но оставался повышенным по отношению к исходному значению.

К сожалению, нам не удалось добиться 100% успеха при лечении пациентов с рецессией десны. Кроме того, полученный положительный результат оказался не слишком стойким и держался не более 9 месяцев.

В то же время мы не наблюдали осложнений или негативных реакций на введение аутофибробластов, а повторный курс инъекций позволял вновь получить положительный результат и уменьшить зону рецессии.

В целом проведенное исследование позволяет утверждать, что использование аутофибробластов при лечении пациентов с рецессией десны является перспективным методом лечения, однако требуются дальнейшие исследования и последующая регистрация медицинской технологии в установленном порядке.

Выводы

1. Инъекционное введение аутофибробластов способствует увеличению субстрата мягких тканей в месте введения клеток и позволяет уменьшить или устранить рецессию десны, возникшую после проведения пародонтологического лечения и имплантологических вмешательств.

2. Сравнительное исследование введения различных концентраций аутофибробластов показало нецелесообразность применения концентраций 10х 106 и 8х10б кл/мл в силу формирования клеточных конгломератов и неоднородности суспензий, а также сложностью либо полной невозможностью их введения в ткани.

Концентрации в диапазоне от 2*10б до 5х10б оказались одинаково удобными для введения и оказывали идентичный клинический эффект в отношении прироста мягких тканей.

3. Планиметрическое изучение местного статуса у лиц с патологией пародонта и после имплантологических вмешательств позволило определить динамику происходящих изменений после однократного введения аутофибробластов: отсутствие клинически видимого результата на протяжении 1-го месяца, несущественное увеличение уровня десны на 0,2 мм к концу 2-го месяца и максимальный прирост - до 1,5 - 2 мм - к концу 3-го месяца. В последующие 6 мес. достигнутый прирост уменьшался и через 9 месяцев составлял 1 мм.

4. Клинические и планиметрические изменения тканей десны сопровождались изменениями гемодинамических и микроциркуляторных процессов, которые в определенной мере зависели от исходного состояния пародонта, но во всех случаях прослеживалась фазность показателей через 1, 3 и 6 мес. При этом контролируемые показатели через 6 месяцев приближались или полностью возвращались к исходному состоянию.

5. Клинические и функциональные изменения обусловлены не реактивным местным ответом на травму при введении суспензии, а влиянием введенной культуры аутофибробластов. Это подтверждено результатами оптической

когерентной томографии: увеличением толщины десны через 2 нед. на 200 мкм, через 2 мес. - на 230 мкм, с 5-го по 9-й месяцы результат оказывался максимальным - 254 мкм. Кроме увеличения толщины слизистой отмечалось формирование более контрастных и упорядоченных слоев слизистой оболочки.

6. Сравнительное изучение клинико-функциональиых изменений в тканях десны показало эффективность применения аутофибробластов как с интервалом в 9 месяцев, так и с однонедельным интервалом.

7. Полученные результаты клинических, планиметрических и функциональных исследований показали эффективность применения аутологичных фибробластов для устранения дефекта мягких тканей после пародонтологических и имплантологических вмешательств, безопасность процедуры и отсутствие негативных побочных явлений.

Практические рекомендации

1. Забор исходного материала для последующего выращивания культуры аутофибробластов целесообразно проводить из области бугров верхней челюсти, неба или из преддверия полости рта. Предпочтение следует отдавать области бугров верхней челюсти в силу возможности обеспечения лучшей слюноизоляции и стерильности забираемого трансплантата.

2. Для внутритканевого введения целесообразно использовать концентрацию аутофибробластов не более 5*106 клеток.

3. В зависимости от плотности тканей в месте вмешательства следует вводить объем 0,3 - 0,4 мл - до появления видимой ишемизации тканей и обратного вытекания раствора из места инъекции.

4. В связи с отсутствием разницы в клиническом эффекте при введении клеточной культуры с разными временными интервалами, специалисты могут использовать обе предлагаемые методики по собственному выбору, а также персонально определять количество повторных курсов инъекций в зависимости от конкретной клинической ситуации.

5. Простота забора материала для выращивания аугофибробластов и их последующего введения, а также отсутствие осложнений на данное вмешательство позволяет прогнозировать достаточно широкое использование предлагаемых методик в условиях стоматологических поликлиник с учетом показаний и противопоказаний после регистрации данной технологии в установленном порядке.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Оптимизация методов устранения рецессий десны при имплантологических и пародонтологических вмешательствах. Тезисы // Сборник трудов Международной научно-практической конференции «Стоматология и челюстно-лицевая хирургия: Современные технологии, новые возможности». - Махачкала, 2007. - С. 59-60. В соавт. с A.A. Кулаковым.

2. Применение фибробластов в пародонтологии и имплантологии // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - № 3. - С. 165-168.

3. Использование аутологичных фибробластов слизистой оболочки рта человека для устранения рецессий десны // Dentist. - Казахстан, 2007. - № 1(5). - С. 177-178. В соавт. с A.A. Кулаковым.

4. Применение аутологичных фибробластов слизистой оболочки рта человека для устранения рецессий десны // Стоматология. - 2007. - Спец. Выпуск. - С. 52-56. В соавт. с A.A. Кулаковым, А.И. Грудяновым, B.JI. Зориным, А.И Зориной.

5. Применение аутологичных фибробластов слизистой оболочки рта человека для устранения рецессий десны// XI11 Международная конференция челюстно-лицевых хирургов и стоматологов «Новые технологии в стоматологии». - 2008. - С. 126-127. В соавт. с A.A. Кулаковым, B.JI. Зориным, А.И Зориной.

6. Клеточные технологии в пародонтологии // Стоматология. - 2009. - №1. - С. 71-73. В соавт. с А.И. Грудяновым, B.JI. Зориным, А.И. Зориной.

7. Использование аутологичных фибробластов слизистой оболочки полости рта человека для устранения рецессий десны // Тезисы V международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - 2008. - С. 64-65. В соавт. с А.А. Кулаковым, В.Л. Зориным, А.И Зориной.

Для заметок

Заказ № 44/05/09 Подписано в печать 14.05.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

,4? ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maihinfo@cfr.ru

Актуальность исследования. Современные имплантология и пародонтология вышли на новый качественный уровень. Достижимыми стали как функциональные, так и высокоэстетичные результаты, что особенно важно для, воссоздания естественной улыбки, когда между коронкой зуба и десной достигается полная гармония.

Контуры межзубных мягких тканей, так же как цвет и текстура кератинизированных тканей, являются очень значимыми элементами эстетики фронтальной группы зубов.

Успех зубной имплантации, высокий показатель приживления имплантатов и их функционирование, а также эффективность терапии при лечении воспалительных заболеваний пародонта во многом зависят от адекватного состояния мягких тканей краевого пародонта [196].

По мнению D. Hoelscher и A. Simons (1994) [138], многие неудачи зубной имплантации напрямую связаны с проблемами мягких тканей, что может проявляться в форме послеоперационной рецессии либо гиперплазии десны [183], периимплантита с одновременной потерей кости в зоне прилегания к имплантату [147,156] и последующего обнажения резьбы на теле имплантата [140].

После проведения хирургических вмешательств на пародонтальных карманах и кости альвеолярного отростка в большинстве случаев также не удается добиться гарантированного успеха регенерации утраченных структур периодонта [15,98,149], причем послеоперационная рецессия десны, которая отмечается в 30 - 65% случаев, создает как функциональные, так и косметические проблемы для пациентов [158].

В частности, возникающие рецессии десны являются причиной повышенной чувствительности оголенных шеек зубов и ретенции зубного налета, который оказывается важным фактором дальнейшей потери зубодесневого прикрепления.

Кроме того, что рецессии десны практически неизбежно сопровождают хирургические вмешательства, в 10% случаев рецессии десны являются самостоятельной формой патологии пародонта [158,169]. Вышесказанным объясняется актуальность разработки новых методов лечения этой патологии, которые на сегодня ограничены только хирургическими (причем далеко не во всех случаях эффективными) вмешательствами [153,159].

Другими причинами рецессии десны и формирования «черных треугольников», или «зияющих межзубных пространств», являются травма, в том числе ятрогенная, а также дивергенция корней зубов и патологическая форма коронок зубов.

С помощью ортодонтического лечения можно устранить дивергенцию корней зубов [144], с помощью реставрационных мер - восстановить форму зубов и создать межзубные контакты [106,135,144], а сочетанием этих двух видов вмешательств — обеспечить вполне приемлемый эстетический результат, в том числе и у пациентов'с патологией тканей пародонта [108,114,115,195]. Что же касается устранения дефицита мягких тканей краевого пародонта, в том числе и межзубных сосочков, то в силу особой сложности лишь в последнее; время стоматологи стали активно заниматься этой проблемой.

Причем основное внимание стоматологов-хирургов направлено на хирургические методики сохранения либо формирования межзубных сосочков при помощи трансплантации твердых и мягких тканей в «зияющие межзубные пространства» [98,109,117,123,124,178,186]. При этом риск неудач достаточно высок в связи со значительным повреждением тканей и практически неизбежным последующим снижением кровоснабжения в зоне хирургического воздействия.

Успехи клеточной биологии и смежных дисциплин создали надежный фундамент для разработки новых подходов в решении вопросов устранения патологии мягких тканей краевого пародонта.

В конце 1990-х гг. возникло новое направление реконструктивной хирургии - тканевая инженерия (tissue engineering) - основанное на использовании культивированных клеток человека. Задачей этого направления явилось замещение или восстановление утраченных тканей за счет имплантации или трансплантации выращенных in vitro клеток здоровых тканей и органов.

Современные методы изоляции клеток и способы их культивирования предполагают использование как специализированных зрелых клеток, так и их предшественников на любых этапах дифференцировки. Многообещающие перспективы развития тканевой инженерии связаны с возможностью использования в качестве исходного материала не только ксено- и аллогенных источников, но и аутогенных клеток, размноженных вне организма и ретрансплантированных в составе реконструированной ткани. Это, в свою очередь, сокращает сроки получения клеточных трансплантатов, открывает возможности для получения неограниченного количества донорского материала и создания клеточных банков, а также для гистотипического восстановления поврежденных тканей и органов.

В частности, для устранения ретракции десны после пародонтологических и имплантологических вмешательств перспективным представляется применение клеточных культур фибробластов или продуцируемых ими биологически активных веществ.

Особое внимание к фибробластам обусловлено тем, что они являются основным клеточным компонентом соединительной ткани [12,21,25,97]. Показано, что фибробласты, полученные из ткани десны, имеют ценную фенотипическую гетерогенность и наиболее предсказуемо могут способствовать регенерации тканей пародонта за счет продуцирования ими проколлагена, проэластина, факторов роста, которые служат волоконным каркасом для соединительной ткани, а также фибронектина и гликозаминогликанов, формирующих экстрацеллюлярный матрикс. Продуцируемые фибробластами ферменты и белки играют важную роль в регуляции местных гомеостатических процессов и межклеточных взаимодействий [6,21,22,75,97].

Кроме того, аутогенные фибробласты в отличие от аллогенных не вступают в конфликт с собственной иммунной системой и, соответственно, не отторгаются организмом, не вызывают аллергических реакций и прочих побочных эффектов. Именно этим объясняется интерес их использования в стоматологии для восстановления утраченных тканей десны, межзубных десневых сосочков, а также, в случае необходимости, для увеличения толщины десны.

Имеется ряд сообщений об инъекционном введении аутологичных фибробластов в косметологии и пластической хирургии с целью улучшения внешнего вида и замедления процессов физиологического старения кожи [24,83,191,198]. В литературе встречаются данные об использовании клеточной терапии как поддерживающей при рассеянном склерозе, сексопатологиях и бесплодии у мужчин и женщин, при онкологических заболеваниях [20,24,36,71,76,111,191].

В стоматологии появились немногочисленные работы по использованию этой методики с целью восстановления межзубных сосочков и устранения «черных треугольников» [ 143,15 5].

В общем же, уровень разработки этого вопроса можно охарактеризовать как самый начальный. В связи с этим требуется отработка самой методики приготовления клеточных культур, а также клиническое и экспериментальное изучение эффекта их использования в зависимости от конкретной клинической ситуации. В этой связи на базе ФГУ ЦНИИС совместно с ООО «Медико-биологические технологии» (разработчик) и ГУ Медико-Генетическим Научным Центром АМН (соразработчик) было запланировано и проведено клиническое исследование на добровольцах в соответствии с действующими международными нормами и решением Росздравнадзора о проведении клинических испытаний.

Цель исследования. Разработка и оценка эффективности метода устранения рецессий десны за счет использования аутологичных фибробластов человека.

Задачи исследования:

1. Определить оптимальный участок для забора исходного материала с целью последующего выращивания культуры аутофибробластов.

2. Отработать клиническую методику инъекционного введения культуры аутофибробластов в зоны рецессий десны.

3. По данным клинического обследования, фотометрии, оптической когерентной томографии и компьютерной системы Florida Probe изучить влияние введения различных доз клеточных культур на состояние массива мягких тканей краевого пародонта.

4. По данным клинических, фотометрических и функционально-диагностических методов изучить эффективность проводимого лечения в зависимости от интервалов между инъекциями и кратности введения аутофибробластов.

5. На основании комплекса клинических и лабораторных исследований разработать рекомендации для использования инъекционного метода введения культуры аутофибробластов в целях устранения рецессий десны.

Научная новизна. Впервые в России отработана методика инъекционного введения аутофибробластов в десну и/или в межзубные десневые сосочки с целью уменьшения и/или устранения рецессий десны и «черных треугольников».

Впервые по данным электронной системы Florida Probe и оптической когерентной томографии изучено влияние инъекционного введения аутофибробластов на состояние мягкотканного массива пародонта. Выявлено, что инъекционное введение аутофибробластов обеспечивает увеличение массива мягких тканей десны, уменьшение «черных треугольников» и рецессии десны. Достигнутые изменения сохраняются на протяжении 9-ти мес., затем полностью или частично возвращаются к исходному состоянию.

Впервые с помощью реопародонтографии и лазерной допплеровской флоуметрии изучено влияние аутофибробластов на состояние гемодинамических процессов в тканях пародонта. Выявлено, что инъекционное введение клеточной культуры сопровождается увеличением интенсивности гемодинамических и микроциркуляторных процессов в месте введения, которое сохраняется до 9-ти мес. и затем возвращается к исходному состоянию.

Впервые на основании комплекса клинических и функциональных методов определено оптимальное количество аутофибробластов в единице объема физиологического раствора для инъекционного введения в десну и/или в межзубные десневые сосочки. Установлено, что для внутритканевого введения оптимальной является концентрация не более 5х106 клеток, а оптимальный объем физраствора 0,3 — 0,4 мл.

Впервые на основании комплекса клинических и функциональных методов изучено влияние различной кратности инъекционного введения аутофибробластов на состояние мягких тканей десны и длительность • сохранения достигнутых результатов. Установлено, что нет разницы в клиническом эффекте при введении аутофибробластов с разными временными интервалами, а достигнутые результаты сохраняются до 9-ти месяцев после инъекции клеточных культур.

Практическая значимость работы.

- Определены оптимальные участки для забора исходного материала и приготовления культуры аутофибробластов для инъекционного введения в десну и/или в межзубные десневые сосочки с целью уменьшения и/или устранения рецессий десны и «черных треугольников».

Обосновано количество однократно вводимых в десну аутофибробластов.

- Обоснована кратность повторных введений аутофибробластов и определены оптимальные временные интервалы между повторными инъекциями в целях максимального увеличения объема мягких тканей десны и достижения косметического эффекта при устранении рецессии десны после проведения имплантологических вмешательств или при патологии пародонта в ходе одного курса лечения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Инъекционное введение аутологичных фибробластов в количестве от 2x106 до 5*Ю6 клеток в один участок обеспечивает увеличение толщины десны, начиная со 2 недели по 9-й месяц (с 200 мкм до 254 мкм), уменьшение «черных треугольников» и рецессии десны на 1,5 - 2 мм в сроке до 9 мес. после первого введения, что подтверждается результатами клинического контроля, фотометрии и ОКТ.

2. Сравнительное изучение клинико-функциональных изменений в тканях десны показало эффективность применения аутофибробластов как с интервалом в 9 месяцев, так и с однонедельным интервалом. При рецидиве рецессии десны показано проведение повторного курса инъекционного введения клеточных культур.

Внедрение результатов исследования в практику. Зарегистрирован патент РФ № 2005127087 «Биотрансплантат и способ коррекции дефектов мягких тканей, способ получения биотрансплантата» (от 29.08.2005).

Методика инъекционного введения аутологичных фибробластов с целью устранения или уменьшения степени рецессии десны используется в работе отделения клинической и экспериментальной имплантологии и пародонтологии ФГУ «ЦНИИ стоматологии и 4JIX Росмедтехнологий».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и включает введение, главу «Обзор

выводы

1. Инъекционное введение аутофибробластов способствует увеличению субстрата мягких тканей в месте введения клеток и позволяет уменьшить или устранить рецессию десны, возникшую после проведения пародонтологического лечения и имплантологических вмешательств.

2. Сравнительное исследование введения различных концентраций аутофибробластов показало нецелесообразность применения концентраций 10x106 и 8x106 кл/мл в силу формирования клеточных конгломератов и неоднородности суспензий, а также сложностью либо полной невозможностью их введения в ткани.

Концентрации в диапазоне от 2x106 до 5*106 оказались одинаково удобными для введения и оказывали идентичный клинический эффект в отношении прироста мягких тканей.

3. Планиметрическое изучение местного статуса у лиц с патологией пародонта и после имплантологических вмешательств позволило определить динамику происходящих изменений после однократного введения аутофибробластов: отсутствие клинически видимого результата на протяжении 1-го месяца, несущественное увеличение уровня десны на 0,2 мм к концу 2-го месяца и максимальный прирост - до 1,5-2 мм - к концу 3-го месяца. В последующие 6 мес. достигнутый прирост уменьшался и через 9 месяцев составлял 1 мм.

4. Клинические и планиметрические изменения тканей десны сопровождались изменениями гемодинамических и микроциркуляторных процессов, которые в определенной мере зависели от исходного состояния пародонта, но во всех случаях прослеживалась фазность показателей через 1, 3 и 6 мес. При этом контролируемые показатели через 6 месяцев приближались или полностью возвращались к исходному состоянию.

5. Клинические и функциональные изменения обусловлены не реактивным местным ответом на травму при введении суспензии, а влиянием введенной культуры аутофибробластов. Это подтверждено результатами оптической когерентной томографии: увеличением толщины десны через 2 нед. на 200 мкм, через 2 мес. — на 230 мкм, с 5-го по 9-й месяцы результат оказывался максимальным — 254 мкм. Кроме увеличения толщины слизистой отмечалось формирование более контрастных и упорядоченных слоев слизистой оболочки.

6. Сравнительное изучение клинико-функциональных изменений в тканях десны показало, что нет разницы в клиническом эффекте при введении аутофибробластов с разными временными интервалами между инъекциями в участки с разным исходным состоянием тканевого субстрата.

7. Полученные результаты клинических, планиметрических и функциональных исследований показали эффективность применения аутологичных фибробластов для устранения дефекта мягких тканей после пародонтологических и имплантологических вмешательств, безопасность процедуры и отсутствие негативных побочных явлений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Забор исходного материала для последующего выращивания культуры аутофибробластов целесообразно проводить из области бугров верхней челюсти, неба или из преддверия полости рта. Предпочтение следует отдавать области бугров верхней челюсти в силу возможности обеспечения лучшей слюноизоляции и стерильности забираемого трансплантата.

2. Для внутритканевого введения целесообразно использовать концентрацию аутофибробластов не более 5x106 клеток.

3. В зависимости от плотности тканей в месте вмешательства следует вводить объем 0,3 - 0,4 мл - до появления видимой ишемизации тканей и обратного вытекания раствора из места инъекции.

4. В связи с отсутствием разницы в клиническом эффекте при введении клеточной культуры с разными временными интервалами, специалисты могут использовать обе предлагаемые методики по собственному выбору, а также персонально определять количество повторных курсов инъекций в зависимости от конкретной клинической ситуации.

5. Простота забора материала для выращивания аутофибробластов и их последующего введения, а также отсутствие осложнений на данное вмешательство позволяет прогнозировать достаточно широкое использование предлагаемых методик в условиях стоматологических поликлиник с учетом показаний и противопоказаний после регистрации данной технологии в установленном порядке.