Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Интрастромальное введение аутологичных мононуклеаров крови в комплексном лечении язвенных кератитов различной этиологии

ЛЕВЧЕНКО НАДЕЖДА АНАТОЛЬЕВНА

Интрастромалыюе введение аутологичных моноиуклеаров крови в комплексном лечении язвенных кератитов различной этиологии (экспериментально-клиническое исследование)

14.01.07 - глазные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 5 г "■ ° 2012

Красноярск - 2012

005014118

Работа выполнена на кафедре офтальмологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Кривошеина Ольга Ивановна

Шатилова Римма Ивановна Раткина Наталия Николаевна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «_»_20 г. в_часов на заседании совета

по защите докторских и кандидатских диссертаций Д208.037.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России (660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1).

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций

кандидат медицинских наук, доцент Кочетова Людмила Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Больные с воспалительной патологией глаз занимают первое место среди обратившихся на амбулаторный прием к офтальмологу (40,2%), составляя по Российской Федерации около 16 млн. человек в год (Майчук Ю.Ф., 2010). Поражения роговицы в 70% случаев протекают в виде изъязвлений (Зайцев A.B., 2009; Каспарова Е.А., 2009).

Язвенные кератиты относятся к числу наиболее тяжелых заболеваний глаз, трудно поддающихся лечению и приводящих к значительному снижению или потере зрения (Майчук Ю.Ф., 2010). В 8-9% случаев патологический процесс завершается анатомической гибелью глаза, в 17% выполняется энуклеация в связи с безуспешностью лечения, в 23-25% наблюдается осложненное течение заболевания (Klaus F., 2001; Южаков A.M., 2003; Аветисов С.Э., 2007). Ежегодно в мире регистрируется 1,5-2,0 миллиона случаев монокулярной слепоты вследствие язвенного поражения роговицы. Согласно статистическим данным, в 27,6% язва роговицы является первичной и в 30,2% -вторичной, возникающей, как правило, на фоне герпетического кератита (Аветисов С.Э., 2007; Каспаров'А.А.,2010).

По данным В .А. Шаимовой (1999), на долю бактериальных язвенных кератитов приходится 47,3% всей воспалительной патологии роговой оболочки. В 49% случаев причиной нетравматической перфорации роговой оболочки является бактериальная язва (Еременко А.И., 2011). Среди микрофлоры в 63% встречается патогенная, в 15,7% - условно-патогенная (Шаимова В .А., 2001; Белоусова Е.И., 2002). Патогенная флора представлена, преимущественно, Pseud, aeruginosa - 40-42% и Staph, aureus - 21-24%; условно-патогенная - Staph, epidirmidis - 5-6% и E. coli - 10-12% (Шаимова В.А., 2001; Абдуллин И.Ю., 2004; Егоров В.В., 2004; Анджелов В.О., 2005).

Однако в 30-44,8% случаев не удается выделить возбудителя, что существенно затрудняет, а, нередко, и снижает эффективность лечения (Май-

чук Ю.Ф., 2011). Кроме того, отмечается рост численности антибиотикоре-зистентных возбудителей (Tugsirepat Т., 2003; Белый Ю.А., 2008; Ковтун A.B., 2009). Так, например, число устойчивых штаммов к широко применяемому гентамицину достигает 63,6%, к тетрациклинам и аминогликозидам -20-40% (Barathi M.J., 2002; Суркова В.К., 2007; Саржевская Л.Э., 2010; Май-чук Ю.Ф., 2011). Необходимо отметить, что в последние годы появились данные о возрастании устойчивости возбудителей к антибиотикам хинолоно-вой группы (Шаимова В.А., 2002; Wilhelmus K.R., 2003; Mah-Sadorra J.H., 2004; Егоров В.В., 2005). По результатам проведенных в США исследований, число штаммов стафилококка, устойчивых к ципрофлоксадину, возросло до 35% (Wilhelmus K.R., 2003).

Герпетические кератиты представляют собой наиболее распространенные вирусные заболевания органа зрения, при этом они составляют около 80% всех воспалительных процессов роговицы (Суров A.B., 2007; Майчук Ю.Ф., 2011; Финогенова Т.С., 2011). Свыше 90% герпетических поражений глаз представлены рецидивирующим офтальмогерпесом (Майчук Ю.Ф., 2010).

Офтальмогерпес характеризуется высокой медико-социальной значимостью, что обусловлено его значительной распространенностью, упорным рецидивирующим течением, трудностью лечения, а также снижением или полной потерей зрения больных (Гайдамака Т.Б., 2007; Каспаров A.A., 2010; Майчук Ю.Ф, 2010; Bottos J.L., 2010). Несмотря на широкий выбор лекарственных препаратов, удельный вес офтальмогерпеса продолжает неуклонно расти (Malecha М.А., 2004; Кричевская Г.И., 2006; Егоров Е.А., 2007), что связано как с генетическим паразитированием вируса, так и с формированием устойчивых к противовирусным препаратам штаммов.

В клинической офтальмологии на протяжении последнего десятилетия с целью коррекции репаративных процессов в тканях глазного яблока при различных видах патологии органа зрения активно используются цитокины -

иммунопептиды, вырабатываемые клетками лимфоидной и нелимфоидной природы и участвующие в воспалительно-репаративных реакциях (Каспаров A.A., 2004; Шаимова В.А., 2005; Бикбов М.М., 2008; Каспарова Е.А., 2008).

Продуцентами цитокинов являются моноциты / макрофаги. Т и В-лимфоциты, естественные киллеры, гранулоциты, тучные клетки и ряд стро-мальных клеток (Бикбов М.М., 2008; Слепова О.С., 2008; Мальдов Д.Г., 2011). Цитокины в клинической практике используются системно и местно. По данным A.A. Годзенко (2006), наиболее целесообразно местное применение препаратов цитокинов, позволяющее достигать высокой локальной концентрации вещества, целенаправленно воздействовать на орган - мишень и свести к минимуму нежелательные системные проявления.

Достижения современной медицинской науки предоставляют офтальмологу большой объем информации о новых эффективных методах лечения воспалительных заболеваний глаз, однако необходим качественно новый подход к выбору стратегии при лечении данной патологии с позиции рационального использования, что значительно повысило бы качество и эффективность лекарственной помощи населению.

Все вышеизложенное определило направление настоящего научного исследования.

Цель исследования - повышение эффективности комплексного лечения больных с язвенными кератитами различной этиологии посредством ин-трастромального введения аутологичных мононуклеаров крови.

Задачи исследования:

1. В эксперименте изучить влияние интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови на динамику течения индуцированного повреждения роговицы.

2. Выявить и изучить в эксперименте морфологические особенности воспалительно-регенераторных процессов при индуцированном повреждении

роговицы на фоне интрастромального введения аутологичных мононуклеа-ров крови.

3. Исследовать клиническую эффективность интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови в комплексном лечении больных язвенными кератитами герпетической и бактериальной этиологии.

4. Провести сравнительный анализ эффективности комплексного лечения больных язвенными кератитами герпетической и бактериальной этиологии с применением интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови и традиционной фармакотерапии.

Научная новизна

На экспериментальной модели индуцированного повреждения роговицы разработан метод интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови.

Впервые в эксперименте изучены особенности течения воспалительно-репаративных процессов при индуцированном повреждении роговицы на фоне интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови и традиционной фармакотерапии. Установлено, что на фоне интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови значительно уменьшаются продолжительность и выраженность воспаления, а также ускоряется переход патологического процесса в стадию репарации.

Выявлено, что интрастромальное введение аутологичных мононуклеаров крови на фоне традиционной фармакотерапии экспериментально индуцированного повреждения роговицы способствует быстрой смене клеточных фаз в патологическом очаге и активизирует процесс регенерации поврежденных роговичных структур.

Впервые показана значительная клиническая эффективность интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови в комплексном лечении больных с язвенными кератитами герпетической и бактериальной этиологии.

Практическая значимость

Результаты экспериментальных исследований позволили получить новые данные о патоморфологии повреждения роговой оболочки, а также об участии мононуклеарных клеток крови в воспалительно-репаративных процессах при ее стромальных дефектах.

Разработан и внедрен в клиническую практику комплексный метод лечения больных язвенными кератитами герпетической и бактериальной этиологии, включающий интрастромальное введение аутологичных мононуклеа-ров крови на фоне традиционной фармакотерапии. Предложенный метод лечения характеризуется высокой эффективностью, обеспечивая стабильные клинико-функциональные результаты и сокращая число осложнений данного заболевания.

Получен патент РФ на изобретение № 2010148129 от 13.10.2011 г. «Способ лечения глубоких стромальных кератитов».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Интрастромальное введение аутологичных мононуклеаров крови в лечении экспериментально индуцированного повреждения роговицы обеспечивает быстрое купирование воспаления и активизирует репаративную регенерацию в патологическом очаге.

2. Интрастромальное введение аутологичных мононуклеаров крови в комплексной фармакотерапии язвенных кератитов герпетической и бактериальной этиологий способствует быстрой эпителизации стромального дефекта и препятствует избыточному разрастанию соединительной ткани в зоне повреждения, обеспечивая высокие клинико-функциональные результаты.

3. Комплексное лечение язвенных кератитов герпетической и бактериальной этиологий в сочетании с интрастромальным введением аутологичных мононуклеаров крови существенно сокращает число осложнений заболевания и характеризуется отсутствием побочных реакций.

Внедрение результатов работы в практику. Разработанный метод комплексного лечения язвенных кератитов герпетической и бактериальной этиологий внедрен в клиническую практику офтальмологической клиники Сибирского государственного медицинского университета (ГБОУ ВПО Сиб-ГМУ) (г. Томск). Результаты экспериментальных и клинических исследований используются в программе лекционного курса и практических занятий на кафедре офтальмологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития.

Апробация работы Основные материалы диссертации доложены и обсуждены: на заседании Томского областного общества офтальмологов (2009, 2010); XI, XII Международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2010, 2011); юбилейной студенческой конференции студенческого научного общества им. Н.И. Пирогова (Томск, 2010, 2011\ V Международной научно-практической конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, 2010); V и VI Всероссийской научной конференции молодых ученых (Москва, 2010, 2011); Всероссийской научной конференции «Молеку-лярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010); Всероссийской юбилейной научно-практической конференции, посвященной 120-летию кафедры офтальмологии ГБОУ ВПО СибГМУ (Томск, 2011); межрегиональной научно-практической конференции офтальмологов, посвященной 125-летию офтальмологической помощи населению Красноярского края «Актуальные вопросы офтальмологии» (Красноярск, 2011); Международном конгрессе The Association for Research in Vision and Ophthalmology (США, Форт-Лодердейл, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе, 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ для публикации результатов диссертационных исследований, 1 - в международной печати. По-

лучен патент РФ на изобретение «Способ лечения глубоких стромальных кератитов» № 2010148129 от 13.10.2011 г.

Личный вклад автора состоит в разработке алгоритма исследования, реализации основных его этапов, систематизации материала, статистической обработке, анализе и интерпретации полученных результатов.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из оглавления, введения, трех глав исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 9 таблицами, 18 рисунками. Библиографический список включает 303 источника, из них 220 отечественных и 83 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика экспериментальных исследований

Выполнена серия экспериментов на 24 половозрелых кроликах породы Шиншилла массой 2,5-4,0 кг. Перед экспериментом всех животных выдерживали на протяжении недельного карантинного срока в условиях вивария на обычном пищевом режиме. В условиях операционной под наркозом каждому животному в оптической зоне выполняли тотальную деэпителизацию и механическое повреждение собственного вещества и заднего эпителия роговой оболочки одного из глаз при помощи трепана.

В зависимости от способа лечения животные были разделены на 2 группы:

- основную (п=12 глаз) - животным на фоне традиционной фармакотерапии, включающей инсталляции раствора офлоксацина 5 раза в день и корне-регеля 3 раза в день, в толщу стромы поврежденной роговицы однократно вводили аугологичные мононуклеары крови;

группу сравнения (п=12 глаз) - животным после повреждения роговицы проводили только традиционную фармакотерапию.

Процедуру выделения мононуклеаров крови проводили на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО СибГМУ (директор - д.м.н., профессор А.Н. Байков). Мононуклеарные клетки из крови экспериментального животного выделяли методом фракционирования в градиенте плотности на разделяющем растворе фиколл-верографин. Чистота мононуклеаров, полученных на градиенте фиколл-верографин, составляла 96-98%. Жизнеспособность клеточного материала оценивали в тесте с трипа-новым синим. Процент окрашенных (погибших) элементов составлял 1,5-2%, что не превышало допустимое (не более 3%) количество.

Общая продолжительность эксперимента составила 21 сутки. В ходе эксперимента проводили наружный осмотр, биомикроскопию, флюоресцентную пробу, фоторегистрацию. Забор материала производили на 3, 5, 7, 14,21 сутки от начала эксперимента. Из каждой группы с помощью глубокого наркоза выводили по 2 животных с последующей энуклеацией обоих глаз. Забой экспериментальных животных осуществляли с соблюдением правил и норм, прописанных в директивах Европейского сообщества (86/609 EEC) и Хель-синской декларации. Полученный материал фиксировали для световой микроскопии. Материалом для гистологических исследований служили энук-леированные глаза экспериментальных животных. Гистологические исследования проводили на кафедре гистологии и эмбриологии ГБОУ ВПО СибГМУ (зав. кафедрой - д.м.н., проф. С.В. Логвинов). Полученный в ходе экспериментов материал фиксировали для световой микроскопии. После приготовления парафиновых срезов препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

Характеристика клинических исследований

Клинический раздел работы выполнен на базе офтальмологической клиники ГБОУ ВПО СибГМУ (Томск). Больные с язвенными кератитами в зависимости от этиологии были распределены на 2 группы: герпетические и бактериальные, каждая из которых, в свою очередь, в зависимости от метода

лечения, были разделены на 2 подгруппы: основную и сравнения. По классификации A.A. Каспарова (1989), герпетический кератит был представлен глубокой формой - метагерпегический с изъязвлением. Степень тяжести поражения роговицы среди общего числа больных обеих групп оценивали по классификации D.B. Jones (1981).

Основная подгруппа с герпетическим язвенным кератитом представлена 42 больными (42 глаза). Тяжелый патологический процесс наблюдали у 24 человек (57,1%), средней степени тяжести - у 18 человек (42,9%). Основная подгруппа с бактериальным язвенным кератитом представлена 41 больным (41 глаз). При этом тяжелый патологический процесс наблюдали у 20 человек (48,8%), средней степени тяжести - у 21 человека (51,2%).

Сроки обращения больных обеих подгрупп в стационар составили от 3 до 7 дней.

Больным подгрупп, наряду с традиционным консервативным лечением (системное и местное применение противовирусных и/или антибактериальных препаратов, противовоспалительных и противоаллергических средств, дезинтоксикационных и метаболических препаратов), выполнялось интраст-ромальное введение аутологичных мононуклеаров крови. Мононуклеарные клетки из крови пациента выделяли методом фракционирования в градиенте плотности. Чистота мононуклеаров составляла 96%, жизнеспособность клеточного материала в тесте с трипановым синим находилась в пределах 9798%.

В условиях операционной после обработки операционного поля с соблюдением правил асептики и антисептики выполняли местную анестезию больного глаза (инсталляции 0,4% раствора инокаина, ретробульбарно вводили 3,0 мл 2% раствора лидокаина). Затем под острым углом к поверхности роговицы, отступя 2-3 мм от края язвы, в поверхностные слои стромы инъек-ционно медленно вводили суспензию аутологичных мононуклеаров крови на 3,9 и 12 часах в объеме 0,1- 0,2 мл. В ходе лечения процедуру выполняли 1-2

раза с интервалом 4-5 дней в зависимости от степени тяжести заболевания и динамики клинической картины.

Подгруппа сравнения с герпетическим язвенным кератитом представлена 38 больными (38 глаз). При этом тяжелый патологический процесс наблюдали у 15 человек (39,4%), средней степени тяжести - у 23 человек (60,6%). Подгруппа сравнения с бактериальным язвенным кератитом представлена 39 больными (39 глаз). При этом тяжелый патологический процесс наблюдали у 15 человек (38,4%), средней степени тяжести - у 24 человек (61,6%). Сроки обращения больных обеих подгрупп в стационар составляли от 3 до 7 дней. Больным данных подгрупп проводили традиционную фармакотерапию (системное и местное применение противовирусных и/или антибактериальных препаратов, противовоспалительных и противоаллергических средств, а также назначение дезинтоксикационных и метаболических препаратов).

Всем больным проводили общеофтальмологическое обследование, включавшее визомстрию, биомикроскопию переднего отрезка глаза, обратную бинокулярную офтальмоскопию, транспальпебральное измерение внутриглазного давления, определение чувствительности роговицы, исследование соскоба с конъюнктивы методом флюоресцирующих антител (МФА), фоторегистрацию, иследование крови с помощью иммуноферментиого анализа (ИФА) на обнаружение антител в крови к вирусу простого герпеса (ВПГ). Лабораторная диагностика, включающая методы МФА и ИФА, проводилась на базе клинико-лабораторного и диагностического центра СибГМУ.

Всех больных с целью исключения сопутствующей патологии и профилактики внутриглазного заноса бактериальной инфекции консультировали смежные стоматолог, оториноларинголог, терапевт, иммунолог и фтизиатр. Визометрию проводили по стандартной методике. Офтальмобиомикроско-пию проводили с помощью щелевой лампы фирмы Karl Zeiss - Yena. Осмотр заднего отрезка глаза проводили с помощью налобного бинокулярного оф-

тальмоскопа с линзой +20,0 дшр. Обратную офтальмоскопию выполняли в условиях медикаментозного мидриаза.

Методы статистической обработки. Объем полученных данных в ходе экспериментального и клинического исследований является достаточным для проведения адекватного статистического анализа. Для описания изменчивости количественных признаков использовали общепринятые статистические процедуры, включая расчет параметров распределений (средняя, стандартное отклонение, мода, верхний и нижний квартили). Проверку на нормальность распределений осуществляли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова.

Для оценки значимости различий при сравнении средних величин двух независимых выборок использовали непараметрический тест рангов Вальда-Вольфовитца. Сравнение дисперсий проводили по тесту Брауна-Форсайта; сравнение средних значений нескольких независимых распределений проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа по Фишеру, включая метод линейных контрастов Шеффе. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий Расчеты основных статистик осуществляли с помощью программ «STATISTICA for Windows 7.0», «Microsoft Excel 2010».

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты экспериментальных исследований

При сравнительном анализе результатов лечения индуцированного повреждения роговицы в эксперименте выявлена высокая эффективность применения аутологичных мононуклеаров крови на фоне традиционной фармакотерапии, включающей антибактериальные и метаболические средства.

В ходе морфологических исследований получены следующие данные. Средний срок купирования воспаления у животных основной группы, в отличие от группы сравнения, сократился в 1,9 раза, составив 8,5±0,17 и

16,3±0,18 суток, соответственно. У животных основной группы резорбция перифокалыюго отека и инфильтрации стромы роговицы сократились в 1,9 раза, завершившись к 7,8±0,17 суткам. В группе сравнения данный процесс завершился лишь к 15,1±0,18 суткам. Сроки эпителизации роговиой оболочки сократились в 1,7 раза, составив 6,5±0,17 и 11,0±0,16 суток, соответственно.

На фоне интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови при лечении индуцированного повреждения роговой оболочки у животных основной группы осложнений не было, в то время как у животных группы сравнения развитие десцеметоцеле наблюдали в 3 глазах (25%), а на 2 глазах (16,6%) возникла перфорация роговицы.

В ходе морфологических исследований получены следующие данные. На 3-й сутки от начала эксперимента у животных основной группы передний эпителий роговой оболочки был представлен 5-6 слоями плоских клеток. Подлежащая пограничная мембрана визуализировалась на всем протяжении. Собственное вещество роговой оболочки содержало пучки коллагеновых волокон, расположенных несколько неупорядоченно, в передней трети отмечалась диффузная мононуклеарная инфильтрация (96±1,0 клеток в поле зрения). Задняя пограничная мембрана и задний эпителий определялись не на всем протяжении.

У животных группы сравнения передний эпителий роговой оболочки был представлен дистрофически измененными эпителиоцитами. Передняя пограничная мембрана визуализировалась не на всем протяжении. Собственное вещество роговой оболочки характеризовалась выраженным отеком, коллагеновые волокна в ней располагались в виде рыхлой сети, воспалительная инфильтрация была представлена большим количеством полиморфноя-дерных лейкоцитов (95±1,0 клеток в поле зрения). Задний эпителий роговой оболочки на большем протяжении был десквамирован.

На 7-е сутки у животных основной группы передний эпителий роговой оболочки был представлен 5-6 слоями плоских клеток. Назальные элителио-циты активно пролиферировали. В собственном веществе роговой оболочки ход коллагеновых пучков становился упорядоченным. Сохранялось диффузное скопление мононуклеарных клеток (78±1,0 клеток в поле зрения) и единичные расширенные сосуды краевой петлистой сети. Задний эпителий роговой оболочки сохранялся практически на всем протяжении.

У животных группы сравнения клетки переднего эпителия располагались в 6-7 слоев и имели кубическую форму, на поверхности которого обнаруживали очаговые отложения фибрина. В передней трети собственного вещества роговой оболочки отмечалось уменьшение отека, в задней части роговицы пучки коллагеновых волокон были расслоены отечной жидкостью и имели волнообразный ход. В собственном веществе роговой оболочки сохранялась диффузная лимфомоноцитарная инфильтрация (71,1±1,0 клеток в поле зрения) и тонкостенные новообразованные сосуды. Задний эпителий представлял собой один ряд плоских клеток, местами он был опущен.

На 14-е сутки у животных основной группы передний эпителий роговой оболочки содержал 4-5 слоев плоских клеток, эпителиоциты базального слоя имели кубическую форму, в единичных ядрах которых наблюдались митозы. В области лимба отмечалось очаговое скопление мононуклеарных клеток (30±0,1 клеток в поле зрения). Собственное вещество роговой оболочки содержало упорядочснно расположенные пучки коллагеновых волокон вокруг, которых отмечалось очаговое скопление мононуклеарных клеток (30±0,1 клеток в поле зрения).

У животных группы сравнения передний эпителий роговой оболочки состоял из 4-5 слоев плоских клеток. В задней трети собственное вещество роговой оболочки было гомогенным вследствие деструкции. В области лимба обнаруживались сосуды, вокруг которых отмечалось значительное скоп-

ления лимфоцитов (30±0Д клеток в поле зрения) и моноцитов (7,4±0,1 клеток в поле зрения).

На 21-е сутки у животных основной группы передний эпителий роговой оболочки содержал 4-5 слоев плоских клеток. Передняя и задняя пограничные мембраны определялись на всем протяжении. В области лимба сохранялась умеренная мононуклеарная инфильтрация (5,3±0,2 клеток в поле зрения). В собственном веществе роговой оболочки коллагеновые волокна были расположены упорядоченно.

У животных группы сравнения передний эпителий роговой оболочки имел нормальное строение. Передняя пограничная мембрана была несколько утолщенной. На уровне передних двух третьих собственного вещества роговой оболочки отмечалось активное образование коллагеновых волокон и новообразованные сосуды, вокруг которых сохранялось очаговое скопление лимфоцитов (14,5±0,1 клеток в поле зрения). В задней трети собственного вещества роговой оболочки сохранялись отек и гомогенизация волокон.

Результаты клинических исследований

Клинические исследования базируются на анализе наблюдений за 160 больными (160 глаз) с язвенными кератитами. В зависимости от этиологии заболевания, больные были распределены на 2 группы: герпетические и бактериальные, каждая из которых в зависимости от метода лечения была разделена на 2 подгруппы: основную и сравнения (табл. I).

Половозрастное и этиологическое распределение больных с язвенными кератитами, абс., %

Группы больных Число больных Пол Воз[ 1аст

мужчины женщины мужчины женщины

Герпетические язвенные кератиты -основная группа 42 31 (73,8%) 11(26,2%) 47,6+5,9 39,1+2,5

Герпетические язвенные кератиты -группа сравнения 38 25 (65,8%) 13(34,2%) 47,9+5,6 34,5+3,9

Бактериальные язвенные кератиты -основная группа 41 32(78,1%) 9(21,9%) 50,4+9,6 51,4+4,8

Бактериальные язвенные кератиты -группа сравнения 39 28(71,8%) 11(28,2%) 41,9+6,7 56,2+10,4

Этиология заболевания была установлена в ходе исследования соско-бов конъюнктивальной полости с помощью МФА и микробиологического исследования содержимого конъюнктивальной полости. При этом у больных с герпетическим язвенным кератитом высокая концентрация антигена к ВПГ выявлена у 60 больных (75%). У всех больных с герпетическим язвенным кератитом анализ определения антител в крови к ВПГ методом ИФА был положительным.

Результаты микробиологического исследования содержимого конъюнктивальной полости у больных бактериальным язвенным кератитом представлены в таблице 2.

Характеристика микрофлоры конъюнктивальной полости у больных с бактериальным язвенным кератитом, абс., %

Вид возбудителя Подгруппы больных

основная сравнения

Staph, aureus 21 (51,2%) 17(43,6%)

Staph, epidermidis 11(26,8%) 12 (30,7%)

Strept pyogenes 3 (7,3%) 4(10,3%)

E. coli 3 (73%) 4 (10,3%)

Enterobacteriura 3 (7,3%) 4 (10,3%)

У больных с язвенными кератитами были установлены непосредственные причины развития заболевания. Клиническая картина у всех обследованных больных на момент госпитализации в стационар имела сходные черты: заболевание начиналось остро, отмечалось общее недомогание, значительное снижение зрения, светобоязнь и слезотечение. В конъюнктивальной полости обнаруживали слизистое и / или аизисто-гнойное отделяемое. У больных с герпетическим язвенным кератитом чувствительность роговицы отсутствовала. При биомикроскопии отмечали отек и смешанную инъекцию бульбар-ной конъюнктивы глазного яблока. Степень тяжести течения язвенных кератитов у больных обеих групп оценивали по локализации язвы, размеру области поражения, глубине и наличию осложнений (табл. 3).

Таблица 3

Причины развития язвенных кератитов, абс., %

Причины Группы больных

Герпетический язвенный кератит Бактериальный язвенный кератит

Травмы роговицы: - ногтевой фалангой - веткой - листом бумаги 12 (15%) 5 (6,3%) 5 (6,3%) 2 (2,4%) 45 (56,3%) 15(18,8%) 27 (33,8%) 3 (3,7%)

Предшествующая общая инфекция (ОРВИ и др.) 63 (78,7%) 15 (18,7%)

Синдром «сухого глаза» 0 10(12,5%)

Нарушение режима ношения контактных линз 5 (6,3%) 10 (12,5%)

Распределение больных с язвенными кератитами по степени тяжести, абс., %

Группы больных Степень тяжести заболевания

Средняя степень Тяжелая степень

Герпетические язвенные кератиты -основная группа 18(42,9%) 24(57,1%)

Герпетические язвенные кератиты -группа сравнения 23 (60,6%) 15 (39,4%)

Бактериальные язвенные кератиты -основная группа 21 (51,1%) 20 (48,8%)

Бактериальные язвенные кератиты -группа сравнения 24(61,6%) 15 (38,4%)

У больных с герпетическими язвенными кератитами основной подгруппы язва располагалась центрально у 18 человек (42,9%), парацентраль-но - у 24 человек (57,1%), в подгруппе сравнения - у 23 человек (60,6%) язва располагалась центрально, у 15 человек (39,4%) - парацентрально. У больных с бактериальными язвенными кератитами основной подгруппы язва располагалась центрально у 21 человека (51,1%), парацентрально - у 20 человек (48,8%), в подгруппе сравнения у 24 человек (61,6%) язва располагалась центрально, у 15 человек (38,4%) - парацентрально.

По глубине поражения язва локализовалась, преимущественно, в средних или глубоких слоях стромы роговицы. Дно язвенного дефекта было заполнено некротическим детритом, края инфильтрированы, подрыты. Детали передней камеры просматривались с трудом из-за выраженного помутнения роговицы у 25 больных (15,6%) основных подгрупп. У остального числа обследованных больных ткань радужки была значительно отечна, сосуды стромы расширены, реакция зрачка на свет вялая. Среди общего числа обследованных больных опалесценция влаги и нити фибрина в передней камере определялись у 10 больных (12,5%) герпетическими 38 больных (47,5%) бактериальным язвенными кератитами, гипопион от 1 до 3 мм высотой был у 7

больных (8,7%) с герпетическим язвенным кератитом и 30 больных (37,5%) с бактериальным язвенным кератитом.

Сравнительный анализ результатов лечения выявил значительную эффективность интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови в комплексном лечении герпетических и бактериальных язвенных кератитов. Следует отметить, что все пациенты основных подгрупп, независимо от этиологии язвенного кератита, хорошо переносили лечение, токсических и аллергических реакций мы не наблюдали. Уже на 2-е сутки от начала лечения больные отмечали уменьшение боли в глазу, слезотечения, светобоязни. Для сравнительной оценки эффективности лечения в группах учитывали сроки эпителизации роговой оболочки, динамику перикорнеальной инъекции, продолжительность пребывания больных в стационаре, изменение остроты зрения (табл. 5,6).

Таблица 5

Динамика течения герпетического язвенного кератита в зависимости от метода лечения Мо (01;03), дни

Клинические признаки Подгруппы больных

основная сравнения

Эпителизация роговицы 5 (5;5) И(11;11)

2=8,44; р<0,0001

Рассасывание инфильтрации 5<4;5) 11(И;И)

&=8,66; р<0,0001

Исчезновение перикорнеальной шгьекции 8(8;8) | 14 (14;14)

£=8,66; р<0,000|

Рассасывание гипопиона 3 (3,3) | 6 (б;6)

г=8,21; р<0,0001

Купирование воспаления 10 (10;10) I 15 (15;15)

2=8,66; р<0,000;

Длительность пребывания в стационаре 12 (12;12) | 18(18;18)

г=8,&7; р<0,0001

Динамика течения бактериального язвенного кератита в зависимости от метода лечения Мо (01;<33), дни

Клинические признаки Подгруппы больных

основная сравнения

Эпителизация роговой оболочки 6 (5;6) 11 (10;11)

г=8,72; р<0,0001

Рассасывание инфильтрации 5 (5;5) | 10(10;11)

г=8,72; р<0,0001

Исчезновение перикорнеалыюй инъекции 8 (8;8) | 13 (12;13)

2=8,72; р<0,0001

Рассасывание гипопиона 3 (3;3) I 5(5;6)

2=7,82; р<0,0001

Купирование воспаления 9 (9;9) | 14 (14;14)

8,72; р<0,0001

Длительность пребывания в стационаре 11 (11,11) 17(17;17)

2>=8,91;р<0,0001

В результате исследований выяснилось, что срок очищения язвенного дефекта от некротических масс у больных основных подгрупп с язвенными кератитами разной этиологии сократился в 1,8-2,2 раза в сравнении с подгруппами сравнения. Рассасывание перифокального отека и инфильтрации стромы роговицы ускорилось в 2 раза. Как следствие, в более ранние сроки, чем в подгруппах сравнения, наступала эпителизация роговицы (на 5 - 6-е сутки в основных подгруппах и на 11-е сутки в подгруппах сравнения). Рассасывание гипопиона у больных с герпетическими и бактериальными язвенными кератитами в основных подгруппах ускорилось в 2 раза, завершившись к 3-м суткам, в то время как в подгруппах сравнения данный процесс завершился лишь к 6-м суткам. В 1,6 раза быстрее у больных основных подгрупп происходило купирование явлений воспаления.

Таким образом, использование методики интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови в комплексном лечении у больных язвенными кератитами различной этиологии позволило избежать осложнений данного заболевания.

У больных подгрупп сравнения развитие десцеметоцеле при герпетическом язвенном кератите произошло у 6 человек (15,8%), при бактериальном язвенном кератите - у 8 человек (20,5%), по поводу чего была выполнена лечебная кератопластика. Кроме того, у 3 человек (7,9%) при герпетическом и у 4 человек (10,3%) при бактериальном язвенных кератитах произошла перфорация роговицы, в связи с этим было выполнено срочное оперативное вмешательство (лечебная кератопластика, витрэктомия) (табл. 7).

Таблица 7

Осложнения язвенного кератита различной этиологии

Вид осложнения Группы больных

Герпетический язвенный кератит Бактериальный язвенный кератит

Подгруппы больных основная сравнения основная сравнения

Десцеметоцеле - 6(15,8%) - 8 (20,5%)

Х'=1,48 р=0,193 Хг=2,93 р=0,083

Перфорация роговицы | 3 (7,9%) | 4(10,3%)

Х'=1,60 р=ОДОЗ Хг=4,Э7 (>=0,052

Формирующееся в исходе язвенного кератита помутнение роговицы у больных основных подгрупп было значительно меньшей интенсивности, чем у больных подгрупп сравнения.

Применение интрастромального введения аутологичных мононуклеа-ров крови в лечении больных с язвенными кератитами положительно отразилось на состоянии зрительных функций (табл. 8). На момент госпитализации острота зрения у больных всех групп составляла в среднем 0,02+0,01. К 21-м суткам у больных основных подгрупп острота зрения составляла в среднем 0,5+/-0,01, у больных подгрупп сравнения - 0,09+/-0,01.

Динамика остроты зрения у больных с язвенными кератитами различной этиологии в зависимости от метода лечения

Группы больных Острота зрения

Иа момент госпитализации Через Здня Через 6 дней Через 9 дней Через 12 дней Через 21 день

Бактериальные яз веяные кератиты -основная группа 0,017+0,005 0,044+0,009 ** 0,078+0,009 аа 0,114+0,040 аа 0,188+0,050 аа 0,533+0,048 а*

Бактериальные язвенные кератиты - 0,017+0,005 0,028+0,005 ** 0,040+0,005 аа 0,077+0,007 аа 0,087+0,008 аа 0,101+0,036 а*

Герпетические язвенные кератиты -основная группа 0,017+0,006 0,039+0,004 аа 0,078+0,006 а* 0,078+0,006 аа 0,188+0,023 а* 0,481+0,040 а а

Герпетические язвенные кератиты — группа сравнения 0,017+0,005 0,028+0,005 да 0,047+0,006 а* 0,047+0,006 аа 0,078+0,005 аа 0,088+0,006 **

Примечание:

статистически значимый уровень р<0,05 отмечен * статистически значимый уровень р<0,001 отмечен

Таким образом, очень важное медико-соци&чьное значение имеет существенное сокращение продолжительности пребывания больных основных подгрупп в стационаре, в среднем на 5 дней. При этом период стационарного лечения больных основной подгруппы с герпетическим язвенным кератитом составил 12 дней, больных с бактериальным язвенным кератитом - 11 дней, у больных подгруппы сравнения с герпетическим язвенным кератитом - 18 дней, у больных с бактериальным язвенным кератитом - 17 дней, соответственно.

Выводы

1. Интрастромальное введение аутологичных мононуклеаров крови в лечении экспериментально индуцированного повреждения роговицы способствует достоверно более быстрому купированию экссудативно-деструктивной воспалительной реакции в патологическом очаге.

2. . Интрастромальное введения аутологичных мононуклеаров крови при экспериментально индуцированном повреждении роговицы стимулирует ре-паративную регенерацию поврежденных структур, препятствуя при этом избыточному рубцеванию и неоваскуляризации роговицы.

3. Комплексное лечение больных с язвенными кератитами герпетической и бактериальной этиологии с применением интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови ускоряет эпителизацию дефекта и способствует формированию меньшего по площади и интенсивности помутнения роговицы, существенно улучшая зрительные функции в исходе заболевания.

4. Использование интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови в комплексной фармакотерапии язвенных кератитов герпетической и бактериальной этиологии не вызывает осложнений в сравнении с результатами при традиционном лечении, и характеризуется отсутствием побочных эффектов.

Практические рекомендации

1. С первых дней госпитализации в стационар в комплекс консервативного лечения больных с язвенными кератитами герпетической и бактериальной этиологии целесообразно включать интрастромальное введение аутологичных мононуклеаров крови.

2. Свежевыделенную взвесь аутологичных мононуклеаров крови в условиях операционной с соблюдением правил асептики и антисептики, местной анестезии больного глаза, вводят под острым углом к поверхности роговицы, отступя 2-3 мм от края язвы, в поверхностные слои стромы посредством инъекции медленно на 3, 9 и 12 часах в объеме 0,1- 0,2 мл. В зависимости от степени тяжести и течения заболевания, рекомендуем повторять введение взвеси аутологичных мононуклеаров крови в роговую оболочку 1-2 раза с интервалом в 4-5 дней.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Левченко, H.A. Лечение экспериментального повреждения роговицы с помощью аутологичных мононуклеаров крови / H.A. Левченко, О.И. Криво-шеина // Науки о человеке. Материалы XI конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2010.-С. 60-61.

2. Левченко, H.A. Экспериментальное исследование эффективности применения аутологичных мононуклеаров крови в лечении повреждений роговицы / H.A. Левченко, A.A. Крылова // Материалы Всероссийской 69-й итоговой студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова.-Томск, 2010.-С.46-47.

3. Левченко, НА Эффективность интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови в лечении повреждений роговицы (экспериментальное исследование) / НА. Левченко, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов // Актуальные проблемы офтальмологии. Сборник научных работ V Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов. - Москва, 2010.- С.121-123.

4. Левченко, ILA. Применение аутоцитокинов в леченин экпсримен-тальных повреждений роговины / H.A. Левченко, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов И Цитокины и воспаление.- Санкт-Петербург, 2010. -Т.9. - №3. - С.77.

5. Левченко, H.A. Воспалительно-репаративная регенерация роговицы при интрастромальном введении мононуклеаров крови (экспериментальное исследование) / H.A. Левченко, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов // Невские горизонты-2010. Материалы юбилейной научной конференции.- Санкт-Петербург, 2010. - С.350-355.

6. Левченко, H.A. Патоморфология репаративной регенерации роговицы при интрастромальном введении аутологичных мононуклеаров крови / НА Левченко, ИВ. Запускалов, OK Кривошеина // Пролиферативный синдром в оф-

тальмологии. Сборник научных работ VI Международной научно-практической конференции. - Москва, 2010.- С.33-37.

7. Левченко, H.A. Результаты лечения герпетических кератитов с использованием аутологичных мононуклеаров крови / H.A. Левченко, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов // Актуальные вопросы офтальмологии. Сборник материалов Всероссийской юбилейной научно-практической конференции, посвященной 120-летию кафедры и клиники офтальмологии СибГМУ. - Томск, 2011.- С.54-57.

8. Левченко, H.A. Экспериментальное исследование возможности применения аутологичных мононуклеаров крови при индуцированном повреждении роговицы / H.A. Левченко, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов // Актуальные вопросы офтальмологии. Сборник материалов Всероссийской юбилейной научно-практической конференции, посвященной 120-летию кафедры офтальмологии СибГМУ. - Томск, 2011.- С.57-60.

9. Левченко, НА. Оценка клинической эффективности интрастромального введения аутологичных мононуклеаров крови в лечении герпетических язвенных кератитов / H.A. Левченко, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов // Актуальные проблемы офтальмологии. Сборник научных работ VI Всероссийской научной конференции молодых ученых. - Москва, 2011.-С. 173-174.

10. Левченко, H.A. Динамика воспалительно-регенераторных процессов при экспериме!Гтальной язве роговицы на фоне применения аутологичных мононуклеаров крови // НА Левченко, И.В. Запускалов, О.И. Кривошеина// Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - №1. -С.38-42.

11. Левченко, H.A. Влияние аутологичных мононуклеаров крови иа регенераторные процессы при стромальных повреждениях роговицы в эксперименте / H.A. Левченко, О.И. Кривошеина // Бюллетень сибирской медицины. - 2011,- №4,- С.27-31.

12. Левченко, H.A. Клиническое исследование эффективности применения аутологичных мононуклеаров крови при лечении герпетических кератитов /

H.A. Левченко, A.A. Крылова // Материалы Всероссийской 70-й итоговой студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова. - Томск, 2011.- С.42-43.

13. Левченко, H.A. Перспективы клеточной терапии в лечении герпетических язвенных кератитов / H.A. Левченко, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов // Сибирь офтальмологическая. Сборник трудов научно-практической конференции. - Тюмень, 2011.- С.61-62.

14. Левченко, H.A. Эффективность локальной аутоцитокинотерапи в лечении экспериментального повреждения роговицы / H.A. Левченко, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов // Актуальные вопросы клинической офтальмологии. Социально значимые проблемы общей медицинской практики. Материалы научно-практической конференции. - Северск, 2011. -С.61-63.

15. Левченко, H.A. Роль аутологичных мононуклеаров крови в роцессе заживления экспериментального поражения роговицы / H.A. Левченко, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов // Восток-Запад. Сборник научных трудов научно-практической конференции по офтальмологии с международным участием,- Уфа, 2011,- С.87-89.

16. Левченко, H.A. Опыт применения аутологичных мононуклеаров крови в комплексном лечении герпетических стромальных кератитов / H.A. Левченко Н Науки о человеке. Материалы XII конгресса молодых ученых и специалистов.- Томск, 2011.- С.63-64.

17. Левченко, НА. Аутоцитокинотерапия в лечении вирусных поражений глаз / H.A. Левченко, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов // Актуальные вопросы офтальмологии. Материалы межрегиональной научно-практаческой конференции офтальмологов. - Красноярск, 2011. - С. 137-141.

18. Levchenco, N. The efficiency of autocytocine therapy in of the corneal damages. (Experimental study) / N. Levchenco, O. Krivosheina, I.V. Zapusca-lov, J. Khoroshikh // Invest Ophtalmol. Vis Sei. - 2011, Vol. 61. - P.S5.

Патент РФ на изобретение

1. Способ лечения глубоких стромальных кератитов // Патент на изобретение № 2010148129 от 13.10.2011 г. (Соав. Кривошеина О.И., Запускалов И.В.)

Список использованных сокращений

ВПГ - вирус простого герпеса ИФА - иммуноферментный анализ МФА - метод флюоресцирующих антител

+/- т - границы доверительного интервала средней арифметической величины

п - число наблюдений в выборке р - показатель достоверности разности средних величин Мо- мода

СЬ - верхний квартиль СЬ - нижний квартиль