Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Интерфероновый статус при различных формах патологии

российская академия медицинских наук научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. н.ф. гамалеи

, , „ О К На правах рукописи

- - ПОП Г;£3 0Ю А^лгееЛ ¿9$

АРИНЕНКО Руслан Юрьевич

ИНТЕРФЕРОНОВЫЙ СТАТУС ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ПАТОЛОГИИ

14.00.36

7^/ Аллергология и иммунология

с I / _.. ..а

МУ- /у. ^ Шу

Р ^ Автореферат /

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/г>. А

Р и!?. & /^¿-¿ы+ге^^^

Работа выполнена в НИИ Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф Гамалеи РАМН

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Малиновская В.В.

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук,

профессор Кадагидзе З.Г. - доктор биологических наук Пронин А.В.

Ведущее учреждение: Научно-Исследовательский Институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

I в

Научно-Исследовательском Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан « » аЛНТи^Ь^кЯ 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Коптелова Е.И.

в

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Интенсивное развитие биологии объясняет повышенный интерес к процессам, протекающим в организме. Научные открытия последних лет сформировали новое направление в иммунологии — исследование системы интерферона. Открытые в качестве природных противовирусных факторов, в настоящее время интерфероны рассматриваются как одни из ключевых регуляторов не только защитных, но и многих физиологических процессов протекающих в организме.

Внедрение в медицинскую практику интерферонов, индукторов их образования, иммуномодуляторов обусловило интерес исследователей к оценке влияния этих веществ на регуляторные и защитные системы организма. Оценка эффективности, изучение механизмов действия новых лекарственных средств не может быть полным без определения состояния системы интерферона. Поиск и изучение новых индукторов интерферонообразования, иммуномодуляторов обязательно предусматривает определение их влияния на процессы продукции интерферона как на лабораторных моделях, так и на уровне организма.

Существующие методы количественного определения активности интерферона и оценки интерферонового статуса весьма трудоемки, продолжительны и не всегда позволяют получать точные и воспроизводимые результаты. Кроме того, они отличаются большой себестоимостью и высокими требованиями к профессионализму исполнителя.

Поэтому представляется актуальным дальнейшее развитие и оптимизация методов определения активности интерферона, что крайне необходимо для правильной оценки состояния системы интерферона и обнаружения интерферониндуцирующего действия различных соединений химической и биологической природы.

Углубленные исследования интерферонового статуса при разных формах патологии помогут глубже понять механизмы развития заболевания, определить тактику лечения и прогнозировать его исход.

Цель работы

Усовершенствование методов изучения состояния системы интерферона для дальнейшего исследования интерферонового статуса при различных заболеваниях и проведения скрининговых исследований по обнаружению новых индукторов интерферона.

Задачи работы

1. Определить оптимальные условия и компоненты биологической тест-системы для исследования антивирусной активности интерферонов.

2. Автоматизировать учет результатов определения активности интерферона.

3. Оптимизировать условия изучения интерферонового статуса.

4. Исследовать интерфероновый статус при ряде инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний.

5.Изучить действие некоторых индукторов образования интерферона в условиях in vitro и in vivo.

Научная новизна

Разработан оригинальный высокочувствительный вариант методики определения противовирусной активности интерферона (ИФН) с автоматическим учетом результатов. Для его осуществления, после окраски/фиксации клеточного монослоя, впервые предложено использовать экстрагирование связавшегося красителя 2%-ным раствором додецилсульфата Na на 5% глицерине с последующим измерением оптической плотности материала. Величина экстинкции оказалась прямо пропорциональна количеству клеток монослоя, защищенных ИФН. Впервые предложено использовать калибровочную кривую зависимости оптичсской плотности экстрактов окрашенного клеточного монослоя от активности стандартного препарата ИФН. Определен характер зависимости величины оптической плотности клеточных экстрактов от уровня антивирусной активности ИФН.

Для оценки ИФН статуса впервые применили новый режим инактивации NDV и кислотолабильных ИФНов либо экспозицией в течение 1 часа при 37°С и рН 2.0 либо термической инактивацией в течение 1 часа при 56°С. Разработанный способ инактивации существенно сокращает сроки проведение исследований ИФН статуса.

Для изучения ИФН-индуцирующей активности химических соединений впервые предложено использовать клетки перевиваемой линии Namalva, что позволило стандартизовать условия проведения исследований.

Впервые обнаружены некоторые общие закономерности динамики показателей ИФН статуса при различных формах патологии и разных схемах лечения. Показана взаимосвязь изменений показателей

ИФН статуса с динамикой других клинико-лабораторных параметров; выявлена возможность выбора тактики лечения больных и прогнозирования исходов некоторых заболеваний на основании оценки состояния системы ИФН.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанный нами способ аппаратного учета результатов определения противовирусной активности препаратов интерферона повышает чувствительность и воспроизводимость методики.

2. Перевиваемая лимфобластоидная культура клеток Namalva является чувствительной стандартной моделью для изучения процессов образования интерферона в условиях in vitro. Обнаружено, что динамика и уровни продукции интерферона зависят от природы и доз индуктора.

3. Сформулированы критерии оценки интерферонового статуса больных, основанные на выявлении разных типов интерферона в сыворотке крови и анализе интенсивности образования а/{3- и у-интерферонов клетками периферической крови. Установлено, что характер изменений основных показателей интерферонового статуса связан с природой и клиническими формами заболеваний, а также с особенностями медикаментозного лечения.

Практическая значимость работы

Модифицированный метод количественного определения противовирусной активности ИФН, отличается не только высокой точностью и чувствительностью, но и возможностью автоматизировать учет результатов, а также позволяет увеличить объемы исследований, снижает трудозатраты на проведение анализа, дает воспроизводимые стандартные результаты. Метод может быть использован при производстве ИФН для контроля активности и качества выпускаемых препаратов, а также при скрининговых исследованиях индукторов образования интерферона различной химической природы. Метод апробирован и внедрен в работу лаборатории противовирусных препаратов и индукторов ИФН НИИ гриппа РАМН (С-Петербург).

Разработанный нами способ оценки ИФН статуса позволяет получать достаточно полную характеристику состояния системы ИФН. Информативность метода и сокращенные сроки получения результатов делают возможным использовать его в клинической практике. Обнаруженные нами закономерности изменений показателей ИФН

статуса и их связи с клинико-лабораторными параметрами оказались полезны для оценки состояния больных инфекционными, аутоиммунными и онкологическими заболеваниями в плане уточнения диагноза, выбора методов иммуномодулирующих воздействий, прогнозирования исходов заболевания. На способ определения активности ИФН и исследования ИФН статуса получен приоритет (заявка № 98105888 от 30.03.1999 г.).

Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования были доложены на:

1.4-м национальном конгрессе "Человек и Лекарство". Москва. 1997.

2.ХХХШ-м международном конгрессе физиологических наук. С-Петербург. 1997.

3.8-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям. Лозанна. Швейцария. 1997.

4.9-м Азиатском конгрессе по неврологии. Сеул. Корея. 1996. 5.3-м национальном конгрессе "Человек и Лекарство". Москва.

1996.

Разработанные методы апробированы и внедрены в работу: 1 .Лаборатории противовирусных препаратов и индукторов интерферона НИИ гриппа РАМН, С-Петербург. 2.Лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологии им. Отта РАМН, С-Петербург.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликована 21 печатная работа.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения и перечня цитированной литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 24 рисунками. Библиографический указатель включает 316 источников, из которых 84 отечественных и 232 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Методы исследования

Определение ЭИД50 и ЦПД50 вирусов VSV и NDV проводилось общепринятыми методами [Леннет, 1974].

Определение активности и специфичности иммунной сыворотки к NDV проводилось общепринятыми методами [Леннет, 1974, Фри-мель, 1987].

Статистический анализ полученных данных проводился методами вариационной статистики с определением средней величины, стандартного отклонения, критериев различия по Стюденту.

Клинические исследования (характеристика обследованных пациентов и изучение клинико-лабораторных показателей, исключая исследования ИФН статуса), в соответствии с принятыми методическими стандартами лабораторной диагностики, выполнялись при непосредственном участии сотрудников следующих медицинских учреждений С-Петербурга:

1.Специализированной клиники вирусных инфекций при НИИ гриппа РАМН. Руководитель работы — д.м.н. Виноградова E.H.

2.Кафедры и клиники гематологии BMA им. Кирова. Руководитель работы — д.м.н., проф. Новик A.A.

3.Клиники нейрохирургии и нейроинфекций при НИИ мозга РАН и клиники нейроинфекций BMA им. Кирова. Руководитель работы — д.м.н., проф. Головкин В.И.

4.НИИ акушерства и гинекологии им. Отта РАМН. Руководитель работы — д.м.н. Сельков С.А.

1.2. Определение активности интерферона

В 96-луночных микропланшетах готовили микрокультуры клеток Л-41 в ростовой питательной среде (PC: смесь сред 199 и ДМЕМ 1/1, 10% сыворотки КРС, глутамин 300 мг/л, пенициллин и стрептомицин до 100 ед/мл). Засеянные микропланшеты помещали в термостат при 37°С, 5% С02 и повышенной влажности (90-95%) до образования полного монослоя клеток (24 часа).

После образования монослоя PC удаляли и в каждую лунку вносили по 100 мкл поддерживающей среды (ПС), являющейся полным аналогом PC, но содержащей 2% сыворотки КРС. Исключение составляли лунки 1-го ряда, в которые вносили по 160 мкл ПС. Затем в лунки 1-го ряда последовательно вносили по 40 мкл исследуемых проб и титровали в лунках горизонтальных рядов "А"—"Н", перенося в каждую последующую лунку по 100 мкл. Таким образом, получали серию из шести 2-кратных разведений исходной пробы (1/5-1/10-1/201/40-1/80-1/160). Аналогичньш образом титровали референс-препарат с рядом конечных концентраций 25-12.5-6.3-3.1-1.6-0.8 МЕ/мл. В часть лунок вместо ИФН-содержащих проб вносили IIC для контроля развития ЦПД VSV. После титрования микропланшеты помещали в термостат при 37°С и 5% С02 на 18 часов. Затем материал удаляли, лунки трижды промывали стерильным физиологическим раствором, и в каждую лунку вносили по 100 мкл Г1С, содержащей 100 ЦПД5о/лунку индикаторного вируса (VSV). В лунки контроля качества клеток вместо VSV вносили по 100 мкл ПС. Микропланшеты вновь помещали в термостат на 18-24 часа. После развития 90-100% деструкции клеток в лунках с контролем VSV из микропланшетов удаляли ПС и в каждую лунку вносили по 50 мкл 0.1% раствора кристаллического фиолетового на 30% этаноле. Через 10 мин раствор красителя удаляли и микропланшеты промывали в проточной воде.

Учет результатов титрования антивирусной активности ИФН проводили двумя способами:

1. Визуальный учет, при котором сравнивали плотность окрашенного монослоя в опытных и контрольных пробах.

2. Аппаратный учет, когда краситель экстрагировали из клеток, оптическую плотность экстрактов измеряли на ридере для ИФА при 590 нм и определяли активность ИФН в исследуемых образцах по калибровочной кривой, полученной для референс-препарата ИФН-а.

1.3. Исследование интерферонового статуса

ИФН статус оценивали по следующим показателям: общая активность ИФН (сИФН) и содержание различных типов ИФН в сыворотке крови; способность лейкоцитов продуцировать ИФН разных типов спонтанно и при стимуляции in vitro.

Объектом исследований служила кровь здоровых людей и лиц с разными формами патологии. Для получения сыворотки, венозную

или капиллярную кровь центрифугировали 10-15 минут при 1000 g, отбирали сыворотку и хранили до начала исследования -25 °С. При типировании ИФН-а/р и ИФН-у сыворотки инкубировали с монокло-нальными антителами (МАТ) к соответствующему типу ИФН в течение 2 часов при 37°С. МАТ использовали в конечном разведении 1/100. Количество каждого типа ИФН выражали разностью между общей активностью сИФН и активностью ИФН в образце, после контакта с МАТ. Для определения уровня сывороточного кислотола-бильного ИФН-а в образцы сыворотки добавляли 0.1 н. НС1 до рН 2.0, и после определенного периода инкубирования рН восстанавливали 0.1 н. МаОН. Содержание кислотолабильного ИФН-а определяли как разность активности сыворотки, обработанной МАТ к ИФН-у и активности закисленной/восстановленной сыворотки.

Для определения интенсивности образования ИФН лейкоцитами крови в стерильные пробирки вносили по 200 мкл РС на основе среды ИРМ1-1640, 25 мкл крови с 10-15 ед/мл гепарина и по 25 мкл индуктора: 5-7 1§ЭИД5(/мл КОУ для стимуляции синтеза ИФН-а/р, либо 100 мкг/мл СЭА или ФГА для стимуляции синтеза ИФН-у. При определении спонтанной продукции ИФН вместо индуктора вносили эквивалентный объем РС. Полученные индукционные системы инкубировали 24 часа при 37°С, после чего сохраняли при -25°С до определения активности ИФН.

1.4. Изучение интерферои-ипдуцирующей активности химических соединений различной природы

ИФН-индуцирующую активность химических соединений определяли с помощью разработанной нами модели, включающей перевиваемые клетки линии Катака. В лунках микропланшетов титровали исследуемые соединения в 150 мкл РС на основе ИРМ!-1640. Затем в лунки вносили по 50 мкл суспензии клеток №та1уа (4x106 кл/мл) и помещали в термостат при 37"С на 24 часа. При изучении образования отдельных типов ИФН использовали МАТ или закисле-ние/восстановление материала. В опыте предусматривали контроль спонтанной продукции ИФН клетками Ката1уа, а также контроль ИФН-продуцирующей активности клеток в присутствии ро1у!/ро1уС. Для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов ставили дополнительные тесты на цитотоксическую (в отношении клеток Каша1уа и Л-41) и прямую антивирусную активность

(в отношении УБУ). Для этого растворы испытуемых веществ в соответствующих концентрациях инкубировали в присутствии суспензии клеток Namalva или монослоя клеток Л-41 в течение 24 часов при 37°С, после чего определяли число выживших клеток после окрашивания трипановым синим. Прямую антивирусную активность исследуемых химических соединений определяли по снижению интенсивности ЦПД в отношении клеток Л-41, предварительно выдержанных в присутствии изучаемых веществ в течение 24 часов при 37°С по сравнению с контролем монослоя Л-41.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В последнее время большое внимание уделяется изучению механизмов систем защиты организма и вопросам их регуляции. Среди наиболее перспективных направлений этих работ важную роль играет изучение системы ИФН и ее значения в поддержании гомеостаза.

Знание закономерностей функционирования системы ИФН помогает глубже понять патогенез многих заболеваний и определить методы коррекции дисфункции защитных систем. Для характеристики состояния системы ИФН было введено понятие "ИФН статуса". Изучение ИФН статуса включает в себя: определение содержания различных типов ИФН в физиологических жидкостях, исследования интенсивности образования ИФН клетками крови и др. При изучении показателей ИФН статуса основным методом является определение активности ИФН в исследуемых образцах. Существует две группы методов определения ИФН: иммунохимический (иммуноферментный и радиоиммунный анализ) и методики, основанные на обнаружении биологической активности ИФН. Иммунохимические методы не позволяют анализировать биологическую активность ИФН, и при исследовании клинического материала могут давать искаженные результаты. Методы, позволяющие тестировать активность ИФН преимущественно основаны на определении противовирусного действия ИФН в биологической тест-системе.

Задачей первого этапа наших исследований было создание биологической модели и подбор условий постановки опыта, обеспечивающих высокую чувствительность, точность и воспроизводимость результатов опыта при сокращении материальных и трудовых затрат.

Дня этого нами был разработан метод аппаратного учета количества клеток в лунках микропланшетов, который позволил повысить чувствительность, точность метода и дал возможность получать более достоверные и объективные результаты определения ИФН. С этой целью монослой клеток окрашивали 0.1% раствором кристаллического фиолетового на 30% этаноле, после чего краситель экстрагировали дистиллированной водой, 30% этанолом или 2% раствором ДЦС-Na на 5% глицерине. Оптическую плотность экстрактов определяли на ридере для ИФА при длине волны, соответствующей максимуму поглощения (590 нм). Наиболее эффективным экстрагентом оказался ДДС-Na, при использовании которого оптическая плотность материала была строго пропорциональной количеству клеток. Дистиллированная вода и 30% этанол полностью не экстрагировали краситель из монослоя, особенно при плотности клеточного пласта ниже 20-30%, что искажало результаты исследования.

Биологическая система для определения ИФН состоит из культуры клеток высоко чувствительных к действию ИФН и индикаторного вируса — цитапатического агента с коротким циклом репродукции. При выборе индикаторного вируса мы руководствовались особенностями его цитопатического действия, проявляющегося в наиболее полном разрушении клеток тест-культуры, что представлялось крайне важным для последующей отработки аппаратного метода учета результатов определения активности ИФН.

Был исследован характер цитопатического действия двух вирусов: вируса везикулярного стоматита (VSV), штамм Индиана и вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС) в культуре клеток М-19. Наиболее полная деструкция клеток с отделением от поверхности субстрата происходила под действием VSY. Вирус ЕМС также разрушал зараженные клетки, однако их фрагменты оставались па ростовой поверхности и связывали краситель при тотальном окрашивании тест-культуры. В последующем, краситель экстрагировался ДДС-Na и давал высокие фоновые показатели при аппаратном учете результатов определения числа выживших клеток. Таким образом, в качестве индикаторного вируса нами был выбран VSV.

При поиске тест-культуры для определения противовирусной активности ИФН нами были исследованы перевиваемые линии клеток JI-41, А-539 и Нер-2, а также штамм диплоидных фибробластов человека М-19. Чувствительность клеток к ИФН определяли по уровню их

защиты от ЦПД УБУ после инкубации в присутствии ряда разведений стандартных препаратов ИФН-а и ИФН-у. Как оказалось, наибольшей чувствительностью к ИФН обладали клетки М-19. Перевиваемые клетки Л-41 и А-539 также показали высокую чувствительность к ИФН. При этом, их чувствительность не зависела от пассажного уровня культуры. Поскольку клетки Л-41 образуют плотный монослой, обладают высокой чувствительностью к ИФН и сохраняют это свойство в процессе непрерывного культивирования, они были использованы нами в дальнейших исследованиях в качестве тест-культуры.

С помощью метода аппаратного определения количества красителя, связавшегося с микрокультурами клеток Л-41, нами была изучена зависимость числа сохранившихся после заражения УБУ клеток от активности стандартных препаратов ИФН. Полученная калибровочная кривая была использована для определения активности ИФН в растворах и жидкостях.

Специальными исследованиями в динамике мы установили, что пик антивирусного состояния в клетках Л-41 наступает через 16-18 часов после контакта с ИФН-а и ИФН-у. Большая продолжительность экспозиции клеток с ИФН не увеличивала уровня противовирусной защиты, а, напротив, приводила к развитию артефактов. Поэтому в нашей аранжировке метода тестирования ИФН мы выдерживали клетки в присутствии ИФН-содержащего материала не более 18-20 часов.

Показано, что динамика развития ЦПД УБУ определяется величиной заражающей дозы вируса. Уменьшение заражающей дозы УБУ в 10 раз приводило к удлинению периода наступления 50%-ной деструкции монослоя клеток Л-41 на 2-4 часа. Увеличение продолжительности контакта клеток тест-культуры с индикаторным вирусом не влияло на характер калибровочной кривой и, соответственно, на результаты определения активности ИФН. Таким образом, появилась возможность, варьируя дозу УБУ, более надежно планировать работу исследователя, т.е. учитывать результаты исследования в наиболее удобное время.

Тем самым, благодаря нашим разработкам удалось повысить точность (до ±0.5 МЕ/мл) и воспроизводимость методики, увеличить чувствительность определения активности ИФН (до 0.1-0.3 МЕ/мл), а также существенно сократить трудозатраты на проведение исследо-

ваний, стандартизовать и сделать процесс учета результатов стандартным и объективным.

Исследование ИФН статуса осуществляют по ряду показателей: определение активности сывороточного ИФН с возможным последующим типированием, оценка уровня стимулированной индукторами продукции различных типов ИФН лейкоцитами крови in vitro и др. [15]. Сохранив общие принципы прототипной методики мы внесли в нее некоторые существенные изменения.

Так, ранее для инактивации вируса-индуктора (NDV) питательную среду индуцированных лейкоцитов выдерживали при рН 2.0 в течение 72 часов при 4°С. В этих же условиях инактивировали и ки-слотолабильные ИФН-а. Вместо этого мы экспонировали материал при рН 2.0 в течение 1 часа при 37°С либо прогревали его в течение 1 часа при 56°С. Установлено, что с помощью предложенных способов инактивации NDV полностью устранялись инфекционная и интерферирующая активности NDV, разрушались кислотолабильные ИФН-а, но сохранялась биологическая активность нормальных ЙФН-а/р. Тем самым, с использованием термической или кислотной инактивации значительно сокращались сроки проведения исследования ИФН статуса.

На этапе консервации проб нами была показана возможность замораживания всей индукционной системы, т.е. клеток крови и индуктора, а не культуральной среды лейкоцитов. Установлено, что после однократного замораживания/оттаивания всей индукционной системы активность присутствующего в ней ИФН не только не снижается, но даже несколько возрастает. Возможно это связано с разрушением клеток-продуцентов и высвобождением находящегося в их цитоплазме ИФН. Благодаря этому приему нам удалось не только упростить, но и несколько повысить чувствительность методики определения уровня продукции ИФНов клетками крови.

Для типирования сывороточных ИФН и для установления факта образования клетками кислотолабильного ИФН-а мы использовали моноклональные антитела (МАТ) к ИФН-а и ИФН-у, а также иммунную сыворотку к NDV. Предварительное исследование специфической активности МАТ установило полное отсутствие перекрестных реакций в отношении разных типов ИФН. В разведении 1/100 МАТ эффективно подавляли противовирусную активность 100 МЕ/мл со-

отвегствующего типа ИФН, а в разведении 1/10 они нейтрализовали активность 100-1000 МЕ/мл ИФН. Иммунная сыворотка kNDV в разведении 1/100 полностью подавляла цитопатическое действие вируса и вторичную интерференцию между NDV и индикаторным вирусом (VSV), совершенно не влияя на противовирусную активность стандартных препаратов ИФН-а и ИФН-у.

Таким образом, разработанный нами методический подход к исследованию ИФН статуса позволяет адекватно оценивать состояние системы ИФН.

В процессе исследований была разработана биологическая модель для изучения ИФН-индуцирующей активности химических соединений в условиях in vitro. С этой целью была изучена чувствительность к индукторам ИФН ряда клеточных культур: переживающих культур лейкоцитов периферической крови (ЛПК) и линий перевиваемых клеток лимфобластоидного происхождения (Jurkat, Molt-4, U-937, Namalva). Суспензии клеток одинаковый плотности (106 кл/мл) инкубировали в присутствии стандартных доз вируса болезни Ньюкасла (NDV, 0.5 ^ЭИД50/мл) и энтеротоксина St. aureus типа А (СЭА, 10 мкг/мл). После 24-часовой инкубации клеток в культуральной жидкости определяли активность синтезированного клетками ИФН. Было установлено, что наибольшей ИФН-продуцирующей активностью обладали ЛПК (титр ИФН-сс/р составил 486±8 МЕ/мл, титр ИФН-у — 211 ±6 МЕ/мл). Кроме ЛПК, выраженная способность синтезировать ИФН обнаружена у клеток Namalva (ИФН-а/р 186±7.5 МЕ/мл, ИФН-у 130±4 МЕ/мл). В связи с невысокой воспроизводимостью результатов индукции ИФН-образования в культурах ЛПК, в дальнейшей работе в качестве стандартной модели для изучения ИФН-индуцирующей активности различных соединений мы использовали клетки линии Namalva.

С помощью разработанной биологической модели нами были проведены скрининговые исследования по поиску новых перспективных индукторов ИФН. В результате этой работы были обнаружены вещества, индуцирующие образование высоких титров ИФН в опытах in vitro. Эти химические соединения могут послужить основой для создания новых фармацевтических препаратов индукторов ИФН.

С привлечением приведенных выше методических разработок мы исследовали состояние системы ИФН при некоторых формах патоло-

гии. Использовали сокращенный вариант исследования ИФН статуса: определение содержания общего сывороточного ИФН (сИФН) и уровня индуцированной продукции ИФН-а/р и ИФН-у клетками крови in vitro (индукция ИФН-аУ(3 и ИФН-у). При обследовании 112 здоровых доноров были определены средние значения: сИФН - 3.1 ±2.4 МЕ/мл; индукция ИФН-а/р - 396.2+138.4 ME; индукция ИФН-у -206.0±76.3 ME. В дальнейшем, при оценке нарушений ИФН статуса у больных с разными формами патологии, результаты исследований сравнивали с усредненными нормативными показателями.

ИФН статус определяли в группах больных с острыми и хроническими инфекционными болезнями, аутоиммунными процессами, лимфопролиферативными заболеваниями.

Было проведено исследование динамики показателей ИФН статуса в процессе лечения больных острыми и хроническими формами вирусных гепатитов (гепатиты типа В, С, микст-форма В+С).

При исследовании ИФН статуса до лечения больных при всех формах вирусных гепатитов (ВГ) наблюдали увеличение уровня сИФН и снижение потенции лейкоцитов к образованию ИФН-а/р и ИФН-у. В случаях острых ВГ В (n— 15) или С (п=26) уровень сИФН был выше, а способность лейкоцитов синтезировать ИФН-а/р и ИФН-у ниже, чем при хронических формах ВГ В (п=16) или С (п=15) (рис. 1). Значения показателей ИФН статуса при микст-форме хронического ВГ В+С (n= 12) соответствовали таковым при хронической моноинфекции. ИФН статус больных с острой смешанной инфекцией ВГ В+С (п=3) своими показателями напоминал показатели ИФН статуса больных острыми ВГ В и С. Полученные данные позволяют считать, что состояние системы ИФН при ВГ определяется формой течения патологического процесса, а не этиологическим фактором.

В Индукция ИФН-альфа/бета О Индукция ИФН-гамма □ сИФН

Рис. 1. ИФН статус при разных формах ВГ. ВГВ - вирусный гепатит типа В, ВГС - вирусный гепатит типа С, о - острая форма, х - хроническая форма.

Изучена динамика показателей ИФН статуса у 25 больных острым гепатитом В в процессе лечения препаратами ИФН. Интрон-А или реальдирон вводили подкожно по 3 млн. МЕ через день в течение 55 дней. Установлено, что выраженный терапевтический эффект сопровождался тенденцией к нормализации ИФН статуса. Через 1 месяц после окончания курса лечения уровень сИФН снижался до 16.9±2.9 МЕ/мл, а способность лейкоцитов к образованию ИФН-а/р возрастала до 187.9+15.0 МЕ и ИФН-у — до 91.4+7.3 МЕ (р<0.05). При отсутствии заметных изменений в клиническом состоянии больных показатели ИФН статуса достоверно не изменялись.

При химиотерапии острого ВГ С ретровиром (по 200 мг 6 раз в день в течение 3 недель) было обнаружено, что эффективность лечения зависела от исходного (до начала лечения) показателей ИФН статуса больных. Так, когда состояние системы ИФН больных соответствовало острой форме ВГ (группа 1, п=8), лечение, как правило, сопровождалось положительной клинической динамикой. Если же ИФН статус напоминал таковой при хроническом течении заболевания (группа 2, п=11), существенных изменений в клиническом течении

болезни не наблюдали. После курса лечения ретровиром в группе 1 наблюдали достоверные тенденции к нормализации показателей ИФН статуса; тогда как у больных 2-й группы углублялась депрессия ИФН-продуцирующей активности клеток (рис. 2)._

Фон После 3 мес Фон После 3 мес

а Индукция ИФН-альфа/бета □ Индукция ИФН-гамма ПсИФН

Рис. 2. Динамика ИФН статуса до, после и через 3 месяца по окончании курса химиотерапии оВГС.

Исследована динамика ИФН статуса при лечении острого гепатита В (п=Т4) синтетическим индуктором ИФН амиксином. Препарат назначали по 0.25 мг на 1, 2, 7, 13 и 14 день. Положительные изменения клинико-лабораторных показателей коррелировали с позитивной динамикой показателей ИФН статуса: постепенным снижением уровня сИФН в сочетании с восстановлением значений индуктивной активности лейкоцитов.

Было изучено состояние системы ИФН больных нейроборрелио-зом (НБ) при центральных и периферических поражениях нервной системы. Во всех случаях выявлено повышение уровня сИФН. При начальных формах развития поражений ЦНС (до полугода, п=20) мы отмечали существенное снижение способности лейкоцитов к образованию ЙФН-а/р и ИФН-у. На более поздних стадиях болезни (п=21), на фоне сниженной способности клеток к продукции ИФН-а/р, наблюдали усиление их потенций к образованию ИФН-у. При поражениях ПНС (п=26) вне зависимости от продолжительности заболевания, напротив, наблюдали близкую к норме продукцию ИФН-а/р, со-

провождавшуюся выраженной депрессией функции образования клетками ИФН-у. Через 7-10 дней после курса лечения с использованием индуктора ИФН циклоферона (250 мг на 1, 2,4,6, 8 дни) во всех случаях мы наблюдали достоверное повышение продукции лейкоцитами ИФН-а/р до нормальных значений и выраженные тенденции к нормализации процесса образования ИФН-у. Нормализация показателей ИФН статуса сопровождалась положительной динамикой клинических и неврологических показателей (рис. 3). Приведенные данные свидетельствуют о том, что при прогрессировании поражений ЦНС нарушаются процессы регуляции ИФН-генеза. В подостром периоде снижается продукция всех типов ИФН, а при длительных поражениях ЦНС отмечается гиперпродукция лейкоцитами ИФН-у. Так как ИФН-у играет важную роль в процессах демиелинизации, то, вероятно, повышение уровня образования клетками ИФН-у является одним из механизмов патогенеза центральных поражений при НБ. При поражениях ПНС, наоборот, патогенетически значимым является резкое снижение способности лейкоцитов к образованию ИФН-у._

Фон После Фон После Фон После

■ Индукция ИФН-альфа/бета О Индукция ИФН-гамма ОсИФН

Рис. 3. ИФН статус при различных вариантах НБ до ("фон") и после лечения циклофероном ("после"). Группа 1 — поражения ЦНС, длительность заболевания 4-6 месяцев; группа 2 — то же, длительность заболевания более 2 лет; группа 3 — поражения ПНС.

У больных наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) при любой выраженности болезни отмечали повышение уровня сИФН до 20-30 ME/мл. При 1-3 степени распространенности НГЭ (116 больных) интенсивность образования ИФН-a/ß составила 140-200 МЕ, а ИФН-у — 37-56 МЕ. При 4 степени (17 больных) подавление индуктивной активности клеток ИФН было более выраженным: ИФН-a/ß — 98.3±7.8 МЕ, ИФН-у — 2б.б±1.8 МЕ. После курса лечения с использованием циклоферона не наблюдали достоверных изменений уровня сИФН. После окончания лечения больных НГЭ 1-3 степени распространенности происходило сбалансированное повышение потенций лейкоцитов к образованию ИФН-a/ß (в 1.7 раза) и ИФН-у (в 2.3 раза), р<0.05. При этом, нормализация показателей ИФН статуса сопровождалась положительными изменениями клинико-лабораторных показателей. У больных с 4 степенью использованная схема лечения оказалась малоэффективной, а изменения состояния системы ИФН носили неоднозначный характер: уровень сИФН достоверно не изменялся, продукция клетками ИФН-a/ß снижалась в 4.3 раза, а образование ИФН-у возрастало в 5 раз, р<0.05. Приведенные данные свидетельствуют о том, что положительный эффект от применения индукторов ИФН в лечении НГЭ достигается при относительно высокой индуктивной активности лейкоцитов (1-3 степень болезни). Существенное подавление ИФН-образования (4 степень заболевания) не позволяет успешно использовать в лечении НГЭ иммуностимулирующие препараты.

При изучении ИФН статуса больных ревматоидным артритом (РА) выявлена зависимость состояния системы ИФН от степени активности иммуновоспалительного процесса. При I степени активности РА титры сИФН составили 23.1 ±1.6 ME/мл, а уровень образования клетками ИФН-a/ß был на уровне 134.0±8.2 МЕ и ИФН-у — 53.9±5.1 ME. II степень выраженности РА характеризовалась возрастанием содержания сИФН (34.0±2.6 ME/мл), способность же клеток к продукции ИФН падала. При III степени РА снижались как титры сИФН (20.5±2.3 ME/мл), так и ИФН-продуцирующая активность клеток. У больных с системными проявлениями РА (васкулит, лимфоа-денопатия, нефропатия и др.) уровень сИФН был в 1.2 раза выше, а способность клеток к образованию ИФН в 1.3 раза ниже, чем в кон-

трольной группе сравнения (р<0.05). Таким образом, полученные данные указывают на то, что уровень активности системы ЙФН коррелирует с тяжестью течения РА.

У больных реактивным артритом (РеА) хламидийной этиологии обнаружено, что в активной фазе болезни (лихорадочная реакция) уровень сИФН был выше, чем у больных в стадии ремиссии с нормальной температурой тела. По-видимому, острая реакция организма сопровождается активизацией защитных процессов, в том числе и системы ИФН.

По завершении курса комплексного лечения РА и РеА с использованием циклоферона мы наблюдали достоверное снижение уровней сИФН, возрастание ИФН-индуцирующей активности клеток. У больных, получавших только базовую терапию, достоверной динамики ИФН статуса не выявлено. Элиминация возбудителя при РеА происходила чаще у больных, получавших в курсе комплексной терапии циклоферон, чем в группе лиц, лечившихся традиционными средствами. Таким образом, использование индукторов ИФН приводило к выраженному клиническому и ИФН-корригирующему эффекту (рис.

4Ь_

До лечения После До лечения После

■ Индукция ИФН-альфа/бета О Индукция ИФН-гамма ШсИФН

Рис. 4. Динамика ИФН статуса при комплексном лечении РА с использованием циклоферона. Основная группа — базовая терапия + циклоферон (п=38), контрольная группа — только базовая терапия (п=34).

Известно, что важную роль в патогенезе рассеянного склероза (PC) играет ИФН-у. На основании результатов исследования ИФН статуса больные PC больные PC были подразделены на три группы. 1-я группа больных (16 человек) характеризовалась повышением уровня сИФН до 23.1 ±2.4 МЕ/мл на фоне выраженного подавления функции образования ИФН-а/р и ИФН-у до 233.9+18.6 ME и 48.9±4.1 ME соотв. 2-я группа (13 человек) отличалась от первой еще более высоким содержанием сИФН (35.6±4.1 МЕ/мл) и близкими к норме показателями образования лейкоцитами ИФН-у (138.2±10.7 ME), р<0.05. Продукция ИФН-а/р была почти такой же, как в 1-й группе (215.4±20.6 ME). В 3-й группе (7 человек) наблюдали аномально высокую способность лейкоцитов к продукции ИФН-у (287.7±25.6 ME), что сочеталось со сходными со 2-й группой значениями продукции ИФН-а/р и уровнем сИФН (203.4±17.6 ME и 35.7±2.9 МЕ/мл соотв.), р<0.05. Наиболее тяжелое течение патологического процесса с серьезными осложнениями имело место у больных 3-й группы, лейкоциты которых вырабатывали высокие титры ИФН-у. Аномально повышенная продукция ИФН-у лейкоцитами in vitro и высокие титры сИФН позволяют сделать вывод о существенных нарушениях регуляции процессов синтеза ИФН-у в организме. Использование при лечении этих больных препаратов ИФН-р (бетаферон) приводило к выраженному клиническому эффекту у больных 3 группы, что сопровождалось нормализацией уровня сИФН и показателей образования ИФН-у. Таким образом, оценка ИФН статуса при PC может оказаться решающим фактором для выбора иммунокорригирующей терапии.

При лимфопролиферативных заболеваниях: злокачественной не-ходжкинской лимфоме (ЗНЛ) и лимфогранулематозе (ЛГМ) исходные значения показателей ИФН статуса свидетельствовали о существенной нагрузке на систему ИФН и отражали наличие в организме факторов, стимулирующих выработку ИФН. После проведенных 6-8 курсов химиотерапии (винкристин, доксрубицин, преднизолон) у больных ЛГМ не наблюдали существенных изменений ИФН статуса. После курса химиотерапии у больных ЗНЛ было отмечено снижение титров сИФН и снижение продукции лейкоцитами ИФН-ос/Р; индукция ИФН-у достоверно не изменялась. В результате проведенного лечения происходило полное исчезновение или заметное уменьшение

опухолевой массы. В то же время, полученные данные свидетельствуют, что в результате химиотерапии, несмотря на положительные клинические изменения, реактивность системы ИФН либо не восстанавливалась (ЛГМ) либо еще более подавлялась (ЗНЛ) (рис. 5). Это может быть показанием для комбинирования химиотерапии с методами иммунокоррекции._

В Индукция ИФН-альфа/бета □ Индукция ИФН-гамма ОсИФН

Рис. 5. Динамика ИФН статуса до и после (через 1 месяц) 6-8 курсов химиотерапии лимфопролиферативных заболеваний. ЗНЛ -— злокачественная неход-жкинская лимфома (90 больных), ЛГМ — лимфогранулематоз (34 больных).

л Л к

Основываясь на приведенных материалах можно сделать вывод, что во многих случаях уровень реактивности системы ИФН связан не с той или иной нозологической формой инфекционного или аутоиммунного заболевания, а с особенностями течения болезни. Можно выделить несколько разновидностей ИФН статуса и соответствующих им типов клинического состояния (рис. 6).

500

ш 400 2

е зоо

<х

| 200 &

х

5 100

о

1.Норма 2.Выраженная 3.Слабая 4.Депрессия

_реакция_реакция_

□ Индукция ИФН-альфа/бета □ Индукция ИФН-гамма ОсИФН

Рис. 6. Возможные варианты состояния системы ИФН.

Нормальное физиологическое состояние систем защиты организма, и системы ИФН в частности, проявляется в состоянии "боеготовности", когда в кровотоке присутствует минимальное количество ИФН, но в случае необходимости система способна быстро наработать достаточные количества ИФН.

Выраженная (активная) реакция систем защиты обусловлена интенсивным развитием инфекционного заболевания. Она сопровождается острым течением болезни и проявляется в значительном повышении уровня сИФН (до 25-50 МЕ/мл и более), что, соответственно, ведет к истощению до 15-30% от нормы ресурсов образования различных типов ИФН. Т.е. выраженная реакция системы ИФН заключается в массированной выработке различных типов ИФН для обеспечения неспецифической резистентности организма и запуска других защитных реакций.

Слабая (недостаточная) реакция защитных систем выражается в слабой реакции организма на патологический процесс, явно недостаточной для выздоровления. При этом наблюдается некоторое повышение по сравнению с нормой уровня сИФН до 10-25 МЕ/мл и снижение способности клеток к образованию разных типов ИФН на 5075%. Обычно, такой тип реакции имеет место при подостром или хроническом течении инфекционных заболеваний, когда у больного

СИ

--45 с 40 I + 35 =

+ зо е

з 25 « л 20 ? о

+ 15 5

10 | 3 О

-- 5

развиваются вторичные ИФН- и иммунодефицитов различной степени тяжести. Недостаточная активность систем защиты может быть обусловлена большими дозами антибиотиков, химиопрепаратами, хирургическими вмешательствами, обширными механическими и термическими травмами и т.д.

Депрессия (анэргия) активности систем защиты организма проявляется в глубоком подавлении активности иммунитета, и системы ИФН в частности. сИФН выявляется в следовых количествах (0-10 МЕ/мл), что можно объяснить крайним истощением резервов образования ИФН: индуктивная активность клеток составляет менее 10-15% от нормы. Такое состояние системы ИФН имеет место при тяжело протекающих хронических заболеваниях, персистирующих инфекциях, а также в результате применения массивных курсов иммуноде-прессантов, химиопрепарагов, антибиотиков и цитостатиков.

Характер изменений ИФН статуса обычно отражает состояние систем защиты организма и соответствует клинической динамике болезни.

При острых инфекционных заболеваниях развивается выраженная реакция системы ИФН, причем в первую очередь повышается уровень сИФН, а затем падает индуктивная активность лейкоцитов. При благоприятном развитии болезни, показатели ИФН статуса плавно возвращаются к нормальным. При неполном излечении и хрониза-ции заболевания уровень сИФН несколько снижается, а способность клеток к образованию ИФН может даже несколько повышаться — система ИФН переходит в состояние, соответствующее слабой реактивности. При хроническом течении заболевания, развитии иммунодефицитов, значения показателей ИФН статуса обычно варьируют в пределах, соответствующих слабой реакции системы ИФН. Процесс выздоровления обычно предваряется активацией защитных систем и системы ИФН, т.е. переходом системы ИФН в состояние выраженной реакции, что проявляется в относительном повышении уровня сИФН, снижении индуктивной активности клеток (что наблюдается не всегда) и дальнейшем стремлении показателей ИФН статуса к норме. Прогрессирование патологического процесса приводит к полному истощению системы ИФН, что сопровождается снижением всех показателей ИФН статуса, и, особенно, ИФН-продуцирующей активности лейкоцитов. Как правило, переход системы ИФН в состояние депрессии происходит либо из состояния выраженной реакции (переход за-

болевания в персистирующую форму и развитие иммуно- и ИФН-дефицита), либо из состояния слабой реакции (при осложненном течении хронической патологии). Положительные тенденции в развитии болезни соответствуют активизации системы ИФН: увеличению индуктивной активности лейкоцитов и повышению уровня сИФН. При выздоровлении, все показатели ИФН статуса увеличиваются, и система ИФН последовательно переходит к состоянию слабой, а затем и выраженной реакции с дальнейшим стремлением ИФН статуса к полной нормализации.

Сопоставляя клиническое состояние больного с показателями его ИФН статуса можно прогнозировать характер развития патологического процесса. Достаточная реактивность системы ИФН дает основание для благоприятного прогноза исхода заболевания. Если реакция системы ИФН не адекватна клинической картине, то вероятен малоблагоприятный исход болезни, поскольку налицо дисбаланс защитных систем организма. Такое состояние может иметь место при недостаточности системы ИФН в течении острого заболевания; при хронических заболеваниях, сопровождающихся глубокой депрессией системы ИФН; при различных аутоиммунных и онкологических заболеваниях, когда происходит нарушение баланса продукции различных типов ИФН.

Прогнозирование исхода заболевания будет более надежным при исследовании ИФН статуса в динамике. Положительная динамика показателей ИФН статуса соответствует благоприятному исходу заболевания; тенденции к снижению реактивности системы ИФН или ее депрессии обычно сопутствуют углублению патологии и осложненному течению заболевания.

Закономерности функционирования системы ИФН помогают определять наличие вялотекущих инфекционной патологии при отсутствии явной манифестации заболевания, диагностировать развитие вторичных иммунодефиците®, выявлять предрасположенность к инфекционным и аутоиммунным заболеваниям.

Состояние системы ИФН помогает определить стратегию имму-номодулирующих воздействий. При выраженном подавлении образования клетками ИФН, назначение иммуностимулирующих препаратов (индукторы ИФН, компоненты клеточных стенок микроорганизмов, синтетические иммуностимуляторы) представляется малоперспективным, поскольку защитные системы не в состоянии адекватно

ответить на такого рода воздействие. В этих случаях более показано применение иммунозаместительных препаратов (препараты ИФН, гамма-глобулин, интерлейкины). При выраженной реакции со стороны системы ИФН (резкое повышение уровня сИФН на фоне угнетения ИФН-образования) использование индукторов ИФН и иммуностимуляторов, также будет не всегда эффективным. Дополнительная стимуляция может не привести к ожидаемому выбросу эндогенных защитных факторов. В этих случаях также большей эффективностью будут обладать иммунозаместительные препараты, усиливающие действие эндогенных защитных факторов. При сохранении достаточной способности к образованию собственных защитных факторов, применение индукторов ИФН и иммуностимуляторов является полностью обоснованным. Таким образом, чем ниже способность лейкоцитов продуцировать ИФН, тем более показана заместительная им-муномодулирующая терапия, и, наоборот, чем выше индуктивная активность клеток крови, тем больший эффект будет иметь стимулирующая иммуномодуляция. В ряде случаев (при активном состоянии активации защитных систем) применение иммуномодулирующих воздействий нецелесообразно, поскольку организм сам обеспечивает нужный уровень защитных факторов. Внесение их извне или дополнительная стимуляция их синтеза в организме может только нарушить нормальную регуляцию развития защитных реакций и повредить больному.

ВЫВОДЫ

1,Усовершенствование метода определения противовирусной активности интерферона и использование аппаратного учета результатов позволило повысить чувствительность, надежность, точность и воспроизводимость базового метода.

2.Разработана стандартная лабораторная модель для изучения активности индукторов ИФН химической и биологической природы. В опытах in vivo и in vitro обнаружены некоторые особенности интерферонообразования под влиянием ряда синтетических индукторов ИФН.

З.Оптимизированы условия подготовки образцов и методов определения ИФН статуса.

4.Исследовано состояние системы ИФН у представительной группы здоровых людей и лиц с разными формами патологии. Установлено, что изменения ИФН статуса, обычно обусловлены не этиологическим фактором, а формой и состоянием патологического процесса.

5.Определены четыре основных формы реакций со стороны системы ИФН, характеризующие состояние здоровья и разные фазы инфекционных, аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний,

б.Показана возможность на основании исследования ИФН статуса прогнозировать течение патологического процесса. В зависимости от состояния системы ИФН предлагаются различные варианты иммунокорригирующей терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I .Система интерферона — первая линия защиты организма.//Российский

семейный врач. — 1998. —№1. — с.24-30. /соавг. Алферов В.П., Аникин В.Б./

2.Интерферонотерапия и иммунотерапия: методы контроля и повышения эффективности.//Тегга Medica. — 1998. — №1. — с.32-34. /соавт. Аникин В.Б., Малиновская В.В./

3.Использование циклоферона и реаферона в лечении наружного гени-тального эндометриоза.// Тепа Medica. — 1998. — №1. — с.36-41. /соавт. Сельков С. А., Ярмолинская М.И./

4.Разработка системы оценки эффективности циклоферона.//Медико-биологический конгресс. С-Петербург. - 1997. — Тез.№4048. /соавт. Аникин В.Б., Романцов М.Г./

5.Интерфероновый статус в клинической характеристике вирусных гепа-титов.//Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции. — С-Петербург. — 1997. — с. 95-102. /соавт. Яковлев A.A., Романцов М.Г./

6.Лечение затяжных форм вирусного гепатита В препаратами рекомби-нантного интерферона.// Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции. — С-Петербург. — 1997. — с.103-111. /соавт. Виноградова E.H., Захарова Н.Г./

7.Результаты использования AZT в комплексной терапии гепатитов В и С.// Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции. — С-Петербург. — 1997. — с. 115-121. /соавт. Кинго З.Н., Шулятьева Т.А./

8.Амиксин в комплексной терапии гепатитов В и С.// Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции. — С-Петербург. — 1997. — с. 122-127. / соавт. Пискарев И.Г., Аникин В.Б./

9.Реакция системы интерферона на введение антиметаболитов.//Сборник трудов 4-го национального конгресса "Человек и Лекарство". Москва. — 1997. — с. 214. /соавт. Братина Г.С., Романцов М.Г./

Ю.Использование виферона в лечении хронических урогенитальных инфекций.// Сборник трудов 4-го национального конгресса "Человек и Лекарство". Москва. —1997. — с. 248. /соавт. Брагина Г.С., Берникова A.C./

II .Иммунотерапия наружного генитального эндометриоза.// Сборник тру-

дов 4-го национального конгресса "Человек и Лекарство". Москва. — 1997. — с. 291. /соавт. Сельков С.А., Коваленко А.Л./

12.Использование циклоферона в комплексной терапии генитального эндометриоза.// Сборник трудов 3-го национального конгресса "Человек и Лекарство". Москва. — 1996. — с.249. /соавт. Ярмолинская М.И., Сельков С.А./

13.Интерфероногенез у больных вторичным гломерулонефритом при системных васкулитах./ Сборник трудов 3-го национального конгресса

"Человек и Лекарство". Москва. — 1996. — с. 124. /соавт. Зоткин Е.Г., Раймуев К.В./

14.Интерфероновый статус при химиотерапии вирусных гепатитов.// Сборник трудов 3-го национального конгресса "Человек и Лекарство". Москва. — 1996. — с. 68. /соавт. Захарова Н.Г./

15.Индуктор интерферона циклоферон как препарат выбора в лечении лейкозов. // Сборник трудов 3-го национального конгресса "Человек и Лекарство". Москва. — 1996. — с. 7. /соавт. Аникин В.Б./

16.Изменения интерферонового статуса у больных вирусным гепатитом В при использовании низкомолекулярного индуктора интерферона амик-сина.// Матери&чы симпозиума "Клиническая медицина". Калининград. — 1996. — с. 40-41. /соавт. Аникин В.Б., Малиновская В.В./

17.Интерфероновый статус для мониторинга патологических процессов; интерфероновый ответ на модели вирусного гепатита; возможность использования индуктора интерферона циклоферона при лейкемии.// Материалы симпозиума "Клиническая медицина". Калининград. —

1996. — с. 33-35. /соавт. Романцов М.Г., Аникин В.Б./

18.Significance of interferon status research during neuroimmunological disorders.//XXXIII Interactional Congress of Physiological Sciences IUPS. St. Petersburg. Rissia. — 1997. — AbstrJ1710. /со-auth. Anikin V.B., Golovkin V.I./

19.Interferon status during antigen-induced arthritis.//8th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Lauzanne. Switzerland. —

1997. — Abstr.#P858a. /со-auth. Anikin V.B., Romantsov M.G./. 20.1nterferon status for viral hepatitis outcome prognosis.// 8th European

Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Lauzanne. Switzerland. — 1997. — Abstr.#P858b. /со-auth. Anikin V.B., Romantsov M.G./.

21.Interferon status and serotonine metabolism of patients with multiple sclerosis.//9-th Asian and Oceanian congress of neurology. Seoul. Korea. — 1996. /со-auth. Golovkin V.I./.

Актуальность темы

Интенсивное развитие биологии объясняет повышенный интерес к процессам, протекающим в организме. Научные открытия последних лет сформировали новое направление в иммунологии — исследование системы интерферона. Открытые в качестве природных противовирусных факторов, в настоящее время интерфероны рассматриваются как одни из ключевых регуляторов не только защитных, но и многих физиологических процессов протекающих в организме.

Внедрение в медицинскую практику интерферонов, индукторов их образования, иммуномодуляторов обусловило интерес исследователей к оценке влияния этих веществ на регуляторные и защитные системы организма. Оценка эффективности, изучение механизмов действия новых лекарственных средств не может быть полным без определения состояния системы интерферона. Поиск и изучение новых индукторов интерферонообразования, иммуномодуляторов обязательно предусматривает определение их влияния на процессы продукции интерферона как на лабораторных моделях, так и на уровне организма.

Существующие методы количественного определения активности интерферона и оценки интерферонового статуса весьма трудоемки, продолжительны и не всегда позволяют получать точные и воспроизводимые результаты. Кроме того, они отличаются большой себестоимостью и высокими требованиями к профессионализму исполнителя.

Поэтому представляется актуальным дальнейшее развитие и оптимизация методов определения активности интерферона, что крайне необходимо для правильной оценки состояния системы интерферона и обнаружения интерферониндуцирующего действия различных соединений химической и биологической природы.

Углубленные исследования интерферонового статуса при разных формах патологии помогут глубже понять механизмы развития заболевания, определить тактику лечения и прогнозировать его исход.

Цель работы

Усовершенствование методов изучения состояния системы интерферона для дальнейшего исследования интерферонового статуса при различных заболеваниях и проведения скрининговых исследований по обнаружению новых индукторов интерферона.

Задачи работы

1. Определить оптимальные условия и компоненты биологической тест-системы для исследования антивирусной активности интерферонов.

2. Автоматизировать учет результатов определения активности интерферона.

3. Оптимизировать условия изучения интерферонового статуса.

4. Исследовать интерфероновый статус при ряде инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний.

5. Изучить действие некоторых индукторов образования интерферона в условиях in vitro и in vivo.

Научная новизна

Разработан оригинальный высокочувствительный вариант методики определения антивирусной активности интерферона (ИФН) с автоматическим учетом результатов. Для его осуществления, после окраски/фиксации клеточного монослоя, впервые предложено использовать экстрагирование связавшегося красителя 2%-ным раствором до-децилсульфата Na на 5% глицерине с последующим измерением оптической плотности материала. Величина экстинкции оказалась прямо пропорциональна количеству клеток монослоя, защищенных ИФН. Впервые предложено использовать калибровочную кривую зависимости оптической плотности экстрактов окрашенного клеточного монослоя от активности стандартного препарата ИФН. Определен характер зависимости величины оптической плотности клеточных экстрактов от уровня антивирусной активности ИФН.

Для оценки ИФН статуса впервые применили новый режим инактивации NDV и кислотолабильных ИФНов либо экспозицией в течение 1 часа при 37°С и рН 2.0 либо термической инактивацией в течение 1 часа при 56°С. Разработанный способ инактивации существенно сокращает сроки проведение исследований ИФН статуса.

Для изучения ИФН-индуцирующей активности химических соединений впервые предложено использовать клетки перевиваемой линии Namalva, что позволило стандартизовать условия проведения исследований.

Впервые обнаружены некоторые общие закономерности динамики показателей ИФН статуса при различных формах патологии и разных схемах лечения. Показана взаимосвязь изменений показателей ИФН статуса с динамикой других клинико-лабораторных параметров; выявлена возможность выбора тактики лечения больных и прогнозирования исходов некоторых заболеваний на основании оценки состояния системы ИФН.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанный нами способ аппаратного учета результатов определения противовирусной активности препаратов интерферона повышает чувствительность и воспроизводимость методики.

2. Перевиваемая лимфобластоидная культура клеток Namalva является чувствительной стандартной моделью для изучения процессов образования интерферона в условиях in vitro. Обнаружено, что динамика и уровни продукции интерферона зависят от природы и доз индуктора.

3. Сформулированы критерии оценки интерферонового статуса больных, основанные на выявлении разных типов интерферона в сыворотке крови и анализе интенсивности образования а/р- и у-интерферонов клетками периферической крови. Установлено, что характер изменений основных показателей интерферонового статуса связан с природой и клиническими формами заболеваний, а также с особенностями медикаментозного лечения.

Практическая значимость работы

Модифицированный метод количественного определения антивирусной активности ИФН, отличается не только высокой точностью и чувствительностью, но и возможностью автоматизировать учет результатов, а также позволяет увеличить объемы исследований, снижает трудозатраты на проведение анализа, дает воспроизводимые стандартные результаты. Метод может быть использован при производстве ИФН для контроля активности и качества выпускаемых препаратов, а также при скрининговых исследованиях индукторов образования интерферона различной химической природы. Метод апробирован и внедрен в работу лаборатории противовирусных препаратов и индукторов ИФН НИИ гриппа РАМН (С-Петербург).

Разработанный нами способ оценки ИФН статуса позволяет получать достаточно полную характеристику состояния системы ИФН. Информативность метода и сокращенные сроки получения результатов делают возможным использовать его в клинической практике. Обнаруженные нами закономерности изменений показателей ИФН статуса и их связи с клинико-лабораторными параметрами оказались полезны для оценки состояния больных инфекционными, аутоиммунными и онкологическими заболеваниями в плане уточнения диагноза, выбора методов иммуномодулирующих воздействий, прогнозирования исходов заболевания. Метод апробирован и внедрен в практику в НИИ акушерства и гинекологии им. Отта РАМН (С-Петербург). На способ определения активности ИФН и исследования ИФН статуса получен приоритет (заявка № 98105888 от 30.03.1999 г.).

Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования были доложены на: 1.4-м национальном конгрессе "Человек и Лекарство". Москва. 1997. 2.ХХХШ-М международном конгрессе физиологических наук. С-Петербург. 1997.

3.8-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям. Лозанна. Швейцария. 1997.

4.9-м Азиатском конгрессе по неврологии. Сеул. Корея. 1996.

5.3-м национальном конгрессе "Человек и Лекарство". Москва. 1996. Разработанные методы апробированы и внедрены в работу:

1 .Лаборатории противовирусных препаратов и индукторов интерферона НИИ гриппа РАМН, С-Петербург. 2.Лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологии им. Отта РАМН, С-Петербург.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 21 печатная работа.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения и перечня цитированной литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 24 рисунками. Библиографический указатель включает 316 источников, из которых 84 отечественных и 232 иностранных авторов.

5. ВЫВОДЫ

1 .Усовершенствование метода определения противовирусной активности интерферона и использование аппаратного учета результатов позволило повысить чувствительность, надежность, точность и воспроизводимость базового метода.

2.Разработана стандартная лабораторная модель для изучения активности индукторов ИФН химической и биологической природы. В опытах in vivo и in vitro обнаружены некоторые особенности интерферонообразования под влиянием ряда синтетических индукторов ИФН.

3.Оптимизированы условия подготовки образцов и методов определения ИФН статуса.

4.Исследовано состояние системы ИФН у представительной группы здоровых людей и лиц с разными формами патологии. Установлено, что изменения ИФН статуса, обычно обусловлены не этиологическим фактором, а формой и состоянием патологического процесса.

5.Определены четыре основных формы реакций со стороны системы ИФН, характеризующие состояние здоровья и разные фазы инфекционных, аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний.

6.Показана возможность прогнозировать течение патологического процесса на основании результатов исследования ИФН статуса. В зависимости от состояния системы ИФН предлагаются различные варианты иммунокорригирующей терапии.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее время большое внимание уделяется изучению механизмов систем защиты организма и вопросам их регуляции. Среди наиболее перспективных направлений этих работ важную роль играет изучение системы ИФН и ее значения в поддержании гомеостаза.

Знание закономерностей функционирования системы ИФН помогает глубже понять патогенез многих заболеваний и определить методы коррекции дисфункции защитных систем. Для характеристики состояния системы ИФН было введено понятие "ИФН статуса". Изучение ИФН статуса включает в себя: определение содержания различных типов ИФН в физиологических жидкостях, исследования интенсивности образования ИФН клетками крови и др. При изучении показателей ИФН статуса основным методом является определение активности ИФН в исследуемых образцах. Существует две группы методов определения ИФН: иммунохимический (иммуноферментный и радиоиммунный анализ) и методики, основанные на обнаружении биологической активности ИФН. Иммунохимические методы не позволяют анализировать биологическую активность ИФН, и при исследовании клинического материала могут давать ложнопо-ложительные результаты. Методы, позволяющие тестировать активность ИФН основаны, преимущественно, на определении противовирусного действия ИФН в биологической тест-системе.

Задачей первого этапа наших исследований было создание биологической модели и подбор условий постановки опыта, обеспечивающих высокую чувствительность, точность и воспроизводимость результатов опыта при сокращении материальных и трудовых затрат.

Для этого нами был разработан метод аппаратного учета количества клеток в лунках микропланшетов, который позволил повысить чувствительность, точность метода и дал возможность получать более достоверные и объективные результаты определения ИФН. С этой целью монослой клеток окрашивали 0.1% раствором кристаллического фиолетового на 30% этаноле, после чего краситель экстрагировали дистиллированной водой, 30% этанолом или 2% раствором ДДС-Ма на 5% глицерине. Оптическую плотность экстрактов определяли на ридере для ИФА при длине волны, соответствующей максимуму поглощения (590 нм). Наиболее эффективным экстрагентом оказался ДДС-Ыа, при использовании которого оптическая плотность материала была строго пропорциональной количеству клеток. Дистиллированная вода и 30% этанол полностью не экстрагировали краситель из монослоя, особенно при 20-30%-ной плотности клеточного пласта, что искажало результаты исследования.

Биологическая система для определения ИФН состоит из культуры клеток высоко чувствительных к действию ИФН и индикаторного вируса — цитопатического агента с коротким циклом репродукции. При выборе индикаторного вируса мы руководствовались особенностями его цитопатического действия, проявляющегося в наиболее полном разрушении клеток тест-культуры, что представлялось крайне важным для последующей отработки аппаратного метода учета результатов определения активности ИФН.

Был исследован характер цитопатического действия двух вирусов: вируса везикулярного стоматита (VSY), штамм Индиана и вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС) в культуре клеток М-19. Наиболее полная деструкция клеток с отделением от поверхности субстрата происходила под действием VSV. Вирус ЕМС также разрушал зараженные клетки, однако их фрагменты оставались на ростовой поверхности и связывали краситель при тотальном окрашивании тест-культуры. В последующем, краситель экстрагировался ДДС-Na и давал высокие фоновые показатели при аппаратном учете результатов определения числа выживших клеток. Таким образом, в качестве индикаторного вируса нами был выбран VSV.

При поиске тест-культуры для определения противовирусной активности ИФН нами были исследованы перевиваемые линии клеток J1-41, А-539 и Нер-2, а также штамм диплоидных фибробластов человека М-19. Чувствительность клеток к ИФН определяли по уровню их защиты от ЦПД VSY после инкубации в присутствии ряда разведений стандартных препаратов ИФН-а и ИФН-у. Как оказалось, наибольшей чувствительностью к ИФН обладали клетки М-19. Перевиваемые клетки Л-41 и А-539 также показали высокую чувствительность к ИФН. При этом, их чувствительность не зависела от пассажного уровня культуры. Поскольку клетки Л-41 обладают высокой чувствительностью к ИФН и сохраняют это свойство в процессе непрерывного культивирования, они были использованы нами в дальнейших исследованиях в качестве тест-культуры.

С помощью метода аппаратного определения количества красителя, связавшегося с микрокультурами клеток Л-41, нами была изучена зависимость числа сохранившихся после заражения VSV клеток от активности стандартных препаратов ИФН. Полученная калибровочная кривая была использована для определения активности ИФН в растворах и жидкостях.

Специальными исследованиями в динамике мы установили, что пик антивирусного состояния в клетках JI-41 наступает через 16-18 часов после контакта с ИФН-а и ИФН-у. Большая продолжительность экспозиции клеток с ИФН не увеличивала уровня противовирусной защиты, а, напротив, приводила к развитию артефактов. Поэтому в нашей аранжировке метода тестирования ИФН мы выдерживали клетки в присутствии ИФН-содержащего материала не более 18-20 часов.

Показано, что динамика развития ЦПД VSV определяется величиной заражающей дозы вируса. Уменьшение заражающей дозы VSV в 10 раз приводило к удлинению периода наступления 50%-ной деструкции монослоя клеток J1-41 на 2-4 часа. Увеличение продолжительности контакта клеток тест-культуры с индикаторным вирусом не влияло на характер калибровочной кривой и, соответственно, на результаты определения активности ИФН. Таким образом, появилась возможность, варьируя дозу VSV, более надежно планировать работу исследователя, т.е. учитывать результаты исследования в наиболее удобное время.

Тем самым, благодаря нашим разработкам удалось повысить точность (до ±0.5 МЕ/мл) и воспроизводимость методики, увеличить чувствительность определения активности ИФН (до 0.1-0.3 МЕ/мл), а также существенно сократить трудозатраты на проведение исследований, стандартизовать и сделать процесс учета результатов стандартным и объективным.

Исследование ИФН статуса осуществляют по ряду показателей: определение активности сывороточного ИФН с возможным последующим типированием, оценка уровня стимулированной индукторами продукции различных типов ИФН лейкоцитами крови in vitro и др. [15]. Сохранив общие принципы прототипной методики мы внесли в нее некоторые существенные изменения.

Так, ранее для инактивации вируса-индуктора (NDV) питательную среду индуцированных лейкоцитов выдерживали при рН 2.0 в течение 72 часов при 4°С. В этих же условиях инактивировали и кислотолабильные ИФН-а. Вместо этого мы экспонировали материал при рН 2.0 в течение 1 часа при 37°С либо прогревали его в течение 1 часа при 56°С. Установлено, что с помощью предложенных способов инактивации NDV полностью устранялись инфекционная и интерферирующая активности NDV, разрушались кислотолабильные ИФН-а, но сохранялась биологическая активность нормальных ИФН-а/(3. Тем самым, с использованием термической или кислотной инактивации значительно сокращались сроки проведения исследования ИФН статуса.

На этапе консервации проб нами была показана возможность замораживания всей индукционной системы, т.е. клеток крови и индуктора, а не культуральной среды лейкоцитов. Установлено, что после однократного замораживания/оттаивания всей индукционной системы активность присутствующего в ней ИФН не только не снижается, но даже несколько возрастает. Возможно это связано с разрушением клеток-продуцентов и высвобождением находящегося в их цитоплазме ИФН. Благодаря этому приему нам удалось не только упростить, но и несколько повысить чувствительность методики определения уровня продукции ИФНов клетками крови.

Для типирования сывороточных ИФН и для установления факта образования клетками кислотолабильного ИФН-а мы использовали моноклональные антитела (МАТ) к ИФН-а и ИФН-у, а также иммунную сыворотку к NDV. Предварительное исследование специфической активности МАТ установило полное отсутствие перекрестных реакций в отношении разных типов ИФН. В разведении 1/100 МАТ эффективно подавляли противовирусную активность 100 МЕ/мл соответствующего типа ИФН, а в разведении 1/10 они нейтрализовали активность 100-1000 МЕ/мл ИФН. Иммунная сыворотка к NDV в разведении 1/100 полностью подавляла цитопатическое действие вируса и вторичную интерференцию между NDV и индикаторным вирусом (VSV), совершенно не влияя на противовирусную активность стандартных препаратов ИФН-а и ИФН-у.

Таким образом, разработанный нами методический подход к исследованию ИФН статуса позволяет адекватно оценивать состояние системы ИФН.

В процессе исследований была разработана биологическая модель для изучения ИФН-индуцирующей активности химических соединений в условиях in vitro. С этой целью была изучена чувствительность к индукторам ИФН ряда клеточных культур: переживающих культур лейкоцитов периферической крови (ЛПК) и линий перевиваемых клеток лимфобластоидного происхождения (Jurkat, Molt-4, U-937, Namalva). Суспензии клеток одинаковый плотности (106 кл/мл) инкубировали в присутствии стандартных доз вируса болезни Ньюкасла (NDV, 0.5 ^ЭИД50/мл) и энтеротоксина St. aureus типа А (СЭА, 10 мкг/мл). После 24-часовой инкубации клеток в культуральной жидкости определяли активность синтезированного клетками ИФН. Было установлено, что наибольшей ИФН-продуцирующей активностью обладали ЛПК (титр ИФН-а/р составил 486±8 МЕ/мл, титр ИФН-у — 211±6 МЕ/мл). Кроме ЛПК, выраженная способность синтезировать ИФН обнаружена у клеток Namalva (ИФН-а/р 186±7.5 МЕ/мл,

ИФН-у 130±4 МЕ/мл). В связи с невысокой воспроизводимостью результатов индукции ИФН-образования в культурах ЛПК, в дальнейшей работе в качестве стандартной модели для изучения ИФН-индуцирующей активности различных соединений мы использовали клетки линии Namalva.

С помощью разработанной биологической модели нами были проведены скри-нинговые исследования по поиску новых перспективных индукторов ИФН. В результате этой работы были обнаружены вещества, индуцирующие образование высоких титров ИФН в опытах in vitro. Эти химические соединения могут послужить основой для создания новых фармацевтических препаратов индукторов ИФН.

С привлечением приведенных выше методических разработок мы исследовали состояние системы ИФН при некоторых формах патологии. Использовали сокращенный вариант исследования ИФН статуса: определение содержания общего сывороточного ИФН (сИФН) и уровня индуцированной продукции ИФН-а/р и ИФН-у клетками крови in vitro (индукция ИФН-а/р и ИФН-у). При обследовании 112 здоровых доноров были определены средние значения: сИФН - 3.1+2.4 МЕ/мл; индукция ИФН-а/р -396.2+138.4 ME; индукция ИФН-у - 206.0+76.3 ME. В дальнейшем, при оценке нарушений ИФН статуса у больных с разными формами патологии, результаты исследований сравнивали с усредненными нормативными показателями.

ИФН статус определяли в группах больных с острыми и хроническими инфекционными болезнями, аутоиммунными процессами, лимфопролиферативными заболеваниями.

Было проведено исследование динамики показателей ИФН статуса в процессе лечения больных острыми и хроническими формами вирусных гепатитов (гепатиты типа В, С, микст-форма В+С).

При всех формах вирусных гепатитов (ВГ) происходило увеличение уровня сИФН и снижение потенции лейкоцитов к образованию ИФН-а/р и ИФН-у. В случаях острых ВГ В или С уровень сИФН был выше, а способность лейкоцитов синтезировать ИФН-а/р и ИФН-у ниже, чем при хронических формах ВГ. Значения показателей ИФН статуса при микст-форме хронического ВГ В+С соответствовали таковым при хронической моноинфекции. ИФН статус больных с острой смешанной инфекцией ВГ В+С своими показателями напоминал показатели ИФН статуса больных острыми ВГ В и С. Полученные данные позволяют считать, что состояние системы ИФН при ВГ определяется формой течения патологического процесса, а не этиологическим фактором.

Изучена динамика показателей ИФН статуса у 25 больных острым гепатитом В в процессе лечения препаратами ИФН. Интрон-А или реальдирон вводили подкожно по 3 млн. МЕ через день в течение 55 дней. Установлено, что выраженный терапевтический эффект сопровождался тенденцией к нормализации ИФН статуса. Через 1 месяц после окончания курса лечения уровень сИФН снижался до 16.9±2.9 МЕ/мл, а способность лейкоцитов к образованию ИФН-а/р возрастала до 187.9±15.0 МЕ и ИФН-у — до 91.4±7.3 МЕ (р<0.05). При отсутствии заметных изменений в клиническом состоянии больных показатели ИФН статуса достоверно не изменялись.

При химиотерапии острого ВГ С ретровиром (по 200 мг 6 раз в день в течение 3 недель) было обнаружено, что эффективность лечения зависела от исходного (до начала лечения) показателей ИФН статуса больных. Так, когда состояние системы ИФН больных соответствовало острой форме ВГ (группа 1), лечение, как правило, сопровождалось положительной клинической динамикой. Если же ИФН статус напоминал таковой при хроническом течении заболевания (группа 2), существенных изменений в клиническом течении болезни не наблюдали. После курса лечения ретровиром в группе 1 наблюдали достоверные тенденции к нормализации показателей ИФН статуса; тогда как у больных 2-й группы углублялась депрессия ИФН-продуцирующей активности клеток.

Исследована динамика ИФН статуса при лечении острого гепатита В синтетическим индуктором ИФН амиксином. Препарат назначали по 0.25 мг на 1, 2, 7, 13 и 14 день. Положительные изменения клинико-лабораторных показателей коррелировали с позитивной динамикой показателей ИФН статуса: постепенным снижением уровня сИФН в сочетании с восстановлением значений индуктивной активности лейкоцитов.

Было изучено состояние системы ИФН больных нейроборрелиозом (НБ) при центральных и периферических поражениях нервной системы. Во всех случаях выявлено повышение уровня сИФН. При начальных формах развития поражений ЦНС (до полугода) мы отмечали существенное снижение способности лейкоцитов к образованию ИФН-а/р и ИФН-у. На более поздних стадиях болезни, на фоне сниженной способности клеток к продукции ИФН-а/р, наблюдали усиление их потенций к образованию ИФН-у. При поражениях ПНС вне зависимости от продолжительности заболевания, напротив, наблюдали близкую к норме продукцию ИФН-а/р, сопровождавшуюся выраженной депрессией функции образования клетками ИФН-у. Через 7-10 дней после курса лечения с использованием индуктора ИФН циклоферона (250 мг на 1, 2, 4, 6, 8 дни) во всех случаях мы наблюдали достоверное повышение продукции лейкоцитами

ИФН-а/р до нормальных значений и выраженные тенденции к нормализации процесса образования ИФН-у. Нормализация показателей ИФН статуса сопровождалась положительной динамикой клинических и неврологических показателей. Приведенные данные свидетельствуют о том, что при прогрессировании поражений ЦНС нарушаются процессы регуляции ИФН-генеза. В подостром периоде снижается продукция всех типов ИФН, а при длительных поражениях ЦНС отмечается гиперпродукция лейкоцитами ИФН-у. Так как ИФН-у играет важную роль в процессах демиелинизации, то, вероятно, повышение уровня образования клетками ИФН-у является одним из механизмов патогенеза центральных поражений при НБ. При поражениях ПНС, наоборот, патогенетически значимым является резкое снижение способности лейкоцитов к образованию ИФН-у.

У больных наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) при любой выраженности болезни отмечали повышение уровня сИФН до 20-30 МЕ/мл. При 1-3 степени распространенности НГЭ (116 больных) интенсивность образования ИФН-а/р составила 140-200 МЕ, а ИФН-у — 37-56 МЕ. При 4 степени (больных) подавление индуктивной активности клеток ИФН было более выраженным: ИФН-а/р — 98.3+7.8 МЕ, ИФН-у — 26.6+1.8 МЕ. После курса лечения с использованием циклоферона не наблюдали достоверных изменений уровня сИФН. После окончания лечения больных НГЭ 1-3 степени распространенности происходило сбалансированное повышение потенций лейкоцитов к образованию ИФН-а/р (в 1.7 раза) и ИФН-у (в 2.3 раза), р<0.05. При этом, нормализация показателей ИФН статуса сопровождалась положительными изменениями клини-ко-лабораторных показателей. У больных с 4 степенью использованная схема лечения оказалась малоэффективной, а изменения состояния системы ИФН носили неоднозначный характер: уровень сИФН достоверно не изменялся, продукция клетками ИФН-а/р снижалась в 4.3 раза, а образование ИФН-у возрастало в 5 раз, р<0.05. Приведенные данные свидетельствуют о том, что положительный эффект от применения индукторов ИФН в лечении НГЭ достигается при относительно высокой индуктивной активности лейкоцитов (1-3 степень болезни). Существенное подавление ИФН-образования (4 степень заболевания) не позволяет успешно использовать в лечении НГЭ иммуностимулирующие препараты.

При изучении ИФН статуса больных ревматоидным артритом (РА) выявлена зависимость состояния системы ИФН от степени активности иммуновоспалительного процесса. При I степени активности РА титры сИФН составили 23.1+1.6 МЕ/мл, а уровень образования клетками ИФН-а/р был на уровне 134.0±8.2 МЕ и ИФН-у — 53.9±5.1 МЕ. II степень выраженности РА характеризовалась возрастанием содержания сИФН (34.0±2.6 МЕ/мл), способность же клеток к продукции ИФН падала. При III степени РА снижались как титры сИФН (20.5±2.3 МЕ/мл), так и ИФН-продуцирующая активность клеток. У больных с системными проявлениями РА (васкулит, лимфоаденопатия, неф-ропатия и др.) уровень сИФН был в 1.2 раза выше, а способность клеток к образованию ИФН в 1.3 раза ниже, чем в контрольной группе сравнения (р<0.05). Таким образом, полученные данные указывают на то, что уровень активности системы ИФН коррелирует с тяжестью течения РА.

У больных реактивным артритом (РеА) хламидийной этиологии обнаружено, что в активной фазе болезни (лихорадочная реакция) уровень сИФН был выше, чем у больных в стадии ремиссии с нормальной температурой тела. По-видимому, острая реакция организма сопровождается активизацией защитных процессов, в том числе и системы ИФН.

По завершении курса комплексного лечения РА и РеА с использованием цикло-ферона мы наблюдали достоверное снижение уровней сИФН, возрастание ИФН-индуцирующей активности клеток. У больных, получавших только базовую терапию, достоверной динамики ИФН статуса не выявлено. Элиминация возбудителя при РеА происходила чаще у больных, получавших в курсе комплексной терапии циклоферон, чем в группе лиц, лечившихся традиционными средствами. Таким образом, использование индукторов ИФН приводило к выраженному клиническому и ИФН-корригирующему эффекту.

Известно, что важную роль в патогенезе рассеянного склероза (РС) играет ИФН-у. На основании результатов исследования ИФН статуса больные РС больные РС были подразделены на три группы. 1-я группа больных (16 человек) характеризовалась повышением уровня сИФН до 23.1 ±2.4 МЕ/мл на фоне выраженного подавления функции образования ИФН-а/р и ИФН-у до 233.9±18.6 МЕ и 48.9±4.1 МЕ соотв. 2-я группа (13 человек) отличалась от первой еще более высоким содержанием сИФН (35.6±4.1 МЕ/мл) и близкими к норме показателями образования лейкоцитами ИФН-у (138.2±10.7 МЕ), р<0.05. Продукция ИФН-а/р была почти такой же, как в 1-й группе (215.4±20.6 МЕ). В 3-й группе (7 человек) наблюдали аномально высокую способность лейкоцитов к продукции ИФН-у (287.7±25.6 МЕ), что сочеталось со сходными со 2-й группой значениями продукции ИФН-а/р и уровнем сИФН (203.4±17.6 МЕ и 35.7+2.9 МЕ/мл соотв.), р<0.05. Наиболее тяжелое течение патологического процесса с серьезными осложнениями имело место у больных 3-й группы, лейкоциты которых вырабатывали высокие титры ИФН-у. Аномально повышенная продукция ИФН-у лейкоцитами in vitro и высокие титры сИФН позволяют сделать вывод о существенных нарушениях регуляции процессов синтеза ИФН-у в организме. Использование при лечении этих больных препаратов ИФН-ß (бетаферон) приводило к выраженному клиническому эффекту у больных 3 группы, что сопровождалось нормализацией уровня сИФН и показателей образования ИФН-у. Таким образом, оценка ИФН статуса при PC может оказаться решающим фактором для выбора иммунокорригирующей терапии.

При лимфопролиферативных заболеваниях: злокачественной неходжкинской лимфоме (3HJ1) и лимфогранулематозе (ЛГМ) исходные значения показателей ИФН статуса свидетельствовали о существенной нагрузке на систему ИФН и отражали наличие в организме факторов, стимулирующих выработку ИФН. После проведенных 6-8 курсов химиотерапии (винкристин, доксрубицин, преднизолон) у больных ЛГМ не наблюдали существенных изменений ИФН статуса. После курса химиотерапии у больных ЗНЛ было отмечено снижение титров сИФН и снижение продукции лейкоцитами ИФН-a/ß; индукция ИФН-у достоверно не изменялась. В результате проведенного лечения происходило полное исчезновение или заметное уменьшение опухолевой массы. В то же время, полученные данные свидетельствуют, что в результате химиотерапии, несмотря на положительные клинические изменения, реактивность системы ИФН либо не восстанавливалась (ЛГМ) либо еще более подавлялась (ЗНЛ). Это может быть показанием для комбинирования химиотерапии с методами иммунокоррекции.

Основываясь на приведенных материалах можно сделать вывод, что во многих случаях уровень реактивности системы ИФН связан не с той или иной нозологической формой инфекционного или аутоиммунного заболевания, а с особенностями течения болезни. Можно выделить несколько разновидностей ИФН статуса и соответствующих им типов клинического состояния.

Нормальное физиологическое состояние систем защиты организма, и системы ИФН в частности, проявляется в состоянии "боеготовности", когда в кровотоке присутствует минимальное количество ИФН, но в случае необходимости система способна быстро наработать достаточные количества ИФН.

Выраженная (активная) реакция систем защиты обусловлена интенсивным развитием инфекционного заболевания. Она сопровождается острым течением болезни и проявляется в значительном повышении уровня сИФН (до 25-50 ME/мл и более), что, соответственно, ведет к истощению до 15-30% от нормы ресурсов образования различных типов ИФН. Т.е. выраженная реакция системы ИФН заключается в массированной выработке различных типов ИФН для обеспечения неспецифической резистентности организма и запуска других защитных реакций.

Слабая (недостаточная') реакция защитных систем выражается в слабой реакции организма на патологический процесс, явно недостаточной для выздоровления. При этом наблюдается некоторое повышение по сравнению с нормой уровня сИФН до 10-25 МЕ/мл и снижение способности клеток к образованию разных типов ИФН на 50-75%. Обычно, такой тип реакции имеет место при подостром или хроническом течении инфекционных заболеваний, когда у больного развиваются вторичные ИФН- и иммуно-дефицитов различной степени тяжести. Недостаточная активность систем защиты может быть обусловлена большими дозами антибиотиков, химиопрепаратами, хирургическими вмешательствами, обширными механическими и термическими травмами и т.д.

Депрессия (анэргия) активности систем защиты организма проявляется в глубоком подавлении активности иммунитета, и системы ИФН в частности. сИФН выявляется в следовых количествах (0-10 МЕ/мл), что можно объяснить крайним истощением резервов образования ИФН: индуктивная активность клеток составляет менее 10-15% от нормы. Такое состояние системы ИФН имеет место при тяжело протекающих хронических заболеваниях, персистирующих инфекциях, а также в результате применения массивных курсов иммунодепрессантов, химиопрепаратов, антибиотиков и цитостати-ков.

Характер изменений ИФН статуса обычно отражает состояние систем защиты организма и соответствует клинической динамике болезни.

При острых инфекционных заболеваниях развивается выраженная реакция системы ИФН, причем в первую очередь повышается уровень сИФН, а затем падает индуктивная активность лейкоцитов. При благоприятном развитии болезни, показатели ИФН статуса плавно возвращаются к нормальным. При неполном излечении и хронизации заболевания уровень сИФН несколько снижается, а способность клеток к образованию ИФН может даже несколько повышаться — система ИФН переходит в состояние, соответствующее слабой реактивности. При хроническом течении заболевания, развитии иммунодефицитов, значения показателей ИФН статуса обычно варьируют в пределах, соответствующих слабой реакции системы ИФН. Процесс выздоровления обычно предваряется активацией защитных систем и системы ИФН, т.е. переходом системы ИФН в состояние выраженной реакции, что проявляется в относительном повышении уровня сИФН, снижении индуктивной активности клеток (что наблюдается не всегда) и дальнейшем стремлении показателей ИФН статуса к норме. Прогрессирование патологического процесса приводит к полному истощению системы ИФН, что сопровождается снижением всех показателей ИФН статуса, и, особенно, ИФН-продуцирующей активности лейкоцитов. Как правило, переход системы ИФН в состояние депрессии происходит либо из состояния выраженной реакции (переход заболевания в персистирую-щую форму и развитие иммуно- и ИФН-дефицита), либо из состояния слабой реакции (при осложненном течении хронической патологии). Положительные тенденции в развитии болезни соответствуют активизации системы ИФН: увеличению индуктивной активности лейкоцитов и повышению уровня сИФН. При выздоровлении, все показатели ИФН статуса увеличиваются, и система ИФН последовательно переходит к состоянию слабой, а затем и выраженной реакции с дальнейшим стремлением ИФН статуса к полной нормализации.

Сопоставляя клиническое состояние больного с показателями его ИФН статуса можно прогнозировать характер развития патологического процесса. Достаточная реактивность системы ИФН дает основание для благоприятного прогноза исхода заболевания. Если реакция системы ИФН не адекватна клинической картине, то вероятен малоблагоприятный исход болезни, поскольку налицо дисбаланс защитных систем организма. Такое состояние может иметь место при недостаточности системы ИФН в течении острого заболевания; при хронических заболеваниях, сопровождающихся глубокой депрессией системы ИФН; при различных аутоиммунных и онкологических заболеваниях, когда происходит нарушение баланса продукции различных типов ИФН.

Прогнозирование исхода заболевания будет более надежным при исследовании ИФН статуса в динамике. Положительная динамика показателей ИФН статуса соответствует благоприятному исходу заболевания; тенденции к снижению реактивности системы ИФН или ее депрессии обычно сопутствуют углублению патологии и осложненному течению заболевания.

Закономерности функционирования системы ИФН помогают определять наличие вялотекущих инфекционной патологии при отсутствии явной манифестации заболевания, диагностировать развитие вторичных иммунодефицитов, выявлять предрасположенность к инфекционным и аутоиммунным заболеваниям.

Состояние системы ИФН помогает определить стратегию иммуномодулирующих воздействий. При выраженном подавлении образования клетками ИФН, назначение иммуностимулирующих препаратов (индукторы ИФН, компоненты клеточных стенок

97 микроорганизмов, синтетические иммуностимуляторы) представляется малоперспективным, поскольку защитные системы не в состоянии адекватно ответить на такого рода воздействие. В этих случаях более показано применение иммунозаместительных препаратов (препараты ИФН, гамма-глобулин, интерлейкины). При выраженной реакции со стороны системы ИФН (резкое повышение уровня сИФН на фоне угнетения ИФН-образования) использование индукторов ИФН и иммуностимуляторов, также будет не всегда эффективным. Дополнительная стимуляция может не привести к ожидаемому выбросу эндогенных защитных факторов. В этих случаях также большей эффективностью будут обладать иммунозаместительные препараты, усиливающие действие эндогенных защитных факторов. При сохранении достаточной способности к образованию собственных защитных факторов, применение индукторов ИФН и иммуностимуляторов является полностью обоснованным. Таким образом, чем ниже способность лейкоцитов продуцировать ИФН, тем более показана заместительная иммуномодули-рующая терапия, и, наоборот, чем выше индуктивная активность клеток крови, тем больший эффект будет иметь стимулирующая иммуномодуляция. В ряде случаев (при активном состоянии активации защитных систем) применение иммуномодулирующих воздействий нецелесообразно, поскольку организм сам обеспечивает нужный уровень защитных факторов. Внесение их извне или дополнительная стимуляция их синтеза в организме может только нарушить нормальную регуляцию развития защитных реакций и повредить больному.

98